CN112161946A - 一种频域发光寿命成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种频域发光寿命成像系统，包括样品台、激发光源、第一透镜组、斩波器、滤光片、第二透镜组、成像器件、计算机和信号发生装置。适用于微秒及以上发光寿命的频域寿命成像系统。该种成像手段使用斩波器作为主要的频域发光调控器件，测量的波段可以从可见区延伸到近红外区(300–1700nm)，相比传统频域寿命成像系统，不仅提供了近红外区的光谱范围(1000–1700nm)，而且相比前者使用的高分辨探测器，高速相机以及精密时序设备，极大降低了寿命成像的成本，具有可拓展性和易用性，在微秒以上的发光寿命成像领域具有极大的应用前景。

Description

一种频域发光寿命成像系统
技术领域
本发明涉及发光成像领域，尤其涉及频域发光寿命成像系统。
背景技术
发光成像技术是一种以发光探针的性质变化为检测信号的可视化技术，具有操作简单、分辨率高、造价低廉、可连续实时监测等优势。利用发光探针标记的方法，可以实现细胞、生物组织、乃至动物活体内目标的信号动态检测，达到定性，定量和定位分析的目的。目前，发光成像技术已经成为化学、生物和医学等基础研究领域中非常重要的研究方法。
时间分辨发光成像技术作为一种新兴的探测手段，相对于稳态发光成像技术有更佳的信号还原能力。在复杂的细胞，生物组织和动物活体内环境，时间分辨发光在时间域上进行了一次发光校正，使得在理想情况下，探针的发光寿命信号不受探针的局域浓度分布、激发光的强度，以及环境的变化情况等的影响，而只受需要探测的物种或物理量的影响。因此，该类技术对于解决活生物体中的定量和半定量的问题，具有极好的应用前景。目前，已经在细胞层面以及活体层面用于探测离子浓度、氧含量、温度、pH等等。
然而，经研究发现，尽管时间分辨(寿命)成像在生物和医学研究方面得到了一些应用，但是距离将该工具转化为普适化的研究手段仍然具有相当的距离，其根本原因在于设备的成本极高。例如需要非常精细的脉冲光源，如飞秒或皮秒激光，精细的时序计时和控制电子设备，以及时序探测设备，如单光子探测器、像增强相机、条纹相机等(参考中国专利CN101632577B、CN102692401A、CN102998290A)。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是解决现有技术中高精度的发光成像系统的成本极高。本发明提供了一种频域发光寿命成像系统，适用于微秒及以上发光寿命的频域寿命成像系统，具有便捷、低成本，同时又精准的优势，对生物和医学的基础和应用研究都会起到较大的推动作用。
为实现上述目的，本发明提供了一种频域发光寿命成像系统，包括样品台、激发光源、第一透镜组、斩波器、滤光片、第二透镜组、成像器件、计算机和信号发生装置；
样品台用于放置待检测样品，待检测样品中包含发光探针和发光探针分散液；
激发光源向样品台发射正弦波动的激发光；
第一透镜组收集样品台的待检测样品的发光信号；
信号发生装置分别与计算机、斩波器和激发光源连接，提供晶体管-晶体管逻辑电平(TTL)信号，控制斩波器转动频率和相位，提供同步的调制信号给激发光源，并提供同步的TTL信号触发成像器件；
滤光片设置于斩波器和第二透镜组之间，用于阻挡激发光透过待检测样品发光；
第二透镜组将通过斩波器的光汇聚至成像器件；
计算机与成像器件连接，并控制成像器件，收集和处理频域时间分辨发光探测信号。
进一步地，待检测样品中包含发光探针分散液的浓度设置为0.005mg～50mg/mL。
进一步地，激发光源使用正弦形式的周期性激发光激发待测样品，使用滤光片收集所需光谱区间的正弦波动的发光，并通过斩波器后到达成像器件。
进一步地，的激发光正弦波动周期和斩波器转动周期一致并且同步。
进一步地，成像器件被信号发生装置触发，并且以激发光和斩波器相位相对固定的时间作为一个时间切片，在时间切片以内完成一帧图像的曝光；同步地采集一个时间切片序列的信号，在序列的信号内激发光和斩波器的相对相位完成了一次扫描；收集处理序列的信号，可以得到放置于样品台的发光探针的频域信息，频域信息通过校正得到发光寿命信息。
进一步地，成像器件包括面阵型成像器件，针对面阵型成像器件，所获得的频域信息以特定的斩波器叶片以及斩波速度进行校正，从而得到发光寿命信息。
进一步地，激发光源选自半导体激光器、脉冲激光器、LED光源、氙灯、卤素灯或汞灯中的一种或多种。
进一步地，面阵型成像器件包括电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)、铟镓砷红外相机中的一种。
进一步地，信号发生装置包含波形发生器、函数发生器、电脑驱动的数据采集卡、多功能I/O设备或经过同步的上述仪器中的一件或多件。
技术效果
本发明一种频域发光寿命成像系统，适用于微秒及以上发光寿命的频域寿命成像系统。该种成像手段使用斩波器作为主要的频域发光调控器件，测量的波段可以从可见区延伸到近红外区(300–1700nm)，相比传统频域寿命成像系统，不仅提供了近红外区的光谱范围(1000–1700nm)，而且相比前者使用的高分辨探测器，高速相机以及精密时序设备，极大降低了寿命成像的成本，具有可拓展性和易用性。可作为普通成像设备上的时间分辨附加模块使用，对激发光进行正弦调制，并增加透镜组和斩波器，几乎可以和任意现有的光学成像设备，如荧光显微镜，体视镜，小动物成像设备等结合而不破坏原有的成像设计，适用于不同的相机和不同的发光波段，结合微秒以上寿命的发光探针，可以方便地实现从微观尺度到宏观尺度，从紫外光区到近红外区的高灵敏微秒以上的时间分辨成像，从而进一步拓展时间分辨和成像的发展和应用空间。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的频域发光寿命成像系统结构示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的频域发光寿命成像系统原理示意图；
图3是本发明的一个较佳实施例的频域发光寿命成像系统的频域校正原理示意图；
图4是本发明的实施例1频域发光寿命成像应用示意图；
图5是本发明的实施例2频域发光寿命成像应用示意图；
图6是本发明的实施例3频域发光寿命成像应用示意图；
图7是本发明的实施例4频域发光寿命成像应用示意图；
图8是本发明的实施例5频域发光寿命成像应用示意图。
具体实施方式
本发明的实施方式提供一种频域发光寿命成像系统，用于对微秒级别以上的发光寿命进行时间分辨成像。如图1所示，本实施例的频域时间分辨成像系统包括样品台1，激发光源2，第一透镜组3，斩波器4，滤光片5，第二透镜组6，成像器件7，计算机8和信号发生装置9。其中，所述样品台1用于放置待检测样品，例如可以为溶液样品、固体样品、细胞、生物组织或活体小动物等，激发光源2接收信号发生装置9发出的调制信号，发出正弦波动的激发光；第一透镜组3将样品台1的发光信号汇聚至斩波器4的叶片处；信号发生装置9分别与计算机8、斩波器4和激发光源2连接，提供晶体管-晶体管逻辑电平信号，控制斩波器4的转动频率和相位，同时提供相同频率的调制信号给激发光源2，提供同步的触发信号给成像器件7；滤光片5设置在斩波器4和第二透镜组6之间，将激发光滤除，用于阻挡激发光透过待检测样品发光；所述第二透镜组6将光束汇聚至成像器件7；计算机8用于控制成像器件7，收集和处理频域时间分辨发光信号。
本实施例中，频域发光寿命成像系统使用的是频域时间分辨探测模式。图2是本发明的实施方式中频域时间分辨探测方式的原理示意图。如图2所示，在正弦波动的激发光照射下，发光物质发出相同频率，不同相位正弦波动的发射光，斩波器与激发光的相对相位可以进行移动，每移动一次进行一次图像的拍摄，系列图像上对应点的强度可以还原成正弦波动的曲线(如图2最下方所示，黑点表示一个点强度随相位的变化情况)。
在本发明的一些具体实施方式中所提供的频域发光寿命成像系统，成像包括频域时间分辨的光谱成像、探针分散液或者溶液的频域时间分辨发光成像、生物分子的频域时间分辨发光成像、细胞频域时间分辨发光成像、动物体内器官或组织的频域时间分辨发光成像。使用正弦形式的周期性激发光激发样品，使用滤光片收集所需光谱区间的正弦波动的发光，该发光通过斩波器后到达成像器件。其中，激发光源使用半导体激光器、脉冲激光器、LED光源、氙灯、卤素灯、汞灯等，可以自发发出正弦形式的激发光，或在正弦形式的模拟信号调制下被驱动发出正弦形式的激发光，或使用光学调制设备，如液晶调制器等对稳态激发光调制发出正弦形式的激发光。激发光正弦波动周期和斩波器转动周期一致并且同步，扫描激发光和斩波器之间的相对相位(相对相位为0-360°),可以在成像器件端获得随正弦波动的发光信号。激发光和斩波器的周期可以随发光探针的寿命而进行优选以获得较为明显的相位区分。成像器件可以被信号发生装置触发，并且以发射光和斩波器相位相对固定的时间作为一个时间切片，在这个时间切片以内完成一帧图像的曝光；同步5地采集一个时间切片序列的信号，在该序列内发射光和斩波器的相对相位完成了一次扫描(相位为0-360°)。收集处理该序列的信号，可以得到发光探针的频域信息，该频域信息可以进一步通过校正得到发光寿命信息。对于面阵型的成像器件，所获得的频域信息需要针对特定的斩波器叶片以及斩波速度进行校正。
成像器件包括电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)、铟镓砷红外相机等面阵型成像器件。
信号发生装置包含波形发生器、函数发生器、电脑驱动的数据采集卡、20多功能I/O设备或经过同步的上述仪器中的一件或多件。
以下将以几个具体的实施例来说明本发明的一种频域发光寿命成像系统。
实施例1针对面阵成像器件实施的频域相位图像校正
图3是本实施例中的频域相位图像校正原理示意图。如图3所示，当斩波器叶片扫过成像或探测圈时，会产生时间差，从而在该区域产生相位差。这个相位差可以使用均匀的漫反射样品或者短寿命(如荧光寿命在纳秒级别的荧光染料)样品作为空白进行校正，也可以使用已知发光寿命的发光材料进行校正。在实际实践中，对于光学设计良好的系统，使用线性校正，即在图像出现相位偏差的x或者y方向进行数值的线性校正即可。例如，对于坐标为(p,q)的点，x方5向的偏差，校正可使用如下公式：
Ti校正(p,q)＝Ti(p,q)+(q-x/2)*k
其中，Ti(p,q)为原始坐标为(p,q)点的相位值，x为x方向图像含有的像素点数目，Ti校正(p,q)为校正后坐标为(p,q)点的相位值，k为相位校正系数，可以通过如下式计算：10
k＝p/x
其中，p为图像在x方向总的相位偏差，x为x方向图像含有的像素点数目。
图4(a)为一个1.2mL的样品瓶校正前的相对相位图像，(b)为校正后的结果，(c)为取了校正前竖直方向一列像素点的相对相位偏移情况和相应的线性拟合。
实施例2使用频域发光寿命成像系统提取频域发光信息
图5为使用NaYF4,Yb,Er稀土上转换发光纳米颗粒作为样品放置于样品台，拍摄的一系列发光图像(共37帧，每帧曝光时间为0.1秒)一个像素点相位与发光强度的关系图。图中的拟合曲线使用如下公式进行20
y＝a*sin((x-t)/180*3.1416)+c
其中，x,y分别为相位值(°)和发光强度值，c为背景值，t为拟合获得的与样品发光寿命相关的相位值。
图5中的黑色正弦曲线代表了相位为0°时的参考曲线。
使用该拟合公式拟合图5中的数据获得如下结果：
a＝578,c＝1544,t＝112.7
其中，t的数值即为所分析样品的频域信息。
实施例3使用频域发光寿命成像系统原位测试不同发光寿命的NaNdF4,Yb@CaF2纳米颗粒
将分散在环己烷中的立方相NaNdF4,Yb@CaF2纳米颗粒(分别掺杂了5％Yb(发光寿命96.9μs)和25％Yb(发光寿命504.1μs))装在1.2mL玻璃样品瓶中，瓶底朝上，放置在样品台上。开启任意波形发生器，785nm半导体激光器和斩波器，斩波器频率固定在400Hz。激发光经过扩束对准样品台，产生的发光信号经由第一透镜组(Nikon 50mm f 1.8)、光学斩波器，经过一块980±20nm带通滤光片，以及第二透镜组(Navitar 35mm f1.4)，最后进入电子倍增相机(EMCCD，Andor iXon Ultra 897，可检测光谱范围300–1100nm)，拍摄20张序列，相机每一张的曝光时间为1秒,经电脑收集处理获得图像。使用980±20nm带通滤光片收集纳米颗粒的发光。
图6(a)为拍摄的系列发光强度图像计算获得的相对相位图像，(b)为相对相位图像中相位值分布的统计。可以从图中明确看出不同相位值分布的两个峰且互不重叠。
实施例4使用频域发光寿命成像系统测定小鼠全身的寿命图像
将亲水性的NaYbF4@CaF2纳米颗粒分散在水中，通过尾静脉注射200μL1mg/mL的纳米颗粒分散液进入小鼠血液，将小鼠使用5％异氟烷气体麻醉后，将麻醉的活体小鼠固定在样品台上，开启任意波形发生器，915nm半导体激光器和斩波器，激发光通过扩束对准小鼠全身，产生的发光信号经由汇聚第一透镜组、光学斩波器(频率为1000Hz)和第二透镜组，最后进入InGaAs近红外相机(滨松C12741-11，可检测光谱范围900–1700nm)，经电脑收集处理获得图像。
图7(a)为小鼠的全身发光强度图，(b)为显示发光探针寿命的相位图。发光收集范围为980±20纳米。
实施例5使用频域发光寿命成像系统测定小鼠腿部血管的寿命图像
将亲水性的NaNdF4,Yb@CaF2包裹聚丙烯酸和聚乙二醇的纳米颗粒分散在水中，通过尾静脉注射200μL 1mg/mL的纳米颗粒分散液进入小鼠血液，将小鼠使用5％异氟烷气体麻醉后，将麻醉的活体小鼠腿部固定在样品台上，开启任意波形发生器，793nm半导体激光器和斩波器，激发光通过扩束对准小鼠全身，产生的发光信号经由汇聚第一透镜组(焦距20mm消色差透镜,650-1100nm增透膜，50mm直径)、光学斩波器，通过850nm长通滤光片和900nm长通滤光片，以及第二透镜组(Navitar 50mm f1.4)，最后进入电子倍增相机(EMCCD，Andor iXon Ultra 897)，经电脑收集处理获得图像。
图8(a)为小鼠的全身发光强度图，(b)为显示发光探针寿命的相位图。发光收集范围为980±20纳米。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，包括样品台、激发光源、第一透镜组、斩波器、滤光片、第二透镜组、成像器件、计算机和信号发生装置；
所述样品台用于放置待检测样品，所述待检测样品中包含发光探针分散液；
所述激发光源接收所述信号发生装置发出的调制信号，向所述样品台发射正弦波动的激发光；
所述第一透镜组收集所述样品台的待检测样品的发光信号；
所述信号发生装置分别与所述计算机、所述斩波器和所述激发光源连接，提供晶体管-晶体管逻辑电平(TTL)信号，控制所述斩波器转动频率和相位，提供同步的调制信号给所述激发光源，并提供同步的TTL信号触发所述成像器件；
所述滤光片设置于所述斩波器和所述第二透镜组之间，用于阻挡激发光透过所述待检测样品发光；
所述第二透镜组将通过所述斩波器的光汇聚至所述成像器件；
所述计算机与所述成像器件连接，并控制所述成像器件，收集和处理频域时间分辨发光探测信号。
2.如权利要求1所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述待检测样品中包含发光探针分散液的浓度设置为0.005mg～50mg/mL。
3.如权利要求1所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述激发光源使用正弦形式的周期性激发光激发所述待测样品，使用所述滤光片收集所需光谱区间的正弦波动的发光，并通过斩波器后到达成像器件。
4.如权利要求3所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述的激发光正弦波动周期和所述斩波器转动周期一致并且同步。
5.如权利要求1所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述成像器件被所述信号发生装置触发，并且以激发光和斩波器相位相对固定的时间作为一个时间切片，在所述时间切片以内完成一帧图像的曝光；同步地采集一个时间切片序列的信号，在所述序列的信号内激发光和斩波器的相对相位完成了一次扫描；收集处理所述序列的信号，可以得到放置于样品台的发光探针的频域信息，所述频域信息通过校正得到发光寿命信息。
6.如权利要求5所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，成像器件包括面阵型成像器件，针对所述面阵型成像器件，所获得的频域信息以特定的斩波器叶片以及斩波速度进行校正，从而得到发光寿命信息。
7.如权利要求3所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述激发光源选自半导体激光器、脉冲激光器、LED光源、氙灯、卤素灯或汞灯中的一种或多种。
8.如权利要求6所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述面阵型成像器件包括电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)、铟镓砷红外相机中的一种。
9.如权利要求1所述的一种频域发光寿命成像系统，其特征在于，所述2信号发生装置包含波形发生器、函数发生器、电脑驱动的数据采集卡、多功能I/O设备或经过同步的上述仪器中的一件或多件。
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