JP2019194581A - 多層ナノワイヤ複合体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体分子検知用抗体及び細胞捕集用抗体が搭載された多層構造ナノワイヤ複合体及びその製造方法、さらに生体分子検知用抗体及び細胞捕集用抗体が搭載された多層構造ナノワイヤ複合体を用いた免疫細胞の捕集及び免疫細胞から分泌される生体分子を同時に検知する方法を提供する。【解決手段】免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法は、第１金属１１２及び第２金属１１４が交互に積層された多層ナノワイヤ１１０を調製する段階と、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子１２２を前記第２金属に付着する段階と、前記多層ナノワイヤの前記第１金属にチオール基で処理された第１抗体１３４を付着する段階と、前記第２金属に前記高分子のカルボキシル基を通して蛍光体を含む第２抗体１２４を付着する段階から構成される。【選択図】図１

Description

本発明は、第１金属と第２金属が交互に積層された多層構造のナノワイヤを活用して細胞及び生体分子検知のための免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法に関する。より詳細には、前記多層ナノワイヤに細胞捕集用抗体と生体分子検知用抗体が第１金属と第２金属それぞれに選択的に同時に搭載されている免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法に関する。

体外診断免疫物質検知法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）は人体の免疫程度（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を表す免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）又は免疫物質（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）の数値を測定する検査であり、定量分析は免疫系の作動程度（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を検査する適切な指標として使用されている。しかし、体外診断免疫物質検知法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）において、免疫細胞捕集（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）、免疫細胞刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）、免疫物質（例えば、サイトカイン）検知などの各過程で細胞の分離作業が必要である。各検査過程が複雑であり、個別工程による検査装備が異なるため、時間と費用の問題がある。

例えば、インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ、ＩＦＮ−γ）のようなサイトカインを検出するために、サンドイッチ酵素結合免疫分析法（ｓａｎｄｗｉｃｈ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫スポット分析法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＰＯＴ）、フローサイトメトリ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）などが使用されている。この分析法は、免疫細胞から排出される免疫物質（例えば、サイトカイン）を直接的に検知することではなく、血液中に分布しているサイトカインを間接的に検出する。したがって、誤った検査の発生する可能性が高いだけでなく、患者から多量の血液を必要とする。この分析法は、高コスト及び多大な時間を費やすという短所があるにもかかわらず、現存する技術に代わる効率的な検出方式はない。

このような問題を解決するために、最近、検知感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の高いナノ素材を様々な観点で使用している。代表的に磁気的特性を有するコア、生体親和性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）材料をシェルで蓄積するコアシェル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ）構造のナノ粒子、自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を有している量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）が応用されている。しかし、ナノ粒子の場合、単一の抗体のみを表面に修飾（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）し、２種類以上の抗体を修飾すると、抗体間の干渉現象によって表面修飾効率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）及び抗体作用能力（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に問題がある。

本発明の解決しようとする一技術的課題は、生体分子検知用抗体及び細胞捕集用抗体が搭載された多層構造ナノワイヤ複合体を提供するものである。

本発明の解決しようとする一技術的課題は、生体分子検知用抗体及び細胞捕集用抗体が搭載された多層構造ナノワイヤ複合体の製造方法を提供するものである。

本発明の解決しようとする一技術的課題は、生体分子検知用抗体及び細胞捕集用抗体が搭載された多層構造ナノワイヤ複合体を用いた免疫細胞の捕集及び免疫細胞から分泌される生体分子を同時に検知する方法を提供するものである。

本発明の一実施例による免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法は、第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤを調製する段階と、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子を前記第２金属に付着する段階と、前記多層ナノワイヤの前記第１金属にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理された第１抗体を付着する段階と、前記第２金属に前記高分子のカルボキシル基を通して前記第２抗体を付着する段階と、を含む。前記第２抗体は蛍光体を含む。

本発明の一実施例において、前記第１金属は金であり、前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料である。

本発明の一実施例において、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、エチル基又はポリエチレングリコールに連結される。

本発明の一実施例において、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）である。

本発明の一実施例において、前記チオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）の処理は、前記高分子のアミノ基と反応できる２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ又はＳＡＴＡ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）を用いて行われる。

本発明の一実施例において、前記第１抗体は、前記第２抗体より先に反応させる。

本発明の一実施例において、前記第２抗体は、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、そしてｓｕｌｆｏ ＮＨＳ（ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）と混合された後、前記高分子に結合する。

本発明の一実施例において、前記多層ナノワイヤの前記第１金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであり、前記多層ナノワイヤの前記第２金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍである。

本発明の一実施例による免疫物質検知ナノワイヤ複合体は、第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤと、前記第２金属に付着され、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子と、前記多層ナノワイヤの前記第１金属にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理されたあと付着された第１抗体と、前記第２金属に前記高分子のカルボキシル基を通して付着された前記第２抗体と、を含む。前記第２抗体は蛍光体を含む。

本発明の一実施例において、前記第１抗体は、免疫物質及び第１補助抗体とサンドイッチ結合し、前記第１補助抗体は補助蛍光体を含み、前記第２抗体は免疫細胞と結合し、前記第２抗体の蛍光体は外部光の提供を受けて第１蛍光を提供し、前記第１抗体の補助蛍光体は、前記第２抗体の蛍光体の第１蛍光の提供を受けて第２蛍光を提供する。

本発明の一実施例において、前記第１金属は金であり、前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料である。

本発明の一実施例において、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、エチル基又はポリエチレングリコールに連結される。

本発明の一実施例において、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）である。

本発明の一実施例において、前記多層ナノワイヤの前記第１金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであり、前記多層ナノワイヤの前記第２金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍである。

本発明の一実施例による免疫物質検知方法は、第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤ、前記第１金属に付着された第１抗体、及び前記第２金属に付着された高分子、蛍光体を含み、前記高分子に付着された第２抗体を含むナノワイヤ複合体を調製する段階と、免疫細胞を含む免疫細胞溶液を調製する段階と、前記ナノワイヤ複合体と前記免疫細胞溶液を混合して第１混合溶液を生成し、前記免疫細胞と前記第２抗体を反応させる段階と、補助蛍光体を含む第１補助抗体を前記ナノワイヤ複合体と前記免疫細胞溶液が混合された混合溶液に投入して第２混合溶液を生成し、前記免疫細胞が放出した免疫物質、第１抗体、及び第１補助抗体をサンドイッチ結合させる段階と、励起光を第２混合溶液に照射して前記蛍光体を発光させ、前記蛍光体の発光による前記補助蛍光体の発光を検出する段階と、を含む。

本発明の一実施例において、前記第１抗体とサンドイッチ結合しない前記第１補助抗体を除去する段階をさらに含む。

本発明の一実施例において、前記免疫細胞と前記第２抗体が反応しないナノワイヤ複合体を除去する段階をさらに含む。

本発明の一実施例において、前記免疫細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞であり、前記免疫物質はＩＦＮ−γである。

本発明の一実施例において、前記第１金属は金であり、前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料である。

本発明の一実施例において、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、エチル基又はポリエチレングリコールに連結される。

本発明の一実施例による多層構造ナノワイヤ複合体は、生体親和性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）材料で構成されており、官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含んでいる有機分子及び抗体によって安定的に生体機能化（ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されている。多層構造ナノワイヤ複合体は、生体分子検知用抗体及び細胞捕集用抗体が搭載される。細胞捕集用抗体は蛍光体を含み、生体分子検知用抗体は、免疫物質を介在して補助生体分子検知用抗体とサンドイッチ結合する。多層構造ナノワイヤ複合体の細胞捕集用抗体は、免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）を含むターゲット細胞を捕集する。また、細胞捕集用抗体が結合する特定の免疫細胞は、抗原などの刺激（例えば、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）によって免疫物質を放出する。これによって、多層構造ナノワイヤ複合体の生体分子検知用抗体は、放出された免疫物質及び外部から注入された補助生体分子検知用抗体とサンドイッチ結合する。外部から提供された励起光は、蛍光体を第１波長帯域で発光させ、蛍光体の発光は、補助生体分子検知用抗体に付着された補助蛍光体を第２ 波長帯域で蛍光共鳴エネルギ移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、 ＦＲＥＴ）現象によって発光させる。これによって、第２波長帯域の発光強度を検出すると、免疫物質の濃度が高感度に検知される。したがって、多層構造ナノワイヤ複合体は、疾病診断及び免疫治療など多様なバイオメディカル分野において活用することができる。

本発明の一実施例による多層構造ナノワイヤ複合体は、高価な有細胞分析装備でなくても蛍光を測定できる様々な装備を通して免疫物質を診断することができる。

特に、本発明は、先行文献であるＬａｎｇｍｕｉｒ Ｖｏｌ ２２、 ｐｐ １０５８２８−１０５３４ （２００６）、ＡＣＳ Ｎａｎｏ Ｖｏｌ ７、 ｐｐ ９７７１−９７７９ （２０１３）の提案方法を超えて、異種の抗体を層選択的に、同時に修飾しただけでなく、蛍光体間のエネルギ伝達現象を活用して高い精度と効率性を有した免疫検査技法を提示する。

本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する概念図である。 本発明の他の実施例による免疫物質、検知ナノワイヤ複合体の製造方法を説明する図面である。 本発明の他の実施例による免疫物質、検知ナノワイヤ複合体の製造方法を説明する図面である。 本発明の他の実施例による免疫物質、検知ナノワイヤ複合体の製造方法を説明する図面である。 本発明の他の実施例による免疫物質、検知ナノワイヤ複合体の製造方法を説明する図面である。 本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する流れ図である。 本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する概念図である。 本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する概念図である。 フローサイトメトリによって測定した免疫細胞捕集用抗体の捕集効率を示すグラフである。 本発明の一実施例によるナノワイヤ複合体の免疫物質（ＩＦＮ−γ）の濃度による相対形状の強さを示すグラフである。 本発明のために電気めっき法で製造した鉄／金多層ナノワイヤの解像度透過電子顕微鏡（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＨＲＴＥＭ）写真及びエネルギ分散型分光分析法（ＥＤＳ）写真である。 フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）及びゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をそれぞれ示す結果である。 フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）及びゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をそれぞれ示す結果である。 蛍光物質（ＢＶ４２１）が結合したバーコードナノワイヤの発光結果である。 蛍光物質（ＡＦ４８８）が結合したバーコードナノワイヤの発光結果である。 ナノワイヤ複合体を示す共焦点レーザ顕微鏡のイメージである。 蛍光体と補助蛍光体との間の蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）現象を確認するために、アクセプタ（ａｃｃｅｐｔｏｒ）の蛍光をブリッチング（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）させたの後、ドナ（ｄｏｎｏｒ）の蛍光強度の増加を確認した結果である。

多層ナノワイヤは、生体親和性材料（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）から構成され、２つの金属が交互に積層された構造を含む。前記多層ナノワイヤはその応用性が著しく高いことが期待されるにもかかわらず、２種以上の抗体を同時に固定化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）して検体（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）を分析することが難しいので、その応用性が制限されていた。

本発明の一実施例によるナノワイヤ複合体は、第１金属と第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤを含む。前記多層ナノワイヤの第１金属に生体分子検知用抗体が修飾され、前記多層ナノワイヤの第２金属に細胞捕集用抗体が修飾される。前記細胞捕集用抗体は蛍光体を含み、免疫細胞と結合する。前記生体分子検知用抗体は、免疫物質及び外部から注入され、補助蛍光体を含む生体分子検知用抗体がサンドイッチ結合を行う。また、外部から提供される光は蛍光体を発光させ、前記蛍光体の発光は蛍光共鳴エネルギ移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、 ＦＲＥＴ）現象によって前記補助蛍光体の発光を誘導する。すなわち、蛍光共鳴エネルギ移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、 ＦＲＥＴ）現象を用いて免疫物質を検知する。

本発明の一実施例によると、第１金属（Ａｕ）及び第２金属（Ｆｅ）が交互に積層されたナノワイヤを調製する。両端にカルボキシル基とアミノ基を同時に有する高分子は、前記第２金属（Ｆｅ）に付着される。前記ナノワイヤの前記第１金属（Ａｕ）にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理された第１抗体（生体分子検知用抗体）が付着される。前記第２金属（Ｆｅ）に前記高分子のカルボキシル基を通して蛍光体を含む前記第２抗体（免疫細胞捕集用抗体）が付着される。外部から提供される励起光は蛍光体を発光させ、前記蛍光体の発光は、第１抗体（生体分子検知用抗体）にサンドイッチ結合する第１抗体（生体分子検知用抗体）に含まれる補助蛍光体の発光を蛍光共鳴エネルギ移動現状によって誘導する。

以下、好ましい実施例に基づいて発明をより詳細に説明する。しかし、この実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、実験条件、物質種類などによって本発明が制限又は限定されないということは、当業界の通常の知識を有する者にとって自明である。

図１は、本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する概念図である。

図１に示すように、免疫物質検知ナノワイヤ複合体１００は、第１金属１１２及び第２金属１１４が交互に積層された多層ナノワイヤ１１０と、前記第２金属１１４に付着され、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子１２２と、前記多層ナノワイヤ１１０の前記第１金属１１２にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理されたあと付着された第１抗体１３４と、前記第２金属１１４に前記高分子１２２のカルボキシル基を通して付着された前記第２抗体１２４と、を含む。前記第２抗体１２４は蛍光体１２６を含む。前記第１抗体１３４は免疫物質（インターフェロンγ）と補助蛍光体１３８を含む第１補助抗体１３７とサンドイッチ結合する。前記第２抗体１２４は免疫細胞と結合する。前記第２抗体１２４の蛍光体１２６は励起光の提供を受けて第１ 蛍光を提供し、前記第１補助抗体１３７の補助蛍光体１３８は前記第２抗体１２４の蛍光体１２６の第１蛍光体１２の提供を受けて第２蛍光を提供する。第１抗体は生体分子検知用抗体であり、前記第２抗体は免疫細胞捕集用の抗体である。

第２抗体１２４は、前記免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を捕集する。前記免疫細胞１０は、前記第２抗体１２４又は抗原の刺激によって免疫物質１３６を分泌する。前記免疫物質１３６は、インターフェロンγである。前記免疫物質１３６は、第１抗体１３４と結合する。また、前記免疫物質１３６は、補助蛍光体１３８を含む第１補助抗体１３７及び第１抗体１３４とサンドイッチ結合を行う。第１補助抗体１３７は、補助蛍光体１３８が付着されたことと抗原結合部位が異なることを除けば、前記第１抗体１３４と同一である。励起光源は、前記第２抗体１２４の蛍光体１２６を発光させる。蛍光体１２６と補助蛍光体１３８が平均的に１０ナノメートル以内の近距離にあるとき、共鳴によってエネルギが伝達される。それに応じて、前記補助蛍光体１３８が発光する。一方、蛍光体１２６と補助蛍光体１３８が数百ナノメートル以上の遠距離にあるとき、共鳴によってエネルギは伝達されない。前記蛍光体１２６はＢＶ４２１（商標名）であり、前記補助蛍光体１３８はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（商標）である。

前記第１金属は金であり、前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料である。前記多層ナノワイヤの前記第１金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであり、前記ナノワイヤの前記第２金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍである。

高分子は両端にカルボキシル基とアミノ基を有する。前記高分子はエチル基又はポリエチレングリコールに連結される。前記高分子は、１１-アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）である。

したがって、免疫物質検知ナノワイヤ複合体１００は、特定の免疫細胞から分泌される免疫物質１３６のみを選択的に検出し、免疫物質１３６の量を補助蛍光体１３８の発光強度として提供する。この免疫物質感知方法は、通常の方法で検出できない領域である７２４ｐｇ／ｍＬの免疫物質（インターフェロンγ）濃度を検出する。

図２Ａないし図２Ｄは、本発明の他の実施例による免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法を説明する図面である。

図２Ａないし図２Ｄに示すように、免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法は、第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤ１１０を調製する段階と、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子１２２を通して前記第２金属１１４に付着する段階と、前記多層ナノワイヤ１１０の前記第１金属１１２にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理された第１抗体１３４を付着する段階と、前記第２金属１１４に前記高分子のカルボキシル基を通して蛍光体１２６を含む前記第２抗体１２４を付着する段階、とを含む。

［多層構造ナノワイヤの合成］
図２Ａに示すように、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）形態の鉄／金（Ｆｅ／Ａｕ）多層ナノワイヤ１１０の合成は、一つのめっき槽でパルス電気めっき（ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法によって行われた。めっき槽に使用される脱イオン水基盤の溶液は前駆体である硫酸鉄七水化物（ｉｒｏｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｈｅｐｔａｈｙｄｒａｔｅ （ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、０.１６ Ｍ）、ジシアノ金( I )酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｃｙａｎｏａｕｒａｔｅ （Ｉ）、Ｋ［Ａｕ（ＣＮ）２］、０.０１ Ｍ）、そして緩衝剤であるホウ酸（ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ、 Ｈ３ＢＯ３、 ０．８０ Ｍ）を含む。

陽極酸化アルミニウム（ａｎｏｄｉｚｅｄ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｏｘｉｄｅ、 ＡＡＯ）は、電気めっきが進行されるナノテンプレート（ｎａｎｏｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用される。ナノテンプレートは、直径が数百ナノメートルである複数の細穴を含む。前記ナノテンプレートの一方の面に３００ｎｍの銀（Ａｇ）を電子ビーム蒸着装置（ｅ−ｂｅａｍ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）によって蒸着させる。蒸着された銀（Ａｇ）は、電気めっきの作用電極（ｗｏｒｋｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）として利用され、白金（Ｐｔ）電極板を対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）として使用する。

一浴（Ｓｉｎｇｌｅ ｂａｔｈ）状態の第１金属（金）と第２金属（鉄）を交互に還元させるために、それぞれ１０ ｍＡ／ｃｍ２、１ ｍＡ／ｃｍ２の電流密度をパルス形で印加した。ナノテンプレート（ｎａｎｏｔｅｍｐｌａｔｅ）に多層ナノワイヤ１１０が合成される。

作用電極は、ヨード（Ｉ）系の銀腐食液で除去される。その後、水酸化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、 ＮａＯＨ、１Ｍ）で陽極酸化 アルミニウムナノテンプレートを選択的に除去する。第２金属（鉄）の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍである。第１金属（金）の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍである。

遠心分離機を用いて脱イオン水で５回以上洗浄して、前記ナノテンプレートの内部に存在していた多層ナノワイヤ１１０を得る。分散した多層ナノワイヤ溶液は、表面の生体機能化過程のためにリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で溶液置換を行った。

［多層ナノワイヤ表面官能基処理及び特性分析］
多層ナノワイヤ１１０の表面処理は、アミノ基とカルボキシ基を両端に同時に有している１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を第２金属（鉄）に追加することによって構成される。１１-アミノウンデカン酸は両端にアミノ基とカルボキシル基を有する。具体的には、１１-アミノウンデカン酸をリン酸緩衝液に６ ｍＭで溶解させる。その後、１ ｍＬのリン酸緩衝液に分散された多層ナノワイヤ１１０とアミノウンデカン酸溶液１ ｍＬを１:１の割合で混ぜる。この後、混合溶液を常温で８時間以上シェーカ（ｓｈａｋｅｒ）で混合させる。１１-アミノウンデカン酸のアミノ基は、第２金属（鉄）の表面に付着する。反応終了後、遠心分離機を用いた洗浄法を用いて残余物を除去する。

［多層ナノワイヤの第１金属（金）の抗体複合化方法］
異種の２つの抗体をそれぞれ前記多層ナノワイヤ１１０の他の部位に修飾するために２つの化学反応を用いた。免疫物質検知用抗体（第１抗体）の表面にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）を修飾するために、２−イミノチオラン（２−ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ、 ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）を２ ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液を作製する。以後、この溶液から５０μＬを取り出し、免疫物質検知用抗体（第１抗体）５０μＬと混合する。常温で２時間反応した後、スピン脱塩カラム（ｓｐｉｎ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎｓ）を用いて洗浄する。

チオール基が処理された免疫物質検知用抗体（第１抗体）と十分に分散されている多層ナノワイヤ溶液０.５ ｍＬ、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ）０.５ ｍＬを２時間常温で反応させて、第１金属（金）に抗体修飾を行った。前記多層ナノワイヤ１１０の第１金属１１２は、チオール基が処理された免疫物質検知用抗体（第１抗体）と結合する。免疫物質検知用抗体（第１抗体）と多層ナノワイヤ１１０の第１金属（金）の結合反応が終了すると、リン酸緩衝液で３回以上洗浄する。

［多層ナノワイヤの第２金属（鉄）の抗体複合化方法］
免疫細胞捕集用抗体（第２抗体）１２４を第２金属（鉄）に選択的修飾過程を進行する。この場合、免疫細胞捕集用抗体１２４ ３０μＬ、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）０.４ｍＬ、ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ（ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｏｓｕｃｃｃｃｓｉｄｅ）０.５ｍｌを多層ナノワイヤ溶液と混合して２時間常温でシェーカで反応させる。チオール基が先に修飾された免疫物質検知用抗体（第１抗体）を優先的に第１金属（金）に反応させる過程によって、２回目の修飾過程を経る免疫細胞捕集用抗体（第２抗体）立場から立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を誘発する。したがって、立体障害は、免疫細胞捕集用抗体（第２抗体）が第２金属（鉄）に選択的に付着することにおいて決定的な役割を果たす。免疫細胞捕集用抗体（第２抗体）は蛍光体１２６を含む。前記蛍光体はＢＶ４２１（商標名）である。

図３は、本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する流れ図である。

図４Ａ及び図４Ｂは、本発明の一実施例による免疫物質検知方法を説明する概念図である。

図３、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、本発明の一実施例による免疫物質検知方法は、第１金属１１２及び第２金属１１２が交互に積層された多層ナノワイヤ１１０、前記第１金属１１２に付着された第１抗体１３４、及び前記第２金属に付着された高分子、蛍光体を含み、前記高分子に付着された第２抗体を含むナノワイヤ複合体１００を調製する段階（Ｓ１１０）、免疫細胞１０を 含む免疫細胞溶液を調製する段階(Ｓ１２０)、前記ナノワイヤ複合体１００と前記免疫細胞溶液を混合して第1混合溶液を生成し、前記免疫細胞１０と前記第２抗体１２４を反応させる段階(Ｓ１３０)、補助蛍光体１３８を含む第１補助抗体１３７を前記ナノワイヤ複合体１００と前記免疫細胞溶液が混合された第１混合溶液に投入して第２混合溶液を生成し、前記免疫細胞が放出した免疫物質１３８、第１抗体１３４、及び第１補助抗体１３７をサンドイッチ結合させる段階（Ｓ１５０）と、励起光を第２混合溶液に照射して前記蛍光体１２６を発光させ、前記蛍光体の発光による前記補助蛍光体１３８の発光を検出する段階（Ｓ１７０）と、を含む。

ナノワイヤ複合体１００が調製される（Ｓ１１０）。ナノワイヤ複合体１００の製造は上述の通りである。

ヒトの血液から分離した末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）のうち、免疫細胞捕集用抗体が結合する特定の免疫細胞を分離する。すなわち、免疫細胞溶液は、血液から遠心分離法を通して特定の免疫細胞（末梢血単核細胞）を含むように分離される。フィコール・ハイパック密度勾配遠心分離法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて末梢血中の末梢血単核細胞を分離する。末梢血単核細胞を含む免疫細胞溶液が調製される（Ｓ１２０）。

免疫細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を捕集するためのＣＤ８分子に対する第２抗体（免疫細胞捕集用抗体）を結合させたナノワイヤ複合体１００を免疫細胞溶液（末梢血単核細胞溶液）と混合して第１混合溶液を生成した後、摂氏４度で１時間反応させる（Ｓ１３０）。

また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞とナノワイヤ複合体１００の免疫細胞捕集用抗体の捕集効率及び特異性を確認するために、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が区分できる蛍光標識（ｌａｂｅｌ）されたＣＤ３分子に対する抗体と混合して、反応時に一緒に反応させる。

所定時間経過後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と反応しないナノワイヤ複合体１００を除去する。反応しないナノワイヤ複合体１００の除去は、遠心分離機を用いて行う（Ｓ１４０）。遠心分離機によって反応しないナノワイヤ複合体１００を除去した後、反応したナノワイヤ複合体１００はＰＢＳで２回洗浄される。

補助蛍光体１３８を含む第１補助抗体１３７を前記ナノワイヤ複合体１００と前記免疫細胞溶液が混合された第１混合溶液に投入して第２混合溶液を生成する。それに応じて、前記免疫細胞１０が放出した免疫物質１３８、第１抗体１３４、及び第１補助抗体１３７は、サンドイッチ結合される（Ｓ１５０）。第１補助抗体１３７は第１抗体１３４と同一であるが、補助蛍光体１３８を含まない。第１補助抗体１３７は補助ＩＦＮ−γ検知用抗体であり、補助ＩＦＮ−γ検知用抗体は他のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ、抗体認識部位）に反応する補助蛍光体１３８を含む。前記補助蛍光体１３８は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（商標）蛍光物質である。第１抗体、前記補助抗体、及び免疫物質は、サンドイッチ結合を行う。

前記第１抗体１３４とサンドイッチ結合しない前記第１補助抗体１３７を除去する（Ｓ１６０）。具体的に、サンドイッチ結合しない前記第１補助抗体１３７の除去は遠心分離機を用いて行う。遠心分離機によってサンドイッチ結合しない前記第１補助抗体１３７を除去した後、反応したナノワイヤ複合体１００はＰＢＳで洗浄される。

励起光を第２混合溶液に照射して前記蛍光体１２６を発光させ、前記蛍光体の発光による前記補助蛍光体１３８の発光を検出する（Ｓ１７０）。励起光は紫外線領域であり、蛍光体１２６による発光スペクトルは４２０ｎｍで最大値を有する。補助蛍光体１３８による発光スペクトルは５００ｎｍで最大値を有する。

共焦点レーザ顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、 ＣＬＳＭ）と光ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、 ＰＬ）装備は、前記補助蛍光体の蛍光を検出し分析する。

［免疫細胞捕集効率分析］
フィコール・ハイパック密度勾配遠心分離法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて末梢血中の末梢血単核細胞を分離する。ナノワイヤ複合体１００の免疫細胞捕集用抗体（第２抗体）が結合する特定免疫細胞の捕集効率は、フローサイトメトリで分析する。このために、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ cells）を捕集するためのＣＤ８分子に対する第２抗体（免疫細胞捕集用抗体）を結合させたナノワイヤ複合体１００を末梢血単核細胞と混合して、摂氏４度で１時間反応させる。

また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と結合する免疫細胞捕集用抗体の捕集効率及び特異性を確認するために、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が区分できる蛍光標識されたＣＤ３分子に対する抗体と混合して、前記反応時に一緒に反応させる。

１時間経過後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と反応しないナノワイヤ複合体１００を除去するためにＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリでナノワイヤ複合体１００に結合された免疫細胞捕集用抗体の捕集効率を測定する。

図５は、フローサイトメトリによって測定した免疫細胞捕集用抗体の捕集効率を示すグラフである。

図５に示すように、ｘ軸はナノワイヤ複合体１００に付着されている蛍光体（ＢＶ４２１）の蛍光強度を示す。すなわち、ｘ軸はナノワイヤ複合体１００の量に比例する。ｙ軸は染まったＣＤ８陽性Ｔ細胞の染料（蛍光標識されたＣＤ３分子）の蛍光強度を表す。つまり、ｙ軸はＣＤ８陽性Ｔ細胞の数に比例する。ナノワイヤ複合体１００の量が増加するにつれて、蛍光体（ＢＶ４２１）とＣＤ８陽性Ｔ細胞に付着した蛍光が両方見える四角の中に結果が移動（ｓｈｉｆｔｉｎｇ）する。したがって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の捕集（ｃａｐｔｕｒｅ）が行われる。ここで、１ＡＵはナノワイヤの任意濃度を指し、実測値は１ ＡＵ当たり２.７５ μｇ／ｍＬ 水準で、既存のナノ素材基盤バイオセンサと比較して著しく少ない量のナノワイヤのみが使用された。

ＣＤ３抗体はＣＤ３及びＣＤ４ Ｔセルを捕集する。ナノワイヤ複合体の濃度は、０、５ＡＵ、１０ＡＵ、２０ＡＵ、４０ＡＵ、及び８０ＡＵで測定された。この場合、四角ボックスはナノワイヤ複合体の細胞捕集効率を示す。

ＣＤ８分子に対する免疫細胞捕集用抗体が結合したナノワイヤ複合体の量が５ＡＵから８０ＡＵまでに増加するにつれて、蛍光体（ＢＶ４２１）の蛍光強度は増加する。ゆえに、ＣＤ８＋Ｔ 細胞の捕集効率は０.１３から９５.２％までに増加することを確認することによって、ナノワイヤ複合体の細胞捕集性能を検証した。

［生体分子定量分析による検知感度分析］
ナノワイヤ複合体１００にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を定量分析して、免疫物質検知感度を測定した。ナノワイヤ複合体１００の量を６８７.５ｎｇで固定させた後、免疫物質であるＩＦＮ−γの量を調節した後、ＩＦＮ−γをナノワイヤ複合体溶液に混合して、常温で２時間抗原抗体反応を誘導させる。ナノワイヤ複合体１００の第１抗体（ＩＦＮ−γ検知用抗体）は、免疫物質であるＩＦＮ−γと反応する。

未反応のまま残った免疫物質（ＩＦＮ−γ）は、リン酸緩衝液で洗浄して除去される。

ナノワイヤ複合体１００に付着されたＩＦＮ−γ検知用抗体と他のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ、抗体認識部位）に反応するＡＦ４８８蛍光物質を有する補助ＩＦＮ−γ検知用抗体は、ＩＦＮ−γを介在してサンドイッチ結合する。

常温で２時間反応した後、未反応のまま残った補助ＩＦＮ−γ検知用抗体は、リン酸緩衝液で洗浄して残留物を除去する。

最終反応が完了したナノワイヤ複合体溶液は、２００μＬに完全に分散させる。検知された免疫物質の定量分析は、ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒの相対的な蛍光値（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔ）の強度を比較して行われる。この場合、補助蛍光体（ＡＦ４８８蛍光物質）の蛍光検知波長帯は５３５ｎｍである。

図６は、本発明の一実施例によるナノワイヤ複合体の免疫物質（ＩＦＮ−γ）の濃度による相対的形状の強度を示すグラフである。

図６に示すように、この場合、著しく少量（５ＡＵ）のナノワイヤ複合体１００の濃度（１３.７５μｇ／ｍＬ）であるにもかかわらず、ＩＦＮ−γの検知限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＬＯＤ）は７２４ｐｇ／ｍＬである。このような検知限界は、常用免疫検知装置の検知限界より低い。

図７は、本発明のために電気めっき法で製造した鉄／金多層ナノワイヤの解像度透過電子顕微鏡（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＨＲＴＥＭ）写真及びエネルギ分散型分光分析法（ＥＤＳ）写真である。

図７に示すように、多層ナノワイヤは交互に積層された２０ｎｍの鉄層と２０ｎｍの金層を含む。エネルギ分散型分光分析法のデータを参照すると、鉄の重量パーセントと金の重量パーセントは一定の周期を有する。それに応じて、鉄／金多層ナノワイヤの構造が確認される。

図８Ａ及び図８Ｂは、フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）及びゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をそれぞれ示す結果である。

図８Ａ及び図８Ｂに示すように、ナノワイヤ１１０の表面処理は、アミノ基とカルボキシル基を両端に同時に有している１１−アミノウンデカン酸（１１-ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を第２金属（鉄）に行う。ＦＴＩＲ結果を参照すると、表面処理前のナノワイヤで検出されないＮＨ２ピークとＣＯＯ−ピークが検出される。したがって、表面官能基処理前後の差から、アミノ基と鉄層の結合によってカルボキシル基でコーティングされた多層ナノワイヤであることが分かる。

図９Ａは、蛍光物質（ＢＶ４２１）が結合されたバーコードナノワイヤの発光結果である。

図９Ｂは、蛍光物質（ＡＦ４８８）が結合されたバーコードナノワイヤの発光結果である。

図９Ａ及び図９Ｂに示すように、第２抗体に結合された蛍光体（ＢＶ４２１）の蛍光スペクトルは、４２５ でピークを示す。また、第１補助抗体に結合された補助蛍光体（ＡＦ４８８）の蛍光スペクトルは、５００ｎｍでピークを示す。励起光の波長は４０５ｎｍである。

図１０は、ナノワイヤ複合体を表す共焦点レーザ顕微鏡のイメージである。

図１０の上部イメージに示すように、第２抗体に結合された蛍光体（ＢＶ４２１）は、ナノ複合体の第２金属（鉄）でのみ蛍光を表す。すなわち、蛍光体（ＢＶ４２１）が結合されている免疫細胞（ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞捕集用抗体（第２抗体）が立体障害と選択的化学反応によって第２金属（鉄）のみで選別的に付着される。

図１０の下部イメージに示すように、ナノ複合体の第１金属（金）に選択的に固定化されたＩＦＮ−γ検知用抗体がＩＦＮ−γとの抗原抗体結合後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）蛍光物質が結合されている補助ＩＦＮ−γ検知用抗体がサンドイッチ結合を成すことを示す。

図１１は、蛍光体と補助蛍光体との間の蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）現象を確認するために、アクセプタ（ａｃｃｅｐｔｏｒ）の蛍光をブリッチング（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）させた後、ドナ（ｄｏｎｏｒ）の蛍光強度の増加を確認した結果である。

図１１に示すように、ＦＲＥＴ効率は１４.４ パーセントである。

上記のように、本発明を特定の好ましい実施例に対して図示して説明したが、本発明はこのような実施例に限らず、当該発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が特許請求の範囲で請求する本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で行うことができる様々な形態の実施例をすべて含む。

１１０ 多層ナノワイヤ
１１２ 第１金属
１１４ 第２金属
１２２ 高分子
１２４ 第２抗体
１２６ 蛍光体
１３４ 第１抗体
１３７ 補助抗体
１３８ 補助蛍光体

Claims (20)

1. 第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤを調製する段階と、
   両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子を前記第２金属に付着する段階と、
   前記多層ナノワイヤの前記第１金属にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理された第１抗体を付着する段階と、
   前記第２金属に前記高分子のカルボキシル基を通して前記第２抗体を付着する段階と、を含み、
   前記第２抗体は蛍光体を含むことを特徴とする免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
2. 前記第１金属は金であり、
   前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料であることを特徴とする請求項１に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
3. 両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、エチル基又はポリエチレングリコールに連結されることを特徴とする請求項１に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
4. 両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）であることを特徴とする請求項３に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
5. 前記チオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）の処理は、前記高分子のアミノ基と反応できる２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ又はＳＡＴＡ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）を用いて行われることを特徴とする請求項４に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
6. 前記第１抗体は、前記第２抗体より先に反応させることを特徴とする請求項１に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
7. 前記第２抗体は、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、そしてｓｕｌｆｏ ＮＨＳ（ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）と混合された後、前記高分子に結合することを特徴とする請求項５に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
8. 前記多層ナノワイヤの前記第１金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであり、
   前記多層ナノワイヤの前記第２金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体の製造方法。
9. 第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤと、
   前記第２金属に付着され、両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子と、
   前記多層ナノワイヤの前記第１金属にチオール基（ｔｈｉｏｌ’ｓ ｇｒｏｕｐ）で処理されたあと付着された第１抗体と、
   前記第２金属に前記高分子のカルボキシル基を通して付着された前記第２抗体と、を含み、
   前記第２抗体は蛍光体を含むことを特徴とする免疫物質検知ナノワイヤ複合体。
10. 前記第１抗体は、免疫物質及び第１補助抗体とサンドイッチ結合し、
    前記第１補助抗体は補助蛍光体を含み、
    前記第２抗体は免疫細胞と結合し、
    前記第２抗体の蛍光体は外部光の提供を受けて第１蛍光を提供し、
    前記第１抗体の補助蛍光体は、前記第２抗体の蛍光体の第１蛍光の提供を受けて第２蛍光を提供することを特徴とする請求項９に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体。
11. 前記第１金属は金であり、
    前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料であることを特徴とする請求項９に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体。
12. 両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、エチル基又はポリエチレングリコールに連結されることを特徴とする請求項９に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体。
13. 両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）であることを特徴とする請求項９に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体。
14. 前記多層ナノワイヤの前記第１金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであり、
    前記多層ナノワイヤの前記第２金属の厚さは２０ｎｍないし５０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の免疫物質検知ナノワイヤ複合体。
15. 第１金属及び第２金属が交互に積層された多層ナノワイヤ、前記第１金属に付着された第１抗体、及び前記第２金属に付着された高分子、蛍光体を含み、前記高分子に付着された第２抗体を含むナノワイヤ複合体を調製する段階と、
    免疫細胞を含む免疫細胞溶液を調製する段階と、
    前記ナノワイヤ複合体と前記免疫細胞溶液を混合して第１混合溶液を生成し、前記免疫細胞と前記第２抗体を反応させる段階と、
    補助蛍光体を含む第１補助抗体を前記ナノワイヤ複合体と前記免疫細胞溶液が混合された混合溶液に投入して第２混合溶液を生成し、前記免疫細胞が放出した免疫物質、第１抗体、及び第１補助抗体をサンドイッチ結合させる段階と、
    励起光を第２混合溶液に照射して前記蛍光体を発光させ、前記蛍光体の発光による前記補助蛍光体の発光を検出する段階と、を含むことを特徴とする免疫物質検知方法。
16. 前記第１抗体とサンドイッチ結合しない前記第１補助抗体を除去する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の免疫物質検知方法。
17. 前記免疫細胞と前記第２抗体が反応しないナノワイヤ複合体を除去する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の免疫物質検知方法。
18. 前記免疫細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞であり、
    前記免疫物質はＩＦＮ−γであることを特徴とする請求項１５に記載の免疫物質検知方法。
19. 前記第１金属は金であり、
    前記第２金属はＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏのうち少なくとも一つを含む強磁性材料であることを特徴とする請求項１５に記載の免疫物質検知方法。
20. 両端にカルボキシル基とアミノ基を有する高分子は、エチル基又はポリエチレングリコールに連結されることを特徴とする請求項１５に記載の免疫物質検知方法。
    
    

Images