CN101382546B - 颗粒 - Google Patents

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Abstract

一种含有基体聚合物的任选多孔磁性聚合物颗粒的涂覆磁性颗粒，所述聚合物颗粒在其表面上和/或孔隙中具有超顺磁性晶体，所述涂覆颗粒具有由涂层聚合物形成的涂层，其中所述涂覆磁性颗粒基本上为非自身荧光。

Description

颗粒
本申请是中国发明申请(发明名称：颗粒，申请日：2003年12月11日；申请号：200380107827.2)的分案申请。
本发明涉及磁性聚合物颗粒、它们的制备方法及其用途。具体地说，本发明涉及具有低自身荧光的涂覆磁性聚合物颗粒。
为了诊断、分离和合成的目的，磁性聚合物颗粒通常用于各种医学和生物化学领域，例如作为药剂输送的传输手段。这种颗粒依赖于它们的磁性，以实现如下功能：在诊断测定应用中，例如，对含有连接到磁性聚合物颗粒上的分析物的试样施加磁场，以允许隔离分析物，而不使用离心分离或过滤；和治疗应用中，例如，对病人施加磁场可用于使目标药物-运载磁性聚合物颗粒达到期望的身体位置。
磁性在这里是指聚合物颗粒含有超顺磁性晶体。从而，该磁性聚合物颗粒可磁性取代，但并非可永久磁化。
已知很多制备磁性聚合物颗粒的方法，其中大部分包括由预成型磁性氧化铁如磁铁矿制备含有磁赤铁矿或磁铁矿的聚合物颗粒。在US-A-4,654,267(Ugelstad)中描述了这些方法中的一些，其内容在此引入作为参考。
因而US-A-4,654,267对于在其之前的方法概述了许多局限性；这些包括获得相似大小和/或均质或均一磁性的磁性颗粒的困难，以及更常见的问题，其涉及将磁性材料引入多孔聚合物颗粒空穴的困难。
随着沉淀主要发生在表面上、或在大开口腔内，缩短磁性聚合物颗粒在其应用中的使用寿命的磁性颗粒的浸出从而成了问题。
为了克服这些缺点以生产具有位于聚合物孔隙内的磁性材料的多孔、磁性聚合物颗粒，US-A-4,654,267提出使用具有用以将铁离子引入聚合物颗粒中的表面官能团的多孔聚合物颗粒。这些官能团可以通过在聚合物生产中使用官能化共聚单体而获得或通过聚合物的后聚合处理以引入官能团，例如通过聚合物表面上现有基团的偶联或转化。
超顺磁性晶体从多孔聚合物颗粒中的浸出可以进一步通过在载有聚合物颗粒的超顺磁性晶体上形成其它聚合物涂层、或更具体地说通过至少部分地以聚合物涂层填充颗粒孔隙来进行抑制。这种涂层聚合物一般可以由单体与底层颗粒的聚合物表面上悬垂的官能团反应而形成。
然而，当以这种方法制备涂覆磁性聚合物颗粒时，它们表现出称为自身荧光的特性，即它们表现出固有的荧光。虽然对于涂覆磁性聚合物颗粒的很多用途，例如在合成或分离中的应用，自身荧光没有引起问题，但对于该颗粒用于检测发光的测定，颗粒发出的自身荧光可以产生不需要的背景信号。自身荧光还可以掩盖来自所关心的发射体的信号。这将降低测定的灵敏度。
现在我们令人惊讶地发现，通过避免基体聚合物、颗粒涂层和任何表面官能团中的共轭离域电子体系(除了苯环中的以外)，可以将磁性聚合物颗粒表现出的自身荧光最小化。以前，这种共轭离域电子体系被认为对于在磁化步骤中进行铁氧化物的吸引和使聚合物涂覆顺利是必需的。
结果，可以在涂覆磁性聚合物颗粒的制备中使用具有减小的或无自身荧光的基体聚合物，因而该涂覆磁性聚合物颗粒表现出显著的低自身荧光。这种颗粒可用于各种测定，特别是检测荧光的测定。
虽然在非-磁性聚合物珠体中将荧光体用作标记是已知的，在磁性珠体中这种荧光标记的使用具有能够结合磁性试样制备和检测的优势，即将用于自动试样制备和/或浓缩的仪器与检测平台相结合，这种检测平台例如流式细胞计、荧光显微镜、高分辨率阵列扫描仪或激光扫描血细胞计数器。所有这些检测装置属于微流体装置，其中使用磁性来进行试样制备和/或浓缩的可能性是重要的。
本发明的目的通过以下实现：
1.一种含有基体聚合物的任选多孔磁性聚合物颗粒的涂覆磁性颗粒，所述聚合物颗粒在其表面上和/或孔隙中具有超顺磁性晶体，所述涂覆颗粒具有由涂层聚合物形成的涂层，其中所述涂覆磁性颗粒基本上为非自身荧光。
2.条目1的涂覆磁性颗粒，其具有相当于在450±25nm的激发波长下曝光时间为500ms或600ms的平均灰度值差值(ΔMGV)小于600的自身荧光水平。
3.条目2的涂覆磁性颗粒，其具有相当于在450±25nm的激发波长下曝光时间为500ms或600ms的平均灰度值差值(ΔMGV)小于300的自身荧光水平。
4.条目1-3中任一项的涂覆磁性颗粒，其基本上不含共轭离域电子体系(除了在苯环中的那些以外)。
5.条目1-4中任一项的涂覆磁性颗粒，其中所述涂层聚合物由至少一种环氧化物形成。
6.条目5的涂覆磁性颗粒，其中所述涂层聚合物由至少两种环氧化物形成。
7.条目6的涂覆磁性颗粒，其中该环氧化物选自表氯醇、表溴醇、异丙基缩水甘油醚、丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-二(2，3-环氧丙氧基)丁烷)、乙基己基缩水甘油醚、甲基缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、缩水甘油、和甲基丙烯酸缩水甘油酯。
8.条目1-7中任一项的涂覆磁性颗粒，其中该聚合物颗粒为多孔的。
9.条目1-8中任一项的涂覆磁性颗粒，其中该聚合物颗粒直径在0.8-10μm的范围内。
10.条目9的涂覆磁性颗粒，其中该颗粒直径在2-10μm的范围内。
11.条目1-10中任一项的涂覆磁性颗粒，其中所述基体聚合物为苯乙烯聚合物、苯乙烯/丙烯酸酯类聚合物和丙烯酸酯类聚合物的组合。
12.条目1-11中任一项的涂覆磁性颗粒，其中该颗粒表面带有自由氨基。
13.条目1-12中任一项的涂覆磁性颗粒，其中还含有荧光团或不同荧光团的混合物。
14.条目13的涂覆磁性颗粒，其中所述荧光团通过氨键连接到外涂层聚合物上或溶胀进涂层聚合物中并包埋在其中。
15.条目13或14的涂覆磁性颗粒，其中所述荧光团为Bodipy630/650、Bodipy650/655、DY-647或AMCA-X。
16.条目13-15的涂覆磁性颗粒，其中所述荧光团发射蓝/绿区域的电磁波谱。
17.条目1-16中任一项的涂覆磁性颗粒，其中还含有亲合配体。
18.条目1-17中任一项的涂覆磁性颗粒混合物，其中聚合物颗粒直径的变异系数小于8％。
19.条目1-18中任一项的涂覆磁性颗粒混合物，其中含有至少第一组带有第一荧光团的涂覆磁性颗粒和第二组带有第二荧光团的涂覆磁性颗粒，所述第一和第二组的颗粒直径不同。
20.条目1-19中任一项的涂覆磁性颗粒的制备方法，该涂覆磁性颗粒不含共轭离域电子体系，所述方法包括将基本上没有表面硝基且在其表面上和/或孔隙中具有超顺磁性晶体的多孔磁性聚合物颗粒与选自环氧化物的形成聚合物的单体的反应。
21.条目1-19中任一项的涂覆磁性颗粒或颗粒在测定中的应用。
22.条目20的应用，其中所述测定含有下列步骤：
i)将含有第一荧光团和亲合配体的涂覆磁性颗粒加入到其中可存在目标分析物的试样中；
ii)如果存在所述分析物，让所述亲合配体与所述分析物相结合以形成络合物；
iii)将络合物与指示器接触以使所述指示器连接到所述分析物上，其中所述指示器任选地带有第二荧光团；
iv)将所述颗粒从所述试样中磁性分离；和
v)检测所述第一荧光团和如果存在的所述第二荧光团。
23.条目22的应用，其中使用流式细胞计或通过显微镜检查法进行检测。
24.条目22或23的应用，其中该颗粒形成珠状排列的部分，对该珠状排列进行分析以检测每个珠型的位置和第二荧光团的存在。
25.条目22-24中任一项的应用，其中所述指示器为生物素或不同于所述第一荧光团的第二荧光团。
26.条目21-24中任一项的应用，其中步骤(i)还包括下列步骤：
将至少带有进一步亲合配体(专用于可存在于试样中的其它分析物)和进一步的荧光团的第二涂覆磁性颗粒加入到所述试样中，所述第一和进一步亲合配体及所述第一和进一步荧光团不相同。
27.条目26的应用，其中所述第二涂覆磁性颗粒与所述第一涂覆磁性颗粒的直径不同。
28.条目22-27中任一项的应用，其中所述指示器为生物素且在荧光团检测前，将所述络合物与抗生蛋白链菌素涂覆表面相接触。
29.条目21的应用，其中所述测定含有下列步骤：
i)将含有第一荧光团和亲合配体的涂覆磁性颗粒与试样相接触，其中可存在目标分析物且其中存在带有能够与用于亲合配体的所述目标分析物相竞争的指示器的分析物；
ii)让所述亲合配体连结到所述分析物上，如果所述分析物存在，或所述分析物带有指示器；
iii)将所述颗粒从所述试样中磁性分离；和
iv)检测第一荧光团。
30.条目29的应用，其中所述指示器为生物素且在荧光团检测前，将所述络合物与抗生蛋白链菌素涂覆表面相接触。
31.一种含有基体聚合物、在其表面上和/或孔隙中配置有超顺磁性晶体的任选多孔磁性聚合物颗粒，所述基体聚合物基本上不含共轭离域电子体系且任选地以选自磺酸、羧酸、胺、和环氧基的基团进行表面官能化，所述颗粒基本上为非自身荧光。
因而，从本发明的一个方面看，提供了含有基体聚合物的任选多孔磁性聚合物颗粒，该聚合物颗粒在其表面上和/或孔隙中具有超顺磁性晶体，所述基体聚合物优选基本上不含共轭离域电子体系和任选地以选自磺酸、羧酸、胺、和环氧基的基团进行表面功能化，所述颗粒基本上为非自身荧光，例如具有相当于在450±25nm的激发波长下曝光时间为500ms或600ms的平均灰度值差值(ΔMGV)小于600的自身荧光水平。
从本发明的另一个方面看，提供了含有基体聚合物的任选多孔磁性聚合物颗粒的涂覆磁性颗粒，所述聚合物颗粒在其表面上和/或孔隙中具有超顺磁性晶体，所述涂覆颗粒具有涂层聚合物形成的涂层，其中所述涂覆磁性颗粒基本上为非自身荧光，例如具有相当于在450±25nm的激发波长下曝光时间为500ms或600ms的平均灰度值差值(ΔMGV)小于600的自身荧光水平且所述涂覆颗粒优选基本上不含共轭离域电子体系。
基体聚合物(或聚合物)是指聚合物(或聚合物)及如果需要的话，交联剂，其用于形成未涂覆聚合物颗粒，如下面的进一步详细限定。
基本上不含共轭离域电子体系是指基体聚合物和如果存在的话，所述涂层聚合物(即涂覆颗粒本身)不含任何发生离域(除苯环内部以外)的电子体系。
通过在多孔基体聚合物的孔隙、任选地例如以磺酸、羧酸、胺、或环氧基(但不具有硝基)进行官能化的表面中形成超顺磁性晶体而生产的未涂覆磁性聚合物颗粒应当为有效的非自身荧光。这种未涂覆颗粒(和因此的涂覆颗粒)优选ΔMGV值小于300，特别的小于200，尤其小于100。这种未涂覆颗粒可以用作本发明涂覆颗粒生产或在超顺磁性晶体的浸出不成为问题的最终用途中的中间体。
未涂覆和涂覆颗粒的ΔMGV更优选小于400，特别的低于350，更特别低于300。
使用荧光显微镜，通过以滤过具有480nm分束器的450±25nm激发带滤波器的100W水银灯或75W氙灯发出的光、和以滤过520nm宽带(longpass)滤波器的发射光照射带有颗粒的基底(例如玻璃)表面，测定颗粒的ΔMGV。ΔMGV是测定的最少30个颗粒的平均灰度值和测定的类似的最少(例如25个位置)背景位置(即基底上的位置)的平均灰度值的差值。
为了方便，可以使用Olympus产的装配有100W水银灯或75W氙灯和ChromaTechnology产的激发及发射滤波器以及Uplan-Apo20x物镜的BX-61荧光显微镜测定ΔMGV。可以使用曝光时间为500ms(氙灯)或600ms(水银灯)的F-视图数字式单色CCD相机(4096灰度级)来进行发射检测且使用SoftImagingSystems的Analysis软件可以进行测定MGV值的图像分析。
对于自身荧光测定，该颗粒可以分散在液体介质中的平行玻璃基底(例如显微镜载玻片)之间，或在pH7.4磷酸盐缓冲盐水(实施例18)中进行缓冲，该液体介质例如甘油和1.5g/l十二烷基硫酸钠水溶液(如实施例12)的体积比为1∶1的混合物。在实施例12和18中详细解释了自身荧光测定。
用于本发明颗粒的聚合物颗粒中的超顺磁性晶体可以为能够在聚合物颗粒表面上、或更优选在多孔聚合物颗粒的孔隙中以超顺磁性晶体的形式沉淀的任何材料。因而，本发明颗粒中的超顺磁性晶体可以为能够表现出超顺磁性的任何元素、合金或化合物。优选磁性氧化铁，例如磁铁矿或磁赤铁矿；然而，如果需要的话，晶体可以为混合的氧化物或其它磁性材料。存在的结晶磁性材料的总量一般高于1重量％，优选高于3重量％，期望地高于或等于5重量％，例如高达40重量％。基于涂覆颗粒的全部干重，根据Fe(或在不同于铁氧化物的磁性材料的情况下的等效金属)的重量基位计算百分数。该超顺磁性晶体在基体聚合物的表面上，即在颗粒的外表面上或，更优选，在多孔基体颗粒中的孔隙的表面上。
该任选多孔磁性聚合物颗粒可以通过常规方法使用单体而进行制备。一般来说，可以使用任何多孔非自身荧光聚合物颗粒。然而，应当优选用以形成基体聚合物(和涂层聚合物)的单体，以使所得到的聚合物基本上不含除苯环以外的共轭离域电子体系。因而例如优选避免使用二乙烯基苯作为交联剂。
由于硝基自身含有离域电子体系且因而有助于聚合物颗粒的自身荧光，因此也应当避免在聚合物颗粒表面上存在硝基。
该基体聚合物特别优选乙烯聚合物、苯乙烯聚合物或，特别地，丙烯酸酯类聚合物。优选用于基体聚合物制备的单体包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、三丙烯酸三羟甲酯、四丙烯酸季戊四醇酯和其它丙烯酸酯类或甲基丙烯酸酯类单体。
优选基体聚合物不是水-溶胀的。
在本发明的一个优选实施方式中，可以通过接种聚合反应，即多级聚合来生产基体聚合物，在该多级聚合中将来自一个阶段的粒状聚合物用作产生更大尺度粒子的随后聚合反应的种子。在这种实施方式中，在一个阶段中使用的单体不必与其它阶段使用的单体相同。在这种实施方式中，最终阶段生产的聚合物优选为丙烯酸酯类聚合物。在初始聚合阶段生产的聚合物优选为苯乙烯聚合物。在一个特别优选的实施方式中，初始聚合物(种子)为苯乙烯，中间体聚合物为苯乙烯/丙烯酸酯类共聚物，其最终聚合物为丙烯酸酯类。
含有颗粒的基体聚合物可以通过任何适于生产粒子聚合物颗粒的技术进行制备，例如悬浮聚合、乳液聚合、分散聚合等。然而，特别优选使用公知的Ugelstad法生产颗粒，例如US4,654,267或WO00/61647中所述。然而，优选在磁化过程中使用氨取代乙二胺。令人惊讶地发现，氨的使用导致了具有较低自身荧光等级的颗粒。
因而，在引入磁性颗粒前，可以使用氨将氨基引入到颗粒表面上。
可以使用Ugelstad法生产颗粒，Ugelstad法基本上为单分散，即颗粒直径的变异系数(CV)极小，例如2-5％。CV定义为100乘以(标准偏差)除以平均值，其中平均值为平均颗粒直径且标准偏差为粒度的标准偏差。CV优选在主模型上进行计算，即通过将单模态分布曲线与检测的粒度分布相匹配。因而，可以对一些低于或高于模型尺寸的颗粒在计算中进行折扣，例如其可以基于总颗粒数量(即可检测的颗粒)的约90％。这种CV的测定可以在CoulterLS130粒度分析仪上进行。
该涂层聚合物优选由至少一种环氧化物化合物，优选至少两种环氧化物化合物形成。
多孔磁性聚合物颗粒与涂料单体的反应在基体聚合物颗粒的孔隙中形成涂层聚合物，其基本上用于堵塞这些孔隙，将超顺磁性晶体物理密封在聚合物颗粒中。然后，相对于多孔原料，所得的″涂覆″颗粒具有降低的孔隙率。令人惊讶的是，据信超顺磁性晶体似乎对聚合进行催化，从而使涂层优先形成于其附近。由于大多数超顺磁性晶体在起始多孔颗粒的孔隙内，在颗粒的外表面上不会形成任何显著程度的涂层。
在一个优选实施方式中，多孔聚合物颗粒与环氧化物的混合物进行反应。优选，该环氧化物含有至少一个醚键和任选疏水组分，例如亚烷基链。一般，环氧化物的碳原子含量为3-50，优选3-25。可使用的典型环氧化物包括表氯醇、表溴醇、异丙基缩水甘油醚、丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-二(2，3-环氧丙氧基)丁烷)、新戊二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩甘油醚、缩水甘油、和甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙基己基缩水甘油醚、甲基缩水甘油醚、甘油丙氧基三缩水甘油醚、聚(丙二醇)二缩水甘油醚、1，3丁二醇二缩水甘油醚、叔-丁基缩水甘油醚、1，4环己烷二甲醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、十二烷基缩水甘油醚、O-(2，3环氧丙基)-O′-甲基聚乙二醇缩水甘油醚、缩水甘油基四氟乙醚、1，6己二醇二缩水甘油醚、辛基缩水甘油醚、癸基缩水甘油醚、聚(表氯醇-共-环氧乙烷-共-烯丙基缩水甘油醚)、聚乙二醇二缩水甘油醚、三羟甲基乙烷三缩水甘油醚、三羟甲基丙烷、三缩水甘油醚、叔-丁基二甲基甲硅烷基缩水甘油醚、1，2-环氧丁烷、1，2-环氧戊烷、1，2-环氧-5-己烯、1，2-环氧-己烷、1，2-环氧-7-辛烯、1，2-环氧辛烷、1，2，7，8-二环氧辛烷、1，2-环氧-9-癸烯、1，2-环氧癸烷、1，2-环氧十二烷、1，2-环氧十四烷等。
一般，以涂料单体浸渍多孔磁性聚合物颗粒或将多孔颗粒在有机溶剂中的分散体与液体环氧化物混合物相混合，可以对涂层反应产生影响，这些涂料单体例如使用这些单体(例如在如甲醇、甲苯、二甲苯、二甘醇、二甲醚或二甘醇二甲醚的有机溶剂中)的溶液。可以使用超声处理以改善浸渍且可以通过升高温度至例如升至50-100℃以加速该反应。通过施加低于室压的压力，萃取所用的任何溶剂。
从又一个方面来看，本发明提供了此前描述的不含共轭离域电子体系的涂覆磁性颗粒的制备方法，所述方法包括基本上没有表面硝基且在其表面上和/或孔隙中具有超顺磁性晶体的多孔磁性聚合物颗粒与选自环氧化物的形成聚合物的单体的反应。
从再一个方面来看，本发明提供了这种颗粒在合成、萃取或测定中的应用。
如果期望，在涂层聚合反应之前或涂层聚合之后，可将其它材料浸渍进或化学吸附到颗粒上。一般这种其它材料为辐射发射体或吸收体，例如荧光团、发光材料、延时荧光材料、发色团或放射性标记材料。
通常，本发明颗粒的尺寸(即直径)通常在微米范围，例如0.3-100μm，特别是0.5-50μm，更特别地为0.8-10μm，例如2-10μm，例如5和μm。
一般，所用的多孔颗粒的表面积为至少15m2/g(通过BET氮气吸收法测定)，且更优选为至少30m2/g，例如高达700m2/g，当精确到平均颗粒直径2.7μm(即以2.7/MD乘以表面积，其中MD为微米单位的平均直径)时。同样的比例，优选颗粒孔体积为至少0.1mL/g。
一般，在涂覆之前，聚合物颗粒为球形且基本上为单分散，且一旦进行涂覆，特别优选保持球形且基本上为单分散。
基本上为单分散是指对于大多数颗粒(例如至少100，更优选至少1000)，颗粒的变异系数(CV)小于20％，例如小于15％，优选小于12％，更优选小于11％，再更优选小于10％且最优选不大于约8％，例如2-5％。
通常，磁性聚合物颗粒的应用，例如用作诊断工具，要求适当的程度的亲电性，以便它们可以充分地参与普遍作为生物学介质的水体系中的偶合和其它反应。
虽然涂料的一般极性为期望的亲电性，可以引入某些含有疏水部分的涂料以使亲电性的程度达到期望的程度。这样，本发明可以提供具有宽范围极性的有用的诊断和其它工具。
如果期望，可以对涂覆磁性聚合物颗粒的表面进行进一步功能化，例如通过偶合药物分子、指示器标记(例如发色团、酶或无线电标记)、或亲合配体(例如抗体或抗体片段、一部分特定连结配合对(bindingpartnerpair)(例如生物素或抗生蛋白链菌素)、低聚肽、低聚核苷酸、或低聚糖)。
这种偶合可以为直接或间接(因此可以或可以不包含使用偶联剂以形成颗粒和偶联到其上的物质之间的联接)且可以为可生物降解的或非-生物降解的。如果磁性聚合物颗粒将用于活性化合物的目标释放，则期望为可生物降解偶联。从而，在涂层受到影响后，可以对涂层的侧基进行操作以提供适当的用以连接到这种物质上的官能团(例如环氧、羟基、氨基、酮、巯基、异硫氰酸酯、异氰酸脂、甲苯磺酰基、羧酸等官能团)。
本发明的低自身荧光颗粒具体用于对颗粒的荧光进行检测的应用中，例如指示器带有荧光团的测定。荧光团是指表现出固有荧光的化合物。在一些测定中，可以优选使用着色颗粒或珠体。在这点上，用于这种测定的着色颗粒/珠体要求存在荧光团来“色彩编码”颗粒。已知很多不同的荧光团可以制备各种色彩编码珠体，(即当受到较短波长光的激发时，每个珠体以发射光的特征波长、不同的强度等进行分类。激发源可以为激光或一种或几种波长的滤过光)。这种编码可以通过例如，提供不同荧光强度、具有不同荧光光谱、两种或多种荧光团之间的不同强度-比的珠体、或通过使用具有各种荧光团的不同直径的珠体来建立。其它可能的编码方法可以为磁性标记、折射率、吸附光谱、吸附率等的使用。
可以将荧光团连接到本发明低自身荧光颗粒上，通过例如将具有如氨基的表面官能团的颗粒与含有反应基团的荧光团相接触，形成荧光团对颗粒的共价连接。这种官能团可以为琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、羧酸、马来酰亚胺、磺酰氯等。
其它潜在的用于将荧光团结合到(进)珠体的方法可以包括疏水或静电相互作用、荧光团溶胀进涂层及荧光团在涂层中的包埋(或捕集)(包埋可以通过所用溶剂的极性变化来进行诱导)、荧光团在孔隙中的沉积、荧光团溶胀进聚合物基体等。
可以在颗粒合成的任何适宜阶段将荧光团结合到颗粒上。因而，可以在磁化处理之后及随后进行涂覆之前将荧光团结合到颗粒上。可选择地，加入荧光团和随后进行进一步涂覆之前，可以涂覆薄涂层到颗粒上。然而，最方便的，在涂覆最终涂层之后，将荧光团结合到颗粒上。
由于在荧光团上涂覆涂层可以显著地降低其荧光强度，后者的方法最有利，虽然对于香豆素染料AMCA(产自MolecularProbesInc.)来说，如果在其上涂覆涂料，未观察到强度降低。
颗粒和荧光团之间的反应应当易于在有机溶剂中发生，例如二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮、1，4-二噁烷、氯仿、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯等单独或其混合物；首先要求的是这样的溶剂体系，其允许染料对于所有颗粒的均匀分布并允许以高产率进行染料的结合。其可由本领域技术人员可以容易地进行。
荧光团官能化的涂覆磁性颗粒还应带有亲合配体，基于其对具体分析物的亲和力，来对其特性进行选择，将检测该分析物在试样中的存在或不存在。因此，亲合配体可以包括任何能够连接到磁性探针的分子，该磁性探针还能够进行具体分析物的特定识别。因此，亲合配体包括单抗体、多无性系抗体、抗体片段、核酸、低聚核苷酸、蛋白质、低聚肽、多糖、糖、肽、肽编码核酸分子、抗原、药物及其它配体。在试样中，最普通的亲合配体为连接到抗原的抗体。适宜的亲合配体的实例在出版物中可得到且其为公知的。在本领域中，进一步的连结对(bindingpartner)、第二亲合配体和连接基团的使用是常规的且应当理解，如果期望，可以使用具有本发明颗粒的这种类型。
更具体地说，核酸检测一般包括使用含有核酸序列的核酸探针来对被认为含有目标核酸的试样进行探测，该探针特别用于识别，目标核酸的序列，例如与其杂化，从而该核酸亲合配体和目标核酸相结合产生杂化层。相对地，激素、抗体、细胞因子等的免疫测定类型检测一般包括抗体或抗原在珠体上的连结。还对连结配体具有兴趣，该连结配体对于引入到感兴趣的目标上的“标记”具有特定亲和力。这种配体可以为金属螯合物、小有机分子、核酸衍生物或蛋白质。对于在细胞生物学和微生物学中的应用，可以令人感兴趣地连结对特定细胞类型、细菌或病毒具有亲和力的抗体。
该目标材料为任选的生物分子或来源于合成的分子、或这两种类型的结合，例如可以为分子或分子基团、细胞或单细胞生物或病毒，包括例如抗体、氨基酸、蛋白质、肽、多肽、酶、酶底物、激素、淋巴因子、代谢物、抗原、半抗原、细胞因子、凝集素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、毒素、毒物、环境污染物、碳水化合物、低聚糖、多糖、糖蛋白、糖脂、核苷酸、低聚核苷酸、核酸和衍生核酸、DNA、RNA、天然或合成药物、受体、病毒颗粒、细菌颗粒、病毒组分、细胞、细胞组分、天然或合成脂囊泡、聚合物膜、聚合物组件(services)和颗粒及玻璃和塑料表面。
本发明生成的颗粒既与这种目标-连结配体相联接，还可以随后用指示器部分进行标记，该指示器部分例如生物素、发色团、荧光团、放射性同位素或酶。
具体进一步感兴趣的是包括荧光团作为指示器部分的可能性，尤其是在与上述彩色编码颗粒的联合中。将荧光团引入指示器分子中是本领域中已知的。
例如，在核酸检测中，可以使用补充到目标中、以一个或几个荧光团标记的低聚核苷酸探针。在探针合成过程中，可以通过例如使用改进的氨基磷酸酯来进行标记。
可选择地，当存在目标时，可以使用标记核苷酸(nucleotdies)或探针的酶结合。
对于蛋白质/免疫测定，可以使用标准交联试剂标记抗体或抗原；例如在蛋白质或抗原上与氨基反应的N-羟基琥珀酰亚胺活化荧光团。
当这种指示器与已经连接到″彩色编码″荧光团上的本发明低自身荧光颗粒相结合时，存在两个可激发荧光团。这使得珠体在下面更详细描述的各种测定中得以使用并可以多路复用(multiplexing)。
应选择使用的荧光团，以使它们的激发和发射信号不相互干扰。虽然本领域技术人员可以使所用的荧光团达到最小重叠，但因为很多荧光团具有吸收光谱且该吸收光谱在比最大吸收短的波长下表现出拖尾并进一步避免具有适用于指示器的激发光的编码的激发，因而优选该编码(即颗粒荧光团)应设定在比指示器短的波长。此外，该较短波长区域(蓝和绿光发射)也是固有自身荧光最显著的光谱区域。
因而，在本发明的具体优选实施方式中，连接到颗粒的荧光团将在光谱的蓝光区域(即比指示器短的波长)中进行发光，然而连接到指示器部分的荧光团将在光谱的红光区域中进行发光(即比颗粒荧光团长的波长)。
可选择地，连接到颗粒的颜色荧光团(编码)将在比指示器短的波长下进行发光，然而连接到指示器部分的荧光团将在比编码长的波长下进行发光。
使用的适宜的荧光团如下：7-羟基-4-甲基香豆素(AMCA/AMCA-X)、Alexafluor350、Alexafluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、BODIPY493/503、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650-X、BODIPY650/665-X、BODIPYFL、BODIPYTMR、BODIPYTR、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY-505、DY-555、DY-647、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、芘、四甲基若丹明、荧光素、具有或没有适宜的官能团和具有或没有荧光团和官能团之间的联接剂。荧光团可以具有适当的官能团，例如氨基、琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰氯、羧酸等。
这种荧光标记的颗粒可用于各种测定，例如多路复用的免疫测定。例如，可以将颗粒和不同彩色编码及相应的亲合配体的混合物加入将要进行分析的试样中。通过亲和力，将感兴趣的分析物连结到其相应的在着色磁性颗粒上的配体。
在夹层式免疫测定中，连结到特定于分析物的第二抗体(亲合配体)的标记(例如荧光团)然后被连结到捕集的分析物上。该标记可以选自公知的标记，例如无线电免疫测定、荧光或化学发光免疫测定、或免疫PCR技术。由于这些免疫测定技术对于本领域技术人员是已知的，在此不要求对该已知免疫测定技术进行广泛讨论。(Jackowski，George；等，美国专利申请20020160425，2002年10月31日。)
颗粒的磁性用于使该受束缚络合物的简化(自动)清洗易于进行，该清洗用以去除在检测步骤期间将产生干扰的任何未束缚的标记和其它试剂。在不存在清洗步骤时，干扰的程度将取决于所用系统的特性，但在大多数情况下，有必要去除任何未束缚的标记。在所有情况下，相对于没有进行清洗的分析，清洗的结果为降低的背景和增加的信噪比。
然后，在一个或两个检测系统中，对该颗粒-分析物-标记络合物进行分析，其中a)检测珠体色彩和b)检测标记束缚。这可以在相同的检测器、两个并联检测器中同时进行，也可以通过两次使用相同的检测器或通过将珠体络合物从一个检测系统转移到另一个检测系统而连续进行。在后一种情况下，必须可以对颗粒进行追踪，以使颗粒色彩和标记检测之间存在直接关联。
通过颗粒的彩色编码实现多路复用。通过从结合的标记中识别具有信号的颗粒类型，确定分析物。使用两种或多种用以检测分析物的不同标记可以提高多路复用的程度。
检测系统必须能够分析单个颗粒。这可以在例如微流体流式细胞计的流基体系中或在固定珠状排列格式下进行。在后一种情况下，通过亲和力或磁力，被动或主动地将珠体沉积到固体表面上，例如显微镜载玻片、在微流体体系中的微量滴定井(microtitrewell)或结构的底。可以使用高分辨率扫描仪读取珠体的彩色编码，而在珠体表面上的标记的检测将需要更先进的设备，例如显微镜基图象分析系统。
通过检测器识别珠体表面上的标记的能力，确定该体系的检测限制。因而，如果每个分析物上引入更多的标记或引入的标记极大(在易于检测的意义上)，可以提高灵敏度。
在比较性测定中，使用与感兴趣的分析物相竞争的添加标记(例如荧光团)分析物。将对于天然分析物和标记分析物具有相等亲和力的亲合配体(抗体)固定在彩色编码珠体上，从而对于每组分析物，每组彩色编码珠体均具有特定的亲和力。
预期的测定可以使用珠状排列技术。在珠状排列格式中，颗粒可以(被动地)定点或定位在使用磁性的表面上的有限区域中。通过对珠体进行解码的两步法读取珠状排列的结果。通过适宜的软件记录每个珠体的位置及其彩色编码，且记录来自信号正(positive)珠体的信号并与其编码的特性关联起来。
可选择地，不需要使用标记的指示器且代替的分析物可以进一步以这种方式进行反应，在该方法中由生物素进行束缚或/生物素酰化分子束缚到珠体/分析物络合物。然后，其可以束缚到抗生蛋白链菌素涂覆载玻片上并通过显微镜检查法或激光扫描进行分析。
在微流体比较性多路复用免疫测定中，珠体既可以起到指示器的作用，又可以起到标记的作用。可以用相对于目标抗原的抗体对珠体进行涂覆。通过对每个感兴趣的抗体-抗原对使用一个彩色编码以获得多路复用。然后，可以在生物素酰化抗原存在下进行标准比较性测定。其可以在任何适宜的容器中进行，该容器例如管、腔(well)、或微流体装置。
培养后，使用磁性分离以清洗不含未结合抗原的珠体-抗原络合物。然后，将试样通过抗生蛋白链菌素涂覆表面。使用优选的流动或清洗条件，仅具有竞争性、生物素酰化抗原的珠体络合物被束缚。因而，含有高浓度目标抗原的试样将具有低相应彩色编码束缚的珠体或没有相应彩色编码束缚的珠体，同时，相对于低浓度目标，将有大数量的彩色编码束缚的珠体。
该微流体装置可以如显微镜载玻片上的定义范围那样简单，且可以由抗生蛋白链菌素的微阵列定位制得。可选择地，在该微流体装置中，更多络合物溶液进行结合混合、磁性分离和检测。
因而，从另一个方面看，本发明提供了本发明颗粒在测定中的应用，该应用包括下列步骤：
i)将含有第一荧光团和亲合配体的涂覆磁性颗粒加入到其中可存在目标分析物的试样中；
ii)如果存在所述分析物，让所述亲合配体与所述分析物相结合以形成络合物；
iii)将络合物与指示器相连以使所述指示器连接到所述分析物上，其中所述指示器任选地带有第二荧光团；
iv)将所述颗粒从所述试样中磁性分离；和
v)检测所述第一荧光团和如果存在的所述第二荧光团。
或含有下列步骤的测定：
i)将含有第一荧光团和亲合配体的涂覆磁性颗粒与试样相接触，其中可存在目标分析物且其中存在带有能够与用于亲合配体的所述目标分析物竞争的指示器的分析物；
ii)让所述亲合配体连结到所述分析物上，如果所述分析物存在，或所述分析物带有指示器；
iii)将所述颗粒从所述试样中磁性分离；和
iv)检测第一荧光团。
虽然在此已经描述了对于荧光团的测定，但当然可以使用其它与荧光团相连的标记。例如，可以使用不同大小的珠体或具有无线电标记的珠体。
通过参考下列实施例，将对本发明进行进一步描述。这些实施例仅用以说明，而并非限定本发明。
在实施例中，除非另有说明，百分数为重量百分数。
实施例1
种子胶乳
将18.0g聚苯乙烯胶乳与乳液聚合制备的0.5微米单尺度颗粒以及10.8g过氧化二辛酰和10.8g丙酮在108.6g0.6％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中的乳液在室温下共同进行搅拌。20小时后，将该反应混合物加入到93.3g甲基丙烯酸甲酯和93.3g苯乙烯在859.1g0.25％SDS溶液中的乳液中。在25W下搅拌2小时后，将803.4g0.05％KI水溶液充入反应器中并将温度升高到700C反应10小时。聚合后，获得含有1.9微米单尺度颗粒的8.6％干燥物质的种子胶乳。
实施例2
多孔环氧颗粒
将34.5g实施例1的颗粒与5.9g过氧化二辛酰和5.9g丙酮在59.1g0.5％SDS水溶液中的乳液进行混合。在室温下搅拌24小时后，将该反应混合物加入到51.8g甲基丙烯酸缩水甘油酯、51.8g二甲基丙烯酸乙二醇酯和103.6g醋酸丁酯在1013g0.1％羟丙基甲基纤维素水溶液中的乳液中。在室温下，将该悬浮体搅拌2小时并加入474.5g0.44％羟丙基甲基纤维素水溶液。将温度缓慢升高到70℃并对颗粒进行5小时的聚合。在以甲醇进行提纯后，获得直径7.5微米的单尺度颗粒。通过氮吸附，测定比表面积为19.2m2/g干燥物质。通过荧光显微法或流式细胞计无法观察到这些颗粒的自身荧光。
实施例3
由环氧颗粒制得的超顺磁性颗粒
将3.3gFeCl2x4H2O和7.9gFeCl3x6H2O溶解在53g水中并添加到5g实施例2的多孔环氧颗粒干燥物质在61g水中的分散体中。在加入62ml25％NH3水溶液之前，将该悬浮体冷却到50℃并搅拌几分钟。将温度升高到80℃反应2小时。冷却该悬浮体并以水通过若干循环的离心分离来净化该颗粒。提纯后，将该颗粒转移到甲醇中并通过荧光显微法进行分析。在常规磁性聚合物颗粒显示显著的自身荧光的条件下没有观测到自身荧光。测定铁含量为67mgFe/g干燥物质(DS)。该颗粒显示超顺磁性行为并被吸引到磁铁上。
实施例4
超顺磁性颗粒的涂覆
通过离心分离和再悬浮，将3g实施例3的磁性颗粒的干燥物质转移到15g二甘醇二甲醚中。搅拌该悬浮体并加入10g丁二醇二缩水甘油醚和5g缩水甘油。将温度升高到90℃反应20小时。以甲醇净化该颗粒。1080cm-1的FT-IR吸收证实出现来自环氧化物的醚涂层。通过荧光显微法分析该颗粒。没有观测到绿色或红色自身荧光。
可以类似地对实施例6、8和11的颗粒进行涂覆。
实施例5
具有磺基的多孔颗粒
将悬浮在100ml水中的10g实施例2的多孔环氧颗粒的干燥物质与12.6g亚硫酸钠和13.55g硫酸四丁基铵氢钠进行混合。将该混合物在80℃下搅拌20小时。以水进行提纯后，1035cm-1的FT-IR吸收证实引入了磺基。
实施例6
由具有磺基的颗粒制得的超顺磁性颗粒
将3.3gFeCl2x4H2O和7.9gFeCl3x6H2O溶解在53g水中并添加到5g实施例5的颗粒干燥物质在96g水中的分散体中。在加入62ml25％NH3水溶液之前，在5℃下冷却该悬浮体并搅拌几分钟。将温度升高到80℃反应2小时。冷却该悬浮体并以水通过若干循环的离心分离来净化该颗粒。提纯后，将该颗粒转移到甲醇中并通过荧光显微法进行分析。在常规磁性聚合物颗粒显示显著的自身荧光的条件下没有观测到自身荧光。该珠体被吸引到磁铁上并显示超顺磁性行为。测定铁含量为75.5mg/gDS且硫含量为0.28mmol/gDS。
实施例7
具有羧基的多孔颗粒
将28.8g实施例1的种子胶乳与6.4g过氧化二辛酰和10.6g丙酮在106.5g0.5％SDS水溶液中的乳液进行混合。在室温下搅拌24小时后，将该反应混合物加入到由20.7g甲基丙烯酸、83.0g二甲基丙烯酸乙二醇酯、103.7g醋酸丁酯、0.23gSDS和975g0.8％聚乙烯吡咯烷酮水溶液制得的乳液中。在室温下，将该悬浮体搅拌2小时并加入470g水。将温度缓慢升高到70℃并对颗粒进行5小时的聚合。在以甲醇进行提纯后，获得直径8.3微米的单尺度颗粒。通过氮吸附，测定比表面积为210m2/gDS。
实施例8
由羧基颗粒制得的超顺磁性颗粒
将2.2gFeCl2x4H2O和3.0gFeCl3x6H2O溶解在106g水中并添加到5g实施例7的颗粒干燥物质在44g水中的分散体中。在加入51ml25％NH3水溶液之前，将该悬浮体搅拌几分钟。将温度升高到80℃反应1小时。冷却该悬浮体并以水通过若干循环的离心分离来净化该颗粒。提纯后，将该颗粒转移到甲醇中并通过荧光显微法进行分析。在常规磁性聚合物颗粒显示显著的自身荧光的条件下没有观测到自身荧光。该颗粒被吸引到磁铁上并测定铁含量为42mg/gDS。
实施例9
多孔环氧颗粒
将32.0g实施例1的颗粒与6.8g过氧化二辛酰和11.3g丙酮在114.1g0.5％SDS水溶液中的乳液进行混合。在室温下搅拌24小时后，将该反应混合物加入到57.6g甲基丙烯酸缩水甘油酯、57.6g三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、115.2g醋酸丁酯、0.26gSDS和1085g1.1％聚乙烯吡咯烷酮水溶液的乳液中。在室温下，将该悬浮体搅拌2小时并加入521g水。将温度缓慢升高到70℃并对颗粒进行5小时的聚合。在以甲醇进行提纯后，获得直径7.5微米的单尺度颗粒。通过氮吸附，测定比表面积为64m2/gDS。通过荧光显微法无法观察到这些颗粒的自身荧光。
实施例10
多孔氨基颗粒
将78g实施例9的颗粒的干燥物质转移到甲醇中并与1550ml25％NH3水溶液进行混合。在以水对颗粒进行净化之前，将该悬浮体在60℃下搅拌一夜。通过茚三酮反应法，测定伯氨基的含量为0.8mmol/gDS。
实施例11
由氨基颗粒制得的超顺磁性颗粒
将3.9gFeCl2x4H2O和7.9gFeCl3x6H2O溶解在100g水中并添加到10g实施例10的颗粒干燥物质在60g水中的分散体中。在加入81ml25％NH3水溶液之前，将该悬浮体搅拌几分钟。将温度升高到80℃反应2小时。冷却该悬浮体并以水通过若干循环的离心分离来净化该颗粒。提纯后，将该颗粒转移到甲醇中并通过荧光显微法进行分析。在常规磁性聚合物颗粒显示显著的自身荧光的条件下没有观测到自身荧光。该颗粒被吸引到磁铁上并显示超顺磁性行为。测定铁含量为73mg/gDS。
实施例12
通过荧光显微法测定自身荧光
仪器和软件
以Olympus产的BX-61荧光显微镜来测定超顺磁性颗粒的自身荧光。该显微镜装配有ChromaTechnology产的100W水银灯和滤波器立方体(filtercube)。通过具有450nm+/-25nm激发带通-滤波器、480nm分束器和520nm发射带通滤波器的滤波器立方体来测定该自身荧光。所用物镜为Uplan-Apo40x。以F-视图数字式单色CCD相机(4096灰度级)来检测信号。在所有分析中，曝光时间均为600ms。
以SoftImagingSystems产的软件包，Analysis，来进行图像分析。将颗粒总体的平均灰度值(MGV)作为每个颗粒的平均强度的平均值来计算，获得调节颗粒面积差异的强度值。该结果作为颗粒平均灰度值而给出。为了获得不同类型颗粒自身荧光的可比较的值，必须减去背景的灰度值。因此，颗粒自身荧光值作为颗粒和背景之间平均灰度值的差值来进行计算。
试样制备
以1.5gg/LSDS水溶液和甘油体积比为1∶1的混合物稀释该颗粒试样。
将两条双面带(3MScotch136D)粘结到显微镜载玻片上，带间距离大约3mm。将显微镜盖玻片粘结到带顶部以在载玻片和盖玻片之间获得毛细管通道。通过毛细管力将该稀释的颗粒试样置于通道(cannel)中，且该颗粒可以在测定前进行沉降。
结果
研究了两种不同类型的具有苯乙烯/二乙烯基苯基体聚合物的未涂覆磁性聚合物颗粒和实施例3、6、8及11的未涂覆颗粒。其结果列于表1中。
在表2中，给出了涂覆磁性聚合物颗粒的结果。研究了三种不同类型的具有苯乙烯/二乙烯基苯基体聚合物的涂覆磁性聚合物颗粒和实施例4的涂覆颗粒。
颗粒自身荧光作为颗粒平均灰度值和背景平均灰度值之间差值(ΔMGV)而给出。
表1
表2
实施例13
超顺磁性颗粒的涂覆
将通过实施例11的方法获得的0.5克直径5.1μm的颗粒转移到9.5克二甘醇二甲醚中。加入4.6克缩水甘油。该悬浮体在75℃下震荡20小时。以二甘醇二甲醚和甲醇净化该颗粒。1080cm-1的FT-IR吸收证实出现来自环氧化物的醚涂层。通过荧光显微法分析该颗粒。
实施例14
超顺磁性颗粒的涂覆
将通过实施例11的方法获得的0.5克直径5.1μm的颗粒转移到9.5克甲苯中。加入3.6克丁二醇二缩水甘油醚和8.3乙基己基缩水甘油醚。该悬浮体在75℃下震荡20小时。以甲苯和甲醇净化该颗粒。1080cm-1的FT-IR吸收证实出现来自环氧化物的醚涂层。通过荧光显微法分析该颗粒。
实施例15
超顺磁性颗粒的涂覆
将通过实施例11的方法获得的0.5克直径5.1μm的颗粒转移到9.5克二甘醇二甲醚中。加入2.3克丁基缩水甘油醚和3.3克缩水甘油。该悬浮体在75℃下震荡20小时。以二甘醇二甲醚和甲醇净化该颗粒。1080cm-1的FT-IR吸收证实出现来自环氧化物的醚涂层。通过荧光显微法分析该颗粒。
实施例16
超顺磁性颗粒的涂覆
将通过实施例11的方法获得的0.5克直径5.1μm的颗粒转移到9.5克甲苯中。加入3.3g缩水甘油和3.6g丁二醇二缩水甘油醚。该悬浮体在75℃下震荡20小时。以甲苯和甲醇净化该颗粒。1080cm-1的FT-IR吸收证实出现来自环氧化物的醚涂层。通过荧光显微法分析该颗粒。
实施例17
氨基颗粒
将通过实施例16的方法获得的15克颗粒加入到135克二甘醇二甲醚和135克亚乙二氧基二乙胺的混合物中。将该分散体加热至60℃。4小时后，以甲醇和无水二甲基甲酰胺净化该颗粒。通过茚三酮反应法检测颗粒中的伯氨基。通过荧光显微法和流式细胞计分析该颗粒。
实施例18
通过荧光显微法测定自身荧光
仪器和软件
以Olympus产的BX-61荧光显微镜测定实施例13-17的超顺磁性颗粒的自身荧光。该显微镜装配有ChromaTechnology产的75W氙灯和滤波器立方体。通过三个不同的滤波器立方体测定自身荧光，其所用曝光时间如表3所示。所用物镜为Uplan-Apo20x。以F-视图数字式单色CCD相机(4096灰度级)检测信号。以SoftImagingSystems产的软件包，Analysis，进行图像分析。颗粒总体的平均灰度值(MGV)作为每个颗粒的平均强度的平均值来进行计算，获得调整颗粒面积差异的强度值。该结果作为颗粒平均灰度值而给出。为了获得不同类型颗粒自身荧光的可比较的值，必须减去背景的灰度值。因此，颗粒自身荧光值作为颗粒和背景之间平均灰度值的差值来进行计算。
表3
试样制备
在转移到显微镜载玻片的毛细管通道之前，以磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)稀释所有颗粒，如实施例12所述。
结果
研究了两种不同类型的具有苯乙烯/二乙烯基苯基体聚合物的涂覆磁性聚合物颗粒和实施例13、14、15、16及17的涂覆颗粒。在表4中给出的结果也与市购校准颗粒，检测空白，进行了比较。
该检测空白颗粒包括在由BangsLaboratories，Inc.获得的MESF校准组中。该颗粒为7.4微米压缩非-磁性聚合物颗粒，其可用作流式细胞计应用的非-荧光基准，该应用如Schwartz在US5,089,416中所述。
表4
试样 描述 ΔMGV滤波器立方体1 ΔMGV滤波器立方体2 ΔMGV滤波器立方体3
A 空白 -1 -1 -67
B PS/DVB 1087 1851 1269
C PS/DVB 833 829 426
D 实施例13 333 31 -72
E 实施例14 77 18 7
F 实施例15 11 14 -51
G 实施例16 1 67 -64
H 实施例17 53 35 -45
实施例19
通过流式细胞计测定自身荧光
仪器和软件
以BDbiosciences产的BDLSRII流式细胞计测定实施例17的超顺磁性颗粒自身荧光。该激发源为488nm固态激光器和633nm氦氖激光器。用于不同荧光检测器的激发和滤波器说明列于表5中。PMT检测器的电压都设定在600V。通过在正向散射(FSC)对侧向散射(SSC)的图中设定阀值来进行统计，其仅包括单个颗粒。对于每个试样，均设定该流式细胞计以100个/秒的近似速度来对10000个颗粒进行计数。测定每个试样的平均面积。对于面积检测，对于相同类型颗粒随着尺寸的减少，信号降低。(由于当颗粒通过物镜时，流量测量的强度是所检测强度剖面产生的整数。)
表5
BDLSRII流式细胞计的滤波器设定
试样制备
在进行分析前，以磷酸盐缓冲盐水(PBSpH7.4)稀释所有试样。调节该颗粒浓度以通过流式细胞计获得100个/秒的近似数量。
结果
研究了两种不同类型的具有苯乙烯/二乙烯基苯的涂覆磁性聚合物颗粒和实施例17的涂覆颗粒。在表6中给出的结果也与市购校准颗粒，检测空白，进行了比较。
该检测空白颗粒包括在由BangsLaboratories，Inc.获得的MESF校准组中。该颗粒为7.4微米压缩非-磁性聚合物颗粒，其可用作流式细胞计应用的非-荧光基准，该应用如Schwartz在US5,089,416中所述。
表6
强度：单线态的平均通道数
通过使用用于BangsLaboratoriesInc.产的异硫氰酸酯荧光素(FITC)、藻红素(PE)和PE-Cy5的MESF校准套件，可以将测定的自身荧光设为等效可溶荧光团分子(MESF)的值。MESF定义参见
http://nvl.nist.gov/pub/nistpubs/jres/107/1/j71schw.pdf。
当自身荧光与各自的校准曲线进行比较时，在表7中给出了MESF的估计值。
表7
实施例20
具有超顺磁性颗粒的Bodipy630/650与三级荧光强度的结合
将实施例17的方法获得的8μm颗粒在二甲基甲酰胺中的10％(重量/重量)分散体转移到A、B和C三个小瓶中。5.6mgBodipy630/650琥珀酰亚胺基酯(产自MolecularProbesInc.)与11.9mL二甲基甲酰胺相混合并加入到在这些瓶中的颗粒分散体中。在瓶A中，50g颗粒分散体与10.6mL有色溶液相混合，在瓶B中，30g颗粒分散体与0.6mL有色溶液相混合，且在瓶C中，30g颗粒分散体与0.06mL有色溶液相混合。将混合物在室温下震荡24小时，然后放在磁铁上。以甲醇、5％三乙胺的甲醇溶液和水净化该颗粒并在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)中进行稀释。通过荧光显微法和流式细胞计分析该颗粒。
通过荧光显微法进行测定
以Olympus产的BX-61荧光显微镜进行显微镜检查法测定，该荧光显微镜装配有ChromaTechnology产的75W氙灯和滤波器立方体。通过具有630(30)nm激发带通滤波器、650nm分束器、和665nm发射宽带滤波器的滤波器立方体测定荧光。所用物镜为Uplan-Apo20x。将相机曝光时间设定调节为连接到颗粒的染料的相应数量。
以磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)稀释所有颗粒并将其转移到显微镜载玻片的毛细管通道中，如实施例12所述。
与实施例12一样，对所得作为ΔMGV的荧光强度进行计算。所得变异系数(％CV)定义为颗粒平均灰度值(MGV)的标准偏差除以颗粒平均灰度值(MGV)乘以因数100。将该着色颗粒与相似的没有结合染料的颗粒(空白基准)相比较。
表8
显微镜检查法 曝光时间(ms) MGV颗粒 MGV背景 ΔMGV CV％
实施例20，A 50 2349 76 2273 10
实施例20，B 50 425 64 361 10
实施例20，C 100 153 64 89 8
空白 1000 85 96 -11 -
通过流式细胞计进行测定
以Becton-Dickinson产的BDLSRII流式细胞计进行流式细胞计测定。该仪器装配有633nm激光器作为激发源。为了进行检测，相对于用于BDLSRII流式细胞计的APC(Allophycoerithrin)滤波器设定，使用具有规格660(20)nm的发射带通滤波器。PMT检测器的电压设定为250V。通过在正向散射(FSC)对侧向散射(SSC)的图中设定阀值来进行统计，其仅包括单个颗粒。对于每个试样，均设定该流式细胞计以100个/秒的近似速度来对10000个颗粒进行计数。单个颗粒一般含有总数的90％。测定每个试样的平均面积和变异系数。变异系数(％CV)定义为单线态的标准偏差除以特定电压下的单线态的平均强度乘以因数100。
将该着色颗粒与相似的没有结合染料的颗粒(称为空白基准)相比较。在分析之前，以磷酸盐缓冲盐水(PBSpH7.4)稀释所有试样。调整颗粒浓度，以使通过流式细胞计为100个/秒的近似数量。该结果给出在表9中。
表9
流式细胞计 强度：平均通道数单线态PMT电压＝250v 强度分布CV％
实施例20，A 8848 16
实施例20，B 1536 16
实施例20，C 153 42
空白 0 -
实施例21
具有超顺磁性颗粒的Bodipy650/665与三级荧光强度的结合
将以实施例17的方法获得的5μm颗粒转移到二甲基甲酰胺中，得到10％重量/重量分散体。在A、B和C三个小瓶中分别加入1.5mL该分散体。将1.1mgBodipy650/665琥珀酰亚胺基酯(产自MolecularProbesInc.)与1.25mL二甲基甲酰胺进行混合。将该Bodipy溶液与颗粒分散体相混合，得到相对于每毫克的颗粒干燥物质(DS)，具有下列数量的染料：在A)中为1.0mg/gDS，在B)中为0.1mg/gDS且在C)中为0.01mg/gDS。将该分散体在室温下震荡一夜。以5％三乙胺的甲醇溶液和磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)净化该颗粒。
通过实施例20所述的荧光显微法和流式细胞计分析该颗粒。表10和表11中所给出的结果表明，对于这种类型的染料，也能够以大的强度差值对颗粒总体进行染色。
表10
显微镜检查法 曝光时间(ms) MGV颗粒 MGV背景 ΔMGV CV％
实施例21，A 10 511 64 447 8
实施例21，B 100 758 76 682 10
实施例21，C 1000 826 96 730 9
空白 50000 1113 1148 -35 -
表11
流式细胞计 强度：平均通道数单线态PMT电压＝250v 强度分布CV％
实施例21，A 1133 15
实施例21，B 192 15
实施例21，C 20 73
空白 0 -
实施例22
具有超顺磁性颗粒的DY-647与三级荧光强度的结合
将以实施例17的方法获得的5μm颗粒转移到二甲基甲酰胺中，得到10％重量/重量分散体。在A、B和C三个小瓶中分别加入1.5mL该分散体。将1.1mgDY-647琥珀酰亚胺基酯(产自DyomicsGmbH)与1.25mL二甲基甲酰胺进行混合。将该染料溶液与颗粒分散体相混合，得到相对于每毫克的颗粒干燥物质(DS)，具有下列数量的染料：在A)中为1.0mg/gDS，在B)中为0.1mg/gDS且在C)中为0.01mg/gDS。将该分散体在室温下震荡一夜。以5％三乙胺的甲醇溶液、水净化该颗粒，并稀释在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)中。
通过实施例20所述的荧光显微法和流式细胞计分析该颗粒。表12和表13中所给出的结果表明，对于这种类型的染料(DY-647)，也能够以大的强度差值对颗粒总体进行染色。
表12
显微镜检查法 曝光时间(ms) MGV颗粒 MGV背景 ΔMGV CV％
实施例22，A 10 1135 65 1070 15
实施例22，B 100 1180 81 1099 8
实施例22，C 1000 1298 98 1200 10
空白 50000 1113 1148 -35 -
表13
流式细胞计 强度：平均通道数单线态PMT电压＝250v 强度分布CV％
实施例22，A 2955 14
实施例22，B 356 9
实施例22，C 38 227
空白 0 -
实施例23
具有窄强度分布的荧光颗粒
将通过实施例17的方法获得的5μm颗粒转移到二甲基甲酰胺中。将15克10％(重量/重量)颗粒分散体与溶解在2mL二甲基甲酰胺中的1,2mgDY-647琥珀酰亚胺基酯相混合。2小时后，以甲醇和磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7，4)净化着色颗粒的小试样。在实施例20、21和22中所述的流式细胞计上，对该试样进行分析，只是使用了较慢的鞘(sheath)流体流动(低设定)。在表14中给出的结果显示，可以对该超顺磁性珠体进行染色以获得具有极窄强度分布的颗粒总体。
表14
流式细胞计 强度：平均通道数单线态PMT电压＝250v 强度分布CV％
A 2336 6
实施例24
涂覆前着色
着色方法
将通过实施例11的方法获得的颗粒转移到无水二甲基甲酰胺中。在四个不同的瓶子中，38克5％颗粒分散体与含有2mg染料的4mL二甲基甲酰胺进行混合。所用的四种荧光染料，AMCA-X、BodipyTMR、BodipyFL(产自MolecularProbesInc.)和DY-555(产自DyomicsGmbH)具有琥珀酰亚胺基酯官能团。在室温下搅拌20小时后，以5％三乙胺的甲醇溶液净化该颗粒几次并最终以甲醇净化。在进行显微镜检查法分析前，在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中稀释颗粒的小试样。
表15显示染色颗粒的荧光强度作为DMGV值，在适当的用于连接到颗粒的特定荧光团的滤波器中进行分析。
涂覆方法
将0.3克上述着色颗粒转移到二甘醇二甲醚中。调整该分散体中的颗粒含量为10％干燥物质(DS)。将2.1克1，4-丁二醇二缩水甘油醚和2.2克缩水甘油加到该颗粒悬浮体中。将该混合物在涡流中震荡并置于75℃的振荡器(LabMate)中反应20小时。以甲醇和磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)净化该颗粒两次。在显微镜检查法分析之前，以磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)稀释颗粒的小试样。
表15显示染色并涂覆颗粒的荧光强度作为DMGV值，在适当的用于连接到颗粒的特定荧光团的滤波器中进行分析。该结果显示，当着色后完成该涂覆步骤时，香豆素-染料、AMCA-X(产自MolecularProbesInc.)可以是比一系列其它染料更好的替换物。
表15
染料 ΔMGV(染色颗粒) ΔMGV(染色并涂覆颗粒) 激发滤波器nm 发射滤波器nm 曝光时间
AMCA-X 470 614 360(40) 420LP 10
BodipyTMR 1137 66 550(30) 620(60) 10
BodipyFL 1710 174 450(50) 520LP 10
DY-555 2492 40 550(30) 620(60) 20
通过显微镜检查法，将以AMCA-X染色并涂覆的颗粒与没有染料的等效颗粒，空白基准，进行比较，通过不同的滤波器进行检测。如表16所示，AMCA-染料对适于指示器信号的滤波器的检测没有干扰。
表16
激发滤波器(nm) 360(40) 450(50) 550(30) 630(30)
发射滤波器(nm) 420LP 520LP 620(60) 665LP
曝光时间 10ms 500ms 5000ms 50000ms
颗粒类型 ΔMGV ΔMGV ΔMGV ΔMGV
空白基准 0 90 51 -186
以AMCA染色并涂覆 584 108 17 -110

Claims (5)

1.超顺磁性晶体在多孔磁性聚合物颗粒中用于形成涂层的用途，其中所述涂层由包括至少一种环氧化物的涂料单体形成。
2.权利要求1的用途，其中该环氧化物选自：表氯醇、表溴醇、异丙基缩水甘油醚、丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-二(2，3-环氧丙氧基)丁烷)、新戊二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩甘油醚、缩水甘油、和甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙基己基缩水甘油醚、甲基缩水甘油醚、甘油丙氧基三缩水甘油醚、聚(丙二醇)二缩水甘油醚、1，3丁二醇二缩水甘油醚、叔-丁基缩水甘油醚、1，4环己烷二甲醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、十二烷基缩水甘油醚、O-(2，3环氧丙基)-O′-甲基聚乙二醇缩水甘油醚、缩水甘油基四氟乙醚、1，6己二醇二缩水甘油醚、辛基缩水甘油醚、癸基缩水甘油醚、聚(表氯醇-共-环氧乙烷-共-烯丙基缩水甘油醚)、聚乙二醇二缩水甘油醚、三羟甲基乙烷三缩水甘油醚、三羟甲基丙烷、三缩水甘油醚、叔-丁基二甲基甲硅烷基缩水甘油醚、1，2-环氧丁烷、1，2-环氧戊烷、1，2-环氧-5-己烯、1，2-环氧-己烷、1，2-环氧-7-辛烯、1，2-环氧辛烷、1，2，7，8-二环氧辛烷、1，2-环氧-9-癸烯、1，2-环氧癸烷、1，2-环氧十二烷、和1，2-环氧十四烷。
3.权利要求1的用途，其中该涂料单体包括至少两种环氧化物。
4.权利要求3的用途，其中该环氧化物选自表氯醇、表溴醇、异丙基缩水甘油醚、丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-二(2，3-环氧丙氧基)丁烷)、乙基己基缩水甘油醚、甲基缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、缩水甘油、和甲基丙烯酸缩水甘油酯。
5.一种含有基体聚合物的任选多孔磁性聚合物颗粒的涂覆磁性颗粒，所述聚合物颗粒在其孔隙中具有超顺磁性晶体，所述涂覆颗粒具有由涂层聚合物形成的涂层，其中所述超顺磁性晶体通过所述涂层密封，该涂层可通过权利要求1-4中任一项限定的至少一种环氧化物单体或至少两种环氧化物单体的聚合得到。
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0228914D0 (en) 2002-12-11 2003-01-15 Dynal Biotech Asa Particles
EP1693387B1 (en) * 2003-07-17 2012-06-20 Invitrogen Dynal AS Process for preparing coated magnetic particles
AU2004264038B2 (en) * 2003-07-17 2010-09-23 Life Technologies As Process for preparing coated magnetic particles
US20060188905A1 (en) 2005-01-17 2006-08-24 Dynal Biotech Asa Process
GB0500888D0 (en) * 2005-01-17 2005-02-23 Dynal Biotech Asa Process
DE102005052957A1 (de) * 2005-11-03 2007-05-10 Scholz, Dieter Verfahren zur selektiven partikelgebundenen Anreicherung von Biomolekülen oder Biopartikeln
JP4534998B2 (ja) * 2006-02-21 2010-09-01 セイコーエプソン株式会社 帯電粒子の製造方法、帯電粒子、電気泳動分散液、電気泳動シート、電気泳動装置および電子機器
EP2230264B1 (en) * 2006-06-29 2019-10-09 Life Technologies AS Particles containing multi-block polymers
JP4840580B2 (ja) 2006-07-26 2011-12-21 Ｊｓｒ株式会社 磁性粒子およびその製造方法、ならびにプローブ結合粒子
JP2011503244A (ja) * 2006-12-21 2011-01-27 インヴィトロジェン ダイナル エーエス 核酸の単離方法またはリン酸化タンパク質の単離方法における粒子およびその使用
KR101178170B1 (ko) 2006-12-28 2012-08-29 주식회사 엘지화학 표면에 작용기를 포함하는 고분자 입자의 제조방법
US8026071B2 (en) 2007-03-12 2011-09-27 Fabrico Technology, Inc. Systems and methods for detecting target analytes
US20090130448A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-21 Arnold Magnetic Technologies Flexible magnets having a printable surface and methods of production
WO2010029739A1 (ja) * 2008-09-11 2010-03-18 国立大学法人東京工業大学 蛍光分子を含有するポリマー粒子およびその製造方法
EP2339339A4 (en) 2008-09-25 2016-10-12 Jsr Corp CHARGE FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY
GB0819720D0 (en) * 2008-10-28 2008-12-03 Univ Birmingham Methods and products
GB0907372D0 (en) * 2009-04-29 2009-06-10 Invitrogen Dynal As Particles
JP5346261B2 (ja) * 2009-09-11 2013-11-20 積水化学工業株式会社 金属複合有機樹脂粒子、金属複合有機樹脂粒子の製造方法
JP5453027B2 (ja) * 2009-09-18 2014-03-26 積水化学工業株式会社 金属複合有機樹脂粒子、金属複合有機樹脂粒子の製造方法
WO2011100358A2 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Fabrico Technology, Inc. Systems and methods for detecting target analytes
KR102019297B1 (ko) 2012-02-09 2019-09-06 라이프 테크놀로지스 코포레이션 친수성 중합체성 입자 및 그의 제조 방법
WO2013119894A1 (en) 2012-02-09 2013-08-15 Life Technologies Corporation Hydrophobic diacrylamide compound
KR102078892B1 (ko) 2012-02-09 2020-02-19 라이프 테크놀로지스 코포레이션 접합된 중합체성 입자 및 그의 제조 방법
CN102751067B (zh) * 2012-07-03 2015-10-28 中国科学院化学研究所 多功能磁性纳米复合体及其制备方法与应用
CN102838982B (zh) * 2012-07-04 2014-12-24 中国科学院过程工程研究所 一种具有广谱和持久自发荧光的聚合物微球及其制备方法
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
GB201315327D0 (en) * 2013-08-28 2013-10-09 Anmat Technology Ltd Apparatus for detecting an analyte using a fluid having magnetic particles with a binding ligand for binding the analyte
CN105792925B (zh) * 2013-09-09 2018-03-09 微球实验公司 磁性颗粒的制造
WO2015095533A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-25 Massachusetts Institute Of Technology Polymer matrices for controlling crystallization
TW201641938A (zh) * 2015-05-29 2016-12-01 美佳胜肽科技股份有限公司 醫療用磁導微球
WO2017004556A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Life Technologies Corporation Polymer substrates formed from carboxy functional acrylamide
WO2017004559A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Life Technologies Corporation Conjugation of carboxyl functional hydrophilic beads
CN108350490B (zh) 2015-07-06 2022-06-21 生命技术公司 用于测序的底物和方法
GB201512725D0 (en) * 2015-07-20 2015-08-26 Life Technologies As Polymeric particles
JP6880571B2 (ja) * 2016-05-20 2021-06-02 Jnc株式会社 磁性粒子を用いた水溶液中の微生物の回収方法および回収装置
DE102016121483B4 (de) 2016-11-09 2020-06-18 Axagarius Gmbh & Co. Kg Partikelförmiges Feststoff-Kompositmaterial zur Nukleinsäureaufreinigung, enthaltend magnetische Nanopartikel , Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
WO2018185672A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Magbiosense Inc. Bio-assay capture surfaces with bleached autofluorescence
WO2021185682A1 (en) 2020-03-17 2021-09-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Method of improving cell recovery in single-cell analysis
CN111551713A (zh) * 2020-05-15 2020-08-18 中国科学院过程工程研究所 一种covid-19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒
US20230340578A1 (en) 2020-07-08 2023-10-26 Roche Sequencing Solutions, Inc. Spatial analysis of multiple targets in tissue samples
US20220063386A1 (en) * 2020-08-26 2022-03-03 Antonio Rodolfo Aguilar Automobile cover system
CN112111216A (zh) * 2020-10-28 2020-12-22 杭州瑞思新材料有限公司 一种环保型水性漆及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1174510A (zh) * 1994-09-27 1998-02-25 尼科梅德成像有限公司 造影剂

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO155316C (no) 1982-04-23 1987-03-11 Sintef Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler.
JPH0665989B2 (ja) * 1984-12-03 1994-08-24 オリンパス光学工業株式会社 免疫学的分析方法
US5089416A (en) 1984-12-24 1992-02-18 Caribbean Microparticles Corporation Method of use of non-fluorescent particles to determine fluorescence threshold of a flow cytometer relative to the autofluorescence of samples
US5597531A (en) * 1985-10-04 1997-01-28 Immunivest Corporation Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions
US6013531A (en) * 1987-10-26 2000-01-11 Dade International Inc. Method to use fluorescent magnetic polymer particles as markers in an immunoassay
JP2736467B2 (ja) * 1987-10-26 1998-04-02 デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド 磁気応答ポリマー粒子の製造法およびその応用
US5091206A (en) * 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
US5395688A (en) * 1987-10-26 1995-03-07 Baxter Diagnostics Inc. Magnetically responsive fluorescent polymer particles
US4873102A (en) * 1988-03-14 1989-10-10 Manchium Chang Magnetic particles
US5736349A (en) * 1989-09-29 1998-04-07 Nippon Paint Co., Ltd. Magnetic particle and immunoassay using the same
WO1991009141A1 (en) 1989-12-14 1991-06-27 Baxter Diagnostics Inc. Magnetically responsive fluorescent polymer particles and application thereof
US5543054A (en) * 1993-11-24 1996-08-06 Millipore Corporation Method and apparatus for covalent immobilization of charge- conjugated carbohydrate molecules
AU2541695A (en) * 1994-05-15 1995-12-05 Pharmacia Biotech Ab A method of manufacturing particles, and particles that can be produced in accordance with the method
DE19528029B4 (de) * 1995-07-31 2008-01-10 Chemagen Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft Magnetische Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol, Verfahren für ihre Herstellung und Verwendung
GB9523759D0 (en) 1995-11-21 1996-01-24 Pollitt Alexander J World wide web information retrieval system
FR2749082B1 (fr) * 1996-05-24 1998-06-26 Bio Merieux Particules superparamagnetiques et monodispersees
US5786514A (en) * 1996-12-18 1998-07-28 Arco Chemical Technology, L.P. Process for alkoxylating carbonyl-functionalized phenols using double metal cyanide catalysts
US6233047B1 (en) * 1997-01-02 2001-05-15 Lj Laboratories, L.L.C. Apparatus and method for measuring optical characteristics of an object
WO1999019000A1 (en) * 1997-10-11 1999-04-22 The Research Foundation Of State University Of New York Controlled size polymeric microspheres with superparamagnetic cores
CA2260991C (en) * 1997-11-18 2009-03-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplex flow immunoassays with magnetic particles as solid phase
US6714641B2 (en) * 1998-04-03 2004-03-30 Nortel Networks, Ltd Web based personal directory
US6456699B1 (en) * 1998-11-30 2002-09-24 At&T Corp. Web-based generation of telephony-based interactive voice response applications
US6742021B1 (en) 1999-01-05 2004-05-25 Sri International, Inc. Navigating network-based electronic information using spoken input with multimodal error feedback
EP1177231B1 (en) 1999-04-09 2009-08-19 Invitrogen Dynal AS Process for the preparation of monodisperse polymer particles
US20010032081A1 (en) 1999-12-20 2001-10-18 Audiopoint, Inc. System for on-demand delivery of user-specific audio content
US20020006124A1 (en) 2000-01-07 2002-01-17 Ray Jimenez Methods and apparatus for an audio web retrieval telephone system
US6654722B1 (en) 2000-06-19 2003-11-25 International Business Machines Corporation Voice over IP protocol based speech system
US7286521B1 (en) 2000-07-21 2007-10-23 Tellme Networks, Inc. Localized voice over internet protocol communication
US6451547B1 (en) * 2001-04-25 2002-09-17 Syn X Pharma Process for differential diagnosis of Alzheimer's dementia and device therefor
US8697029B2 (en) * 2002-04-18 2014-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Modulated physical and chemical sensors
GB0228914D0 (en) * 2002-12-11 2003-01-15 Dynal Biotech Asa Particles

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1174510A (zh) * 1994-09-27 1998-02-25 尼科梅德成像有限公司 造影剂

Also Published As

Publication number Publication date
GB0228914D0 (en) 2003-01-15
ATE519111T1 (de) 2011-08-15
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US20100087327A1 (en) 2010-04-08
AU2003288454A1 (en) 2004-06-30
EP1573325A1 (en) 2005-09-14
US8697453B2 (en) 2014-04-15
CN1732386A (zh) 2006-02-08
US20140179025A1 (en) 2014-06-26
US9187691B2 (en) 2015-11-17
CA2507625A1 (en) 2004-06-24
EP2051075B1 (en) 2011-08-03

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