TWI414328B - 可植入性神經再生導管 - Google Patents

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Description

可植入性神經再生導管
本發明大體而言係關於一種導管，其可作為神經再生之醫療裝置；尤其是，本發明係關於一種幫助神經組織重新生長或修復之可植入性神經再生導管。
在臨床上常可見到神經損傷，根據統計，每年有超過90,000人受到神經損傷的影響。在多數情況下，中樞神經系統(CNS)並不能自我修復及再生，而周圍神經系統(PNS)則具有自我修復及再生能力。受損後PNS功能復原之研究已成為快速發展之領域，研究人員亦開始尋找可讓神經再生之適當方法。
目前已發展出可讓受損神經再生的各種不同方法，其中一種方法包含將斷裂神經末稍與其周圍實際縫合。當神經缺損的裂口較長，則通常需要植入移植物來橋接，促使神經再生。現今，橋接周邊神經缺損所廣泛使用之材料為自體移植之神經，例如取自病患第二手術位置之神經組織。然而，此種治療提高了捐贈位置功能喪失的可能性，此外，潛在疼痛性神經瘤之形成、捐贈與接受之移植物間的結構差異、以及在糖尿病或其他慢性疾病病患中發現適當的移植捐贈位置的困難性都是需克服的問題，更遑論廣範圍修復所需之移植物材料潛在性的不足。
因此，需要有一種替代的神經移植物材料，不僅要滿足神經自體移植物的需求，而且可克服許多缺點。對於神經再生另一可避免上述問題的選擇方案為人工移植物，事實上，已有許多種類的天然或合成生物材料被用來製造可導引周圍神經再生的管子或導管。
習知上，由於化學安定性較高及富有彈性，神經導管多由聚矽氧橡膠製成。然而，因為聚矽氧管為非生物可分解，且其為非多孔性，由聚矽氧橡膠所製造之導管在臨床應用上時常導致長期併發症，包括纖維化及慢性神經抑制，且常需要第二次手術以移除管子或導管。有鑑於此，不需進行第二次手術以移除導管的生物可分解性聚合物所製備之神經導管，顯然優於非生物可分解性聚合物所製備者。
可吸收性神經導管之目的在於提供短期不受干擾的神經再生環境，並可在神經復原與些微組織反應後降解。雖然種種可吸收性神經導管已被發展，到現在為止結果還是令人不甚滿意，大家也都還在尋找較佳之導管。因此，需要一種使神經組織易於再生長、修復或再生之神經導管。
本發明係關於一種可植入性神經再生導管或滿足此一需求之裝置，根據本發明之一具體實施例，可植入性神經再生導管或裝置包含一生物可分解性聚合物及一金屬。
在本發明之一較佳具體實施例中，聚合物包含聚葡 萄糖胺。於較佳實施例中，聚合物包含幾丁聚醣。
在本發明另一較佳具體實施例中，聚合物包含聚乳酸交酯，例如聚(D-乳酸交酯)、聚(L-乳酸交酯)、及聚(D,L-乳酸交酯)。於更佳之實施例中，聚合物包含聚(D,L-乳酸交酯)。
為了促進神經再生，導管可選擇性包含一神經再生促進成分，該神經再生促進成分可包含生物活性成分或細胞。在本發明之一較佳具體實施例，神經再生促進成分包含一生長因子，例如纖維母細胞生長因子第一型。在本發明另一較佳具體實施例，神經再生促進成分包含細胞，例如許旺氏細胞(Schwann cell)或神經幹細胞(NSCs)。在一些具體實施例中，該細胞不受限於基因改造之細胞。較佳地，該細胞在其基因組中包含一報導基因。更佳地，該細胞在其基因組中包含一編碼螢光蛋白之基因。最佳地，該細胞在其基因組中包含F1B-GFP基因，其可配合人類纖維母細胞生長因子第一型啟動子而表現綠色螢光蛋白。
在一較佳具體實施例中，該導管由聚合物及金屬之混合物製造而成。金屬可包含金或銀，但不限於此。其中，金屬可大大增加導管之物理強度，並促進神經再生。較佳地，金屬的直徑大小約為1至約50奈米，且更佳為約5至約30奈米。在一些具體實施例中，聚合物中的金屬濃度低於500 ppm。在一較佳具體實施例中，聚合物中的金屬濃度約為25 ppm至約100 ppm之間。
在另一較佳具體實施例中，導管可進一步包含一內表面，該內表面上有微溝槽構成。較佳地，該微溝槽之寬度約為1至約50微米之間、間隔約為1至約50微米之間、深度約為0.1至約15微米之間。更佳地，微溝槽之寬度約為10至約30微米之間、間隔約為10至約30微米之間、深度大於約0.5微米。
本發明另一具體實施例揭示了一種可植入性神經再生裝置，其包含一微圖案化導管及一神經再生促進成分。較佳地，該微圖案化導管具有一內表面，該內表面上形成有微溝槽，該微溝槽具有可容納神經再生促進成分之尺寸。
本發明另一具體實施例揭示了一種可植入性神經再生導管，其包含一實質上光滑之外表面及一內表面，該內表面上有微溝槽形成。
根據本發明一具體實施例，其揭示一製造可植入性神經再生導管之方法，該方法包含提供一包含聚合物及金屬之複合材料；形成一微圖案於基材上；轉印該微圖案於子模，澆鑄複合材料於子模上；及由子模分離複合材料。
本發明之其他特徵及優點於檢視後續敘述及圖式後將更加明顯。
本發明大體上係關於一種可做為醫療裝置之導管，其可幫助神經組織之重新生長或修復。於本發明的一些具體實施例中，該導管包含一具有第一端及第二端之多 孔或非多孔管狀結構、一厚度實質均勻之壁、一以壁所區隔之通道，且該通道由管狀結構之第一端延伸至第二端。然而，於另一具體實施例中，該導管亦可為非管狀裝置。
為了排除移除管或導管之二次手術的必要性，該導管較佳為生物可分解性，且可被降解成低分子量片段而可被宿主吸收及清除。此生物可分解性材料之實例非限定地包含各種形式之褐藻膠、聚磷酸酯、膠原、明膠、聚乙醇酸交酯、多醣、醣胺聚多醣、聚乳酸交酯、聚葡萄糖胺以及其前述物質之衍生物或混合物。
除了生物可分解性材料，本發明一些具體實施例之導管可進一步選擇性包含一種能增加導管物理強度或促進神經再生之金屬。較佳地，該金屬可非限定地為金或銀。在一些具體實施例中，金屬直徑大小範圍約為1至約50奈米。在較佳之具體實施例中，金屬直徑大小範圍約為5至約30奈米。
聚合物中的金屬濃度被認為與金屬的大小有關，其通常少於500 ppm。較佳地，聚合物中的金屬濃度約為25 ppm至約100 ppm之間。在一具體實施例中，金屬之平均大小約為5奈米，較佳之濃度約為20 ppm至約150 ppm之間。另一具體實施例中，金屬之平均大小約為50奈米，較佳之濃度約50 ppm以上。
在本發明一些具體實施例中，該導管可選擇地被接種(seed)或充填神經再生促進成分，此成分之實例包括各種生物活性分子，例如神經營養因子、生長因子、生 物黏著分子(例如層黏連蛋白)、及促進排列生長分子(alignment-promoting molecules)。此外，神經再生促進成分亦可為細胞，例如纖維母細胞、許旺氏細胞、神經幹細胞、及神經前驅細胞(neural progenitor cell)皆可應用於本發明之具體實施例。再者，所使用之細胞可被基因改造。例如，其可在基因組中包含一報導基因，例如一編碼螢光蛋白之基因。製備轉基因細胞之方法揭示於美國專利第6,984,518號及7,045,678號，其於本文一併作為參考。
為了促使細胞在神經再生期間排列生長，在本發明一些具體實施例之導管的內表面上可形成微溝槽，該微溝槽可由應用微影技術及蝕刻製程所形成之微圖案化矽來製作。在一些具體實施例中，微溝槽在分別的位置形成，且其係具有可容納神經再生促進成分或可促進神經再生之結構。較佳地，該微溝槽之寬度約為1至約50微米之間、間隔約為1至約50微米之間、深度約為0.1至約15微米之間。更佳地，微溝槽之寬度約為10至約30微米之間、間隔約為10至約30微米之間、深度大於約0.5微米。
下列實施例僅為說明之用，且其並不欲限定後續之申請專利範圍。
實施例1-1：微圖案化聚乳酸交酯之製造
製造微圖案化矽之方法敘述於許氏等人，“於微溝槽化表面之許旺氏細胞之導向生長”，生物科技與生物工 程雜誌，第92(5)期第579-588頁(Hsu et al.,“Oriented Schwann Cell Growth on Microgrooved Surfaces.Biotechnology and Bioengineering.92(5),579-588”)之文章中，其於本文一併作為參考。使用旋轉塗佈機(Branchy Technology,Taiwan)，於3000 rpm將負光阻劑(SU-8 2005,MicroChem,USA)塗覆於p型矽晶圓上，曝光系統(ABM Aligner,USA)之波長為365奈米(I-line)，且曝光時間為12秒，光罩之寬度/間隔大小為20 μm/20 μm。移除未反應之光阻劑以便在矽晶圓(矽/交聯SU-8 2005)上形成3 μm深度之微溝槽。
在圖案化矽晶圓上經由傾注Dow Corning Silastic MDX4-4210產生數種聚(二甲基矽氧烷)(PDMS)子模，以便在圖案轉換製程後促使微圖案化聚合物之模子鬆脫，將微圖案由PDMS子模轉換至生物可分解聚合物。製備含20%聚(D,L-乳酸交酯)(8300D，Cargill Dow，USA)(PLA)之1,4-二氧陸圜(1,4-dioxane)溶劑之溶液，將聚合物溶液澆鑄於PDMS子模，風乾24小時後，再將聚合物基材浸入酒精24小時，並由PDMS子模分離。微圖案可於光學顯微鏡及SEM下檢測其品質，溝槽深度之精確性經由高效能表面量測(High Performance Surface Metrology；P-10，KLA-Tencor，USA)確認。
實施例1-2：神經幹細胞之培養
將取自二月齡小鼠之大腦以手術刀切碎，並輕微磨碎通過遞減直徑、火焰拋光之巴斯德吸量管(Pasteur pipets)，產生單一細胞懸浮液。將經磨碎之細胞接種於直徑35-mm培養皿(每盤1000個活細胞)，其中含10% FBS(Giboco，USA)之DMEM/F-12(1：1)培養基無補充基質或黏著因子。二日後，多數細胞死亡。細胞分裂進行至每盤接近10-20個細胞(×4盤)，將細胞以胰蛋白酶消化、儲集及繼續分裂另2-3日。於6至8日，形成增殖細胞之神經球(neurosphere)，然後轉移至經聚-L-鳥氨酸塗覆之多室玻片。每隔二日，將具有F1B-GFP之細胞轉移，以測定可達成GFP-陽性細胞之最高百分比的時間點。經由以200 μg/ml建納黴素(Geneticin)(Gibco，11811，USA)選擇而獲得穩定之細胞系，將建納黴素-抗性小鼠神經幹細胞儲集(每盤接近30個群落)並擴展。使用螢光活性細胞分類器(FACS Aria，BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)二至三次，以增加GFP-陽性小鼠NSC直至達到大於95%純度。
將NSC培養於補充有10% FBS、200 μg/mlGeneticin、20 ng/ml人類FGF1及鏈黴素-青黴素(100 U/ml)之DMEM/F12,FGF1之內含物幫助維持神經幹細胞之多能性(multipotency)。因此，在FGF1存在下，於GFP-陽性細胞中GFP之表現將持續六週；反之，在FGF1不存在下，GFP表現將僅持續三週。培養物於含5% CO2之濕潤培養箱中以37℃培養，培養基每週更換二次。
實施例1-3：F1B-GFP質體DNA及轉染
為了構築F1B-GFP質體DNA，將含有FGF1之腦特異性啟動子的589-bp SmaI-HindIII片段自F1B-Tag質體分離，並選殖至pEGFP-1之XhoI-HindIII部位。在連接至SmaI部位前，XhoI部位以克列諾(Klenow)片段整平末端，將所產生之4733-bp F1B-GFP質體DNA序列分析以確認其特性。質體pEGFP-1購自BD Biosciences Clontech，將F1B-GFP質體DNA根據產品說明書，以Lipofectamine®(Invitrogen)轉染至小鼠腦細胞。在pEGFP-1含新黴素-抗性序列盒，於200 μg/ml建納黴素濃度篩選G418-陽性細胞。因此，所選擇之小鼠腦細胞在其形成神經球時被認為是神經幹細胞，且可被誘導分化成全部三種神經子代，包括神經元、星狀細胞及寡樹突神經膠質細胞。由於F1B啟動子對於神經幹細胞有活性，其根據GFP之陽性表現而提供一種簡易方法來篩選神經幹細胞。
實施例1-4：增殖及在微圖案化PLA上之NSC排列生長
將基材切割成15 mm圓盤狀並置於24孔培養盤底部，然後將基材以70%酒精溶液消毒15分鐘並以PBS沖洗。將細胞(~1×104細胞/孔)接種於基材上。為了評估細胞附著及增殖，將細胞於24、48或72小時以胰蛋白酶消化，並以錐藍質排除法(trypan blue exclusion)，使用血球計及倒立相位差顯微鏡(Nikon TE-300，Japan)確定數目。
於培養後24及72小時評估細胞排列生長，在基材上NSC之GFP表現可直接在螢光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i，Japan)下觀察。為了定量細胞排列生長，將位於基材上之細胞固定，並以亞甲藍染色，經由在反射式顯微鏡(Nikon Labophot，Japan)下，使用影像分析系統(Image-Pro Lite，Media Cybernetics，USA)，於九個不同區域檢測細胞，以確定定向角。將細胞配合於一橢圓，經由溝槽之主要軸線及方向所產生之角度乃定為定向角。將資料輸入Microsoft Excel以產生角度之分佈(頻率圖)，這些具有-10至10度之間的定向角的細胞乃視為排列生長細胞。排列生長之百分比係定義為在頻率分佈中，全部細胞內排成直線之許旺氏細胞(±10°)分率。
關於細胞骨架之觀察，在測試基材上之細胞以4%三聚甲醛/PBS於室溫下固定。固定後，樣本以PBS清洗並於室溫添加滲透緩衝液，樣本於室溫添加若丹明共軛鬼筆環肽(rhodamine conjugated phalloidin)(1：500之PBS，Sigma，USA)染色。清洗樣本，並於室溫添加4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI，1：500之PBS，Sigma，USA)以染色細胞核。最後，以螢光顯微鏡觀察樣本。於經培養之小鼠細胞中測定GFP之半生期至約26小時，因此，當於受傷之坐骨神經追蹤GFP表現數週時，在分化性神經元中追蹤到極小的GFP表現。
實施例1-5：培養於微圖案化PLA上之NSC基因表現
神經生長因子(NGF)及腦衍生神經營養因子(BDNF)基因之表現經由下列步驟測定。於24或72小時之總RNA在細胞經胰蛋白酶消化後，以Trizol試劑(15596-018，Invitrogen，India)萃取。5 μg之總RNA以第一股cDNA合成套組(Fermentas，USA)反轉錄，於PCR反應中使用1 μl之cDNA反應混合物。於GeneAmp PCR系統2700熱循環器(ABI，USA)進行PCR 35個循環。循環參數為94℃ 30秒，之後56℃ 30秒，然後72℃ 30秒，隨後於72℃最終擴增10分鐘。使用β-肌動蛋白之PCR引子以確認PCR反應之精確性，並作為半定量分析之內部控制，增幅產物於1.5%瓊脂醣-TAE[10 mM Tris(pH 7.5)、5.7%冰醋酸、及1 mM EDTA]凝膠上進行電泳分析，並經溴乙錠染色顯現。
實施例1-6：微圖案化神經導管之動物移植
使用1.5 mm直徑軸心將微圖案化PLA基材滾製成導管，並以少量溶劑將邊緣黏緊，檢查導管之適合度，並在植入前切成12 mm片段。
以用於接種內皮細胞於血管接枝上的滾軸(~1 rpm)，將NSC(~5×104細胞/ml，約30 μl)接種於微圖案化導管上(哈爾等人，"行進軌跡分析：周邊神經重建之長期評估"，美容整形外科雜誌，第89期第251-258頁(Hare et al.,“Walking track analysis：a long-term assessment of peripheral nerve recovery”,Plast.Reconstr. Surg.89,251-258))。24及72小時後，小心地將導管固定並縱切以觀察NSC於管內腔表面排列生長情況。
使用14隻雄性、重250-300 g的Sprague-Dawley大鼠來進行初步動物實驗，將其區分成二組實驗組及二組對照組。二組實驗組(n=4)接受以NSC(72小時)或無NSC接種之微圖案化導管(內徑1.95 mm、壁厚0.49 mm、長12 mm)。二組對照組(n=3)接受矽導管(Silastic，RX50，Dow Corning，USA；內徑1.57 mm、壁厚0.84 mm、長12 mm)及反向自體移植物(reversed autograft)(長10 mm)。
將動物圈養於溫度控制於22±1℃、12小時晝夜循環、及可自由取食標準大鼠飼料及飲水之條件下的標準實驗籠中。外科手術全程以腹腔注射Citosol(6 mg/100g)之一般麻醉的動物進行手術。對於每隻大鼠，在無菌操作下於左後腿實施手術。在皮膚造成切口後，經由撕開肌肉產生裂口而暴露出坐骨神經。以顯微剪切除10 mm神經片段，將反向自體移植物或導管植入10 mm缺口，以7-0尼龍縫線將頭端的神經固定於導管，然後將末端縫入導管另一端。將兩端神經殘幹縫入導管約1 mm之長度。然後使用3-0 Dexon縫線將傷口分層縫合。
評估機能肌肉神經再生的坐骨神經機能指數(SFI)根據步行追蹤分析計算[方程式SFI=-38.3(PLF)+109.5(TSF)+13.3(ITF)-8.8，其中PLF(足印長度函數，print length function)=(實驗PL-正常PL)/正常PL，TSF(足尖伸展函數，toe spread function)=(實驗TS-正 常TS)/正常TS(第1次至第5次足尖)，且ITF(中間足尖伸展函數，inter-median toe spread function)=(實驗IT-正常IT)/正常IT(第2次至第4次足尖)(奈依等人，"以充填外胚層間葉幹細胞之組織工程神經進行周邊神經再生之改良"，口腔與顎面手術國際期刊，第36期第32-38頁(Nie et al.,“Improvement of peripheral nerve regeneration by a tissue-engineered nerve filled with ectomesenchymal stem cells”,Int.J.Oral Maxillofac Surg..36,32-38))。植入六週後，以導管植入之大鼠或對照組於CO2室中安樂死，收取組織並進行組織學分析。樣本於4%三聚甲醛中固定隔夜，以1%四氧化鋨(Polysciences，PA，USA)染色及包埋於石蠟。將樣本切片(橫切片4 μm)，並以H&E或甲苯胺藍染色。將包埋的染色神經切片置於顯微鏡鏡臺上，於中央導管之組織切片影像以數位相機(Nikon Coolpix 4500，Japan)數位化，使用影像分析系統(Image-Pro Lite，Media Cybernetics，USA)確定在中央導管中個別有髓鞘之軸突之數目及面積，亦計數血管之數目。
實驗數據以平均值±標準差(n=3-6)表示，統計差異以單因子變異分析(one-way analysis of variance；ANOVA)分析之，p<0.05被認為具有統計上之意義。
微溝槽之側邊尺寸約為21±0.5/19±0.5 μm(n=3)，顯示PLA上微溝槽深度之表面度量資料皆為3.0±0.1 μm(n=3)。製造過程被成功地控制，以製造可再現的微圖案化基材。NSC乃附著於基材24小時，於無圖案化或微 圖案化基材上細胞之數目並無統計上有意義的差異，二組基材的細胞數目在48小時接近雙倍，且於72小時後增加約6倍。NSC在所有時點皆表現GFP，即維持未分化。微圖案化基材上細胞定位之定量分析顯示，於24小時有74.5±7.5%之NSC排列生長，而於72小時時有84.7±8.2%之NSC排列生長(每一時間點n=3)，此可在微圖案化PLA上的肌動蛋白微絲之方向觀察到；反之，無圖案化PLA上，在細胞骨架之方向中並無斜紋發現。第1圖顯示NGF基因表現(第1A圖)及BDNF基因表現(第1B圖)之半定量分析，於24小時，經細胞在無圖案化PLA上表現NGF與BDNF基因比在微圖案化PLA上更高。然而，於72小時，NSC在微圖案化表面具有較高的NGF及BDNF基因表現。
在滾製程序後，於具有特定尺寸之導管內腔表面上之微圖仍然可見保持良好，在24小時及72小時後，經由旋轉法接種之NSC均在導管內表面上正確排列生長。
在移植過程6週後並無動物死亡，以顯微剪刀在神經導管縱切後，在神經成功連結情況中，可觀察到的新再生神經以薄白色管狀基材之形式連接兩端。如表1中所示，於僅有微圖案化PLA導管組別中，成功率(具有所述成功連結之動物的百分比)為75%，而接種NSC之微圖案化PLA導管組別為100%。
*：p<0.05，大於其他組別
低成功率之聚矽氧烷對照組(33%)及高成功率之自體移植物對照組(100%)如預期般發生，如表2中所示，在中央導管之組織切片影像分析顯示，接種NSC之微圖案化PLA導管比無接種之組別明顯具有較多有髓鞘之軸突(1856±315 vs.829±165，p<0.05)。各軸突的平均面積亦大於(9.4±1.8 μm2 vs.6.5±1.3 μm2，p<0.05)。二者皆具有相當數量的血管數目，表示神經修復正進行中。在軸突與血管數目及軸突平均面積上，自體移植物組具有相似於接種NSC之導管的表現。在犧牲前，來自5至6週期間步行追蹤分析之SFI(表1)亦支持組織學資料，以NSC接種之微圖案化PLA導管的SFI高於僅有導管之組別(-47±12 vs.-69±10，p<0.05)。不管自體移植物組之較佳的組織學結果，二組對照組之SFI值與僅有導管之組別並無顯著差異。由經植入之PLA導管的典型組織學切片，比較自體移植物與正常神經組，顯然地，以NSC接種之PLA導管或自體移植物促成形態上較類似於一般神經。
*：p<0.05，小於其他組別
除了上述PLA導管外，其他材料亦可使用於本發明之具體實施例，例如林氏等人於2008年4月25日於外科神經學雜誌發表之"以聚幾丁醣-金奈米複合物製備之微溝槽化神經導管進行之坐骨神經修復"(Lin et al.,“Sciatic nerve repair by microgrooved nerve conduits made of chitosan-gold nanocomposites.Surgical Neurology,”published on April 25,2008)中所述者，其於本文中一併作為參考。
實施例2-1：製備CHI-AU奈米複合材料
於室溫下將1%幾丁聚醣(Sigma，St Louis，Mo)溶液溶於0.5 mol/L乙酸12小時，含金奈米顆粒溶液由Global NanoTech(Taipei，Taiwan)供應，溶液有含純金細微顆粒(5奈米)之水(50 ppm/mL)。幾丁聚醣溶液過濾 後，添加一定數量之金奈米顆粒溶液；因此聚合物最終濃度為25、50或100 ppm。為了製造生物測試之基材，將100 μL chi-Au溶液塗覆於蓋玻片(直徑15-mm；Matsunami，Osaka，Japan)上，並風乾48小時。
實施例2-2：CHI-AU材料之DMA
使用TA Instruments DMA 2980(New Castle，DE)經由DMA檢測chi-Au材料之動態性質變化。為了製備機械測試之樣本，將chi-Au溶液批覆於玻璃模型上，並於乾燥後剝離。具有約長30 mm×寬5.0 mm×厚0.07 mm之幾何形狀的樣本片於1 Hz及振幅10 μm測試張力，於室溫將樣本架設於DMA，然後以5℃/分鐘之斜率增加，由30℃至220℃測試，動態模數以儲存模數(megapascals；MPa)表示，且散逸能之傾向以參數tan δ表示。
實施例2-3：細胞維持
大鼠神經膠質細胞系C6(BCRC-60046；生物資源保存及研究中心，新竹，台灣)及鼠類神經幹細胞(NSC)應用於體外試驗。NSC分離於2週齡小鼠大腦，並轉染F1B-GFP(美國專利第6,984,518及7,045,678號)。以200 μg/mL建納黴素(11811；Gibco，Los Angeles，CA)篩選獲得穩定的細胞系，將建納黴素-抗性之NSC儲集並擴展，重複使用螢光活化細胞分類機(FACS Aria；BD Biosciences，Palo Alto，Calif)來增加GFP-陽性小鼠腦 細胞直至達到大於95%之純度。C6細胞培養於補充44 mmol/L NaHCO3(Sigma)、10% FBS、鏈黴素-青黴素(50 U/mL)、及1%丙酮酸鈉(59203-100M；JRH，Lenexa，KS)之DMEM。將補充10% FBS、200 μg/mL建納黴素、20 ng/mL人類FGF1、及鏈黴素-青黴素(100 U/mL)之DMEM/F12(11330，Gibco，Carlsbad，CA)使用於NSC培養基。培養物於濕潤培養箱中以5% CO2於37℃中培養，培養基每週更新二次。
實施例2-4：細胞增殖評估
在接種細胞前，將蓋玻片上之複合基材浸泡於70%酒精、以PBS潤洗，然後置於24孔培養盤中。為了評估金奈米顆粒於不同濃度的效果，以每孔接種104個C6細胞及每孔接種5×104個NSC細胞，於24、48及72小時以血球計來計數細胞數目。
實施例2-5：神經營養因子之基因表現
由培養72小時後生長於chi-Au奈米複合物上的C6或NSC萃取總RNA。細胞以胰蛋白酶消化後，添加Trizol試劑(15596-018；Invitrogen，Carlsbad，CA)，根據使用說明，以第一股cDNA合成套組(Fermentas，St Leon-Rot，Germany)反轉錄5 μg總RNA，於含1 μL cDNA、0.5 μL 10 μmol/L之各種引子(表3)、及5 μL 5×PCR Master Mix緩衝液(Gene Mark，Tainan，Taiwan)之25-μL反應體積中進行聚合酶連鎖反應，聚合酶連鎖 反應進行於GeneAmp PCR系統2700熱循環器(ABI，Foster CA，USA)。cDNA之循環參數為94℃ 30秒、55℃ 30秒、及72℃ 30秒、之後於72℃最終擴展7分鐘共計35個循環，β-肌動蛋白用於精確確認PCR反應，並作為半定量分析之一內部控制。在1.5%瓊脂醣-TAE(10 mmol/L Tris[pH 7.5]、5.7%冰醋酸、及1 mmol/L EDTA)凝膠上以電泳分析增幅產物，並以溴乙錠染色顯現。
實施例2-6：CHI-AU上微溝槽之製造
使用蝕刻技術製造具有微圖案之矽晶圓，然後經由澆鑄PDMS於矽晶圓上，將微圖轉移至PDMS子模。為了轉移微溝槽至chi-Au基材上，將含50 ppm金奈米顆粒之溶液澆鑄於PDMS子模上。風乾後，將基材浸入酒精中，並由PDMS子模分離。為了研究NSC於微圖案化chi-Au基材上之生理導引，圖案尺寸為20/20/3 μm(溝槽之寬度/間隔/深度)。
實施例2-7：細胞排列生長
為了評估細胞排列生長，將基材上經培養之NSC(每平方公分3×104個細胞)於培養後24及72小時檢測。以亞甲藍染色後，使用影像分析系統(Image-Pro Lite；Media Cybernetics，Silver Spring，MD)，分量量測在基材上NSC之定向，這些具有定向角介於-10°與10°間之細胞係被當成排列生長細胞，並計算排列生長細胞之比例數目，對照組資料取自無圖案化chi-Au基材上之NSC所作之量測。
實施例2-8：細胞骨架觀察
為了評估基材上NSC之細胞骨架，將培養24及72小時後之細胞於4%三聚甲醛固定，經PBS潤洗數次後，添加500 μL 0.5% Triton X-100(第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；Sigma，T9284)10分鍾，潤洗樣本，並於黑暗中添加300 μL 0.03%鬼筆環肽(P2141，Sigma)30分鐘。為了染色細胞核，將細胞潤洗，並於黑暗中添加300 μL 0.01% DAPI(D9542，Sigma)30分鐘，潤洗樣本，然後置於顯微鏡載玻片上，經由螢光顯微鏡(Eclipse 80i；Nikon，Tokyo，Japan)觀察細胞骨架。
實施例2-9：導管之移植
微圖案化基材以1.5-mm直徑之玻璃軸心滾製於導管上，並以少量幾丁聚醣溶液貼附，將具有1.95-mm內徑及2.22-mm外徑之導管截成12-mm長之片斷，將GFP-陽性小鼠NSC(5×104/mL)懸浮液注入導管，然後在植入前直接封閉導管兩端並以1 rpm轉動72小時。
微溝槽化導管之結構(無細胞接種)使用SEM成像。包埋後，使用日立(Hitachi)塗覆組件IB-2塗覆機，將導管以金塗覆，經塗覆之樣本以掃描式電子顯微鏡檢查(S-3000N，Hitachi，Tokyo，Japan)。
實施例2-10：微溝槽化神經導管之動物移植
將九隻250至300 g重之雄性Sprague-Dawley大鼠用來進行初步動物實驗(各組n=3)。二組實驗組分別接受有NSC接種及無NSC接種之溝槽化表面導管，另一組接受反向自體移植物並作為對照組。將動物圈養於溫度控制於24±1℃及溼度45%與12小時晝夜循環的標準實驗籠中，並自由取食標準大鼠飼料及飲水。所有步驟根據動物照護規則，並經國立中興大學倫理委員會認可實驗。
動物以Citosol(6 mg/100g腹腔注射(杏林新生製藥股份有限公司，台北，台灣))麻醉，於左後腿實施手術。由左膝至臀部在皮膚造成切口，以暴露出下層肌肉，然後收縮肌肉以露出坐骨神經。將微溝槽化導管(含或不含GFP-陽性小鼠之NSC)或反向自體移植物植入10-mm坐骨神經缺口，以7-0尼龍顯微縫線，將神經殘幹固定於導管內部長約1 mm，使用3-0 Dexon(佳合醫材股份有限公司，台北，台灣)分層縫合手術部位。植入六週後，將植入導管之大鼠或對照組安樂死。
實施例2-11：神經再生之機能性評估
於3及6週後進行步行追蹤分析。關於SFI之計算，量測下述足印參數：PL、TS及IT之距離。收集N及E後腿之資料，根據前述方程式計算SFI，指數0反映正常機能，而-100理論上表示完全喪失機能。
實施例2-12：組織學分析
收取組織，於4%三聚甲醛中固定隔夜，以1%四氧化鋨(Polysciences，Warrington，Pa)染色及包埋於石蠟，切片(4 μm)，並以甲苯胺藍染色。使用影像分析系統(Image-Pro Lite，Media Cybernetics)測定有髓鞘之軸突及再生面積之數目，亦計數血管之數目。
使用DMA研究chi-Au之動態機械性質。參考第2圖關於chi-Au動態機械分析，其中第2A及2B圖各說明材料之動態模數及tan δ；此外，參考表4關於材料之 儲存模數及玻璃Tg。根據對於個別chi-Au濃度之DMA掃描之覆蓋，除了25 ppm在82℃前之值(稍低於0 ppm)外，動態模數隨濃度增加而增加。於37℃、25 ppm之動態模數為2787 MPa，而0 ppm為2830 MPa。在0與25 ppm，圖形整體上相似。相較於0與25 ppm，於50 ppm具有一較高之動態模數。具有100 ppm金之幾丁聚醣，如預期般為一堅固的材料，可見最高的動態模數(第2A圖，表4)。幾丁聚醣-金0與25 ppm比chi-Au 50與100 ppm具有較高tan δ，由tan δ峰值所表示之玻璃Tg在50 ppm有些微降低(第2B圖，表4)。
經由分析細胞增殖及C6細胞與NSC之基因表現，體外測試不同chi-Au複合物之細胞相容性。如第3A與3B圖所示，金奈米顆粒在細胞增殖上具有與濃度相關之刺激效果。關於NSC，相較於對照組(0 ppm)，於25或50 ppm之濃度，細胞增殖顯著增加。然而，當金濃度增加至100 ppm時，細胞增殖則類似於對照組。結果顯示，在增殖C6與NSC上，含25或50 ppm之奈米複合物優於其他濃度者。
對於培養於各種基材之C6與NSC的神經營養性基因表現之半定量分析結果簡述於第3C及3D圖。在C6與NSC之基因表現上，金的效果並不相同，一般而言，BDNF與GDNF基因表現程度高於NGF基因表現。比較不同金濃度之chi-Au，C6在50 ppm金時檢測到較高之NGF表現，而BDNF與GDNF之表現量隨金之濃度增加而增加(第3C圖)。相反地，在NSC之NGF、BDNF與GDNF基因表現上並無明顯的濃度從屬性(第3D圖)。對於NGF與GDNF，在僅有幾丁聚醣上，基因表現稍高於在其他濃度者；但差別並未達到顯著性。對於BDNF，在所有濃度之chi-Au上基因表現，僅於25 ppm金之GDNF基因表現低於僅有幾丁聚醣上有顯著性。
NSC在微圖案化表面之生長及定向受基材之三維形態影響。大多數NSC在無圖案化基材上顯露多極性，而在微溝槽化基材上顯露雙極性。在無圖案化表面上之NSC在排列生長上並無呈現特定傾向，但延伸的突起為放射形式。然而，在微圖案化表面上之NSC形態具有平行於圖案化基材之溝槽方向的瘦長突起。
於培養24及72小時後，微圖案化基材上細胞定位之度數顯示於第4圖。結果顯示，於24小時後，78.3%之NSC排列生長於幾丁聚醣基材上，且83.7%之NSC排列生長於chi-Au基材。培養72小時後，超過90%之細胞排列生長於二種基材；且於chi-Au基材上之排列生長些微較佳於僅有幾丁聚醣者(無顯著性)。
SEM觀察清楚的顯示，在滾製程序後可見於導管內腔表面上保留之微溝槽，亦保持其特有之尺寸。
SFI值列於表5。具或不具NSC之chi-Au二組於手術後3週之值上類似。於第6週，二組之值皆明顯大於第3週，尤其是，在NSC-接種之導管的SFI值明顯大於無接種之chi-Au導管的值。
值表示平均值±標準差
*顯著(P<0.05)大於第3週
**顯著(P<0.05)大於chi-Au
在植入程序後6週並無動物死亡。巨觀下，植入物似乎為一不連續擴展且結合於坐骨神經之區域，導管並未被降解。神經成功的連結，可見白色管狀物質通過導管。組織切片顯示，預先接種NSC之導管的有髓鞘軸突及再生面積之數目明顯大於僅有導管者(表6)。在預先接種NSC之導管中的神經纖維周圍可注意到血管新生。
表6 二組實驗組之中央導管的組織學分析資數據
值表示平均值±標準差
*顯著(P<0.05)大於chi-Au
實施例3：CHI-AG在細胞增殖上之效果
為了檢測其他金屬之適用性，製作並試驗chi-Ag奈米複合物，且結果顯示於第5圖。如所示，在第3日，生長於含幾丁聚醣及銀顆粒(5奈米)材料的細胞數目高於生長於含幾丁聚醣材料的細胞數目30%，5-奈米銀顆粒之有效濃度約高於幾丁聚醣30 ppm；然而，一般相信，依顆粒大小，少於500 ppm之任何濃度是合適的。當使用平均大小為25奈米或50奈米之顆粒時，可觀察到第3日之60 ppm的有效濃度需增加細胞數目至30%，因此，可推斷出顆粒大小與濃度間之關係。
可理解到，對於各個揭示之具體實施例，在不背離本發明之精神與範圍下，可進行其他許多變更。基於此項原因，以上敘述並不能視為對於本發明之限制，而應解釋為僅是較佳具體實施例之例示。
第1圖顯示在無圖案化PLA與微圖案化PLA上之基因表現，其中第1A圖說明NGF基因之表現，而第1B圖說明BDNF基因之表現。
第2圖顯示chi-Au之動態機械分析，其中第2A及2B圖各說明材料之動態模數及tan δ。
第3圖顯示chi-Au在C6神經膠質細胞與NSC之增殖與基因表現上之效果：第3A圖為C6增殖；第3B圖為NSC增殖；第3C圖為C6神經膠質細胞中之基因表現；第3D圖為NSC中之基因表現。
第4圖顯示於24與72小時之NSC排列生長(細胞排列生長之百分比)
第5圖顯示chi-Ag在細胞增殖上之效果。

Claims (10)

  1. 一種可植入性神經再生導管，其包含：一生物可分解之聚合物，係選自聚葡萄糖胺、幾丁聚醣、聚乳酸交酯、聚(D,L-乳酸交酯)、或其組合；一生物相容性金屬；及一神經再生促進成分，係選自許旺氏細胞、神經幹細胞、生長因子、或其組合；其中，該可植入性神經再生導管包括一實質上光滑之外表面及一具有至少一微溝槽於其上之內表面。
  2. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該神經幹細胞之基因組包含F1B-GFP基因。
  3. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該神經再生促進成分包含纖維母細胞生長因子第一型。
  4. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該金屬包含金。
  5. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該金屬之大小約為1至約50奈米。
  6. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該金屬之大小約為5至約30奈米。
  7. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該聚合物中該金屬的濃度小於500 ppm。
  8. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該聚合物中該金屬的濃度介於約25 ppm至約100 ppm之間。
  9. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該微溝槽之寬度約為1至50微米之間、間隔約為1至50微米之間、及深度約為0.1至15微米之間。
  10. 如申請專利範圍第1項之導管，其中該微溝槽之寬度約為10至30微米之間、間隔約為10至30微米之間、深度大於約0.5微米。
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