CN108956556A - 一种发光探针及时间分辨荧光检测系统 - Google Patents

一种发光探针及时间分辨荧光检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明属于发光探针技术领域，公开了一种适用于时间分辨的发光探针及其配套的时间分辨荧光检测系统。本发明所提供的发光探针为粒径不大于200nm的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含稀土基质、主要掺杂元素以及可选的其他掺杂元素，所述主要掺杂元素选自Yb、Er、Tm、Nd、Ho中的一种或多种；所述其他掺杂元素选自Sc、Y、La、Ce、Pr、Sm、Eu、Gd、Dy、Lu中的一种或多种。该种发光探针及荧光检测技术利用稀土材料独特的能级结构，通过合适波段的短脉冲激光激发探针的某一能级后，收集该能级和激发光同波段的发光，从而可实现对标记材料的生物分子、细胞、组织或者活体样本的高信噪比、高灵敏度检测和成像。

Description

一种发光探针及时间分辨荧光检测系统
技术领域
本发明属于发光探针技术领域，特别涉及一种适用于时间分辨的发光探针及其配套的时间分辨荧光检测系统。
背景技术
荧光检测技术是一种以荧光探针的荧光性质变化为检测信号的可视化技术，具有操作简单、分辨率高、造价低廉、可连续实时监测等优势。利用发光探针标记的方法，可以实现细胞、生物组织、乃至动物活体内分析目标的信号动态检测，达到定性，定量和定位分析的目的。目前，荧光检测技术已经成为生物和医学基础研究领域中非常重要的研究方法。
时间分辨荧光技术作为一种新兴的荧光探测手段，相对于稳态荧光技术有高分辨、低背景的优势。时间分辨荧光技术可以控制激发光以脉冲的形式激发荧光探针，并且选择性只接收延迟荧光的时间区域，就可以完全滤除激发光的信号，解决激发光干扰的问题；同时，短寿命的自发荧光也会因为时间门控的存在而被滤除，从而在原理上就可以获得更高分辨、更高灵敏度的荧光信号。目前，在时间分辨荧光生物成像和检测领域已经有多种较长寿命的稀土荧光探针获得了较多的研究。
然而，发明人发现，尽管这些材料在检测和成像方面得到了应用，但是仍有相当大的局限性，大部分原因在于材料的能量转换效率低、荧光强度弱、生物相容性差等问题。因此，在应用于检测和成像领域时，需要设计一种特别适合于时间分辨体系的发光探针，该类探针需要有较高的能量转换效率，符合荧光寿命的要求(微秒量级及以上)、尺寸小(纳米量级)，并且在亲水的溶剂相内均匀分散。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同一波段激发、发射的，仅适用于时间门条件的高灵敏发光探针及时间分辨荧光检测技术方案。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式所提供的发光探针为粒径不大于200nm的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含稀土基质、主要掺杂元素以及可选的其他掺杂元素，所述主要掺杂元素选自Yb、Er、Tm、Nd、Ho中的一种或多种；所述其他掺杂元素选自Sc、Y、La、Ce、Pr、Sm、Eu、Gd、Dy、Lu中的一种或多种。
申请人发现，由于某些稀土离子独特的4f电子的能级结构，使得稀土离子的能量吸收和受激发射在同一电子态能级发生，该类过程理论上不存在除了吸收和发射以外的能量损失，具有极高的能量转换效率。例如，仅具有两个电子态能级的Yb3+离子，在975nm左右具有吸收峰，使用该波长的半导体激光器进行脉冲激发，随后使用时间门控关闭激发光，收集荧光，发射峰也在975nm处。其余如Er3+离子在1550nm、975nm左右，Tm3+离子在800、1208nm、1670nm左右，Nd3+离子在730nm、808nm、860nm左右，Ho3+离子在550nm左右等等，它们都在该波长处具有较大的吸收截面和合适的激发态寿命，可以在吸收光子后直接发出同能级的荧光，特异性地用于时间分辨的高灵敏发光检测和成像。
因此，本发明所提供的发光探针及荧光检测技术利用稀土材料独特的能级结构，通过合适波段的短脉冲激光激发探针的某一能级后，收集该能级和激发光同波段的发光，从而可实现对标记材料的生物分子、细胞、组织或者活体样本的高信噪比、高灵敏度检测和成像。
作为优选，所述纳米颗粒选自稀土氟化物REF3、稀土氟化物的复盐AxREF3+ax、稀土氧化物REOx、稀土氟氧化物REOxFy、稀土硫氧化物REOxSy、稀土氢氧化物RE(OH)x、稀土碳酸盐RE(CO3)x、稀土草酸盐RE(C2O4)x或稀土矾酸盐REVO4；其中，RE为稀土元素；A选自Li、Na、K、Ca、Ba中的一种或多种；当A选自Li、Na、K中的一种或多种时，a＝1；当A选自Ca、Ba中的一种或多种时，a＝2；x、y为符合化学组成的整数或非整数。
作为优选，所述纳米颗粒为双层或多层的纳米颗粒，表面修饰的纳米颗粒，和荧光染料、生物分子、量子点、金属纳米颗粒或聚合物微球复合的纳米颗粒；或上述任一种纳米颗粒与细胞的共孵育物。
进一步地，本发明的实施方式还提供上述发光探针的制备方法，该种发光探针由水热法、溶剂热法或高温热分解法制备得到。
优选地，所述水热法或溶剂热法包含如下步骤：取稀土氯化盐或硝酸盐、所需壳层元素的稀土氯化盐或硝酸盐，溶解在选自油酸、亚油酸、蓖麻油酸、硬脂酸、油胺、十八烯、水、乙醇的溶剂中，再与氟化物盐、碱金属盐、草酸盐或矾酸盐混合，经无水无氧处理后，升温至240～340℃，反应5分钟至4小时，冷却后加入选自氯仿、乙醇和/或环己烷、正己烷的有机溶剂，收集沉淀，洗涤后分散在正己烷或环己烷中。
优选地，所述高温热分解法包含下述步骤：取稀土三氟乙酸盐或所需壳层元素的稀土三氟乙酸盐，和碱金属/碱土金属的三氟乙酸盐，在选自油酸、亚油酸、蓖麻油酸、油胺、十八烯的溶剂中溶解，无水无氧处理后，升温至240～340℃，反应5分钟至4小时，冷却后加入选自氯仿、乙醇、环己烷、正己烷的有机溶剂，收集沉淀，洗涤后分散在正己烷或环己烷中。
更进一步地，本发明的实施方式还提供一种时间分辨荧光检测系统，其用于对包含上述发光探针的样品进行时间分辨荧光检测。
优选地，本发明的实施方式所提供的时间分辨荧光检测系统包括样品台、激发光源、信号发生系统、汇聚透镜、具有针孔的斩波器、扩束透镜、检测器和电脑，其中，所述样品台用于放置检测样品，例如可以为溶液样品、固体样品、细胞、生物组织或活体小动物等，所述样品中包含发光探针分散液的浓度为0.05～20mg/mL；所述激发光源向样品台发射532nm、660nm、730nm、785nm、808nm、860nm、975nm、1208nm、1525nm或1670nm波段的激发光；所述汇聚透镜将样品台样品的荧光信号汇聚至斩波器的针孔处；所述信号发生系统提供晶体管-晶体管逻辑电平信号，控制斩波器转动频率和相位，同时提供调制信号给激发光源；所述扩束透镜将汇聚透镜的光扩束成平直的光束，供检测器检测；所述检测器通过信号线路连接计算机；所述计算机用于控制检测器，收集和处理时间分辨荧光探测信号。
在本发明的实施方式所提供的检测系统中，通过调节脉冲控制器的脉冲宽度和相位，以及斩波器的占空比，可以选择激发和发射窗口的时间宽度和相位，通过调节斩波器控制器的转动周期，可以选择不同的激发-收集周期(1-5000Hz)。通过使用TTL信号将激发光和斩波器或者带有电调制触发功能的探测器进行同步，可以进行进一步的时间分辨成像工作，即通过控制一系列的延时门控采集时间，拍摄一系列的图片，将图片通过像素提取和拟合计算获得该像素点上的荧光衰减情况(荧光寿命值)。
在本发明中，针对不同的探测需求，可以使用占空比可调的斩波叶片、旋转周期可精确控制的斩波器及其控制器。针对不同的发光波段，选择在不同波段响应的可见区相机和近红外相机，或光电倍增管(可见-近红外区)和近红外雪崩光电探测器(近红外区)。针对不同荧光寿命的探针以及探测模式，可以使用不同的门控方式(斩波器控制或者相机电触发模式)。
优选地，本发明的实施方式所提供的时间分辨荧光检测系统使用时间门探测模式或者时间分辨探测模式：所述时间门模式以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，用于区分长寿命、短寿命的荧光信号；所述时间分辨模式在所述时间门模式的基础上，控制延迟门控的时间序列，采集不同延迟时间下的信号，然后从系列信号中解出需要的荧光信号衰减过程。
具体来说，在本发明的实施方式中，可以使用时间门模式滤除背景荧光。时间门固定了门控延迟时间(一般在微秒量级)，短寿命的背景荧光(一般在纳秒量级)因此无法被探测器接收。使用时间分辨探测模式可以进一步探测发光衰减情况。通过控制一系列的延时门控采集时间，获取一个延时序列的数据，将数据通过提取和拟合计算，就可以获得荧光衰减情况。对于使用相机的情况而言，一系列延迟时间的发光图片可以进行荧光寿命的分区域拟合，从而获得细胞，生物组织和活体的荧光探针寿命区域分布信息，进行不同荧光寿命区域的区分。
优选地，本发明的实施方式所提供的时间分辨荧光检测系统所进行的检测包括时间分辨的光谱检测、生物分子的时间分辨荧光检测、细胞时间分辨荧光成像、动物体内器官或组织的时间分辨荧光成像。优选地，所述生物分子包含蛋白质、DNA、RNA或生物体内的活性成分。
优选地，本发明的实施方式所提供的时间分辨荧光检测系统中，激发光源使用脉冲氙灯、脉冲激光器、可调制的半导体激光器或LED光源；所述检测器使用面阵探测设备、线列探测设备、光谱探测设备或点探测设备。
优选地，本发明的实施方式所提供的时间分辨荧光检测系统中，面阵探测设备、线列探测设备、光谱探测设备或点探测设备包括电荷耦合器件(CCD)、科学级互补金属氧化物半导体(sCMOS)、电子倍增CCD(EMCCD)、像增强型CCD或CMOS、铟镓砷红外相机、光谱线列相机、光纤光谱仪、光电倍增管(PMT)，雪崩光电二极管(APD)。
优选地，本发明的实施方式所提供的时间分辨荧光检测系统中，所述信号发生系统包含波形发生器、函数发生器、数字延迟发生器、射频信号发生器或经过同步的上述仪器中的两件或多件，或使用电脑驱动的数据采集卡直接进行电压信号的产生和输出。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明所提供的发光探针具有独特的同波段激发-发射特性，相比传统的斯托克斯发光或者反斯托克斯发光的探针，具有能量转换效率高的优点。本发明所提供的探针尺寸小、可修饰性、生物相容性佳，可以在复杂体系内对目标物种进行检测。
(2)本发明所提供的发光探针在传统的荧光探测设备上无法检测其特征发光，需要使用本发明中所提供的时间分辨荧光检测体系。该检测体系可采取时间门、时间分辨等多种探测模式，实时探测从微观到宏观、目标检测物种的光谱性质以及空间分布。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中的荧光时间分辨探测系统的结构示意图；
图2是实施例1中的发光探针的透射电子显微成像照片，其中，(a)为发光探针NaYbF4的透射电子显微成像照片，(b)为发光探针NaYbF4@CaF2的透射电子显微成像照片；
图3是实施例2中的发光探针的透射电子显微成像照片，其中，(a)为发光探针NaYbF4的透射电子显微成像照片，(b)为发光探针NaYbF4@NaYF4的透射电子显微成像照片；
图4是实施例3中的发光探针的荧光光谱图，收集范围400-1100纳米；其中，(a)为发光探针NaYbF4@CaF2的荧光光谱图，(b)为发光探针NaYbF4@NaYF4的荧光光谱图；
图5是实施例4中发光探针NaYbF4@CaF2的动物时间分辨荧光成像图，使用电子倍增相机(EMCCD)拍摄；其中，(a)为荧光场图片，(b)为荧光场和明场叠加后的图片；
图6是实施例5中的发光探针NaErF4@CaF2的时间分辨荧光图，使用近红外光谱仪测试；其中，(a)为时间门荧光光谱图，(b)为改变延迟时间的时间分辨荧光强度图，进一步使用荧光寿命相关表达式拟合出荧光寿命；
图7是实施例6中的发光探针NaErF4@CaF2的时间分辨荧光成像图，使用近红外相机测试；其中，(a)为时间门荧光图(荧光粉末)，(b)为不同延迟时间下的时间分辨平均荧光强度图，可以进一步使用荧光寿命相关表达式拟合出荧光寿命。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
本发明的具体实施方式提供了一种发光探针，该发光探针为粒径不大于200nm的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含稀土基质、主要掺杂元素以及可选的其他掺杂元素，所述主要掺杂元素选自Yb、Er、Tm、Nd、Ho中的一种或多种；所述其他掺杂元素选自Sc、Y、La、Ce、Pr、Sm、Eu、Gd、Dy、Lu中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方式中，所提供的发光探针选自稀土氟化物REF3、稀土氟化物的复盐AxREF3+ax、稀土氧化物REOx、稀土氟氧化物REOxFy、稀土硫氧化物REOxSy、稀土氢氧化物RE(OH)x、稀土碳酸盐RE(CO3)x、稀土草酸盐RE(C2O4)x或稀土矾酸盐REVO4。其中，RE为稀土元素；A选自Li、Na、K、Ca、Ba中的一种或多种；当A选自Li、Na、K中的一种或多种时，a＝1；当A选自Ca、Ba中的一种或多种时，a＝2；x、y为符合化学组成的整数或非整数。
在本发明的一些具体实施方式中，所提供的发光探针为双层或多层的纳米颗粒，表面修饰的纳米颗粒，和荧光染料、生物分子、量子点、金属纳米颗粒或聚合物微球复合的纳米颗粒；或上述任一种纳米颗粒与细胞的共孵育物。
在本发明的具体实施方式中还提供了发光探针的制备方法，该种发光探针由水热法、溶剂热法或高温热分解法制备得到。
在本发明的一些具体实施方式中，所提供的发光探针由水热法或溶剂热法制备，具体包含如下步骤：取稀土氯化盐或硝酸盐、所需壳层元素的稀土氯化盐或硝酸盐，溶解在选自油酸、亚油酸、蓖麻油酸、硬脂酸、油胺、十八烯、水、乙醇的溶剂中，再与氟化物盐、碱金属盐、草酸盐或矾酸盐混合，经无水无氧处理后，升温至240～340℃，反应5分钟至4小时，冷却后加入选自氯仿、乙醇和/或环己烷、正己烷的有机溶剂，收集沉淀，洗涤后分散在正己烷或环己烷中。
在本发明的另外一些具体实施方式中，所提供的发光探针由高温热分解法制备，具体包含下述步骤：取稀土三氟乙酸盐或所需壳层元素的稀土三氟乙酸盐，和碱金属/碱土金属的三氟乙酸盐，在选自油酸、亚油酸、蓖麻油酸、油胺、十八烯的溶剂中溶解，无水无氧处理后，升温至240～340℃，反应5分钟至4小时，冷却后加入选自氯仿、乙醇、环己烷、正己烷的有机溶剂，收集沉淀，洗涤后分散在正己烷或环己烷中。
本发明的实施方式还提供一种时间分辨荧光检测系统，其用于对包含上述发光探针的样品进行时间分辨荧光检测。
在本发明的一些具体实施方式中，所提供的时间分辨荧光检测系统包括样品台1、激发光源2、信号发生系统3、汇聚透镜4、具有针孔的斩波器5、扩束透镜6、检测器7和计算机8。其中，所述样品台1用于放置检测样品，例如可以为溶液样品、固体样品、细胞、生物组织或活体小动物等，所述样品中包含发光探针分散液的浓度为0.05～20mg/mL；所述激发光源2向样品台1发射532nm、660nm、730nm、785nm、808nm、860nm、975nm、1208nm、1525nm或1670nm波段的激发光；汇聚透镜4将样品台1样品的荧光信号汇聚至斩波器5的针孔处；所述信号发生系统3提供晶体管-晶体管逻辑电平信号，控制斩波器5转动频率和相位，同时提供调制信号给激发光源2；所述扩束透镜6将汇聚透镜4的光扩束成平直的光束，供检测器7检测；所述检测器7通过信号线路连接计算机8；所述计算机8用于控制检测器7，收集和处理时间分辨荧光探测信号。附图1为本发明的实施方式中所提供的时间分辨荧光检测系统的结构示意图。
在本发明的一些具体实施方式中，所提供的时间分辨荧光检测系统使用时间门探测模式：时间门模式以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，用于区分长寿命、短寿命的荧光信号。
在本发明的另外一些具体实施方式中，所提供的时间分辨荧光检测系统使用时间分辨探测模式：时间分辨模式在时间门模式的基础上，控制延迟门控的时间序列，采集不同延迟时间下的信号，然后从系列信号中解出需要的荧光信号衰减过程。
在本发明的一些具体实施方式中，所述检测包括时间分辨的光谱检测、生物分子的时间分辨荧光检测、细胞时间分辨荧光成像、动物体内器官或组织的时间分辨荧光成像。其中，所述生物分子包含蛋白质、DNA、RNA或生物体内的活性成分。
在本发明的一些具体实施方式中所提供的时间分辨荧光检测系统，其激发光源使用脉冲氙灯、脉冲激光器、可调制的半导体激光器或LED光源；所述检测器使用面阵探测设备、线列探测设备、光谱探测设备或点探测设备。
在本发明的一些具体实施方式中所提供的时间分辨荧光检测系统，其中所采用的面阵探测设备、线列探测设备、光谱探测设备或点探测设备包括电荷耦合器件、科学级互补金属氧化物半导体、电子倍增CCD、像增强型CCD或CMOS、铟镓砷红外相机、光谱线列相机、光纤光谱仪、光电倍增管，雪崩光电二极管。
在本发明的一些具体实施方式中所提供的时间分辨荧光检测系统，其信号发生系统包含波形发生器、函数发生器、数字延迟发生器、射频信号发生器或经过同步的上述仪器中的两件或多件，或使用电脑驱动的数据采集卡直接进行电压信号的产生和输出。
以下为本发明的具体实施方式的举例，其中的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，或可按本领域已知方法制备。
实施例1发光探针NaYbF4@CaF2纳米颗粒的制备(@代表壳层的包裹，下同)
取10mmol油酸(2.82g)，10mmol油胺(2.67g)，20mmol十八烯(5.04g)，1mmol三氟乙酸镱，1mmol三氟乙酸钠(136mg)，放入100mL三颈瓶中搅拌，将体系密封，升温至110℃抽真空30min，通入氮气保护，升温至300℃反应30min。反应结束后自然冷却，向体系中加入30mL无水乙醇，使用15000rpm的转速离心8min，取沉淀，分散于环己烷中。
取20mmol油酸(5.64g)，20mmol十八烯(5.04g)，1mmol分散于环己烷中的NaYbF4核，4mmol的三氟乙酸钙，在通入氮气保护的情况下，升温至110℃除去环己烷和水，之后抽真空30min，通入氮气保护，升温至300℃反应30min。反应结束后自然冷却，向体系中加入30mL无水乙醇，使用15000rpm的转速离心8min，取沉淀，分散于环己烷中。
图2是本实施例中的发光探针的透射电子显微成像照片，其中，(a)为发光探针NaYbF4的透射电子显微成像照片，(b)为发光探针NaYbF4@CaF2的透射电子显微成像照片。如图2所示，纳米颗粒核NaYbF4的粒径约为6-8nm，核壳结构的纳米颗粒NaYbF4@CaF2的粒径约为11-13nm，而且分散性好，粒径基本均一，表明已经制备出实用级的纳米颗粒。
实施例2发光探针NaYbF4@NaYF4纳米颗粒的制备
1mmol YbCl3和油酸、十八烯混合，升温至110℃至形成澄清的溶液，降温至室温后，加入NaOH和NH4F的甲醇溶液，再升温至110℃除甲醇和水，通入氮气保护，然后升温至300℃，恒温45min。冷却至室温后，加入30mL乙醇，以15000rpm/min离心8min,取沉淀，分散于环己烷中。
1mmol YbCl3和油酸、十八烯混合，升温至110℃至形成澄清的溶液，降温至室温后，加入NaOH和NH4F的甲醇溶液，再加入1mmol合成的NaYbF4核，再升温至110℃除甲醇和水，通入氮气保护，然后升温至300℃，恒温45min。冷却至室温后，加入30mL乙醇，以15000rpm/min离心8min,取沉淀，分散于环己烷中。
图3是本实施例中的发光探针的透射电子显微成像照片，其中，(a)为发光探针NaYbF4的透射电子显微成像照片，(b)为发光探针NaYbF4@NaYF4的透射电子显微成像照片。如图3所示，纳米颗粒核NaYbF4的粒径约为14-16nm，核壳结构的纳米颗粒NaYbF4@NaYF4的粒径约为22-24nm，而且分散性好，粒径基本均一，表明已经制备出实用级的纳米颗粒。
实施例3使用激光泵浦时间分辨检测系统测定发光探针NaYbF4@CaF2和NaYbF4@NaLuF4的时间分辨光谱
将纳米材料配制成的分散液放置于比色皿中，将比色皿置于样品台上，将任意波形发生器，半导体激光器开启，脉冲激发光对准样品池，产生的荧光信号经由汇聚透镜组、光学斩波器和扩束透镜组和探测光纤，最后进入光纤光谱仪(NOVA-EX，复享光学)，经电脑收集处理获得图谱。
图4是本实施例中的发光探针的荧光光谱图，收集范围400-1100纳米；其中，(a)为发光探针NaYbF4@CaF2的荧光光谱图，(b)为发光探针NaYbF4@NaYF4的荧光光谱图。
实施例4利用激光泵浦时间分辨检测系统进行发光探针NaYbF4@CaF2标记小鼠的活体成像
将荧光纳米材料NaYbF4@CaF2配制成的1mg/mL的水溶液200μL，经过皮下注射入小鼠的腹部，将小鼠麻醉之后放置于样品台上，将斩波器控制器，半导体激光器开启，脉冲激发光扩束对准小鼠的全身，产生的荧光信号经由汇聚透镜组、光学斩波器和扩束透镜组最后进入成像设备(EMCCD，Andor iXon Ultra897，)，经电脑收集处理获得成像图像。
图5为发光探针NaYbF4@CaF2的动物时间分辨荧光成像图，使用电子倍增相机(EMCCD)拍摄；其中，(a)为荧光场图片，(b)为荧光场和明场叠加后的图片。
实施例5时间分辨检测系统进行发光探针NaErF4@CaF2的时间分辨光谱探测
将纳米材料NaErF4@CaF2分散在水中(1mg/mL)，使用1550nm的脉冲激光激发材料，产生的荧光信号经由汇聚透镜组、光学斩波器和扩束透镜组和探测光纤，最后进入光纤光谱仪(NIR1700，复享光学)，经电脑收集处理获得图谱。进一步地，我们使用任意波形发生器和斩波器进行同步，可以获得时间分辨荧光图谱。
图6为本实施例中的发光探针NaErF4@CaF2的时间分辨荧光图，使用近红外光谱仪测试；其中，(a)为时间门荧光光谱图，(b)为改变延迟时间的时间分辨荧光强度图，进一步使用荧光寿命相关表达式拟合出荧光寿命。
实施例6时间分辨检测系统进行发光探针NaErF4@CaF2的时间分辨成像
将荧光纳米材料粉末干燥压片，放置于样品台上，将斩波器控制器，波形发生器，半导体激光器(1550nm)开启，脉冲激发光扩束对准材料，通过产生的荧光信号经由汇聚透镜组和扩束透镜组最后进入(铟镓砷红外相机，Xeva-1.7-640，Xenics公司)，经电脑收集处理获得成像图像。进一步使用任意波形发生器和红外相机进行触发同步，可以获得时间分辨的荧光强度。
图7本实施例中的发光探针NaErF4@CaF2的时间分辨荧光成像图，使用近红外相机测试；其中，(a)为时间门荧光图(荧光粉末)，(b)为不同延迟时间下的时间分辨平均荧光强度图，可以进一步使用荧光寿命相关表达式拟合出荧光寿命(如图所示)。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (15)

1.一种发光探针，其特征在于，所述发光探针为粒径不大于200nm的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含稀土基质、主要掺杂元素以及可选的其他掺杂元素，所述主要掺杂元素选自Yb、Er、Tm、Nd、Ho中的一种或多种；所述其他掺杂元素选自Sc、Y、La、Ce、Pr、Sm、Eu、Gd、Dy、Lu中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的发光探针，其特征在于，所述纳米颗粒选自稀土氟化物REF3、稀土氟化物的复盐AxREF3+ax、稀土氧化物REOx、稀土氟氧化物REOxFy、稀土硫氧化物REOxSy、稀土氢氧化物RE(OH)x、稀土碳酸盐RE(CO3)x、稀土草酸盐RE(C2O4)x或稀土矾酸盐REVO4；
其中，RE为稀土元素；
A选自Li、Na、K、Ca、Ba中的一种或多种；
当A选自Li、Na、K中的一种或多种时，a＝1；当A选自Ca、Ba中的一种或多种时，a＝2；
x、y为符合化学组成的整数或非整数。
3.根据权利要求1所述的发光探针，其特征在于，所述纳米颗粒为双层或多层的纳米颗粒，表面修饰的纳米颗粒，和荧光染料、生物分子、量子点、金属纳米颗粒或聚合物微球复合的纳米颗粒；或上述任一种纳米颗粒与细胞的共孵育物。
4.权利要求1至3中任一项所述的发光探针的制备方法，其特征在于，所述发光探针由水热法、溶剂热法或高温热分解法制备得到。
5.根据权利要求4所述的发光探针的制备方法，其特征在于，所述水热法或溶剂热法包含如下步骤：取稀土氯化盐或硝酸盐、所需壳层元素的稀土氯化盐或硝酸盐，溶解在选自油酸、亚油酸、蓖麻油酸、硬脂酸、油胺、十八烯、水、乙醇的溶剂中，再与氟化物盐、碱金属盐、草酸盐或矾酸盐混合，经无水无氧处理后，升温至240～340℃，反应5分钟至4小时，冷却后加入选自氯仿、乙醇和/或环己烷、正己烷的有机溶剂，收集沉淀，洗涤后分散在正己烷或环己烷中。
6.根据权利要求4所述的发光探针的制备方法，其特征在于，所述高温热分解法包含下述步骤：取稀土三氟乙酸盐或所需壳层元素的稀土三氟乙酸盐，和碱金属/碱土金属的三氟乙酸盐，在选自油酸、亚油酸、蓖麻油酸、油胺、十八烯的溶剂中溶解，无水无氧处理后，升温至240～340℃，反应5分钟至4小时，冷却后加入选自氯仿、乙醇、环己烷、正己烷的有机溶剂，收集沉淀，洗涤后分散在正己烷或环己烷中。
7.一种时间分辨荧光检测系统，其特征在于，用于对包含权利要求1至3中任一项所述的发光探针的样品进行时间分辨荧光检测。
8.根据权利要求7所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，包括样品台、激发光源、信号发生系统、汇聚透镜、具有针孔的斩波器、扩束透镜、检测器和计算机，其中，
所述样品台用于放置检测样品，所述样品中包含发光探针分散液；所述激发光源向样品台发射激发光；所述汇聚透镜将样品台样品的荧光信号汇聚至斩波器的针孔处；所述信号发生系统提供晶体管-晶体管逻辑电平信号，控制斩波器转动频率和相位，同时提供调制信号给激发光源；所述扩束透镜将汇聚透镜的光扩束成平直的光束，供检测器检测；所述检测器通过信号线路连接计算机；所述计算机用于控制检测器，收集和处理时间分辨荧光探测信号。
9.根据权利要求8所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，所述样品中包含发光探针分散液的浓度为0.05～20mg/mL；所述激发光源向样品台发射532nm、660nm、730nm、785nm、808nm、860nm、975nm、1208nm、1525nm或1670nm波段的激发光。
10.根据权利要求8所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，使用时间门探测模式或者时间分辨探测模式：
所述时间门模式以激发光关闭与斩波器开启之间的时间差作为延迟的时间门控，用于区分长寿命、短寿命的荧光信号；
所述时间分辨模式在所述时间门模式的基础上，控制延迟门控的时间序列，采集不同延迟时间下的信号，然后从系列信号中解出需要的荧光信号衰减过程。
11.根据权利要求8所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，所述检测包括时间分辨的光谱检测、生物分子的时间分辨荧光检测、细胞时间分辨荧光成像、动物体内器官或组织的时间分辨荧光成像。
12.根据权利要求11所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，所述生物分子包含蛋白质、DNA、RNA或生物体内的活性成分。
13.根据权利要求8所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，所述激发光源使用脉冲氙灯、脉冲激光器、可调制的半导体激光器或LED光源；所述检测器使用面阵探测设备、线列探测设备、光谱探测设备或点探测设备。
14.根据权利要求13所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，所述面阵探测设备、线列探测设备、光谱探测设备或点探测设备包括电荷耦合器件、科学级互补金属氧化物半导体、电子倍增CCD、像增强型CCD或CMOS、铟镓砷红外相机、光谱线列相机、光纤光谱仪、光电倍增管，雪崩光电二极管。
15.根据权利要求8所述的时间分辨荧光检测系统，其特征在于，所述信号发生系统包含波形发生器、函数发生器、数字延迟发生器、射频信号发生器或经过同步的上述仪器中的两件或多件，或使用电脑驱动的数据采集卡直接进行电压信号的产生和输出。
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