CN100523815C - 内含磁性体的粒子及其制造方法、免疫测定用粒子以及免疫测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种内含磁性体的粒子，由有机高分子物质和平均粒径为1～30nm的磁性体形成，所述磁性体以分散的状态被包含于粒子内部。由此，本发明可提供具有均匀的磁性、分散稳定性出色且粒径分布狭窄的内含磁性体的粒子及其制造方法、使用该粒子的免疫测定用粒子、以及使用这些内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子的免疫测定方法。

Description

内含磁性体的粒子及其制造方法、免疫测定用粒子以及免疫测定方法

技术领域

本发明涉及具有均匀的磁性、分散稳定性出色且粒径分布狭窄的内含磁性体的粒子及其制造方法、使用该粒子所形成的免疫测定用粒子、以及使用这些内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子的免疫测定方法。

背景技术

以往，作为含有磁性体的高分子粒子的制作方法，已知有(1)使已制作完的高分子粒子中含铁离子而制作磁性体的方法、(2)在由单体经聚合制作高分子粒子的过程中使之含已制作完的磁性体粒子的方法(参照特开平9—208788号公报)、(3)使分别制作的高分子粒子和磁性体粒子复合化的方法(参照特开平6—231957号公报)。另外，除此之外，还有用高分子等覆盖磁性体粒子的方法(参照特开平6—92640号公报)。

在(1)的方法中，因为使高分子粒子吸收铁离子，所以存在磁性体露在表面上而被氧化的问题。另外，在(2)的方法中，存在磁性体粒子无法被均匀地导入到高分子粒子中的问题，还有因粒径很难控制而成为粒径分布广的物质的问题。另外，在(3)的方法中，因为高分子粒子发生凝聚而无法用于粒径小的粒子。另外，在(4)的方法中，因为无法均匀覆盖，所以有时浮游性或分散性差，而且磁性体粒子表面的一部分会暴露在外。

另一方面，作为微量免疫测定方法，一直以来，已知有放射免疫测定方法、酶免疫测定方法、荧光免疫测定方法等，这些已经被实用化。这些方法中使用分别将同位素、酶、荧光物质等作为标识而附加的抗原或抗体，检测出有无与其发生特异反应的抗体或抗原。当采用这样的免疫测定方法时，内含磁性体的粒子被用于有效且简便地进行B/F分离。另外，还公开了B/F分离以外的使用(参照特开2000—88852号公报)、或将内含磁性体的粒子自身作为标识材料的免疫测定方法(参照特开平6—148189号公报、特开平7—225233号公报、特表2001—524675号公报)。

在将内含磁性体的粒子自身作为标识材料的免疫测定方法中，其测定精度取决于内含磁性体的粒子的均质性即每个粒子的磁性体含量的均匀性。但是，市售的内含磁性体的粒子在磁性体含量方面有偏差，在以往公知的内含磁性体的粒子的制造方法中，难以控制磁性体含量的均匀性。

当将内含磁性体的粒子用于免疫测定方法时，在使抗原或抗体结合的工序或者与被检测物质进行的工序中，有时作为将内含磁性体的粒子分散于缓冲液中的分散液进行处理。为此，要求内含磁性体的粒子具有在分散液的状态下粒子不会自然沉降的高分散稳定性。但是，市售的内含磁性体的粒子如果在分散液的状态下放置一段时间，则过一会儿其中的一部分就会发生沉降，因此存在处理性差的问题。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供具有均匀的磁性、分散稳定性出色且粒径分布狭窄的内含磁性体的粒子及其制造方法，使用其的免疫测定用粒子，以及使用这些内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子的免疫测定方法。

本发明提供一种内含磁性体的粒子，是由有机高分子物质和平均粒径为1～30nm的磁性体构成的内含磁性体的粒子，其特征在于，上述磁性体以分散的状态被包含于粒子内部。

在本发明的内含磁性体的粒子中，构成有机高分子物质的碳元素和构成磁性体的金属元素的构成比率的绝对偏差优选为0.3以下。

在本发明的内含磁性体的粒子中，磁性体优选为在形成内含磁性体的粒子的聚合过程中，在粒子内部氧化金属离子而形成的磁性体。另外，上述金属离子优选为铁离子。

在本发明的内含磁性体的粒子中，上述有机高分子物质优选将由丙烯酸系单体构成的聚合物作为主构成成分，上述丙烯酸系单体优选为具有缩水甘油基的单体。

另外，上述有机高分子物质也优选将由具有缩水甘油基的单体和苯乙烯系单体构成的聚合物作为主构成成分。此时，上述有机高分子物质中的源自苯乙烯系单体的单体单元的比率优选为5～90重量％。

进而，上述有机高分子物质也优选作为聚合物的单体成分具有用下述通式(1)表示的聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或用下述通式(2)表示的化合物。特别优选在具有缩水甘油基的单体、或者具有缩水甘油基的单体和苯乙烯系单体中作为聚合成分而添加。

CH₂＝CR—COO—(CH₂—CH₂—O)_n—H       (1)

式中，R表示H或CH₃，n表示1～20的整数。

式中，X表示H或SO₃ ^-NH₄ ⁺，n表示3～30的整数。

在本发明的内含磁性体的粒子中，上述有机高分子物质优选已被交联。

本发明的内含磁性体的粒子，优选在粒子表面上具有从羧基、羟基、环氧基、氨基、三乙基铵基、二甲基氨基和磺酸基中选择的至少一种官能团。

本发明的内含磁性体的粒子的平均粒径优选为0.05～1μm。

在本发明的内含磁性体的粒子中，磁性体的含量优选为0.1～50重量％。

本发明的内含磁性体的粒子中含有的磁性体的平均粒径优选为1～10nm。

本发明的内含磁性体的粒子优选在其粒子表面上结合有具有可以与抗原或抗体形成共价键的官能团的连接物质(linker)。上述官能团优选为环氧基，上述连接物质优选为聚乙二醇二缩水甘油醚。

本发明的内含磁性体的粒子可以通过下述的方法而制造，即，所述的方法由在水系溶剂中使不具有亲水基的单体和/或具有亲水基的单体发生聚合而形成粒子的工序、在上述粒子中引入金属离子的同时氧化上述金属离子而形成磁性体的工序构成，且同时进行上述形成粒子的工序和上述形成磁性体的工序。

上述不具有亲水基的单体，优选为具有缩水甘油基的丙烯酸系单体、或者、具有缩水甘油基的丙烯酸系单体以及苯乙烯系单体。另外，也优选使不具有亲水基的单体和具有亲水基的单体进行聚合而形成粒子，具有亲水基的单体优选为用下述通式(1)表示的聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或用下述通式(2)表示的化合物。

CH₂＝CR—COO—(CH₂—CH₂—O)_n—H        (1)

式中，R表示H或CH₃，n表示1～20的整数。

式中，X表示H或SO₃ ^-NH₄ ⁺，n表示3～30的整数。

另外，在形成上述粒子的工序中，可以添加反应性乳化剂作为共聚单体。另外，优选后添加聚合引发剂。

在本发明的内含磁性体的粒子上吸附或结合抗原或抗体而成的免疫测定用粒子也是本发明之一。

另外，使用本发明的内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子的免疫测定方法也是本发明之一。

进而，将本发明的内含磁性体的粒子用作标识的免疫测定方法也是本发明之一。

附图说明

图1是在实施例2中得到的内含磁性体的粒子(平均粒径；内含磁性体的粒子0.21μm、磁性体5nm)的TEM照片。

具体实施方式

下面，详细说明本发明。

本发明的内含磁性体的粒子是由有机高分子物质和平均粒径为1～30nm的磁性体构成的。

上述有机高分子物质，是以如下聚合物为主构成成分的物质，所述聚合物由用于形成粒子的核的不具有亲水基的单体、和用于形成在水中稳定分散的粒子且形成粒子的壳的具有亲水基的单体构成。

<不具有亲水基的单体>

作为上述不具有亲水基的单体，例如可以举出苯乙烯、α—甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、氯甲基苯乙烯等苯乙烯系单体；氯乙烯；醋酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯基酯类；丙烯腈等不饱和腈类；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2—乙基己酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、(甲基)丙烯酸乙二醇酯、(甲基)丙烯酸三氟乙酯、(甲基)丙烯酸五氟丙酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸四氢糠基酯等丙烯酸系单体等。这些不具有亲水基的单体可以单独使用，还可以并用2种以上。

作为上述不具有亲水基的单体，优选使用(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2—乙基己酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、(甲基)丙烯酸乙二醇酯、(甲基)丙烯酸三氟乙酯、(甲基)丙烯酸五氟丙酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸四氢糠基酯等丙烯酸系单体。

作为上述不具有亲水基的单体，为了同时进行由聚合完成的粒子的形成和磁性体的形成，更优选使用在粒子的聚合中具有出色的以高浓度引入金属离子的能力的具有缩水基的丙烯酸系单体。在上述的丙烯酸系单体中，特别优选的是甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，因为其与铁离子及磁铁矿(magnetite)的亲合性高。

另外，并用上述的具有缩水甘油基的丙烯酸系单体和苯乙烯系单体也是优选的。

当作为上述不具有亲水基的单体而并用具有缩水甘油基的丙烯酸系单体和苯乙烯系单体的情况下，上述有机高分子物质中的源自苯乙烯系单体的单体单元的比率优选为5～90重量％。当不到5重量％时，得到的粒子在水中的分散稳定性变低，在聚合中容易自凝聚，另外，当超过90重量％时，和作为磁性体的前体的金属离子的亲和性变低，在粒子内形成的磁性体减少。

当并用上述具有缩水甘油基的丙烯酸系单体和苯乙烯系单体时，也可以再并用甲基丙烯酸甲酯。

另外，可以根据用途使用交联性单体作为上述不具有亲水基的单体，上述有机高分子物质可以是已被交联的物质。

作为上述交联性单体，例如可以举出二乙烯基苯、二乙烯基联苯、二乙烯基萘、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6—己二醇二(甲基)丙烯酸酯、新戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基丙烷四(甲基)丙烯酸酯、邻苯二甲酸二烯丙基酯及其异构体、三聚异氰酸三烯丙基酯及其衍生物等。这些交联性单体可以单独使用，还可以并用2种以上。

在这些交联性单体当中，因为乙二醇二(甲基)丙烯酸酯与铁离子以及磁铁矿的亲和性较高，所以适合使用。

<具有亲水基的单体>

作为上述具有亲水基的单体，例如可以举出丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、富马酸、马来酸等具有聚合性不饱和键的羧酸；具有聚合性不饱和键的磷酸酯；具有聚合性不饱和键的磺酸酯；二甲基氨基乙基甲基丙烯酸季盐、二乙基氨基乙基甲基丙烯酸季盐等具有丙烯酰基的胺的盐或乙烯基吡啶等具有乙烯基的含氮化合物的盐之类的具有阳离子基的乙烯基系单体；甲基丙烯酸2—羟乙酯、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、羟甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甘油酯(GLM)等非离子性乙烯基系单体等通常被称为亲水性单体的物质，除此之外还可以举出具有亲水基的反应性乳化剂等。这些具有亲水基的单体可以单独使用，还可以并用2种以上。

作为上述具有亲水基的反应性乳化剂，例如可以举出用下述通式(2)～(9)表示的反应性乳化剂类。

在上述具有亲水基的单体当中，用下述通式(1)表示的聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或用上述通式(2)表示的反应性乳化剂，因为在水中稳定分散离子的能力较高且不妨碍生成磁性体，所以适合使用。

CH₂＝CR—COO—(CH₂—CH₂—O)_n—H         (1)

式中，R表示H或CH₃，n表示1～20的整数。

在上述通式(2)中，n表示3～30的整数，优选表示5～20的整数。

本发明的内含磁性体的粒子优选磁性体含量的偏差较小。作为对内含磁性体的粒子的磁性体含量的偏差进行评价的方法，可以举出使用SEM—DEX的方法、利用同步发光分析的方法等。

上述SEM—EDX是对进行SEM观察的微小区域实施EDX分析(定性分析、定量分析、绘图、粒子分析等)的装置，可以测定磁性体含量的偏差。

作为上述利用同步发光分析的测定装置，例如市售有粒子分析器(particle analyzer)(DP—1000，堀场制作所制)。粒子分析器中，对通过吸气器抽样的固体微粒照射氦微波诱导等离子体的高激发能量，计测每个固体微粒的同步发光，由此可以进行固体微粒的广泛的用途元素的分析、以及各种成分的混杂状态。

内含磁性体的粒子的磁性体含量的偏差，可以利用表示分散状态的所测定数据的偏差值(绝对偏差)进行比较，所述偏差值是先测定构成有机高分子物质的碳元素和构成磁性体的金属元素的同步发光之后，从每个粒子的碳元素和金属元素的混杂比率的偏差计算出来的。上述偏差值的数值越小，磁性体含量的偏差越小，即内含磁性体的粒子的均匀性越高；数值越大，磁性体含量的偏差越大，即内含磁性体的粒子的均匀性越低。

本发明的内含磁性体的粒子，优选构成有机高分子物质的碳元素和构成磁性体的金属元素的构成比率的绝对偏差为0.3以下。当超过0.3时，在用于免疫测定方法的情况下，测定再现性或定量性降低，测定精度恶化，得到的测定数据的可靠性降低。更优选0.27以下，进一步优选0.25以下，进一步优选0.20以下。

上述磁性体优选为在形成内含磁性体的粒子的聚合过程中在粒子内部氧化金属离子而形成的物质。

<金属离子>

上述金属离子只要形成磁性体的离子就没有特别限制，优选铁离子、钴离子、镍离子等，更优选铁离子。作为磁性体的磁铁矿是用氧化剂等氧化氯化亚铁而得到的。通过在用聚合引发剂引发上述单体的聚合的同时进行2价铁离子的氧化(磁铁矿化)，可以调制内含磁性体(磁铁矿)的粒子。

上述磁性体的平均粒径为1～30nm。当不到1nm时，磁性体的磁性响应特性减少，即内含磁性体的粒子的磁性响应特性减少，用于免疫测定时的测定灵敏度降低。另外，当超过30nm时，粒子内的分散性降低。优选为2～20nm，更优选为2～10nm。

在本发明的内含磁性体的粒子中，上述磁性体以分散的状态被包含于内含磁性体的粒子内部。即在本发明的内含磁性体的粒子中，磁性体不露在粒子表面，而是以分散于粒子内部的状态存在。

本发明的内含磁性体的粒子的磁性体含量优选在0.1～50重量％的范围内进行调整。当不到0.1重量％时，内含磁性体的粒子的磁性响应特性减少，用于免疫测定时的测定灵敏度降低。另外，当超过50重量％时，粒子的聚合操作性降低，在粒子聚合中难以引入金属离子。更优选为0.1～40重量％，更优选为1～30重量％。

另外，本发明的内含磁性体的粒子根据需要可以在粒子表面具有羧基、羟基、环氧基、氨基、三乙基铵基、二甲基氨基、磺酸基等官能团。通过这些官能团可以与抗原或抗体形成共价键。

可以通过预先将各种具有官能团的单体配合到聚合用单体混合物中、或在聚合过程中添加所述单体的方式将上述官能团导入到内含磁性体的粒子的表面。作为具有上述官能团的单体，例如作为具有羧基的单体可以举出(甲基)丙烯酸等；作为具有羟基的单体可以举出(甲基)丙烯酸2—羟乙酯等；作为具有环氧基的单体可以举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等，作为具有三乙基铵基的单体可以举出三乙基铵(甲基)丙烯酸酯等，作为具有二甲基氨基的单体可以举出二甲基氨基(甲基)丙烯酸酯等。

本发明的内含磁性体的粒子中，根据需要可以在粒子表面上与具有能与抗原或抗体形成共价键的官能团的连接物质相结合。

<连接物质>

上述连接物质是指，在将内含磁性体的粒子用于免疫测定时，存在于由有机高分子物质构成的粒子与抗原、抗体等化合物之间的化学物质。上述连接物质优选为具有不会引起空间阻碍的长度且不易产生非特异性吸附的化合物，在由有机高分子物质构成的粒子和抗原、抗体等化合物结合之前，在其分子末端例如优选具有氨基、羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、硫醇基等可以与抗原或抗体形成共价键的官能团。作为本发明中的连接物质，只要是能以适当的距离使粒子表面的源自含缩水甘油基单体的环氧基、或通过环氧基的开环生成的羟基、氨基等和抗原、抗体等相结合的物质，就没有特别限制。优选的是在末端具有多个环氧基的化合物、例如聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚等。更优选聚乙二醇二缩水甘油醚。

通过将这样的连接物质导入到内含磁性体的粒子的粒子表面，例如可以提高在内含磁性体的粒子上结合的抗原、抗体、试剂等的反应性，即可以以良好的灵敏度进行精密测定，另外，即使是内含磁性体的粒子的粒子表面相对蛋白质具有非吸附性的物质，因为连接物质具有与蛋白质的结合性，所以可以确实可靠地使抗原或抗体结合在内含磁性体的粒子上。

本发明的内含磁性体的粒子的平均粒径，优选利用其聚合条件在0.05～1μm的范围内进行调整。当不到0.05μm时，容易凝聚，分散稳定性降低；当超过1μm时，例如当在悬浮液中使用内含磁性体的粒子时，内含磁性体的粒子变得容易沉淀，另外当像免疫色谱法那样在多孔性载体中使用内含磁性体的粒子时，内含磁性体的粒子在多孔性载体中难以移动，作为试剂的处理性降低。更优选0.06～0.8μm，进一步优选0.07～0.5μm。

本发明的内含磁性体的粒子可以通过下述的方法制造，所述方法由在水系溶剂中使上述不具有亲水基的单体和/或上述具有亲水基的单体发生聚合而形成粒子的工序、在上述粒子中引入金属离子的同时氧化上述金属离子而形成磁性体的工序构成，且同时进行上述形成粒子的工序和上述形成磁性体的工序。

在水系溶剂中使上述不具有亲水基的单体和/或上述具有亲水基的单体发生聚合而形成粒子的工序中，可以使用聚合引发剂。

<聚合引发剂>

对上述聚合引发剂没有特别限制，例如可以举出水溶性的有机偶氮化合物、无机过氧化物、有机过氧化物等。

作为上述聚合引发剂的合适的例子，可以举出过硫酸钾(以下记为“KPS”；聚合温度为70℃)、偶氮双脒基丙烷盐酸盐(聚合温度为70℃)、2，2—偶氮双[2—(2—咪唑啉—2—基)丙烷]二氢氯化物(聚合温度为60℃)、过硫酸铵(聚合温度为70℃)等。其中，作为过氧化物系聚合引发剂的KPS或过硫酸铵，有望在引发聚合的同时贡献于2价铁离子的氧化，在使用KPS或过硫酸铵的情况下，有可能同时进行基于单体和铁离子的聚合和磁铁矿的生成。就偶氮双脒基丙烷盐酸盐以及2，2—偶氮双[2—(2—咪唑啉—2—基)丙烷]二氢氯化物而言，其氧化力弱，可成为与2价铁离子的缓慢氧化反应有关的聚合引发剂。其中，作为偶氮双脒基丙烷盐酸盐，市售的有商品名为“V—50”(和光纯药工业公司制)的产品，作为2，2—偶氮双[2—(2—咪唑啉—2—基)丙烷]二氢氯化物，市售的有商品名为“VA—044”(和光纯药工业公司制)的产品。

上述聚合引发剂有时会被Fe²⁺的氧化反应而被消耗掉，或者因Fe³⁺的作用失去自由基活性，所以为了促进粒子生长，在粒子生长过程中将其后添加是有效的。此时，不能形成新的二次粒子，而是粒子表面被聚合物覆盖。

<pH调节剂>

在本发明中，为了在聚合的同时制作磁性体，优选将聚合体系内的pH调整成碱性。作为上述聚合引发剂使用KPS或过硫酸铵的体系具有所谓可以得到在水中的分散稳定性好且粒径分布窄的单分散粒子的优点，但因为无法控制氧化力而会使聚合体系内成为酸性，所以存在会成为向磁铁的靠拢性弱的粒子的缺陷。另一方面，使用不具有氧化力的2，2—偶氮双[2—(2—咪唑啉—2—基)丙烷]二氢氯化物作为上述聚合引发剂的体系具有聚合体系内的pH大致为中性的优点。

为了将聚合体系内的pH保持为弱碱性，可以使用一般的碱。优选使用NH₄OH作为pH调节剂。

上述pH调节剂根据需要可以添加多次。

<聚合方法>

本发明的内含磁性体的粒子可以通过悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合、无乳化剂乳液聚合等粒子聚合方法而制造，但最终得到的内含磁性体的粒子的Cv值优选为5％以下，所以适合通过对粒径分布的控制出色的无乳化剂乳液聚合进行制造。

下面说明利用无乳化剂乳液聚合的内含磁性体的粒子的制作方法，但并不限于该方法。

具有代表性的聚合组成由：

由具有亲水基的单体和不具有亲水基的单体构成的单体组合物：3gH₂O：100g

构成。在四口烧瓶中称量上述单体组合物和水。在各口上安装搅拌棒、回流冷凝管。接着，将体系放入恒温槽内，边搅拌边对体系内进行氮气置换。优选将恒温槽的温度调整至所添加的聚合引发剂的聚合温度，例如当使用KPS、偶氮双脒基丙烷盐酸盐或过硫酸铵作为聚合引发剂时，优选为70℃，当使用2，2—偶氮双[2—(2—咪唑啉—2—基)丙烷]二氢氯化物作为上述聚合引发剂时，优选为50～60℃。随后，通过注射筒将已溶解于水的聚合引发剂注入到体系内。将该时点作为聚合开始的时间，在过规定时间之后使用注射筒注入作为磁性源的FeCl₂·4H₂O的水溶液。作为FeCl₂·4H₂O使用将聚合引发剂的1/3～4倍摩尔溶解于水5g中的物质。即，在利用聚合引发剂引发上述的单体的聚合的同时，进行2价的铁离子的氧化(磁铁矿化)，由此制造微粒。

聚合优选开始后进行2小时～24小时。为了得到适度的氧化力，可以在聚合过程中添加NH₄OH，进而为了促进基于聚合的粒子的生长，可以在聚合过程中添加聚合引发剂。如此，可以得到由以分散状态含有磁性体的有机高分子物质构成的粒子。

可以在上述单体组合物中添加反应性乳化剂作为共聚单体。

<反应性乳化剂>

作为上述反应性乳化剂，例如可以举出用下述通式(2)～(10)表示的反应性乳化剂类。

这些反应性乳化剂可以单独使用，还可以并用2种以上。为了除去残留单体、聚合引发剂、未反应的铁离子等，可使用蒸馏水反复进行离心分离、再分散而对已制作的粒子进行精制。在进行离心分离之后，通过倾析去掉上清液，之后添加蒸馏水，利用玻璃棒进行再分散。在精制之后，将得到的内含磁性体的粒子移到玻璃制管瓶(vial)中，用盖子、石蜡薄膜(paraffin film)进行密闭、保存。

将连接物质向本发明的内含磁性体的粒子的粒子表面导入时，例如可在碱性水溶液中分散未导入连接物质的内含磁性体的粒子之后，接着添加聚乙二醇二缩水甘油醚等作为连接物质的化学物质，混合24小时左右而完成。

由此得到的本发明的内含磁性体的粒子，其粒度分布窄且磁性体含量的偏差小，所以具有极好的均质性。因此，本发明的内含磁性体的粒子的分散稳定性高且处理性出色。另外，本发明的内含磁性体的粒子，其平均粒径比较小，所以胶体稳定性好。另外，本发明的内含磁性体的粒子，其内含的磁性体是以微小的尺寸分散而含有，所以即使被磁化也没有磁性残留，也不会产生由起引于此的自凝聚导致的沉降。

通过在本发明的内含磁性体的粒子上吸附或结合抗原或抗体，可以得到免疫测定用粒子。作为在内含磁性体的粒子上吸附或结合抗原或抗体的方法，可以使用物理吸附法或采用了碳二亚胺的化学结合法等公知的方法。当在本发明的内含磁性体的粒子的粒子表面导入有具有环氧基的连接物质时，可通过介助连接物质与抗原或抗体的氨基或硫醇基等形成化学键，制作免疫测定用粒子。这种在本发明的内含磁性体的粒子上结合抗原或抗体而成的免疫测定用粒子也是本发明之一。

本发明的内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子可以用于免疫测定方法。使用本发明的内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子的免疫测定方法也是本发明之一。

作为本发明的免疫测定方法，可以举出使用了内含磁性体的粒子作为载体的放射免疫测定方法、酶免疫测定方法等公知的方法，通过夹层法或竞争法，可以测定目标抗原或抗体。另外，可以使用内含磁性体的粒子作标识来代替作为上述方法的标识物质的同位素、酶等。本发明的内含磁性体的粒子是均匀分散含有磁性体的粒径分布窄的粒子，所以通过在免疫测定方法中用作标识，可以高灵敏度地进行精密测定。

作为使用本发明的内含磁性体的粒子作为标识的免疫测定方法的具体例子，可以举出以往使用荧光物质、着色粒子、金属胶体等作为标识的免疫测定方法。其中，适合的是近年来作为简便且迅速地检测出被检测物质的方法而经常使用的免疫色谱法。上述免疫色谱法中使用至少利用了2种抗体的夹层法。在上述夹层法中，一种抗体在液相中以可以移动的状态下被标记，另一种抗体被永久地固定在层析载体上。当在上述夹层法的试剂中添加试样时，首先被标记的抗体和被检测物质发生反应，然后标识抗体和被检测物质的复合体在层析载体中移动，当来到抗体被固定在层析载体上的固定化部时，在此处被已被固定化的抗体所捕捉。通常，用于免疫色谱法的层析载体的孔径大小为5～20μm，现在，一般的夹层法中使用金属胶体或着色粒子作为标识，并将固定化部的着色(标识物的捕捉状态)当作进行目视观察的定性检查。

但是，被市售的内含磁性体的粒子中存在滞留在层析载体中或不均匀地残留于展开的一侧的层析顶端部位附近等问题，与金属胶体或着色粒子相比，层析展开性的差距较大，所以相对免疫色谱法不具有适合性。

与此相对，本发明的内含磁性体的粒子为与孔径大小相比充分小的粒径，所以可以通过毛细管现象在载体中展开(移动)。即，当本发明的内含磁性体的粒子在平均孔径大小(10～12μm)的层析载体中展开时，没有如上所述的不均匀的滞留，层析展开性非常出色。这可能是因为本发明的内含磁性体的粒子，1)粒度分布窄，2)磁性体含量均匀，3)不产生基于残留磁性的自凝聚。即，本发明的内含磁性体的粒子不同于以往的内含磁性体的粒子，相对免疫色谱法具有适合性。

实施例

下面，举出实施例进一步详细说明本发明，但本发明不仅限于这些实施例。

(实施例1～7)

在200mL的四口烧瓶中称量表1所示的各种单体和水90g。在各口上安装搅拌封口和搅拌棒、回流冷凝管、CERAM橡胶。将体系放入到70℃的恒温槽中，一边在200rpm下进行搅拌，一边对体系内部进行氮气置换30分钟。随后，将已溶于水的作为聚合引发剂的KPS0.06g溶解于10g的水中，用注射筒注入到体系内。将该时点作为开始聚合的时刻，为了得到适度的氧化力，在聚合过程中添加NH₄OH水溶液(将NH₄OH0.165g溶解于水5g中)。另外，自开始聚合2分钟后使用注射筒注入FeCl₂·4H₂O水溶液(将FeCl₂·4H₂O 0.165g溶解于水5g中)。聚合时间自聚合开始时起计为20小时。

将制作的粒子通过用蒸馏水反复4次进行离心分离、再分散而精制。此时，离心分离是在20℃、13500rpm下进行。在进行离心分离之后，通过倾析去掉上清液，添加蒸馏水，用玻璃棒进行再分散，得到内含磁性体的粒子。

表1(单位：克)

 

实施例	GMA	EGDM	AAm	PE—90	PE—350	NE—20	SE—20	FeCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
									1	2.835	0.015	0.15	—	—	—	—	0.088
2	2.835	0.015	—	0.15	—	—	—	0.176
									3	2.685	0.015	—	0.3	—	—	—	0.176
4	2.835	0.015	—	—	0.15	—	—	0.176
									5	2.685	0.015	—	—	0.3	—	—	0.176
6	2.835	0.015	0.05	—	—	0.15	—	0.088
									7	2.835	0.015	0.15	—	—	—	0.06	0.176

表中记载的内容如下所示：

GMA：甲基丙烯酸缩水甘油酯

EGDM：乙二醇二甲基丙烯酸酯

AAm：丙烯酰胺

PE—90：聚乙二醇甲基丙烯酸酯(n＝2)

PE—350：聚乙二醇甲基丙烯酸酯(n＝8)

NE—20：

式中，X表示H。

SE—20：

式中，X表示SO₄NH₄。

对得到的内含磁性体的粒子分散液，通过目视观察了粒子的分散状态。另外，用水稀释已精制的内含磁性体的粒子，沉积固定在用金属网支撑的胶棉膜上，通过透过型电子显微镜(TEM)观察粒子的形态。

在实施例1中得到的内含磁性体的粒子，观察到了有部分凝聚块，随着时间的推移，内含磁性体的粒子会发生沉降，分散稳定性稍低，所以通过超声波处理进行了再分散。另一方面，使用聚乙二醇甲基丙烯酸酯作为具有亲水基的单体的实施例2～5、以及使用了反应性乳化剂的实施例6、7，都没有出现凝聚块，得到了分散稳定性高的内含磁性体的粒子。特别是在使用了反应性乳化剂的实施例6、7中得到的内含磁性体的粒子，其粒子尺寸小且分散稳定性出色。另外，在实施例1～7中得到的内含磁性体的粒子，都是以分散状态在内含磁性体的粒子内部含有磁性体，观察到粒子表面具有清晰的轮廓。在图1中表示了实施例2的内含磁性体的粒子的TEM照片(平均粒径：内含磁性体的粒子0.21μm、磁性体5nm)。另外，实施例1～7中的内含磁性体的粒子的磁性体的平均粒径如表2所示。

表2

 

实施例	平均粒径(nm)
		1	5
2	5
		3	6
4	6
		5	8
6	3
		7	5

进而，为了确认在实施例1～7中制作的内含磁性体的粒子向磁铁的靠拢性，在1.5mL的微管中取少量内含磁性体的粒子的分散液，用蒸馏水适当进行稀释，在带磁铁的微管架(DYNAL公司制，MPC(注册商标)—M)上立起管，通过目视确认了分散的内含磁性体的粒子被磁铁所吸引。特别是使用聚乙二醇甲基丙烯酸酯作为具有亲水基的单体的实施例2～5，与其他实施例1、6、7相比，磁力较大。

(实施例8)

在200mL的四口烧瓶中称量下述的各种单体和水。GMA/EGDM/AAm/H₂O＝2.835/0.015/0.15/90(单位：g)

在各口上安装搅拌封口和搅拌棒、回流冷凝管、CERAM橡胶(CERAMrubber)。将体系放入到70℃的恒温槽中，一边在200rpm下进行搅拌，一边在体系内进行氮气置换30分钟。随后，将已溶于水的作为聚合引发剂的KPS0.06g溶解于10g的水中，用注射筒注入到体系内。将该时点作为开始聚合的时刻，为了在聚合开始1分钟后得到适度的氧化力，添加NH₄OH水溶液(将NH₄OH 0.165g溶解于水5g中)。另外，自开始聚合2分钟后使用注射筒注入FeCl₂·4H₂O水溶液(将FeCl₂·4H₂O 0.165g溶解于水5g中)。聚合时间自聚合开始时起计为2小时。

对制作的粒子通过用蒸馏水反复4次进行离心分离、再分散而精制。此时，离心分离是在20℃、13500rpm下进行。在进行离心分离之后，通过倾析去掉上清液，添加蒸馏水，用玻璃棒进行再分散，得到内含磁性体的粒子。

(实施例9)

在聚合开始后，将下述物质的添加时间变更为以下的规定时间，将聚合时间设为自开始聚合后3个小时，除此之外，与实施例8相同地得到内含磁性体的粒子。

NH₄OH水溶液(将NH₄OH 0.165g溶解于水5g中)：聚合开始30分钟后

KPS(将KPS 0.165g溶解于水5g中)：聚合开始60分钟后

(实施例10)

在聚合开始后，将下述物质的添加变更成以下的规定时间，再后添加GMA，将聚合时间设为自开始聚合后3个小时，除此之外，与实施例8相同地得到内含磁性体的粒子。

KPS(将KPS0.165g溶解于水5g中)：聚合开始60分钟后

FeCl₂·4H₂O水溶液(将FeCl₂·4H₂O 0.165g溶解于水5g中)：聚合开始60分钟后

GMA 0.5g：聚合开始120分钟后(另外，在聚合开始前与实施例8相同地在四口烧瓶中添加了GMA 2.835g)

NH₄OH水溶液(将NH₄OH 0.165g溶解于水5g中)：聚合开始120分钟后

(实施例11)

在聚合开始后，将下述物质的添加变更成以下的规定时间，将聚合时间设为自开始聚合后4个小时，除此之外，与实施例8相同地得到内含磁性体的粒子。

聚合开始1分钟之后NH₄OH/H₂O＝0.165/5(g)

NH₄OH水溶液(将NH₄OH 0.165g溶解于水5g中)：聚合开始1分钟后

KPS(将KPS 0.165g溶解于水5g中)：聚合开始120分钟后

对于在实施例8～11中得到的内含磁性体的粒子，与实施例1相同地进行利用TEM的内含磁性体的粒子的形态观察。

实施例9、10都含有比实施例8更多的磁性体，粒径增大。另外，在实施例11中，观察到在内部含有与实施例9、10同等程度的磁性体，粒子表面是清晰的轮廓。

通过迄今为止的实验，可以推测在粒子生长较快的阶段添加NH₄OH是阻碍生长的主要原因。另一方面，聚合引发剂的后添加使聚合率几乎成为100％，另外，能观察到未形成2次粒子而粒子表面被聚合物覆盖，是有效的方法。实施例8～11中的内含磁性体的粒子的磁性体的平均粒径如表3所示。

表3

 

实施例	平均粒径(nm)
		8	8
9	8
		10	10
11	8

(实施例12)

将在实施例2中得到的内含磁性体的粒子1.0g投入到10％的氨水50mL中，在70℃下搅拌20小时。接着，使用离子交换水进行离心清洗3次，在50mL的离子交换水中分散。接着，添加并混合乙二醇二缩水甘油醚30g，使用氢氧化钠水溶液将pH调整至11，然后在室温下搅拌24小时。反应后，使用离子交换水进行离心清洗3次，得到结合有具有环氧基的连接物质的内含磁性体的粒子。

(实施例13)

在200mL的四口烧瓶中称量苯乙烯3.0g、甲基丙烯酸缩水甘油酯3.0g、乙二醇二甲基丙烯酸酯0.03g、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯0.3g以及水200g。在各口上安装搅拌封口和搅拌棒、回流冷凝管、CERAM橡胶。将体系放入到70℃的恒温槽中，一边在200rpm下进行搅拌，一边在体系内进行氮气置换30分钟。随后，将已溶于水的作为聚合引发剂的KPS 0.1g溶解于20g的水中，用注射筒注入到体系内。将该时点作为开始聚合的时刻，2分钟后使用注射筒注入FeCl₂·4H₂O水溶液(将FeCl₂·4H₂O 0.2g溶解于水20mL中)。为了得到适度的氧化力，在聚合过程中添加NH₄OH 0.4g。聚合时间自聚合开始时起计为20小时。

将制作的粒子通过用蒸馏水反复4次进行离心分离、再分散而精制。此时，离心分离是在20℃、13500rpm下进行。在进行离心分离之后，通过倾析去掉上清液，添加蒸馏水，用玻璃棒进行再分散，得到内含磁性体的粒子。

(实施例14)

除了变更成苯乙烯2.0g、甲基丙烯酸缩水甘油酯4.0g之外，与实施例13相同地制作内含磁性体的粒子。

(实施例15)

除了变更成苯乙烯4.0g、甲基丙烯酸缩水甘油酯1.0g之外，与实施例13相同地制作内含磁性体的粒子。

(实施例16)

将在实施例13中得到的内含磁性体的粒子1.0g投入到10％的氨水50mL中，在70℃下搅拌20小时。接着，使用离子交换水进行离心清洗3次，在50mL的离子交换水中分散。接着，添加并混合乙二醇二缩水甘油醚30g，使用氢氧化钠水溶液将pH调整至11，然后在室温下搅拌24小时。反应后，使用离子交换水进行离心清洗3次，得到结合有具有环氧基的连接物质的内含磁性体的粒子。

(实施例17和18)

在200mL的四口烧瓶中称量表4所示的各种单体和水800g。在各口上安装搅拌封口和搅拌棒、回流冷凝管、CERAM橡胶。将体系放入到70℃的恒温槽中，一边在200rpm下进行搅拌，一边在体系内进行氮气置换30分钟。随后，将已溶于水的作为聚合引发剂的过硫酸铵0.2g溶解于10g的水中，用注射筒注入到体系内。将该时点作为开始聚合的时刻，为了得到适度的氧化力，在聚合过程中添加NH₄OH水溶液(将NH₄OH 0.5g溶解于水10g中)。另外，自开始聚合2分钟后使用注射筒注入FeSO₄·7H₂O水溶液(将FeSO₄·7H₂O 1.3g溶解于水20g中)。聚合时间自聚合开始时起计为20小时。

将制作的粒子通过用蒸馏水反复4次进行离心分离、再分散而精制。此时，离心分离是在20℃、13500rpm下进行。在进行离心分离之后，通过倾析去掉上清液，添加蒸馏水，用玻璃棒进行再分散，得到内含磁性体的粒子。

表4(单位：克)

 

实施例	GMA	EGDM	St	MMA	HS—10
						17	25.6	1.2	2.0	—	0.8
18	22.7	1.2	2.0	2.0	0.8

表中的记载如下所示：

GMA：甲基丙烯酸缩水甘油酯

EGDM：乙二醇二甲基丙烯酸酯

St：苯乙烯

MMA：甲基丙烯酸甲酯

HS—10：

式中，X表示SO₃ ^-NH₄ ⁺，n表示10。

(实施例19)

将在实施例17中得到的内含磁性体的粒子1.0g投入到10％的氨水50mL中，在70℃下搅拌20小时。接着，使用离子交换水进行离心清洗3次，在50mL的离子交换水中分散。接着，添加并混合乙二醇二缩水甘油醚30g，使用氢氧化钠水溶液将pH调整至11，然后在室温下搅拌24小时。反应后，使用离子交换水进行离心清洗3次，得到结合有具有环氧基的连接物质的内含磁性体的粒子。

(实施例20)

利用在实施例2中得到的内含磁性体的粒子制作免疫测定用粒子。

向在实施例2中得到的内含磁性体的粒子30mg中添加磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)6mL，在15000rpm下进行20分钟的离心分离。在得到的沉渣中添加将抗HBsAg单克隆抗体溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中的浓度为0.25mg/mL的溶液1mL，在室温下搅拌混合20小时。随后，为了除去未反应的抗HBsAg单克隆抗体，在15000rpm下进行20分钟的离心分离，进而使得到的沉渣悬浮于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)6mL中，再次在15000rpm下进行20分钟的离心分离。随后，使得到的沉渣悬浮于将牛血清白蛋白溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)的浓度为1重量％的溶液6mL中，在室温下搅拌1小时进行封端(blocking)处理，得到将HBsAg单克隆抗体结合到内含磁性体的粒子上的免疫测定用粒子。

接着，对得到的免疫测定用粒子进行冷藏保存，在15000rpm下进行20分钟的离心分离，将得到的沉渣溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中并使牛血清白蛋白的浓度为1重量％，进而使其悬浮于溶解有浓度为0.01重量％的叠氮化钠的溶液6mL中，立刻进行冷藏保存。

(实施例21、22和23)

从在实施例12、16和19中得到的结合有连接物质的内含磁性体的粒子制作免疫测定用粒子。

向在实施例12、16和19中制作的结合有连接物质的内含磁性体的粒子12mg中添加0.1M硼酸缓冲液1rmL，在15000rpm下进行10分钟的离心分离，除去上清液。向得到的沉渣中添加0.1M硼酸缓冲液380μL、抗α—hCG单克隆抗体溶液(5.0mg/mL)20μL并充分混合，在室温下搅拌20小时。对反应液在15000rpm下进行10分钟的离心分离，除去未反应的抗α—hCG单克隆抗体。其中，通过测量上清液的蛋白浓度确认出，抗α—hCG单克隆抗体向内含磁性体的粒子的结合量为投入量的55％。使得到的沉渣悬浮于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)1mL中，再次进行离心分离。随后，使该沉渣悬浮于将牛血清白蛋白溶解于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)的浓度为5％(w/v)的溶液900μL中，在37℃下搅拌1小时进行封端处理。然后在15000rpm下进行20分钟的离心分离，向沉渣中添加0.1M硼酸缓冲液1mL，用超声波进行分散。接着，使其悬浮于在100mM磷酸缓冲液(pH7.5)中溶解牛血清白蛋白和甘油且其浓度分别达到5％(w/v)之后再溶解了浓度为0.01％(w/v)的叠氮化钠的溶液1mL中，得到免疫测定用粒子。

(比较例1～3)

作为比较例，使用了エスタポ—ルM1—030/40(メルク公司制)的3套(lot)。

(比较例4)

利用比较例1的内含磁性体的粒子制作免疫测定用粒子。

向比较例1的内含磁性体的粒子12.5mg中添加pH9.5的氢氧化钾水溶液1mL，在15000rpm下进行10分钟的离心分离，然后除去上清液，并除去在分散液中添加的表面活性剂。接着，在得到的沉渣中添加0.02M磷酸缓冲液625μL和预先调整的浓度为2％的碳二亚胺溶液(PBS缓冲液)0.625mL，在37℃的恒温槽中搅拌1.5小时。对反应溶液在15000rpm下进行10分钟的离心分离，在除去上清液之后，添加0.02M磷酸缓冲液1.2mL，用超声波进行了再分散。重复3次上述的离心清洗操作，去除未反应的碳二亚胺。接着，向得到的沉渣中添加0.1M硼酸缓冲液1.2mL，，并添加抗α—hCG单克隆抗体200μg，在37℃的恒温槽中搅拌一晚。次日，向反应溶液中添加30mM甘氨酸溶液(硼酸缓冲液)50μL，在37℃恒温槽中搅拌30分钟。然后，在15000rpm下进行10分钟的离心分离，除去未反应的抗α—hCG单克隆抗体。其中，通过测量上清液的蛋白浓度确认出，抗α—hCG单克隆抗体向内含磁性体的粒子的结合量为投入量的63％。使得到的沉渣悬浮在100mM磷酸缓冲液(pH6.5)1mL，再次进行离心分离。使得到的沉渣悬浮在将牛血清白蛋白的浓度调整为1％(w/v)的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)1mL中，在37℃恒温槽中搅拌30分钟，进行封端处理。然后，在15000rpm下进行10分钟的离心分离，并将其沉渣分散在把牛血清白蛋白和甘油的浓度分别调整至5％(w/v)、将叠氮化钠的浓度调整至0.01％(w/v)的100mM磷酸缓冲液(pH7.5)1mL中，得到免疫测定用粒子。

<评价>

(1)分散稳定性的评价

使用在实施例13～18中得到的内含磁性体的粒子和比较例1～3的内含磁性体的粒子，调制固体成分为1％的分散液，在用超声波分散之后，静置并目视观察粒子沉降的产生。当使用比较例1～3的内含磁性体的粒子时，在分散后马上就有部分沉降。另外，在静置后的次日，在样品瓶的底面形成了沉降层，可知其分散稳定性差。另一方面，在实施例13～18的内含磁性体的粒子中，即使在静置的次日仍没有沉降物，分散稳定性出色。

(2)粒子形状的评价

用水稀释在实施例13～18中得到的内含磁性体的粒子和比较例1～3的内含磁性体的粒子，在用金属网支撑的胶棉膜上沉积固定，并用透过型电子显微镜(TEM)观察粒子的形态。

用TEM观察的内含磁性体的粒子和磁性体的平均粒径如表5所示。

表5

由表5可知，在实施例13、14、15和16中得到的内含磁性体的粒子，都是粒径均匀的球形粒子，且观察到内含有磁性体。另一方面，在比较例1～3中，都是粒径为100～1000μm的内含磁性体的粒子混合存在，粒径不均匀。另外，在比较例1～3中，均确认出磁性体暴露在内含磁性体的粒子表面上。

进而，为了确认制作的内含磁性体的粒子(实施例13、14、15和16)会被磁铁所吸引，在1.5mL的微管中取少量内含磁性体的粒子的分散液，用蒸馏水进行适当稀释后，在带磁铁的微管架(DYNAL公司制，MPC(注册商标)—M)上立起管，通过视觉确认分散的内含磁性体的粒子被磁铁所吸引。

(3)磁性体含量的偏差的评价

使用粒子分析器(DP—1000，堀场制作所制)，对实施例15～18和比较例1～3的内含磁性体的粒子测定了构成有机高分子物质的碳元素和构成磁性体的铁元素的同步发光，计算出该测定数据的偏差值。结果显示于表6。

表6

当比较实施例和比较例的内含磁性体的粒子的偏差值时，可知实施例15～18的内含磁性体的粒子的偏差值小，磁性体含量的偏差小。另一方面，比较例1～3的内含磁性体的粒子，其偏差值大，磁性体含量的偏差大。

(4)层析展开性的评价1

(4)—1层析展开性(chromatogram developing)的确认

将实施例21、22和比较例4的免疫测定用粒子分散在将牛血清白蛋白的浓度调整至1％(w/v)且将氚核—100浓度调整至0.03％(w/v)的生理盐水中，使将固体成分浓度达到0.045％(w/v)。将各分散液30μL滴在孔径大小为10～12μm的硝酸纤维素膜片(SRHF P70，日本ミリポア公司制)，使分散液展开成圆形状。已展开的分散液均为直径约18mm的圆形。随后，使其干燥，计测通过内含磁性体的粒子的展开而着色的圆形的直径。结果在使用了实施例18的免疫测定用粒子的情况下为16mm，在使用了实施例19的免疫测定用粒子的情况下为17mm，在使用了比较例4的免疫测定用粒子的情况下为12mm。

在实施例21、22中，免疫测定用粒子的展开域是介质的展开域的约92％，由此可知已与展开介质一同顺利地在层析载体中展开。另一方面，在比较例4中，上述展开域约为70％，所以与实施例21、22相比，展开性较差。另外，在比较例4中，可知点滴中心部附近的着色较浓，为不均匀的展开。

(4)—2试验片的制作

将硝酸纤维素膜片(SRHF P70，日本ミリポア公司制)裁成宽20cm×长6cm的尺寸，在距离其长度方向上端3cm的部位(反应部位)上，涂布将抗β—hCG单克隆抗体溶解于Tris盐酸缓冲液(10mmol/L，pH7.4)以使其浓度达到2.0mg/ml的溶液，此时涂布成宽0.7mm的直线状。随后，在37℃下干燥2小时，然后在将牛血清白蛋白(和光纯药工业公司制)溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)并使其浓度达到1重量％的溶液中浸渍1小时，进行封端处理。进而，随后，在将月桂基苯磺酸钠溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)并使其浓度达到0.1重量％的溶液中进行清洗，然后在硅胶式干燥器内在室温下进行干燥，得到将抗β—hCG单克隆抗体固定化的试验片。

将得到的试验片裁成5mm宽，在长度方向上端重叠宽5mm×长20mm的吸水衬垫(AP22，日本ミリポア公司制)，在下端重叠宽5mm×长15mm的共轭(conjugate)衬垫(グラスフアイバ—，日本ミリポア公司制)，用透明带固定而作成试验片。

(4)—3免疫测定的实施

将实施例21～23和比较例4的免疫测定用粒子，分散在将牛血清白蛋白的浓度调整至1％(w/v)、将氚核—100的浓度调整至0.03％(w/v)且将hCG的浓度调整至0mIU/mL、25mIU/mL、100mIU/mL、1000mIU/mL和5000mIU/mL的试验液生理盐水中，以将免疫测定用粒子的浓度调整至0.05％(w/v)。

接着，在制作的试验片的共轭衬垫上分别滴下hCG为规定浓度的试验液100μL。

在滴下10分钟之后，当使用实施例21～23的免疫测定用粒子时，除了hCG为0mIU/mL的试验片，其它在反应部位都出现了基于免疫测定用粒子的着色。另外，确认出其着色程度依赖于hCG浓度。另外，确认出在反应部位具有与hCG浓度相对应的磁性，表示可应用于将磁性作为标识的免疫测定方法中。

另—方面，当使用比较例4的免疫测定用粒子时，在所有试验片上，在反应部位以及直到反应部位的部位均出现了基于免疫测定用粒子的着色。特别是重叠了共轭衬垫的部位附近的着色强，可确认免疫测定用粒子有滞留，当hCG为1000mIU/mL时，该部位的着色比反应部位还强。当使用比较例4的免疫测定用粒子时，1)在试验片上滞留有免疫测定用粒子，2)按照被检测物质浓度而展开的免疫测定用粒子量发生变动，3)即使不存在被检测物质(hCG：0mIU/mL)也能在反应部位非特异地捕捉免疫测定用粒子，所以表示无法应用于将磁性作为标识的免疫测定方法。

(5)层析展开性的评价2

(5)—1试验片的制作

将硝酸纤维素膜片(SRHF P70，日本ミリポア公司制)裁成宽30cm×长6cm的尺寸，在距离其长度方向上端3cm的部位(反应部位)上，涂布将抗HBsAg单克隆抗体溶解于Tris盐酸缓冲液(10mmol/L，pH7.4)并使其浓度达到2.0mg/ml的溶液，所述抗体具有不同于在实施例20的免疫测定用粒子中使用的物质的反应表位(epitope)，并涂布成宽0.7mm的直线状。随后，在37℃下干燥2小时，然后在将牛血清白蛋白(和光纯药工业公司制)溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)并使其浓度为1重量％而成的溶液中浸渍1小时，进行封端处理。进而，随后，在将月桂基苯磺酸钠溶解于磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)并使其浓度为0.1重量％而成的溶液中进行清洗，然后在硅胶式干燥器内在室温下进行干燥，得到抗HBsAg单克隆抗体固定化膜。

将得到的抗HBsAg单克隆抗体固定化膜裁成宽5mm，在长度方向上端重叠宽5mm×长2cm的吸水用滤纸(日本ミリポア公司制)，用透明带固定而成为试验片。

(5)—2免疫测定的实施

制作在磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中溶解实施例20的免疫测定用粒子并使其浓度为0.1重量％、进而溶解牛血清白蛋白并使其浓度为0.01重量％、进而溶解叠氮化钠并使其浓度为0.01重量％的溶液，将该溶液20μL添加到96坑(well)微型板(ナルジエヌンクインタ—ナシヨナル公司制)的各坑中。

接着，用磷酸缓冲液(100mmol/L，pH7.5)稀释HBs抗原标准品

(50IU/mL)并使其成为规定的浓度。向坑内分别添加100μL并混合之后，将试验片放入到坑内，使之站立。

30分钟后，取出试验片，结果在反应部位出现了与HBs抗原浓度相对应的磁性，表示实施例20的免疫测定用粒子可用于将磁性作为标识的免疫测定方法。

工业上的可利用性

在本发明中，通过同时进行使不具有亲水基的单体和具有亲水基的单体发生共聚而形成粒子的反应、和边将金属离子引入到粒子内边使金属离子改性而形成磁性体的反应，可以得到具有均匀的磁性且粒径分布窄的内含磁性体的粒子。通过在本发明的内含磁性体的粒子上吸附或结合抗原或抗体，可以得到本发明的免疫测定用粒子。另外，通过使用本发明的内含磁性体的粒子或免疫测定用粒子进行免疫测定方法，可以进行灵敏度好的精密测定。进而，通过将本发明的内含磁性体的粒子作为标识进行免疫测定方法，可以进行灵敏度好的精密测定。

另外，当向本发明的内含磁性体的粒子导入连接物质时，例如可以提高结合在内含磁性体的粒子上的抗原、抗体、试剂等的反应性，即可以进行灵敏度好的精密测定，即使本发明的内含磁性体的粒子的粒子表面对蛋白质具有非吸附性，由于连接物质具有和蛋白质的结合性，所以可以将抗原或抗体确实可靠地结合在内含磁性体的粒子上。

Claims (25)

1.一种内含磁性体的粒子，由有机高分子物质和平均粒径为1～30nm的磁性体形成，其特征在于，

所述磁性体以分散的状态被包含于粒子内部，构成有机高分子物质的碳元素和构成磁性体的金属元素的构成比的绝对偏差为0.3以下。

2.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

磁性体是，在形成内含磁性体的粒子的聚合过程中，在粒子内部氧化金属离子而形成的。

3.如权利要求2所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

金属离子是铁离子。

4.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

有机高分子物质的主要构成成分为由丙烯酸系单体形成的聚合物。

5.如权利要求4所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

丙烯酸系单体是具有缩水甘油基的单体。

6.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

有机高分子物质的主要构成成分为由具有缩水甘油基的单体和苯乙烯系单体形成的聚合物。

7.如权利要求6所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

有机高分子物质中的源自于苯乙烯系单体的单体单元的比率为5～90重量％。

8.如权利要求4～7中任意一项所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

作为构成有机高分子物质的聚合物的单体成分，还含有用下述通式(1)表示的聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或用下述通式(2)表示的化合物；

CH₂＝CR—COO—(CH₂—CH₂—O)_n—H   (1)

式中，R表示H或CH₃，n表示1～20的整数；

式中，X表示H或SO₃ ^-NH₄ ⁺，n表示3～30的整数。

9.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

有机高分子物质已被交联。

10.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

在粒子表面上具有从羧基、羟基、环氧基、氨基、三乙基铵基、二甲基胺基和磺酸基中选择的至少1种官能团。

11.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

平均粒径为0.05～1μm。

12.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

磁性体的含量为0.1～50重量％。

13.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

磁性体的平均粒径为2～10nm。

14.如权利要求1所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

在粒子表面结合有具有可以与抗原或抗体形成共价键的官能团的连接物质。

15.如权利要求14所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

可以与抗原或抗体形成共价键的官能团是环氧基。

16.如权利要求14或者15所述的内含磁性体的粒子，其特征在于，

连接物质是聚乙二醇二缩水甘油醚。

17.一种内含磁性体的粒子的制造方法，其特征在于，由

在水系溶剂中使不具有亲水基的单体和/或具有亲水基的单体进行聚合而形成粒子的工序、和

将金属离子引入到所述粒子中的同时氧化所述金属离子而形成磁性体的工序构成，

且使所述形成粒子的工序和所述形成磁性体的工序同时进行。

18.如权利要求17所述的内含磁性体的粒子的制造方法，其特征在于，

不具有亲水基的单体是，具有缩水甘油基的丙烯酸系单体、或者具有缩水甘油基的丙烯酸系单体和苯乙烯系单体。

19.如权利要求17或者18所述的内含磁性体的粒子的制造方法，其特征在于，

形成粒子的单体由不具有亲水基的单体和具有亲水基的单体构成，具有亲水基的单体是用下述通式(1)表示的聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或用下述通式(2)表示的化合物；

CH₂＝CR—COO—(CH₂—CH₂—O)_n—H   (1)

式中，R表示H或CH₃，n表示1～20的整数；

式中，X表示H或SO₃ ^-NH₄ ⁺，n表示3～30的整数。

20.如权利要求17或18所述的内含磁性体的粒子的制造方法，其特征在于，

在形成粒子的工序中，作为共聚单体添加反应性乳化剂。

21.如权利要求17所述的内含磁性体的粒子的制造方法，其特征在于，

在形成粒子的工序中，后添加聚合引发剂。

22.一种免疫测定用粒子，其特征在于，

在权利要求1～16中任意一项所述的内含磁性体的粒子上吸附或结合抗原或抗体而成。

23.一种免疫测定方法，其特征在于，

使用权利要求1～16中任意一项所述的内含磁性体的粒子或权利要求23所述的免疫测定用粒子。

24.一种免疫测定方法，其特征在于，

将权利要求1～16中任意一项所述的内含磁性体的粒子用作标识。

25.如权利要求23或者24所述的免疫测定方法，其特征在于，

使用免疫色谱法。

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