JP2022064287A - 幹細胞の挙動調節用ナノコイル－基板複合体、その製造方法、及びそれを利用した幹細胞の付着及び分化調節方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】リガンドがコーティングされたナノコイルを含む基板を提供し、リガンドがコーティングされたナノコイルに磁場を印加することを制御して幹細胞の付着及び分化を調節する方法を提供する。【解決手段】基板、基板と化学結合されたナノコイル、及びナノコイルと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、ナノコイルは螺旋形のナノワイヤで構成され、一つ以上の金属元素を含み、ナノコイルは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むことを特徴とする幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体：［式１］｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ式１において、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。【選択図】図１
Description
本発明は幹細胞の付着及び分化調節のためのナノコイル（ｎａｎｏｃｏｉｌ）ー基板複合体、その製造方法及び前記ナノコイル－基板複合体を利用した幹細胞の付着及び分化調節方法に関し、具体的には、前記ナノコイル－基板複合体に磁場印加有無によって幹細胞の細胞付着及び分化を調節する方法に関する。
幹細胞は自己再生を通じて増殖が可能であり、骨、脂肪、筋肉、心筋、血管、軟骨などの多様な細胞に分化することができる可能性を有する。最近には、このような特性を利用して損傷された組職、臓器を再生するために幹細胞或いは幹細胞から分化された細胞の体内移植がたくさん研究されている。また、幹細胞が特定細胞に分化することができるように補助することができる生体材料も活発に研究されている。
このように、幹細胞の再生効果を効率的に制御するための方法として生体内でリガンドの提示を通じた技術が利用されている。しかしながら、従来のマイクロ規模のインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）着脱（ｕｎｃａｇｉｎｇ）が幹細胞の付着を調節するが、幹細胞の分化に対する調整はしないという問題がある。
そこで、本出願人はナノバーコードリガンドの周期性及び配列順を制御して幹細胞の付着及び分化を制御する技術を開発及び出願したことがある。
以下、本願出願人は既に出願した幹細胞付着及び分化技術に比べてさらに向上され、生体親和的技術を提供することができる技術を提案する。特にリガンドを予め設計して挿入する方式ではなく、注入後外部刺激を利用して細胞の特性をリアルタイムに変化させることができる技術を提案する。
本発明が解決しようとする課題は、リガンドがコーティングされたナノコイルを含む基板を提供し、リガンドがコーティングされたナノコイルに磁場を印加することを制御して幹細胞の付着及び分化を調節する方法を提供することにある。
本発明は、基板、基板と化学結合されたナノコイル、及び前記ナノコイルと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノコイルは螺旋形のナノワイヤで備えられ、一つ以上の金属元素を含み、前記ナノコイルは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含む幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体を提供する。
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
また、本発明は一つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノコイルを用意するステップと、前記ナノコイルと第１懸濁液とを混合してナノコイルにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、カルボン酸塩が置換されたナノコイルを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノコイルが結合された基板を製造するステップと、ナノコイルが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持してナノコイルの末端にリンカーを結合するステップと、インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノコイルが結合された基板を混合してナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含む幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法を提供する。
また、本発明は前述した幹細胞の細胞付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体に培養液を処理した後、２０ｍＴ～７Ｔの磁場を印加して幹細胞の細胞付着及び分化を調節するステップを含み、前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含む幹細胞の付着及び分化調節方法を提供する：
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
本発明による幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体は、インテグリンリガンドがコーティングされたナノコイルに磁場の印加有無を制御することにより可逆的な制御が可能であり、生体内及び生体外での幹細胞の付着及び表現型分化を効率的に調節することができる。
以下、本発明をより具体的に説明するために、本発明による好ましい実施例を添付図面を参照してより詳しく説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。
本発明は、基板、基板と化学結合されたナノコイル、及び前記ナノコイルと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノコイルは螺旋形のナノワイヤで備えられ、一つ以上の金属元素を含み、前記ナノコイルは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含む幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体を提供する：
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
図１は本発明による幹細胞の細胞付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体及びこれを利用した幹細胞の細胞付着及び分化調節方法を示した模式図である。
図１によれば、本発明のナノコイル－基板複合体は、基板、基板と化学結合されたナノコイル、及び前記ナノコイルと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノコイルは螺旋形に捻じられた形態のナノワイヤで備えられ、前記ナノワイヤはコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つ以上の金属元素を含むことが分かる。
具体的には、前記ナノコイルは式１を充足する螺旋形ナノワイヤで備えられることができる：
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
前記式１で、磁場が印加されないナノコイルの長さは１００ｎｍ～２０μｍ、５００ｎｍ～４μｍまたは１μｍ～３μｍであってもよい。
前記のように、磁場を印加する時、ナノコイルが伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）されて長さが長くなると、生体内で幹細胞の付着を促進させることができる。ただ、磁場が除去される場合ナノコイルが収縮して既存のナノコイルの長さに戻る。
具体的には、前記式１で磁場の印加有無によるナノコイルの長さ変化は１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、１０ｎｍ～５００ｎｍまたは１０ｎｍ～１００ｎｍであってもよい。
本発明のナノコイル－基板複合体でナノコイルの長さ変化が前記式１を充足しない場合、前記ナノコイルの長さ変化が小さくて細胞付着能の差を見せなくて問題になる。
前記ナノコイルの螺旋形外径の平均長さは５０ｎｍ～２００ｎｍまたは１００ｎｍ～２００ｎｍであってもよい。ナノコイルの螺旋形外径が１００ｎｍ未満の場合、ナノコイルが小さすぎてインテグリンリガンドペプチドが所定の間隔を隔てて結合しにくくなり、外径が２００ｎｍを超える場合、基板上にナノコイルが占める領域が広くなって基板で適切な密度で分布しにくいという問題がある。
前記ナノコイルはナノワイヤからなり、前記ナノワイヤはコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つまたは二つ以上の金属元素を含むことができ、前記ナノワイヤは断面が円形のワイヤ形態で備えられ、直径は５ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍまたは５０ｎｍ～８０ｎｍであってもよい。前記のようなワイヤの直径を充足しない場合、ナノコイルの伸長及び収縮が円滑に現れないないことがある。
前記ナノコイル内に結合されたインテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドであってもよく、前記インテグリンリガンドペプチドは複数個が前記ナノコイルに互いに離隔されて結合され、互いに隣合うインテグリンリガンドの間の平均間隔は１ｎｍ～１０ｎｍであってもよい。互いに隣合うインテグリンリガンドペプチドの間の平均間隔が１ｎｍ未満の場合、磁場を印加した場合にも幹細胞の付着及び分化を活性化しにくく、１０ｎｍを超える場合、磁場を印加しない場合にも幹細胞の付着及び分化を活性化して磁場を利用した可逆的制御をしにくいという問題が発生する。
前記ナノコイルで磁場を印加する時、前記ナノコイルの互いに隣合う螺旋は離隔され、互いに隣合うらせんの間のピッチ（ｐｉｔｃｈ）は１ｎｍ～１００ｎｍ、１ｎｍ～５０ｎｍまたは５ｎｍ～３０ｎｍであってもよい。これは磁場の印加時にナノコイルが伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）しながらピッチ間隔が増加したのである。それによってインテグリンリガンドペプチドの間隔も増加する。
前記インテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドで、インテグリンリガンドペプチドのチオール基と螺旋形のナノコイルのポリエチレングリコールリンカーによって結合されることができる。前記ポリエチレングリコールリンカーはマレイミド－ポリエチレングリコール－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。前記のようなリンカーを含んでナノコイルとインテグリンリガンドペプチドとの間の結合力を高めて耐久性を向上させることができる。
前記ナノコイルはカルボン酸塩が置換された構造であってもよい。前記カルボン酸塩置換基はアミノ酸誘導体、具体的にはアミノカプロン酸であってもよい。前記のように、ナノコイルがカルボン酸塩が置換された構造を有することにより、基板及びインテグリンリガンドペプチドとの結合力を高めることができる。
前記基板は表面がアミン化された基板で、アミノシラン溶液に担持されて表面が活性化された基板であってもよく、前記基板の表面にあるアミノ基とナノコイルのカルボキシル基がＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて結合された構造であってもよい。
また、前記基板はナノコイルが結合されない基板の表面が非活性化されたものであってもよい。
また、本発明は一つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノコイルを用意するステップと、前記ナノコイルと第１懸濁液とを混合してナノコイルにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、カルボン酸塩基が置換されたナノコイルを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノコイルが結合された基板を製造するステップと、ナノコイルが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持してナノコイルの末端にリンカーを結合するステップと、インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノコイルが結合された基板を混合してナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含む幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法を提供する。
前記ナノコイルを用意するステップで金属元素を含む溶液はコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つまたは二つ以上の金属元素を含むことができる。
前記ナノコイルを用意するステップは、ナノ気孔を有し、一面に作用電極を有するナノテンプレート（ｎａｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を用意するステップと、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；Ｃ６Ｈ８Ｏ６）、オキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）及び蒸着しようとする金属を含む金属前駆体溶液を含む第１金属前駆体混合液を用意するステップと、前記第１金属前駆体混合液に硝酸（Ｎｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；ＨＮＯ３）を混合して第２金属前駆体混合液を用意するステップと、前記第２金属前駆体混合液に前記ナノテンプレートを浸漬し、前記第２金属前駆体混合液に挿入された対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）と前記作用電極との間に電流を印加して電気メッキ方式で前記ナノ気孔に金属ナノコイルを蒸着させるステップと、前記金属ナノコイルが蒸着されたナノテンプレートで前記作用電極及び前記ナノテンプレートを選択的に除去するステップと、を含む。
前記ナノテンプレートとしては陽極酸化アルミニウム（Ａｎｏｄｉｃ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｏｘｉｄｅ、ＡＡＯ）ナノテンプレート、無機材料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ）ナノテンプレートまたは高分子ナノテンプレートを用いる。ここでは、陽極酸化アルミニウムナノテンプレートを用いる場合を図示する。陽極酸化アルミニウムをナノテンプレート細孔（Ｐｏｒｅ）の直径によってナノワイヤーの大きさが決まり、ナノワイヤーの形成時間及び速度によってナノワイヤーの長さが決まる。
前記ナノ気孔の平均直径は５ｎｍ ～５００ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍまたは１００ｎｍ～２００ｎｍであってもよい。
前記金属前駆体溶液は硫酸コバルト（ＩＩ）七水和物（ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）及び硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の中で少なくとも一つを含むことができる。
硫酸コバルト（ＩＩ）七水和物（ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の濃度は３０ｍＭ～１００ｍＭで、オキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）の濃度は３０ｍＭ～１００ｍＭで、鉄硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の濃度は３０ｍＭ～１００ｍＭで、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；Ｃ６Ｈ８Ｏ６）の濃度は２０ｍＭ～５０ｍＭであってもよい。
前記第２金属前駆体混合液のｐＨは１．５～２．５であってもよい。
前記ナノテンプレートを前記第２金属前駆体混合液に浸漬し、前記第２金属前駆体混合液を収納するメッキ槽（ｐｌａｔｉｎｇ ｂａｔｈ）を減圧するステップをさらに含むことができる。前記メッキ槽の圧力は１００Ｔｏｒｒ～７００Ｔｏｒｒであってもよい。
電気メッキ時に前記作用電極に流れる電流密度は０．１～３００ｍＡ／ｃｍ２で、電気メッキ時間は１分～４８時間であってもよい。
電子ビーム蒸着法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で陽極酸化アルミニウムナノテンプレートの底面に厚さ２５０ｎｍの銀（Ａｇ）電極層を形成する。この電極層は電着時に陰極の役割を果たす。ここで、電極層として他の金属または他の伝導性物質層を用いることができる。
前記カルボン酸塩置換基を置換するステップは、前記ナノコイルと第１懸濁液を混合して８～２０時間または１０～１５時間反応させて実施することができる。前記第１懸濁液はカルボン酸塩置換基を含むアミノ酸誘導体を含むことができ、具体的には、前記アミノ酸誘導体はアミノカプロン酸であってもよい。前記のような第１懸濁液と反応させて前記アミノ酸誘導体がナノコイルの面に結合することができる。
前記ナノコイルが結合された基板を製造するステップは、カルボン酸塩が置換されたナノコイルを含む溶液に表面が活性化された基板を担持して実施することができる。
前記表面が活性化された基板は塩酸及び硫酸の中の何れか一つ以上を含む酸性溶液に３０分～２時間または３０分～１時間浸漬させて製造することができる。これを通じて、前記基板の表面に水酸化基を結合させてアミノ基との結合を容易にして基板の表面活性化を効果的に行うことができる。
前記ナノコイルが結合された基板を製造するステップは、前記表面が活性化された基板を暗条件下でアミノ－シラン溶液に基板を担持して基板の表面をアミン化させることができる。前記アミノ－シラン溶液は（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含むことができる。この時、基板の表面をアミン化させるとは基板の上にアミン基を結合させたという意味である。前記のように、アミノ－シラン溶液に浸漬して基板の表面をアミン化させることにより前記ナノコイルとＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて結合することができる。
前記ナノコイルの末端にリンカーを結合するステップは、ナノコイルが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持して実施することができる。前記ポリエチレングリコールリンカーはマレイミド－ポリエチレングリコール－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。前記のようなリンカーを含んでナノコイルとインテグリンリガンドペプチドとの間の結合力を高めて耐久性を向上させることができる。
前記ナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップは、インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノコイルが結合された基板を混合して実施することができる。前記第２懸濁液はチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含むことができる。
前記ナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップ以後にポリエチレングリコール誘導体を含む溶液にナノコイルが結合された基板を担持してナノコイルが結合されない基板の表面を非活性化させるステップをさらに含むことができる。前記ポリエチレングリコール誘導体はメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－スクシンイミジルカルボキシメチルエステルであってもよい。
また、本発明は前述した幹細胞の細胞付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体に処理した後、２０ｍＴ～７Ｔの磁場を印加して幹細胞の細胞付着及び分化を調節するステップを含み、前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが変化し、下記式１を充足することを特徴とする幹細胞の付着及び分化調節方法を提供する：
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
前記幹細胞の細胞付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル－基板複合体に磁場の印加有無によって可逆的にナノコイルの長さを変化させて生体内及び生体外の幹細胞の付着及び分化を調節することができる。
具体的には、幹細胞の付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル－基板複合体に磁場を印加しない場合ナノコイルが収縮し、ナノコイルのピッチの間隔が減小して幹細胞の付着及び機械感知分化を低下させる可能性がある。
また、幹細胞の付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル－基板複合体に磁場を印加する場合ナノコイルが伸長し、ナノコイルのピッチの間隔が増加して幹細胞の付着及び機械感知分化を促進することができる。
例えば、ナノコイル－基板複合体に磁場を印加してから磁場を除去する場合、ナノコイルの長さが伸長及び収縮が可逆的に発生する。具体的には、磁場を印加してから除去した後再び磁場を印加する場合、ナノコイルの長さが伸長した後収縮してから再び伸長することができる。
これを通じて、本発明によるナノコイル－基板複合体を利用した幹細胞の細胞付着及び分化調節は時間的及び可逆的に調節することができる。
具体的には、前記式１で磁場の印加有無によるナノコイルの長さ変化は１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、１０ｎｍ～５００ｎｍまたは１０ｎｍ～１００ｎｍであってもよい。
本発明のナノコイル－基板複合体でナノコイルの長さ変化が前記式１を充足しない場合、前記ナノコイルの長さ変化が少なくて細胞付着能の差を見せなくて問題になる。
以下、本発明の実施例を記載する。しかし、以下の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の権利範囲が以下の実施例によって限定されるのではない。
［製造例］
製造例
ナノコイルの製造
気孔直径が２００ｎｍの陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）の多孔性テンプレートを用いて電着して製造した。まず、陽極酸化アルミニウム多孔性テンプレートの片面に電子ビーム蒸発器を用いて銀（Ａｇ）を蒸着した。金属イオン前駆体溶液で硫酸コバルト七水和物（ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８Ｍ）と硫酸鉄七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８Ｍ）を脱イオン水に混合して用意した。ＣｏＦｅナノコイルを生産するためにオキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）とＬ－アスコルビン酸（０．０６Ｍ）を前記金属イオン前駆体溶液に添加した。その後、硝酸を前駆体溶液に添加してｐＨ２．５に調整した後、陽極酸化アルミニウムテンプレートの気孔に注入し、２０ｍＡ／ｃｍ２の所定の電流密度を１分間印加してＣｏＦｅナノコイルを蒸着した。ＣｏＦｅナノコイルが蒸着されたナノテンプレートを１ＭのＮａＯＨで４５℃で３０分間反応させてナノテンプレートを除去した後脱イオン水で洗浄してＣｏＦｅナノコイルを製造した。洗浄されたＣｏＦｅナノコイルは基板に結合する前に１ｍＬの脱イオン水に懸濁した。
製造例
ナノコイルの製造
気孔直径が２００ｎｍの陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）の多孔性テンプレートを用いて電着して製造した。まず、陽極酸化アルミニウム多孔性テンプレートの片面に電子ビーム蒸発器を用いて銀（Ａｇ）を蒸着した。金属イオン前駆体溶液で硫酸コバルト七水和物（ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８Ｍ）と硫酸鉄七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８Ｍ）を脱イオン水に混合して用意した。ＣｏＦｅナノコイルを生産するためにオキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）とＬ－アスコルビン酸（０．０６Ｍ）を前記金属イオン前駆体溶液に添加した。その後、硝酸を前駆体溶液に添加してｐＨ２．５に調整した後、陽極酸化アルミニウムテンプレートの気孔に注入し、２０ｍＡ／ｃｍ２の所定の電流密度を１分間印加してＣｏＦｅナノコイルを蒸着した。ＣｏＦｅナノコイルが蒸着されたナノテンプレートを１ＭのＮａＯＨで４５℃で３０分間反応させてナノテンプレートを除去した後脱イオン水で洗浄してＣｏＦｅナノコイルを製造した。洗浄されたＣｏＦｅナノコイルは基板に結合する前に１ｍＬの脱イオン水に懸濁した。
比較制造例
陰性荷電されたチオール化されたＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を添加しないことを除いて製造例１と同じ方法でナノコイルを製造した。
陰性荷電されたチオール化されたＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を添加しないことを除いて製造例１と同じ方法でナノコイルを製造した。
［実施例］
実施例
ナノコイル－基板複合体製造
アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）は製造例で製造したナノコイルの天然酸化物層と反応するものと知られたアミングループに基づいて磁気ＣｏＦｅナノコイルの表面にカップリングするのに使われた。１ｍＬのナノコイルと１ｍＬの６ｍＭアミノカプロン酸溶液の混合溶液を室温で１２時間撹拌した後、遠心分離して脱イオン水で洗浄した。２２ｍｍ×２２ｍｍの平面の細胞培養グレード硝子基板をアミン化させてナノコイルの表面にカルボキシレート基が基板上のアミン基に結合されるようにする。まず、基板を塩酸及びメタノールを１：１で混合した混合物で３０分間洗浄し、脱イオン水で洗浄した。洗浄された基板を硫酸で１時間活性化させて脱イオン水で洗浄した。基板を暗室で３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及びエタノール（１：１）で１時間アミン化してエタノールで洗浄した後、１００℃で１時間乾燥した。１ｍＬの脱イオン水でアミノカプロン酸が結合されたナノコイルを０．５ｍＬの２０ｍＭのＮ－エチル－Ｎ`－（３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ）及び０．５ｍＬの２０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を含む脱イオン水１ｍＬで３時間ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて活性化させ、その後、脱イオン水で洗浄した。
実施例
ナノコイル－基板複合体製造
アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）は製造例で製造したナノコイルの天然酸化物層と反応するものと知られたアミングループに基づいて磁気ＣｏＦｅナノコイルの表面にカップリングするのに使われた。１ｍＬのナノコイルと１ｍＬの６ｍＭアミノカプロン酸溶液の混合溶液を室温で１２時間撹拌した後、遠心分離して脱イオン水で洗浄した。２２ｍｍ×２２ｍｍの平面の細胞培養グレード硝子基板をアミン化させてナノコイルの表面にカルボキシレート基が基板上のアミン基に結合されるようにする。まず、基板を塩酸及びメタノールを１：１で混合した混合物で３０分間洗浄し、脱イオン水で洗浄した。洗浄された基板を硫酸で１時間活性化させて脱イオン水で洗浄した。基板を暗室で３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及びエタノール（１：１）で１時間アミン化してエタノールで洗浄した後、１００℃で１時間乾燥した。１ｍＬの脱イオン水でアミノカプロン酸が結合されたナノコイルを０．５ｍＬの２０ｍＭのＮ－エチル－Ｎ`－（３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ）及び０．５ｍＬの２０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を含む脱イオン水１ｍＬで３時間ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて活性化させ、その後、脱イオン水で洗浄した。
アミン化された基板を活性化されたナノコイルに１時間漬けた後脱イオン水で洗浄した。インテグリンリガンドはまず０．０４ｍＭのマレイミド－ポリ（エチレングリコール）－ＮＨＳエステルリンカーと２μlのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２μＬ）を含む１ｍＬの脱イオン水で暗条件下で１６時間振りながら培養してアミド結合を形成して基板の表面にグラフトされた後脱イオン水で洗浄した。チオール－エン反応を媒介するために前記基板をチオール化されたＲＧＤペプチドリガンド（ＧＣＧＹＣＦＣＤＳＰＧ、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ、０．０４Ｍ）、２μＬのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及び１０Ｍｍのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）を含む脱イオン水１ｍＬで暗条件下で２時間培養した後脱イオン水で洗浄した。細胞の培養前に非－ＲＧＤリガンド特異的幹細胞付着を最小化するために、ナノコイルが結合されない領域を暗所で２μＬのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及び１００μΜメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）を含む脱イオン水１ｍＬで２時間反応させた後洗浄して基板の非－ナノコイルーコーティングされた領域を遮断した。
比較例１
前記比較制造例１で製造したナノコイルを用いたことを除いて同じ方法でナノコイル－基板複合体を製造した。
前記比較制造例１で製造したナノコイルを用いたことを除いて同じ方法でナノコイル－基板複合体を製造した。
［実験例］
実験例１
本発明によるナノコイルの形態と化学的特性を確認するために、製造されたナノコイルを対象に走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）、高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲ－ＴＥＭ）及び高分解能走査透過電子顕微鏡（ＨＲ－ＳＴＥＭ）で撮影し、エネルギー分散型Ｘ線分光法（Ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＤＳ）、電子エネルギー損失分光法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ｌｏｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＥＬＳ）、振動試料型磁力計測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ－ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）及びＸ線回折分析（Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＸＲＤ）を利用して分析し、その結果は図２及び図７に示した。
実験例１
本発明によるナノコイルの形態と化学的特性を確認するために、製造されたナノコイルを対象に走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）、高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲ－ＴＥＭ）及び高分解能走査透過電子顕微鏡（ＨＲ－ＳＴＥＭ）で撮影し、エネルギー分散型Ｘ線分光法（Ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＤＳ）、電子エネルギー損失分光法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ｌｏｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＥＬＳ）、振動試料型磁力計測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ－ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）及びＸ線回折分析（Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＸＲＤ）を利用して分析し、その結果は図２及び図７に示した。
図２は本発明によるナノコイルの走査電子顕微鏡イメージである。具体的には、（Ａ）は電着時間によるＣｏＦｅナノコイルの長さを測定した走査電子顕微鏡イメージ及びグラフであり、（ｂ）は電着テンプレートの気孔直径を調節して製造したＣｏＦｅナノコイルの走査電子顕微鏡イメージであり、（ｃ）はコバルトナノコイルとＣｏＦｅナノコイルの走査電子顕微鏡イメージであり、この時、スケールバーは（ａ）１μｍ、（ｂ）５００ｎｍ及び（ｃ）２００ｎｍである。
図２によれば、本発明によるナノコイルは電着テンプレートの気孔直径によってＣｏＦｅナノコイルの直径を調節することができ、金属イオン前駆体を調節することによってナノコイルの構成元素を調節することができ、電着時間によってＣｏＦｅナノコイルの長さを調節することができることが分かる。
図３は本発明によるナノコイルの高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）イメージエネルギー分散型Ｘ線分光法マッピング（ＥＤＳ ｍａｐｐｉｎｇ）及び高分解能走査透過電子顕微鏡（ＨＲ－ＳＴＥＭ）イメージを示した。
図４は本発明によるナノコイルの（ａ）エネルギー分散型X線分光法（ＥＤＳ）及び（ｂ）電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）で分析した結果グラフ及びマッピングイメージである。
図３及び図４によれば、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ及び電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）イメージでナノコイルはコバルト（Ｃｏ）及び鉄（Ｆｅ）からなり、それぞれ約５０原子％の分布で均一に分布されたことを確認することができる。
図５は 本発明によるナノコイルの高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）イメージであり、図６は 本発明によるナノコイルのＸ線回折分析グラフである。
図５及び図６によれば、ナノコイルは体心立方構造の（１１０）結晶面を有することが分かり、平均格子間隔は約２．０２±０．０２Åであることが分かる。また、等方性インテグリンリガンドと結合を促進するためにナノコイルを成すナノワイヤの直径はインテグリン分子大きさの約１０ｎｍとほぼ類似することが分かる。
図７は本発明によるナノコイルの振動試料型磁力計測定結果グラフである。具体的には、コバルト及び鉄によるナノコイルの磁気特性を確認し、これを通じてナノコイルのナノ伸長（「ＯＮ」）及びナノ収縮（「ＯＦＦ」）の可逆的な二重モード（ｂｉｍｏｄａｌ）転換が可能であることが分かる。
実験例２
本発明によるナノコイル－基板複合体の特性を確認するために、ナノコイル－基板複合体を対象に電界放出走査電子顕微鏡で撮影し、フーリエ変換赤外線分光分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＴ－ＩＲ）を実施し、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＡＦＭ）で撮影し、その結果は図８～図１１に示した。
本発明によるナノコイル－基板複合体の特性を確認するために、ナノコイル－基板複合体を対象に電界放出走査電子顕微鏡で撮影し、フーリエ変換赤外線分光分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＴ－ＩＲ）を実施し、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＡＦＭ）で撮影し、その結果は図８～図１１に示した。
フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）はナノコイルの化学的結合特性を確認するために、ＦＴＩＲはＧＸ１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＵＳＡ）を用いて行った。化学的結合特性の変化に対する分析を経たサンプルを分析する前に凍結乾燥させてＫＢｒペレットに稠密にパッキングした。
図８は本発明によるナノコイル－基板複合体を製造するステップを図式化したイメージである。図８によれば、ナノコイルにアミノカプロン酸を結合させた。その後、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を利用してＥＤＣ及びＮＨＳが含まれた水にアミノカプロン酸が結合されたナノコイルを入れて活性化させた後、表面がアミン化された基板と結合させた。基板が結合されないナノコイルに結合されたアミノカプリン酸にポリエチレングリコールを結合させた後チオール化されたインテグリンリガンド（ＲＧＤ）と反応させてインテグリンリガンドをナノコイルに結合させた。
図９は本発明によるナノコイル－基板複合体のフーリエ変換赤外線分光（ＦＴ－ＩＲ）分析した結果である。図９によれば、アミノカプロン酸がコーティングされたナノコイルの化学的結合特性を分かることができる。具体的には、１５６０ー１５６５Ｃｍ－１及び１３８７ー１３８９Ｃｍ－１でＣＯＯ－結合を確認した。これを通じて、ナノコイルにアミノカプロン酸が成功的に結合されたことが分かる。
また、非リガンド特異的（ ｎｏｎ－ｌｉｇａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）幹細胞の接着を最小化するために、ナノリガンドが結合されない基板はメトキシ－ＰＥＧ－ＮＨＳエステルグループと結合して非活性化させ、図３によれば、ナノコイルの均一な分布は走査電子顕微鏡を通じて確認することができ、密度は約６２８０２±２３８５ナノコイル／ｍｍ２であることが分かる。
図１０は本発明によるナノコイルの伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ、「ＯＮ」）及び収縮（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ、「ＯＦＦ」）による弾性運動の磁気二重モードスイッチング（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｉｍｏｄａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を確認するために原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で撮影した結果である。図１１は本発明によるナノコイルに磁場を印加しない場合を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で撮影した結果である。
図１０及び図１１によれば、本発明によるナノコイル－基板複合体は、磁場を印加すればナノコイルの伸長が発生してナノコイルの長さが長くなり、また磁場を印加しない場合、ナノコイルの収縮が発生してナノコイルの長さが元の状態に戻ることが分かる。しかし、ナノコイルの長さだけ長くなってから再び短くなるだけでナノコイルの外径やナノコイルを成すナノワイヤの直径は大きい差がないことを確認することができる。
具体的には、磁場を印加する時のナノコイルの長さは１２４１±２８ｎｍであり、磁場を印加しない場合、ナノコイルの長さは９９５±４ｎｍに減小し、再び磁場を印加すれば、ナノコイルの長さは１２５５±１８ｎｍに伸びることを確認することができる。この時、ナノコイルの外径は１７４ｎｍ～１８０ｎｍに保持され、、ナノコイルを成すナノワイヤの直径は６６～７１ｎｍに保持されて循環スイッチング （ＯＮ→ＯＦＦ→ＯＮ）される間に大きな差がないことを確認することができる。
これを通じて、本発明のナノコイル－基板複合体は二重モードスイッチングする間に巨視的なリガンド密度が一定に保持されることを分かることができる。
実験例３
本発明によるナノコイル－基板複合体に磁場を印加することによって幹細胞の付着に及ぼす影響を確認するために以下のような実験を行い、その結果は図１２～図１６に示した。
本発明によるナノコイル－基板複合体に磁場を印加することによって幹細胞の付着に及ぼす影響を確認するために以下のような実験を行い、その結果は図１２～図１６に示した。
本発明のリガンド含有ナノコイルの可逆的伸長及び収縮の自己スイッチングが幹細胞の焦点付着、機械感知（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ）及び分化に及ぼす影響を調査するために製造例で製造したナノコイル－基板複合体を利用して評価した。基板を用いる前に紫外線下で２時間滅菌した。ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ、Ｌｏｎｚａからの継代５）を約９，５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度に滅菌された基板上にプレーティングし、１０％ウシ胎児血清、４ＭｍのＬ－グルタミン及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンが補充された高グルコースダルベッコの修正されたイーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれた成長培地で５％ＣＯ２下で３７℃で培養した。
幹細胞の焦点付着性及び機械感知は物質の辺縁近くに永久磁石（２７０ｍＴ）を４８時間配置（「ＯＮ」）してナノコイルが物質の辺縁に向けたリアルタイム伸長（ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）を促進または磁石を４８時間除去（「ＯＦＦ」）してナノコイルを元の構造に可逆的収縮を誘導することにより、幹細胞の焦点付着を調査した。幹細胞焦点付着性及び機械感知を評価するための対照実験は二重モードスイッチング（磁場印加／除去）下で行われたが、ナノコイルまたはインテグリンリガンドのない状態で行われた。
図１２は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して培養された幹細胞（４８時間後）のＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比率）を示すグラフ（ｂ）であり、スケールバーは５０μｍを表す。
図１２によれば、磁場を印加した伸長（「ＯＮ」）モードが磁場を除去した収縮（「ＯＦＦ」）モードよりも広い領域にかけてずっと高い付着細胞密度及び焦点付着を促進し、焦点付着複合体でビンキュリンクラスタリングを促進することを確認することができる。
幹細胞の焦点付着に対する周期的転換「ＯＮ」（伸長）及び「ＯＦＦ」（収縮）の効果は磁石を配置（「ＯＮ」）したり除去（「ＯＦＦ」）して５４時間の間調査したり、１８時間ごとに周期的に転換（「ＯＦＦ－ＯＦＦ－ＯＦＦ」、「ＯＦＦ－ＯＮ－ＯＦＦ」、「ＯＮ－ＯＦＦ－ＯＮ」及び「ＯＮ－ＯＮ－ＯＮ」）して調査した。
図１３は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して１８時間ごとに磁場印加を変化させて培養された幹細胞（５４時間後）のＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージであり、スケールバーは５０μｍを表す。
図１４は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して１８時間ごとに磁場印加を変化させて培養された幹細胞の共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比率）を示すグラフである。
図１３及び図１４によれば、ナノコイル－基板複合体の二重モードスイッチングである「ＯＮ」（伸長）及び「ＯＦＦ」（収縮）はそれぞれ繰り返されたサイクルで可逆的インテグリンβ１発現及び幹細胞の焦点付着を促進及び抑制した。具体的には、磁場を印加する伸長モードでは幹細胞焦点付着が促進され、磁場を除去した収縮モードでは幹細胞焦点付着が抑制されたことが分かる。そこで、磁場を印加してから除去した場合、付着細胞密度、細胞面積及び焦点付着数が増加してから減少することを確認することができる。
付着性幹細胞でＣｏＦｅナノコイルの伸長及び収縮の細胞適合性を確認するために細胞染色を行った。４８時間に伸長（「ＯＮ」）または収縮（「ＯＦＦ」）条件で培養されたリガンドコーティングされたＣｏＦｅナノコイルに付着された幹細胞をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、ＤＭＥＭに０．０５％緑色蛍光カルセイン－ＡＭ及び０．２％赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む染色溶液で３７℃で３０分間培養した。染色された細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡でイメージ化し、幹細胞の生存力を決めるために生きている細胞（緑色）及び死んだ細胞（赤色）の数を数えた。
図１５は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して培養された幹細胞（４８時間後）の生きている細胞と死んだ細胞に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞生存能力を示したグラフ（ｂ）であり、スケールバーは５０μｍを表す。
図１５によれば、ＣｏＦｅナノコイル－基板複合体を用いて磁場印加する伸長モード及び磁場を印加しない収縮モード何れも細胞生存能力が９５％と優れて幹細胞に対して細胞毒性がなくて細胞適合性が優れていることが分かる。
図１６は本発明の比較例によるナノコイルのない基板（Ｎｏ ｎａｎｏｃｏｉｌ）またはインテグリンリガンド（ＲＧＤ）が結合されないナノコイル－基板複合体で二重モードスイッチング（ｂｉｍｏｄａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に対する幹細胞の付着性実験で、培養された幹細胞（２４時間後）のＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比率）を示したグラフ（ｂ）であり、この時、スケールバーは５０μｍを表す。
図１６によれば、比較例はナノコイルがないかインテグリンリガンド（ＲＧＤ）が結合されない基板を用いた状態で二重モードスイッチング「ＯＮ」及び「ＯＦＦ」で有意味な差がないので、幹細胞の付着を促進しないことを確認することができる。
これを通じて、本発明のナノコイル－基板複合体の場合、インテグリンリガンドペプチドとナノコイルに結合されてこそ二重モードスイッチングが効果を現すので、幹細胞の付着を促進し、遠隔で調節するためにはインテグリンリガンドペプチド及びナノコイルが全部必要であることが分かる。
実験例４
本発明によるナノコイル－基板複合体を利用した遠隔及び可逆的二重モードスイッチングである「ＯＮ」（伸長）及び「ＯＦＦ」（収縮）が幹細胞の骨形成分化に対して及ぼす効果を調べるための実験を次のように実行し、その結果は図１７～２４に示した。
本発明によるナノコイル－基板複合体を利用した遠隔及び可逆的二重モードスイッチングである「ＯＮ」（伸長）及び「ＯＦＦ」（収縮）が幹細胞の骨形成分化に対して及ぼす効果を調べるための実験を次のように実行し、その結果は図１７～２４に示した。
インテグリン結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）媒介調節付着及び幹細胞の拡散は幹細胞分化を媒介する機械感知信号を活性化する。細胞付着性フィブロネクチン及びラミニンの周期巨視的伸長は幹細胞で焦点付着キナーゼ（ＦＡＫ）リン酸化を活性化して骨形成分化を促進する。
図１７は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して１８時間の間隔で磁場印加を調節して３６時間培養された幹細胞のＦ－アクチン、核及びＹＡＰに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した核／細胞質ＹＡＰ比率を示したグラフ（ｂ）であり、この時、スケールバーは５０μｍを表す。
図１８は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して１８時間の間隔で磁場印加を調節して３６時間培養された幹細胞のＦ－アクチン、核及びＴＡＺに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した核／細胞質ＴＡＺ比率を示したグラフ（ｂ）であり、この時、スケールバーは５０μｍを表す。
図１７及び図１８によれば、時間を調節した二重モードスイッチングで磁場を印加する伸長（「ＯＮ」）モードは免疫蛍光を通じて可逆的方式で幹細胞のＹＡＰ及びＴＡＺ機械変換器（ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）のかなり高い核移行を刺激するということを確認することができる。
図１９は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して幹細胞を５日間培養するが、２日目の日に磁場印加を調節して培養された幹細胞のオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、Ｆ－アクチン、核に対する共焦点免疫蛍光イメージ及びＡＬＰ染色イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算したアルカリ性ホスファターゼ－陽性細胞比率を示したグラフ（ｂ）であり、この時、スケールバーは５０μｍを表す。
図２０は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して幹細胞を３日間培養するが、一日経った日に磁場印加を調節して培養された幹細胞の核／細胞質ＲＵＮＸ２及びＡＬＰ遺伝子発現プロファイルを定量的に分析したグラフである。
図２１は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して幹細胞を５日間培養するが、２日目の日に磁場印加を調節して培養された幹細胞のＡＬＰ遺伝子、ＲＵＮＸ２、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算したＡＬＰ蛍光強度及び核／細胞質ＲＵＮＸ２比率を示したグラフ（b）であり、この時、スケールバーは５０μｍを表す。
図２０及び図２１によれば、時間を制御した二重モードスイッチングで磁場を印加する伸長（「ＯＮ」）は骨形成分化のための初期マーカーであるＲＵＮＸ２で相当高い核移行、アルカリ性ホスファターゼ陽性細胞及びＲＵＮＸ２／ＡＬＰ遺伝子発現と後期マーカーであるオステオカルシンの明らかな発現を可逆的に促進することが分かる。
図２２は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して抑制剤のない培地とＲＯＣＫ抑制剤（Ｙ２７６３２）及びミオシンII抑制剤（ブレビスタチン）を有する培地で幹細胞を４８時間培養した後、ＹＡＰ、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は前記共焦点免疫蛍光イメージから計算されたＹ２７６３２及びブレビスタチンによる核／細胞質ＹＡＰ蛍光比率を計算したグラフである。
図２３は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して抑制剤のない培地とアクチン重合抑制剤（サイトカラシンＤ）を有する培地で幹細胞を４８時間の間培養した後、ＹＡＰ、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は前記共焦点免疫蛍光イメージから計算されたサイトカラシンＤによる核／細胞質ＹＡＰ蛍光比率を計算したグラフである。
図２４は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して抑制剤のない培地とアクチン重合抑制剤（サイトカラシンＤ）、ＲＯＣＫ抑制剤（Ｙ２７６３２）及びミオシンII抑制剤（ブレビスタチン）を有する培地で幹細胞を４８時間培養した後、ＴＡＺ、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は前記共焦点免疫蛍光イメージから計算されたサイトカラシンＤ、Ｙ２７６３２及びブレビスタチンによる核／細胞質ＴＡＺ蛍光比率を計算したグラフである。
図２２～図２４によれば、二重モードスイッチングで磁場を印加する伸長（「ＯＮ」）モードによって誘導された幹細胞の機械感知はミオシンII、ｒｈｏ－関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）及びアクチン重合のような信号分子を含み、これはＹＡＰ／ＴＡＺ機械変換器の明らかな核移行を肯定的に調節することが分かる。
これを通じて、磁場印加による二重モードスイッチングで磁場を印加する場合、（「ＯＮ」）はＹＡＰ／ＴＡＺ機械変換を通じて幹細胞分化を媒介することが分かる。
実験例５
本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して磁場印加によるナノコイルの伸長及び収縮に対して生体内幹細胞の付着及び機械的形質導入を調節するということを確認するために実験を実施し、その結果は、図２５及び図２６に示した。
本発明によるナノコイル－基板複合体を利用して磁場印加によるナノコイルの伸長及び収縮に対して生体内幹細胞の付着及び機械的形質導入を調節するということを確認するために実験を実施し、その結果は、図２５及び図２６に示した。
図２５は本発明によるナノコイル－基板複合体を利用した生体内宿主幹細胞付着調節に対する実験結果である：（ａ）は皮下移植された基板上にｈＭＳＣが注入されてから６時間後に互いに異なる磁場印加順を有するナノコイルを含んだ場合のヒト特異的核抗体（ＨｕＮｕ）、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージであり、スケールバーは５０μｍを表す。
図２６は図２５に示した共焦点免疫蛍光イメージから付着性細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比率）及び核／細胞質ＹＡＰ蛍光比率を計算したグラフである。
図２５の（ａ）は本発明によるナノコイル－基板複合体をヌードマウスの皮下ポケットに移植した後、ｈＭＳＣを注入して行った実験を図式化したイメージである。
図２５及び図２６によれば、二重モードスイッチングですべての場合において免疫蛍光でヒト特異的核抗体（ＨｕＮｕ）及びＤＡＰＩ陽性核の共同局所化によって基板に付着された注入されたｈＭＳＣを確認することができる。また、生体内可逆的二重モードスイッチングで磁場を印加する伸長（「ＯＦＦ－ＯＮ」及び「ＯＮ－ＯＮ」）グループが磁場を除去した収縮（「ＯＦＦ」）グループに比べてずっと広い領域とビンキュリンクラスタリング及びＹＡＰ機械変換にかけてより高い付着密度及び焦点付着を刺激し、これは長期間にかけて宿主免疫細胞の付着を促進したことを確認することができる。
Claims (19)
- 基板、基板と化学結合されたナノコイル、及び前記ナノコイルと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、
前記ナノコイルは螺旋形のナノワイヤで構成され、一つ以上の金属元素を含み、
前記ナノコイルは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、
前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むことを特徴とする幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体：
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。 - 前記金属元素はコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つ以上の元素を含むことを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。
- 前記ナノワイヤは断面が円形のワイヤ形態で備えられ、直径は５ｎｍ～３０ｎｍであり、
前記ナノコイルの螺旋形外径の平均長さは５０ｎｍ～２００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。 - 前記印加される磁場は１００ｍＴ～７Ｔの大きさであることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。
- 前記インテグリンリガンドペプチドは複数個が前記ナノコイルに互いに離隔されて結合され、互いに隣合うインテグリンリガンドの間の平均間隔は１～１０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。
- 磁場の印加時に、前記ナノコイルの互いに隣合う螺旋は離隔され、互いに隣合う螺旋の間のピッチ（ｐｉｔｃｈ）は１ｎｍ～１００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。
- 前記インテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含み、
前記インテグリンリガンドペプチドのチオール基と螺旋形のナノコイルとポリエチレングリコールリンカーによって結合された構造であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。 - 前記ナノコイルはカルボン酸塩が置換されて基板と結合された構造であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。
- 前記基板はナノコイルが結合されない基板の表面が非活性化されたことを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体。
- 一つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノコイルを用意するステップと、
前記ナノコイルと第１懸濁液とを混合してナノコイルにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、
カルボン酸塩が置換されたナノコイルを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノコイルが結合された基板を製造するステップと、
ナノコイルが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持してナノコイルの末端にリンカーを結合するステップと、
インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノコイルが結合された基板を混合してナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含むことを特徴とする幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法。 - ナノコイルを用意するステップで金属元素を含む溶液はコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つ以上の金属元素を含むことを特徴とする請求項１０に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法。
- カルボン酸塩置換基を置換するステップで、前記第１懸濁液はカルボン酸塩置換基を含むアミノ酸誘導体を含み、
前記アミノ酸誘導体がナノコイルの表面に結合することを特徴とする請求項１０に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法。 - インテグリンリガンドペプチドを結合するステップで、前記第２懸濁液はチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含むことを特徴とする請求項１１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法。
- ナノコイルが結合された基板を製造するステップは、基板を酸性溶液の中に浸漬させて基板の表面を活性化させた後表面が活性化された基板をアミノシラン溶液の中に担持して表面をアミン化させた基板を用いることを特徴とする請求項１１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法。
- ナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップ以後にポリエチレングリコール誘導体を含む溶液にナノコイルが結合された基板を担持してナノコイルが結合されない基板の表面を非活性化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体の製造方法。
- 請求項１～９の中の何れか一項による幹細胞の細胞付着及び分化調節用ナノコイル－基板複合体に培養液を処理した後２０ｍＴ～７Ｔの磁場を印加して幹細胞の細胞付着及び分化を調節するステップを含み、
前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むことを特徴とする幹細胞の付着及び分化調節方法：
［式１］
｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ０は磁場が印加されないナノコイルの長さである。 - 幹細胞の付着及び分化を調節するステップはナノコイル－基板複合体に磁場の印加有無によって可逆的にナノコイルの長さを変化させて生体内または生体外の請求項１６に記載の幹細胞の付着及び分化調節方法。
- 幹細胞の付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル－基板複合体に磁場を印加しない場合、幹細胞の付着及び機械感知分化が低下されることを現す請求項１６に記載の幹細胞の付着及び分化調節方法。
- 幹細胞の付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル－基板複合体に磁場を印加する場合、幹細胞の付着及び機械感知分化が促進されることを現すことを特徴とする請求項１６に記載の幹細胞の付着及び分化調節方法。
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