KR101350825B1 - 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법 - Google Patents

세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101350825B1
KR101350825B1 KR1020120005415A KR20120005415A KR101350825B1 KR 101350825 B1 KR101350825 B1 KR 101350825B1 KR 1020120005415 A KR1020120005415 A KR 1020120005415A KR 20120005415 A KR20120005415 A KR 20120005415A KR 101350825 B1 KR101350825 B1 KR 101350825B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
differentiation
cells
substrate
carbon nanotubes
growth
Prior art date
Application number
KR1020120005415A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130084553A (ko
Inventor
홍승훈
남궁선
박주훈
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020120005415A priority Critical patent/KR101350825B1/ko
Publication of KR20130084553A publication Critical patent/KR20130084553A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101350825B1 publication Critical patent/KR101350825B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/15—Nano-sized carbon materials
    • C01B32/158—Carbon nanotubes
    • C01B32/168—After-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B2202/00—Structure or properties of carbon nanotubes
    • C01B2202/08—Aligned nanotubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B2202/00—Structure or properties of carbon nanotubes
    • C01B2202/20—Nanotubes characterized by their properties

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법 및 이를 이용한 세포의 성장 및 분화 조절 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 탄소나노튜브 기판에서는 분화 배지 없이 상기 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 뼈 세포로의 성장 속도 및 골 분화를 조절할 수 있으며, 성장 속도와 분화가 향상되는 장점이 있고, 또한, 방향을 조절할 수 있고, 이에 따라, 재생조직공학에 이용이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 분화된 정렬된 뼈 세포는 뼈의 강도를 향상시킬 수 있기 때문에 줄기세포를 이용한 인공뼈 제작과 같은 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법{Method for producing carbonnanotube substrate for regulation of the growth and differentiation of stem cell}
본 발명은 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법 및 이를 이용한 세포의 성장 및 분화 조절 방법에 관한 것이다.
줄기세포(Stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포 분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
특히, 중간엽 줄기세포(hMSCs, Human mesenchymal stem cells)는 성체 줄기 세포로서 골수나 지방 조직에서 초대 배양(primary culture)를 통해 주로 얻어지는 것으로써, 주변 환경에 따라 다중계통으로 분화될 수 있는 다분화능 줄기세포이며, 자가유래 이식이 가능하다는 특징으로 인하여 세포 치료제로서 가능성을 인정받아 그 이용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재까지 알려진 바로는 ‘배아 줄기세포’에 비해 암으로 분화할 가능성이 적어 생체 내 이식 시 안정성이 높다는 평가를 받고 있어, 이런 우수한 이점으로 인하여 많은 연구기관에서는 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 배양 분화시키기 위한 노력을 쏟고 있는 실정이다.
최근, 나노구조 기판은 화학적 첨가물 없이 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화를 조절하기 위해 광범위하게 연구되고 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 분화는 나노구조의 무질서 또는 면적을 변화시킴으로써 간단하게 조절되고, 이러한 경우, 분화의 정도는 용해도(soluble cue) 정도에 따라 달라진다. 그러나, 상기 장치는 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 분화에 따른 성장 방향을 조절하기 위해 중요하다. 예를 들어, 분화된 뼈-세포 및 분비된 콜라겐의 정렬은 뼈 구조의 기계적 강도를 향상시킬 수 있다.
그러나, 다양한 일차원 구조들이 상기 목적을 위해 이용되고 있지만, 수 나노미터보다 크고, 이에 따라 생체 내 환경 내에서 바이오시스템을 포함하여 여러 가지 문제점이 발생 될 수 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 탄소나노튜브(CNT)의 작은 직경으로 인해 바이오시스템에 물리적 영향을 주지 않아 줄기 세포 공학계에서 많은 관심을 보이고 있다. 탄소나노튜브를 이용한 생체조직과의 친화성에 대하여 미국의 Supronowicz 그룹은 폴리락틱 액시드와 탄소나노튜브의 복합체를 이용하여 전기적 신호에 의하여 감응하는 세포의 형태를 연구하여 보고 하였고(Supromowicz, P. R등, J. Biomed. Mater. Res. 2002, 5, 499), Ehgks 미국의 켈리포니아 대학교에서는 탄소나노튜브에 바이오 활성 분자를 도입하여 전하의 영향에 따른 신경세포의 성장 반응을 발표한바 있다(Hui Hu 등, Nano Lett. 2004, 4, 507). 또한, 2008년 스위스 로잔공대 미셀 지울리아노 교수와 이탈리아 트리에스테대학 라우라 발레리니 교수의 연구진들은 탄소나노튜브가 전기 전도성이 높고 신경 세포와 밀착해 극도로 미세한 연결을 형성하는 특징 때문에 뇌 신경세포인 뉴런의 끊어진 부분을 연결하는 역할을 할 수 있다는 것을 증명한바 있다(Giada Cellot 등, Nature nanotechnology, 2009, 4, 126-133). 이와 같이, 탄소나노튜브의 생체 적합성에 관한 연구들과 함께 생체에서 여러 목적으로 탄소나노튜브가 연구되고 있다.
종래 대한민국 공개특허 제2011-0129364호에서는 마이크로 컨택 프린팅법 또는 리프트-오프(lift-off)법을 이용하여 탄소나노튜브 랑뮈에-블라제(Langmuir-Blodgett, LB)박막을 기판에 패터닝하는 것을 포함하는 패턴 기판의 제조방법 및 상기 패턴을 통한 줄기세포의 성장 및 분화 조절을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2011-0060000호에서는 망상구조체 탄소나노튜브 박막을 지지체로 사용하여 줄기세포를 성장 및 분화시키는 방법과 탄소나노튜브의 막 두께와 표면 거칠기를 조절하여 줄기세포의 성장 및 분화를 조절하고, 막 두께와 표면 거칠기를 조절하여 성장 및 분화시키는 줄기세포의 개체수를 조절하고, 상기 요소들을 포함하는 배양 지지체를 개시하고 있으나, 종래 기술에서는 세포의 흡착과 성장을 조절하기 위해서 기판에 특정물질을 패턴하거나, 표면의 특성을 바꾸기 위해 복잡한 공정이 요구되고, 이 과정에서는 기술의 특성상 수백 나노미터 내지 수십 마이크로미터의 패턴을 이용할 수밖에 없는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위해 탄소나노튜브를 이용하여 줄기세포의 성장 및 분화를 조절하는 기술을 연구하던 중, 탄소나노튜브를 기판에 스핀-코팅을 수행하여 탄소나노튜브의 밀도를 조절함으로써, 세포의 크기를 조절하고, 성장 속도와 분화가 향상되는 장점이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제2011-0129364호 대한민국 공개특허 제2011-0060000호
Supromowicz, P. R등, J. Biomed. Mater. Res. 2002, 5, 499 Hui Hu 등, Nano Lett. 2004, 4, 507 Giada Cellot 등, Nature nanotechnology, 2009, 4, 126-133
본 발명의 목적은 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 탄소나노튜브 기판에 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 배양시키는 단계를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
스핀-코팅법으로 기판에 탄소나노튜브를 일방향으로 정렬시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 기판에 폴리에틸렌글라이콜(PEG)을 코팅하는 단계(단계 2)를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 탄소나노튜브 기판에 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 배양시키는 단계를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 탄소나노튜브 기판에서는 분화 배지 없이 상기 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 뼈 세포로의 성장 속도 및 골 분화를 조절할 수 있으며, 성장 속도와 분화가 향상되는 장점이 있고, 또한, 방향을 조절할 수 있고, 이에 따라, 재생조직공학에 이용이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 분화된 정렬된 뼈 세포는 뼈의 강도를 향상시킬 수 있기 때문에 줄기세포를 이용한 인공뼈 제작과 같은 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 정렬된 탄소나노튜브(CNT) 기판과 랜덤 CNT 기판 위에서 세포가 자라는 모습을 비교한 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 정렬된 CNT 기판과 랜덤 CNT 기판 위에서 세포의 성장이 조절되는 기작을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 정렬된 CNT 기판과 랜덤 CNT 기판의 AFM 이미지를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 정렬된 CNT의 지름, 길이 및 방향을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 CNT 패턴 위에서 자란 세포의 모습을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 CNT 패턴 위에서 자란 세포를 통계적으로 분석한 도면이다.
도 7은 세포의 골격인 액틴 필라멘트가 본 발명의 실시예에 따른 CNT 방향으로 정렬되어 있는 모습을 나타내는 도면이다.
도 8은 세포의 발이라고 할 수 있는 필로포디아가 본 발명의 실시예에 따른 CNT 방향으로 길게 뻗어있는 모습을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 CNT 기판상의 세포의 생장속도를 분석한 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 정렬된 CNT와 랜덤 CNT 배열에서 뼈세포 분화의 정도를 나타내는 마커인 오스테오칼친(OCN)과 오스테오포틴(OPN)의 형광 이미지를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 정렬된 CNT 기판상의 뼈세포 분화의 마커인 OCN, OPN, 알카린 포스페이트(ALP) 및 코어 바인딩 팩터 알파-1(CBFA1)을 정량 분석(qPCR)한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 뼈세포 분화 기작에 관여하는 GTP-결합 단백질인 RhoA, ROCK2 및 국소 부착 키나아제(FAK)를 정량 분석한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 뼈세포 분화를 방해하는 기작에 관여하는 DKK1 및 sFRP3을 정량 분석한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법:
스핀-코팅법으로 기판에 탄소나노튜브를 일방향으로 정렬시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 기판에 폴리에틸렌글라이콜(PEG)을 코팅하는 단계(단계 2).
이하, 각 단계를 자세히 살펴본다.
상기 단계 1은 스핀-코팅법으로 기판에 탄소나노튜브를 일방향으로 정렬시키는 단계이다.
이때, 사용가능한 상기 기판은 유리 커버 위에 티타늄(Ti)과 금(Au)을 코팅하여 사용하고, 상기 티타늄은 4.5-5.5 nm의 두께, 금은 9.5-10.5 nm의 두께로 코팅하여 사용할 수 있다.
티타늄의 경우, 4.5 nm 미만의 두께로 코팅되는 경우, 티타튬이 접합층으로써 역할을 못할 수 있기 때문에 금과 같이 떨어져 나가는 문제점이 있고, 5.5 nm 초과의 두께로 코팅되는 경우, 세포를 관측할 때 기판을 통과하는 빛의 투과율이 낮아져 현미경으로 관찰하기 어려워지는 문제점이 있다.
또한, 금의 경우, 9.5 nm 미만의 두께로 코팅되는 경우, 표면처리를 할 때 표면처리 물질이 잘 붙지 않는 문제점이 있고, 10.5 nm 초과의 두께로 코팅되는 경우, 가는 세포를 관측할 때 기판을 통과하는 빛의 투과율이 낮아져 현미경으로 관찰하기 어려워지는 문제점이 있다.
나아가, 본 발명에 따른 탄소나노튜브는 단일탄소나노튜브(SWNT)를 사용할 수 있다. 이때, 단일탄소나노튜브의 굵기가 1-2 nm로 얇아 세포 배양시, 종래의 나노구조물보다 세포 및 주위환경에 물리적 영향을 거의 주지 않는 장점이 있다.
또한, 상기 단계 1의 스핀-코팅법 수행 시, 회전속도는 4000-6000 rpm이다.
상기 스핀-코팅 공정 시, 스핀 수가 4000 rpm 미만으로 회전하는 경우, 탄소나노튜브의 밀도가 높아지는 문제점이 있고, 6000 rpm 초과로 회전하는 경우, 탄소나노튜브의 밀도가 낮아지는 문제점이 있다.
나아가, 상기 단계 1은 기판상에 정렬된 탄소나노튜브의 표면 밀도를 조절하여 중간엽 줄기세포(hMSCs) 성장 및 분화의 향상을 가능하게 할 수 있다. 이때, 상기 밀도는 0.3-3 CNT/㎛2로 패턴 할 수 있다. 상기 범위의 밀도에서는 한 개의 세포의 발이 한 번에 한 개씩 탄소나노튜브를 잡고 성장할 수 있도록 하는 것을 가능하게 한다. 이때, 10 ㎛×10 ㎛의 기판 내에는 90-110개의 탄소나노튜브가 정렬될 수 있으며, 이에 따라 세포의 성장 속도와 분화가 향상될 수 있다.
한편, 상기 기판 표면상에 탄소나노튜브의 밀도가 0.3 CNTs/㎛2 미만으로 패턴 시, 적절한 수로 정렬된 탄소나노튜브가 부족하여 원하는 양의 세포를 성장 및 분화를 시키지 못하는 문제점이 있다.
또한, 3 CNTs/㎛2 초과로 패턴 시, 탄소나노튜브가 일정 방향으로 정렬이 되어 있더라도, 세포의 발이 옆에 있는 CNT로 건너갈 수 있기 때문에 원하는 방향으로 성장 및 분화가 잘 되지 않아 세포가 불규칙하게 성장하는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브 기판에서는 밀도를 조절할 수 있어 세포의 성장 방향을 조절할 수 있고, 뼈의 강도는 지지체의 정렬 방향에 따라 달라지는바, 본 발명에 따른 탄소나노튜브 기판에서는 탄소나노튜브가 한 방향으로 정렬이 되어 있어, 뼈의 강도가 더 좋아질 수 있다.
나아가, 상기 단계 2는 탄소나노튜브 외의 기판에 줄기세포의 흡착을 감소시켜 세포의 점착을 감소시키는 대표적 고분자인 폴리에틸렌글라이콜(PEG)을 상기 기판에 코팅하는 단계이다.
상기 폴리에틸렌글라이콜을 탄소나노튜브를 제외한 기판상에 도입함으로써, 탄소나노튜브에 선택적으로 세포를 부착할 수 있는 장점이 있다.
이때, 사용가능한 폴리에틸렌글라이콜(PEG)은 mPEG-SH(메톡시폴리에틸렌글라이콜-티올)를 사용할 수 있다.
상기 PEG는 탄소나노튜브의 밀도가 낮은 경우에 PEG의 적용범위가 높아지기 때문에 세포가 잘 자라지 않은 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 골 세포로 성장 및 분화할 수 있다.
본 발명에 의한 탄소나노튜브 기판에서는 분화 배지 없이 상기 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 뼈 세포로의 성장 속도 및 골 분화를 조절할 수 있으며, 성장 속도와 분화가 향상되는 장점이 있고, 또한, 방향을 조절할 수 있고(표 1 내지 4 및 도 3 내지 13 참조), 이에 따라, 재생조직공학에 이용이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 분화된 정렬된 뼈 세포는 뼈의 강도를 향상시킬 수 있기 때문에 줄기세포를 이용한 인공뼈 제작과 같은 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 탄소나노튜브 기판에 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 배양시키는 단계를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화를 조절하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화의 조절은 기판상에 일방향으로 정렬된 탄소나노튜브의 밀도를 조절함으로써 가능하다.
본 발명에 따른 방법은 세포의 성장 속도 및 분화가 향상되는 장점이 있고, 또한, 방향을 조절할 수 있고, 이에 따라, 재생조직공학에 이용이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 분화된 정렬된 뼈 세포는 뼈의 강도를 향상시킬 수 있기 때문에 줄기세포를 이용한 인공뼈 제작과 같은 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 랜덤 형태의 탄소나노튜브 네트워크와 정렬된 탄소나노튜브 네트워크의 표면 밀도를 동일하게 하기 위하여 CNT 분산액의 농도와 침지 시간을 조절하였다.
< 제조예 1> 탄소나노튜브가 정렬된 형태로 조립된 기판의 제조
단계 1: 탄소나노튜브의 조립
피라나 용액(H2SO4/H2O2 = 3:1)으로 커버글라스를 세척한 후, 5 nm 얇은 티타늄(Ti) 층 및 10 nm 금(Au) 층을 상기 커버글라스 상에 열을 가해 증착하였다. 파우더 형태의 단일벽 탄소나노튜브(Single-walled CNTs;SWNT)(Hanhwa Nanotech)를 초음파를 이용하여 o-디클로로벤젠(0.005 mg/mL)에 분산시켰다. 탄소나노튜브를 정렬된 형태로 조립하기 위해 상기 분산액 내의 탄소나노튜브를 Au 기판 위에 5000 rpm으로 스핀-코팅하였다.
단계 2: PEG 도입
상기 기판의 Au 표면에 에탄올(5 mg/mL) 내의 mPEG-SH(mw 750, Rapp Polymere) 용액으로 2일 동안 기능화(functionalized)하였다. 상기 시료는 탄소나노튜브의 지름, 길이, 방향 빛 표면 밀도를 측정하기 위하여 tapping 모드의 AFM 시스템(MFP-3D, Asylum Research)으로 이미지화 하였다(도 1 참조).
결과
도 1에 나타낸 바와 같이, 탄소나노튜브의 굵기가 1-2 nm인 것으로 확인되었고, 도 2에 나타낸 바와 같이, 탄소나노튜브의 지름은 0.5-2 nm, 길이는 0.5-2 ㎛일 때, 탄소나노튜브의 방향이 10°이하로 대부분의 탄소나노튜브가 금 기판 상에 잘 정렬된 것으로 확인되었다(도 1 및 2 참조).
< 실시예 1> 탄소나노튜브를 이용한 뼈 세포의 성장 및 분화 조절
인간 골수로부터 분리된 hMSCs(Lonza)는 MSC 성장 배지에서 증식시키고(Discher, D. E. et. al., Science 2009, 324, 1673-1677; Segers, V. F. M. et. al., Nature 2008, 451, 937-942; Stappenbeck, T. S. et. al., Science 2009, 324, 1666-1669 참조), 준비된 기질들을 10 μM/㎖ 농도의 피브로넥틴(fibronectin)(Sigma)이 들어있는 인산화 완충 생리 식염수(PBS, Gibco)로 10분 동안 처리하였다. 상기 세포를 5000 세포/cm2의 농도로 기질에 씨드(seed)하고, 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 고농도 포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco) 배양 배지에서 성장시켰다. 세포를 37 ℃, 5% CO2 환경에서 유지시켰고, 배양 배지는 일주일에 두 번 갈아주었다. 2차 전자증배형 CCD(EMCCD, DQC-FS, Nikon)를 갖는 Nikon Eclipse TE2000-U 현미경을 통해 위상차 이미지를 얻었고, 세포의 형태 및 방향은 NIS Elements AR 이미지 소프트웨어를 통해 분석하였다. NIH3T3 섬유아세포 또한 상기와 같은 방법으로 배양하였다.
< 비교예 1> 탄소나노튜브가 랜덤 형태로 조립된 기판의 제조
랜덤 형태의 탄소나노튜브를 조립하기 위해, 상기 제조예 1의 Au 기판 위에 탄소나노튜브 분산액을 올려둔 후, o-디클로로벤젠으로 격렬하게 행군 후, N2 기체로 건조시켰다. 그 후, 상기 기판에 실시예 1과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
< 실험예 1> 주사전자현미경을 이용한 세포 이미징
상기 실시예 1 및 비교예 1의 탄소나토튜브 기판상의 세포 hMSCs는 2.5% 파라포름알데하이드 및 2.5% 글루타르알데하이드를 포함하는 중성 0.1 M PBS를 이용하여 고정하였다. 상기 고정액은 세포 축소를 줄이기 위해 처리되었다. 후고정은 PBS에 포함되는 1% 오스뮴 테트라옥사이드로 처리하였다. 상기 시료는 농도 구배 에탄올로 처리하였고, 임계건조기(critical point dryer, SCP-II, Hitachi)로 건조하고, 스퍼터 코터(sputter coater, SCD 005, BAL-TEC)를 사용하여 백금으로 코팅하고, 그 다음 주사형 전자현미경(SUPRA 55VP, Carl Zeiss)으로 측정하였다.
결과
(1) 도 5에 나타낸 바와 같이, 정렬된 탄소나노튜브(CNT) 기판 위에서 세포가 정렬되어 자라는 모습(실시예 1)과 랜덤 CNT 기판 위에서 세포가 랜덤 방향으로 자라는 모습(비교예 1)을 비교한 결과, 정렬된 CNT 기판 위에서 생장한 세포가 CNT 방향으로 정렬되어 있는 것을 알 수 있고, 또한, 세포의 수 역시, 랜덤 CNT 기판 위에서 자란 세포 수보다 많은 것으로 확인되었다(도 5 참조).
(2) 또한, CNT 패턴 위에서 자란 세포를 통계적으로 분석한 결과, 하기 표 1 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 정렬된 CNT 기판 위에서 세포의 방향이 0-30°로 잘 정렬된 것으로 확인되었다.

방향(°)		 비율(%)
정렬 CNT
(실시예 1)		 랜덤 CNT
(비교예 1)
0-10° 41 16
11-20° 29 13
21-30° 18 13
31-40° 6 13
41-50° 2 9
51-60° 2 9
61-70° 1 10
71-80° 0 10
81-90° 0 7
따라서, 본 발명에 따른 정렬된 CNT 기판의 경우, 성장 속도 및 분화가 빠르고 세포의 성장 및 분화를 조절할 수 있다.
< 실험예 2> 면역조직화학
hMSCs는 4% 포름알데히드 용액으로 고정하였고, 트라이톤(Triton) X-100으로 투과시킨 다음, 1% BSA로 1시간 동안 블락킹(blocking)하였다. 형성 마커를 염색하기 위해, 세포를 오스테오칼신(osteocalcin, OCN) 항체 (1:100, OC430, QED Bioscience) 또는 오스테오폰틴(osteopontin, OPN) 항체(1:100, AKm2A1, Santa Cruz Biotechnology)로 1 시간동안 반응시킨 다음, FITC 접합 항마우스 IgG(1:100, sigma)로 1시간 동안 반응시켰다. 액틴 필라멘트(actin filament)는 TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin)(1:100, Molecular Probes)으로 염색하였다. 핵염색은, DAPI가 들어있는 Prolong gold antifade reagent(Invitrogen)으로 수행하였다. 형광 이미지는 2차 전자증배형 CCD(EMCCD, DQC-FS, Nikon)를 갖는 Nikon Eclipse TE2000-U 현미경을 이용하여 얻었다.
결과
도 7에 나타낸 바와 같이, 세포의 골격인 액틴 필라멘트가 본 발명에 따른 CNT 방향으로 정렬되어 있는 모습을 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 세포의 발이라고 할 수 있는 필로포디아는 본 발명에 따른 CNT 방향으로 길게 뻗어있는 모습을 나타내는 것으로 확인되었다.
< 실험예 3> 세포 증식 활성 측정
정렬되고 무작위 방향성인 CNT 네트워크에 동일한 농도로 세포를 씨드(seed)하였다. 세포의 증식률은 CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)의 프로토콜을 이용한 MTS assay를 통해 결정하였고, HP845 분광기(Hewlett-Packard)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과
세포의 생장속도를 분석한 결과, 하기 표 2 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 증식률이 1.18 배 우수한 것으로 확인되었다. 따라서, 정렬된 탄소나노튜브 기판 위에서 성장속도가 빠르다는 것을 알 수 있다.
증식률
정렬 CNT
(실시예 1)		 1.18
랜덤 CNT
(비교예 1)		 1
< 실험예 4> 양적 실시간 중합효소 연쇄 반응(Q- PCR )
배양하고 4일 후에, hMSCs를 용해시키고, RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 hMSCs 세포의 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA는 reverse transcriptase and random primers (ImProm-II Reverse Transcription System, Promega)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 변환하였다. cDNA 합성을 위해 각 샘플내에서 추출된 전체 RNA(1 μg)를 동일한 양으로 이용하였다. 7300 Real Time PCR system (Applied Biosystems)을 이용한 qPCR에 합성된 cDNA를 이용하였으며, 이때 사용한 프라이머의 정보는 표 S1에서 나타내는 바와 같다. mRNA 발현의 상대적 양은 β-액틴(actin)의 양으로 보정하였고, 그 배수로 표현하였으며, 상대적 유전자 발현은 비교 사이클-임계값 방법(comparative cycle-threshold method)으로 평가하였다. 정렬된 CNT 네트워크에서 배양된 hMSCs의 mRNA의 발현률은 무작위 방향성의 CNT 네트워크로 보정하였다.
결과
(1) 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 정렬된 CNT와 랜덤 CNT 배열에서 뼈세포 분화의 정도를 나타내고, 뼈 세포로 얼마나 분화되었는가를 나타내어주는 지표로써, 마커 (a) 오스테오칼친(OCN)과 (b) 오스테오포틴(OPN)의 형광 이미지 비교한 결과, 랜덤 CNT보다 뼈 세포의 분화가 더 우수한 것으로 확인되었다.
(2) 또한, 하기 표 3 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 정렬된 CNT 기판상의 뼈 세포 분화 마커인 OCN, OPN, 알카린 포스페이트(ALP), 코어 바인딩 팩터 알파-1(CBFA1)을 정량 분석(qPCR)한 결과, 랜덤 CNT 상의 세포에 대한 상대적 전사율이 OCN의 경우에는 1.62배, OPN의 경우에는 1.83배, ALP의 경우에는 1.58배 및 CBFA1의 경우에는 1.48배로 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 1
OCN 1.62
OPN 1.83
ALP 1.58
CBFA1 1.48
(4) 나아가, 하기 표 4 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 뼈세포 분화 기작에 관여하는 GTP-결합 단백질인 RhoA, ROCK2, 국소 부착 키나아제(FAK)를 정량 분석한 결과, 랜덤 CNT 상의 세포에 대한 상대적 전사율이 RhoA의 경우에는 1.28배, ROCK2의 경우에는 1.38배 및 FAK의 경우에는 1.36배로 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 1
RhoA 1.28
ROCK2 1.38
FAK 1.36
(5) 또한, 하기 표 5 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 뼈세포 분화를 방해하는 기작에 관여하는 DKK1, sFRP3을 정량 분석한 결과, 랜덤 CNT 상의 세포에 대한 상대적 전사율이 DKK1의 경우에는 0.85 및 sFRP3의 경우에는 0.75로 우수한 것으로 확인되었다.
따라서, 랜덤 탄소나노튜브 위에서 자란 세포보다 본 발명에 따른 CNT 기판상의 세포에서 뼈세포 분화 마커인 OCN, OPN, ALP 및 CBFA1가 많이 발현되고, 세포 분화의 기작에 관여하는 단백질들(RhoA, ROCK2 및 FAK)이 많이 발현되며, 뼈세포 분화를 방해하는 기작과 관련된 단백질들(DKK1 및 sFRP3)의 발현이 낮아지는 것으로 확인되므로 본 발명에 의한 탄소나노튜브 기판에서는 분화 배지 없이 상기 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 뼈 세포로의 성장 속도 및 골 분화를 조절할 수 있으며, 성장 속도와 분화가 향상되는 장점이 있고, 또한, 방향을 조절할 수 있고, 이에 따라, 재생조직공학에 이용이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 분화된 정렬된 뼈 세포는 뼈의 강도를 향상시킬 수 있기 때문에 줄기세포를 이용한 인공뼈 제작과 같은 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 스핀-코팅법으로 기판에 탄소나노튜브를 일방향으로 정렬시키는 단계(단계 1); 및
    상기 단계 1의 탄소나노튜브가 정렬되어 있는 기판에 폴리에틸렌글라이콜(PEG)을 코팅하는 단계(단계 2)를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화용 탄소나노튜브 기판의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리 커버 위에 티타늄(Ti)과 금(Au)을 코팅하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 탄소나노튜브는 단일벽탄소나노튜브(SWNT)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 스핀-코팅법 수행 시, 회전속도는 4000-6000 rpm인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 1은 기판상에 정렬된 탄소나노튜브의 표면 밀도를 조절하여 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs) 성장 및 분화를 조절하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 밀도를 0.3-3 CNT/㎛2로 조절하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 폴리에틸렌글라이콜(PEG)은 mPEG-SH(메톡시-폴리-(에틸렌글라이콜)티올)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 골 세포로 성장 및 분화하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항의 제조방법으로 제조된 탄소나노튜브 기판에 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 배양시키는 단계를 포함하는 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 성장 및 분화를 조절하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기판상에 일방향으로 정렬된 탄소나노튜브의 표면 밀도를 조절하여 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포(hMSCs) 성장 및 분화를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020120005415A 2012-01-17 2012-01-17 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법 KR101350825B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120005415A KR101350825B1 (ko) 2012-01-17 2012-01-17 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120005415A KR101350825B1 (ko) 2012-01-17 2012-01-17 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130084553A KR20130084553A (ko) 2013-07-25
KR101350825B1 true KR101350825B1 (ko) 2014-01-16

Family

ID=48995134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120005415A KR101350825B1 (ko) 2012-01-17 2012-01-17 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101350825B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088225B (zh) * 2020-03-24 2020-09-01 朗姿赛尔生物科技（广州）有限公司 一种促进间充质干细胞定向分化的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130078574A (ko) * 2011-12-30 2013-07-10 서울대학교산학협력단 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130078574A (ko) * 2011-12-30 2013-07-10 서울대학교산학협력단 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130084553A (ko) 2013-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sorkin et al. Process entanglement as a neuronal anchorage mechanism to rough surfaces
Wang et al. The cellular response of nerve cells on poly-l-lysine coated PLGA-MWCNTs aligned nanofibers under electrical stimulation
Khan et al. Influence of nanoscale surface roughness on neural cell attachment on silicon
Roach et al. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review
EP2833930B1 (en) Systems and method for engineering muscle tissue
Álvarez et al. Artificial extracellular matrix scaffolds of mobile molecules enhance maturation of human stem cell-derived neurons
TW201014914A (en) Materials and methods for cell growth
De Bartolo et al. Influence of membrane surface properties on the growth of neuronal cells isolated from hippocampus
KR20150009669A (ko) 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법
Staii et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy
Rush et al. Surface chemistry regulates valvular interstitial cell differentiation in vitro
Litowczenko et al. Groove‐patterned surfaces induce morphological changes in cells of neuronal origin
TWI414328B (zh) 可植入性神經再生導管
Xia et al. Multivalent Polyanionic 2d Nanosheets Functionalized Nanofibrous Stem Cell‐Based Neural Scaffolds
Portone et al. Lineage‐Specific Commitment of Stem Cells with Organic and Graphene Oxide–Functionalized Nanofibers
KR101350825B1 (ko) 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법
KR20130078574A (ko) 세포의 성장 및 분화의 조절용 탄소나노튜브 기판의 제조방법
Orza et al. Multistructural biomimetic substrates for controlled cellular differentiation
Nguyen et al. Upregulation of osteogenesis of mesenchymal stem cells with virus-based thin films
Chuang et al. The role of titania surface coating by atomic layer deposition in improving osteogenic differentiation and hard tissue formation of dental pulp stem cells
Brüggemann et al. Adhesion and survival of electrogenic cells on gold nanopillar array electrodes
US20150081018A1 (en) Methods and substrates for differentiation of neural stem cells
KR101171774B1 (ko) 탄소나노튜브를 줄기세포의 배양 지지체로 사용하는 방법 및 탄소나노튜브를 포함하는 배양 지지체
CN111893753B (zh) 一种二维超支化聚阴离子纳米片修饰的纳米纤维支架及其制备方法和用途
Nascimento et al. Customizing 3D Structures of Vertically Aligned Carbon Nanotubes to Direct Neural Stem Cell Differentiation

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160224

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200102

Year of fee payment: 7