CN111893753B - 一种二维超支化聚阴离子纳米片修饰的纳米纤维支架及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二维超支化聚阴离子纳米片修饰的纳米纤维支架及其制备方法和用途。具体提供了一种纳米纤维复合材料(PCL‑GO‑HPGS)，它是用超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯对聚己内酯纤维进行表面涂覆后得到的材料。该纳米纤维复合材料作为支架可以提高IPS细胞的粘附和增殖性能，并能高效的维持IPS细胞的干性，避免过早出现非定向分化。在神经分化阶段，该PCL‑GO‑HPGS支架能够促进IPS细胞形成的胚状体向神经元细胞的定向分化，并同时抑制IPS细胞向星形胶质细胞分化。本发明提供的PCL‑GO‑HPGS纳米纤维复合材料可以作为一种新的具有超支化分子多价键及可促进生物粘附性能的纳米纤维支架，在干细胞分化及神经组织再生等疾病治疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于组织工程支架领域，具体涉及一种二维超支化聚阴离子纳米片修饰的纳米纤维支架及其制备方法和用途。
背景技术
神经退行性疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症等的共同特征是在中枢神经系统的不同部位发生特发性神经元丢失，这些神经元的丢失给病人造成了一系列相应的功能障碍。应用人类胚胎干细胞进行细胞替代治疗曾引起人们很大的兴趣，但是一些伦理学问题阻碍了该研究的发展。研究发现，通过导入特定的转录因子，体细胞能够被诱导为具有胚胎干细胞特性的细胞，即诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell，IPS细胞)，而获取人类IPS细胞并不涉及明显的伦理问题，并且运用病人特异性的IPS细胞能使自体移植成为可能。因此，IPS细胞有可能成为细胞替代治疗中可靠的细胞来源。
IPS细胞自2006年出现以来，因其生物特性高度类似于胚胎干细胞，具有无限自我更新能力和多能分化潜力，迅速成为干细胞研究领域的热点。IPS细胞可由多种成熟体细胞重编程获得，且可进行个体化定制，因此，IPS细胞作为一种重要的种子细胞来源，在再生医学以及生物组织工程领域具有极高的应用价值。在组织工程应用中，种子细胞需要与组织工程支架材料复合培养，因此安全无毒并具备良好的生物相容性是对组织工程支架材料的最基本要求。
聚己内酯(polyε-caprolactone，PCL)是一种人工合成高分子聚合物，具有机械强度高、柔韧性佳、生物安全性好及可生物降解等特点，是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准可安全用于人体的化工材料，已被广泛应用于组织工程领域。采用静电纺丝方法将PCL制成纳米纤维支架，能够仿生模拟细胞外基质多孔隙的立体结构，为种子细胞的生长和分化等生理活动提供适宜的局部3D纳米纤维化的微环境。
目前，已有较多干细胞与纳米纤维材料复合培养的报道，但是，这些纳米纤维材料在促进干细胞的粘附和增殖、抑制干细胞过早出现非定向分化、维持干细胞的干性等方面还存在不足。因此，亟需制备出一种能够促进干细胞的粘附和增殖、维持干细胞的干性及诱导其定向分化的纳米纤维支架。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高IPS细胞的粘附和增殖性能，并能维持IPS细胞的干性及促IPS细胞定向神经分化的纳米纤维复合材料及其制备方法和用途。
本发明提供了一种纳米纤维复合材料，它是用超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯对聚己内酯纤维进行表面涂覆后得到的材料。
进一步地，所述超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯是以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物，其中，叠氮化超支化聚甘油为超支化聚甘油上的羟基被叠氮基取代后所得的产物。
进一步地，所述表面改性时，叠氮化超支化聚甘油和氧化石墨烯的质量比为(0.01～100)：1，优选为(1～50):1，更优选为10:1；表面改性时的条件为：温度100～150℃，优选为120℃，时间0.1～48h，优选为6h；
和/或，所述叠氮化超支化聚甘油为超支化聚甘油上5％～20％的羟基被叠氮基取代后所得的产物，优选为超支化聚甘油上11％的羟基被叠氮基取代后所得的产物；
和/或，所述超支化聚甘油的分子量为5000～10000g.mol-1，PDI<2，支化度为40％～60％，优选的，所述超支化聚甘油的分子量为7200g.mol-1，PDI<1.2，支化度为50％。
进一步地，所述超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯是将权利要求2或3所述以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物再进行磺化后所得，所述磺化的步骤为：将权利要求2或3所述以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物加入有机溶剂中，分散均匀，得分散液，然后加入SO3·吡啶配合物，反应，即得；
优选的，所述有机溶剂为DMF，所述分散液的浓度为0.5～1.5mg/mL，优选为1mg/mL；所述以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物与SO3·吡啶配合物的质量比为1：(5～15)，优选为1：10.75；所述反应的温度为50～70℃，优选为60℃，反应的时间为36～72h，优选为48h。
进一步地，所述聚己内酯纤维是以聚己内酯为原料，通过静电纺丝法制得的纤维；
优选的，所述聚己内酯的分子量为60～100kDa，优选为80kDa；
更优选的，所述静电纺丝法的制备工艺为：将聚己内酯溶于有机溶剂，得到聚合物溶液，然后通过静电纺丝，得到聚己内酯纤维；所述有机溶剂优选为1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，所述聚合物溶液的浓度优选为0.05～0.30g/mL，更优选为0.10g/mL。
进一步地，所述纳米纤维复合材料的涂层厚度为5～15nm，优选为10nm。
本发明还提供了上述纳米纤维复合材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)用O2等离子体处理权利要求1～6任一项所述聚己内酯纤维；
(2)将权利要求1～6任一项所述超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯分散到溶剂中，得到分散液；所述溶剂为水或醇类溶剂；
(3)将步骤(1)处理后的聚己内酯纤维浸入步骤(2)所得分散液中，然后取出，干燥，即得；
优选的，步骤(1)中，所述处理时间为0.5～3min，优选为1min；
和/或，步骤(2)中，所述溶剂为水，所述分散液的浓度为0.5～3mg/mL，优选为1mg/mL；
和/或，步骤(3)中，所述浸入时间为0.5～5min，优选为1min。
本发明还提供了一种组织工程修复材料，它是以上述纳米纤维复合材料作为组织工程支架，负载诱导多能干细胞或神经细胞后所得。
本发明还提供了上述纳米纤维复合材料在制备组织工程支架中的用途。
进一步地，所述组织工程支架能够促进诱导多能干细胞的粘附和增殖；
和/或所述组织工程支架能够促进诱导多能干细胞干性的维持；
和/或，所述组织工程支架能够促进诱导多能干细胞形成的胚状体向神经元细胞定向分化，促进神经元细胞的成熟，促进神经元细胞表达微管相关蛋白2和神经元特异性胞核蛋白；
和/或，所述组织工程支架能够抑制诱导多能干细胞中胶质纤维酸性蛋白的表达，抑制诱导多能干细胞向星形胶质细胞分化。
本发明中，当真空度低于1.333×10～1.333×10Pa时称为高真空。
本发明中，SO3·吡啶配合物即三氧化硫吡啶络合物，CAS号26412-87-3。
本发明制备了一种具有生物相容性和多价聚阴离子的超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯的2D纳米材料(GO-HPGS)，并以该2D纳米材料为涂层对PCL纤维进行改性制得了纳米纤维复合材料(PCL-GO-HPGS)，该纳米纤维复合材料能够介导IPS细胞的粘附、增殖和分化。实验证明，本发明制得的PCL-GO-HPGS作为支架可以提高IPS细胞的粘附和增殖性能，并能高效的维持IPS细胞的干性，避免过早出现非定向分化。在神经分化阶段，该PCL-GO-HPGS支架能够促进IPS细胞形成的胚状体向神经元细胞的定向分化，并同时抑制IPS细胞向星形胶质细胞分化。
与PCL-GO和PCL-HPGS支架相比，本发明制得的PCL-GO-HPGS支架在促进IPS细胞增殖、粘附，以及抑制IPS细胞向星形胶质细胞分化上具有显著提高甚至协同增效的作用，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的PCL-GO-HPGS纳米纤维复合材料可以作为一种新的具有超支化分子多价键及可促进生物粘附性能的纳米纤维支架，在干细胞分化及神经组织再生等疾病治疗中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1(a)制备GO-HPGS的示意图，(b)相同放大倍率下GO-HPGS纳米片的TEM图像，(c)GO-HPGS纳米片的HAADF-STEM图像、EDS曲线和相应元素地图，反映了GO-HPGS表面的C、O、N和S元素的分布，(d)GO-HPGS的AFM图像，(e)基于25个随机纳米片的GO-HPGS的厚度分布，每个厚度从3.9nm到4.3nm不等，表明所获得的GO-HPGS纳米片是纯单层产物，(f)GO-HPGS的截面分析，两个箭头之间的高度差约为4.11nm，(g)GO和GO-HPGS的XPS扫描光谱，GO-HPGS表面上(h)C1S、(i)N1S光谱的高分辨率分峰谱图。
图2(a)利用静电纺丝工艺制备PCL纤维和利用GO-HPGS纳米片分散液对PCL纤维进行包覆的流程示意图，(b)样品PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS的SEM图像，(c)S元素在PCL-GO-HPGS上的分布和EDS曲线，(d)PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS的FTIR光谱，(e)PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS的平均静态水接触角，(f)PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS的XPS谱，(g)PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS在培养基中浸泡24小时后的XPS谱，(h)各种纤维支架上C、N、O等的原子百分比，(i)在培养基中浸泡24小时后的各种纤维支架上C、N、O等的原子百分比。
图3(a)细胞粘附在不同纤维支架表面的示意图；(b)在各支架上培养1、3、5天后IPS细胞增殖的CCK-8检测结果；(c)培养3天后IPS细胞的存活、死亡情况(绿色:活细胞，红色:死细胞)；(d)DAPI(细胞核)和鬼笔环肽(F-actin)染色后，单个IPS细胞粘附在支架上的细胞形态；(e)(d)图中F-actin染色的二维分形维数(Df)分布；(f)培养3天后IPS细胞YAP信号的免疫荧光染色(YAP，绿色；DAPI,蓝色)；(g)定量分析不同样本的细胞扩散面积(n＝50)；(h)统计量化每个细胞累积Df值(n＝10)；(i)YAP细胞核/质荧光强度比的统计量化(n＝20),****p<0.0001,***p<0.001,**p<0.01,and*p<0.05。
图4(a)在PCL-GO-HPGS和PCL支架上对IPS细胞进行免疫荧光染色，以进行干性标记：Nanog(绿色)、Oct4(绿色)、Sox2(红色)和SSEA1(红色)；定量分析免疫荧光染色图像的灰度，得到(b)Nanog和Sox2、(c)Oct4和SSEA1的平均表达量，***p<0.001,**p<0.01,and*p<0.05。
图5(a)制备EB和神经分化的示意图；(b)在培养第五天，原代神经元标记物GFAP和Nestin的免疫荧光染色(blue,DAPI，绿色，GFAP，红，Nestin)；分别定量分析免疫荧光染色图像的灰度强度(c)Nestin和(d)GFAP的平均表达；分别在(e)PCL、(f)PCL-HPGS、(g)PCL-GO和(h)PCL-GO-HPGS上生长的EB从中心到边缘的GFAP和Nestin强度分布曲线(n＝10)，***p<0.001,**p<0.01,and*p<0.05。
图6(a)培养7天后，早期神经元标记蛋白Tuj1(蓝色，DAPI；红色,Tuj1)的共聚焦图像，二维分形维数(Df)和荧光强度图；(b)每个样品上的前20个长轴突，轴突的半径和θ(°)分别为轴突的长度和角度；(c)神经元突交点数量随EB中心到边缘的变化，神经突交点表示神经突的顶端节和棘；(d)每个区域的神经突交点数随EB中心到边缘的变化；(e)分析不同样品单个细胞内的定量累积Df值(n＝20)；(f)根据灰度强度进行定量分析，得到了Tuj1的平均表达情况；(g)不同样本每个EB的平均神经元突起数(n＝20)；(h)不同样本的神经突长度分布(n＝20)。***p<0.001,**p<0.01,and*p<0.05。
图7(a)培养14天时，不同样品成熟神经元标记蛋白NeuN和MAP2的共聚焦图像(蓝色，DAPI；绿色,NeuN；红色,MAP2)；(b)根据图7a绘制的NeuN和MAP2蛋白的共定位图；(c)根据免疫荧光染色图像测定NeuN和MAP2的定量强度；(d)曼德斯共域系数(MCC)MAP2和NeuN,MCC为共域蛋白在总表达蛋白中所占的百分比；(e)MAP2与NeuN蛋白的皮尔逊相关系数(PCC)值越小，与共域的相关性越小，***p<0.001,**p<0.01,and*p<0.05。
图8 HPG-N3制备工艺示意图。
图9 HPG的1H-NMR谱图。
图10 HPG的FTIR谱图。
图11 HPG-N3的FTIR谱图。
图12 HPGS的1H-NMR谱图。
图13 HPGS的FTIR谱图。
图14 GO的FTIR谱图。
图15 GO-HPG的FTIR谱图。
图16 GO-HPGS的FTIR谱图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：制备GO-HPGS纳米片包覆的聚己内酯纤维(PCL-GO-HPGS)
1、GO-HPGS 2D纳米片的制备与表征(1.1)叠氮化超支化聚甘油(HPG-N3)的合成
首先，参照文献(Advanced Materials 2014,26(17),2688-2693；AngewandteChemie International Edition 2014,53(43),11650-11655)记载的一步开环阴离子聚合法(ROAP)合成超支化聚甘油(HPG)粗品，然后将HPG粗品在甲醇中溶解，透析3天以进一步纯化。离心去除不能溶解的沉淀物，取上清液浓缩，并在60℃、高真空干燥一夜，以去除残留的甲醇，得到超支化聚甘油(HPG)，分子量＝7200g.mol-1，PDI<1.2，支化度50％。
在高真空(HV)下，将HPG(3.5g)在60℃下干燥一夜。然后将干燥的HPG溶解在干燥的DMF(50毫升)、10毫升吡啶和ET3N(即三乙胺，0.7毫升、4.965毫摩尔、1.5当量)的混合溶液中，然后冷却到0℃。将MsCl(即甲磺酰氯，0.659毫升，8.512毫摩尔，1.5当量)溶于干燥的吡啶(20毫升)中，通过注射器在0℃下滴加入上述溶解了HPG的混合溶液中。在0℃下搅拌溶液1h后，温度升至室温，继续搅拌16h，沉淀抽滤、干燥，取固体在甲醇中透析，获得蜂蜜状的产物，命名为HPG-MS，收率92％。所得HPG-MS的功能化程度(DF)＝11％。HPG-MS的功能化程度即HPG-MS中甲磺酰基的个数占HPG中羟基个数的比例。
将所得的HPG-MS在超声作用下溶于80mL干燥DMF中，然后置于带有回流冷凝器和磁力搅拌器的单颈烧瓶中。加入NaN3(叠氮化钠)，将所得悬浮液在70℃下加热、回流3天。冷却后，用赛力特硅藻土过滤混合物，除去多余的NaN3。滤液在40℃以下的真空环境中浓缩，去除DMF溶剂，然后将所得产物依次在H2O和甲醇中各透析24h，得到棕色糊状化合物，命名为叠氮化超支化聚甘油(HPG-N3)，HPG-N3中，叠氮化合物接枝率为11％，叠氮化合物接枝率即HPG-N3中叠氮基团的个数占HPG中羟基个数的比例。HPG-N3的合成路线如图8所示。
(1.2)氧化石墨烯(GO)的合成。
采用改性Hummers法由天然石墨片制备氧化石墨烯，具体步骤如下：
取2.5g石墨和1.875g NaNO3置于烧瓶中，然后，在冰水浴中加入75mL H2SO4，搅拌，在1h左右缓慢加入10g KMnO4，在冰水浴中搅拌2h，然后在60℃下搅拌12h。然后用去离子水(700mL)缓慢稀释混合物，用H2O2(30％wt)消耗掉多余的KMnO4。将所得体系离心，去除不溶性沉淀。所得GO溶液用盐酸(10wt％)过滤和洗涤。然后用去离子水多次洗涤去除金属离子，在使用前1周，用去离子水对原始的棕色GO溶液进行透析，以去除任何残留的盐和酸。
(1.3)合成HPG共价功能化氧化石墨烯(GO-HPG)。
为了避免高负电荷HPGS与氧化石墨烯(GO)之间的强静电斥力，本实施例使用电中性HPG-N3对GO进行功能化。
将上述合成的HPG-N3(10g)与GO(1g)在120℃下反应6小时，得到HPG共价功能化氧化石墨烯(GO-HPG)。
(1.4)磺化GO-HPG(GO-HPGS)的合成
将上一步制备的GO-HPG(600mg)重新分散在干燥DMF中，形成1mg/mL的分散液。然后在剧烈搅拌的条件下将该分散液加热到60℃，然后在200mL上述分散液中加入6.45gSO3·吡啶配合物，在60℃下反应48h，反应结束后，离心5次除去多余的SO3·吡啶配合物，去除固体，用盐酸水溶液和氢氧化钠水溶液交替透析2天，然后再用蒸馏水透析至中性，蒸干水溶剂，即得到磺化GO-HPG，命名为GO-HPGS。
2、制备GO-HPGS纳米片包覆的聚己内酯纤维
(2.1)制备PCL纤维
利用静电纺丝工艺制备PCL纤维：将PCL(80kDa)溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，制备10％(1g，10mL，w/v)聚合物溶液。将聚合物溶液放置在带有金属针的注射器中，然后喷射到铝箔包裹的滚筒收集器(水平放置)上，，得到PCL纤维。纺丝工艺参数：收集器与注射器针头距离12cm，聚合物溶液流速2mL/h，高压电源电压18千伏。
最后将所得PCL纤维在真空下干燥一夜，从铝箔上剥离，备用。
(2.2)制备GO-HPGS纳米片包覆的PCL纤维
用O2等离子体处理上一步得到的PCL纤维1min，生成亲水基团，将疏水聚合物表面转化为亲水性，便于与GO-HPGS纳米片共价键合。然后将O2等离子体处理后的PCL纤维浸泡在GO-HPGS纳米片分散液(浓度为1mg/mL，溶剂为H2O)中，浸泡1min，然后取出，得到涂覆后的GO-HPGS纳米片，在真空下干燥一夜，得到GO-HPGS纳米片包覆的PCL纤维(涂层厚度为10nm)，命名为PCL-GO-HPGS。制备流程如图2(a)所示。
实施例2：制备GO-HPGS纳米片包覆的聚己内酯纤维(PCL-GO-HPGS/2)
采用与实施例1相同的方法制得PCL纤维和GO-HPGS纳米片，然后用O2等离子体处理上一步得到的PCL纤维0.5min，生成亲水基团，将疏水聚合物表面转化为亲水性，便于与GO-HPGS纳米片共价键合。然后将O2等离子体处理后的PCL纤维浸泡在GO-HPGS纳米片分散液(浓度为0.5mg/mL，溶剂为H2O)中，浸泡0.5min，然后取出，得到涂覆后的GO-HPGS纳米片，在真空下干燥一夜，得到GO-HPGS纳米片包覆的PCL纤维，命名为PCL-GO-HPGS/2。
实施例3：制备GO-HPGS纳米片包覆的聚己内酯纤维(PCL-GO-HPGS/3)
采用与实施例1相同的方法制得PCL纤维和GO-HPGS纳米片，然后用O2等离子体处理上一步得到的PCL纤维3min，生成亲水基团，将疏水聚合物表面转化为亲水性，便于与GO-HPGS纳米片共价键合。然后将O2等离子体处理后的PCL纤维浸泡在GO-HPGS纳米片分散液(浓度为3mg/mL，溶剂为H2O)中，浸泡5min，然后取出，得到涂覆后的GO-HPGS纳米片，在真空下干燥一夜，得到GO-HPGS纳米片包覆的PCL纤维，命名为PCL-GO-HPGS/3。
对比例1：制备HPGS包覆的聚己内酯纤维(PCL-HPGS)
1、超支化聚甘油硫酸盐(HPGS)的合成
采用与实施例1相同的方法制得HPG，然后将HPG溶解在无水DMF(50.0mL)中，形成1mg/mL的分散液，加热至60°。在上述中加入SO3·吡啶配合物(9.88g)溶液，在60℃下反应48h，然后用水(50mL)淬灭反应。然后通过加入1(M)NaOH反应后体系的pH调为8。离心，去除溶液后，将固体在水中透析1周，得超支化聚甘油硫酸盐，命名为HPGS。
2、制备HPGS包覆的聚己内酯纤维
用O2等离子体处理PCL纤维1min，生成亲水基团。然后将O2等离子体处理后的PCL纤维浸泡在HPGS分散液(浓度为1mg/mL，溶剂为H2O)中，浸泡1min，然后取出，得到涂覆后的HPGS，在真空下干燥一夜，得到HPGS包覆的PCL纤维，命名为PCL-HPGS。
对比例2：制备GO包覆的聚己内酯纤维(PCL-GO)
采用与实施例1相同的方法合成氧化石墨烯(GO)。
用O2等离子体处理PCL纤维1min，生成亲水基团。然后将O2等离子体处理后的PCL纤维浸泡在GO分散液(浓度为1mg/mL，溶剂为H2O)中，浸泡1min小时，然后取出，得到涂覆后的GO，在真空下干燥一夜，得到GO包覆的PCL纤维，命名为PCL-GO。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：结构表征
1、实验方法
分别对本发明实施例1和对比例制得的各中间体和终产物进行结构表征。
2、实验结果
HPG的1H-NMR谱图和FTIR谱图如图9、10所示，HPG-N3的FTIR谱图如图11所示，HPGS的1H-NMR谱图和FTIR谱图如图12、13所示，GO的FTIR谱图如图14所示，GO-HPG的FTIR谱图如图15所示，GO-HPGS的FTIR谱图如图16所示。
如图1a所示，叠氮功能化超支化聚甘油通过120℃的硝基环加成反应将GO上的SP2碳键与HPG-N3上的叠氮化物基团共价共轭接枝到GO上。HPG-N3与平面GO之间的疏水相互作用和氢键可以显著提高GO上接枝HPG的数量。叠氮基硝基环加成反应为可伸缩的HPG锚固提供了一种非常快速和稳定的方法。
然后，对GO-HPG进行磺化，将抗生物污染性的HPG转变为多价、生物相容性和生物粘附性的HPGS，即GO-HPGS纳米片。如图1a所示，GO-HPG纳米片通过与SO3·吡啶配合物作用被磺化。图1b所示的TEM图像表明GO-HPGS的2D薄片结构，表明在磺化过程中，GO的高表面/体积比性能和2D结构得到了很好的保持。图1c显示了高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(HAADF-STEM)照片的元素分布，说明C、O、S和NA元素均匀分布在GO-HPGS 2D纳米片上，表明HPGS被均匀地接枝到GO上。图1d显示了GO-HPGS的原子力显微镜(AFM)结果。图1e、图1f显示了基于25个纳米片计算的GO-HPGS的厚度分布，结果表明其厚度从3.9nm到4.3nm不等，图1f两个箭头之间的差值约为4.11nm。同时，通过计算25个纳米片的GO厚度分布(在0.9nm～1.2nm之间)，验证了HPGS在GO纳米片上的均匀接枝。
图16所示的GO-HPGS的FTIR谱图中，3401.8(-OH)、3070.1、2877.2(-CH-、-CH2-)、2106.1(-N3)、1716.3、1611.2、1194.6、1022.0(-SO3-)cm-1处的峰值验证了GO-HPGS的化学结构。用X射线光电子能谱(XPS，图1g，1h，1i)对GO-HPGS化学结构进行了进一步的表征。图1g显示了GO-HPGS纳米片上存在硫元素(硫酸盐基)和氮元素(共轭叠氮化物)，证实了HPG-N3在平面GO上的成功接枝。高分辨率的C1s光谱(图1h)表明存在C＝C、C-C-N、C-O和C＝O峰。高分辨率N1s光谱(图1i)显示了三个主要氮峰，包括401.7eV(残余N3基团)、400.8eV(残余N3基团中的-N＝和＝N-)、399.7eV(环加成形成的N-石墨烯共轭结构)。
图2b显示了用扫描电子显微镜(SEM)观察到的支架的形貌。电纺PCL纤维基底(厚度～50μm)由直径约为1μm的交叉纤维组成。根据放大的SEM图像，GO和GO-HPGS纳米片包覆的样品在纤维上与纯PCL纤维上的光滑表面相比有石墨烯褶皱，这表明GO和GO-HPGS 2D薄膜紧密包裹在纤维表面，三维纳米纤维结构得到了很好的保持。在PCL-GO-HPGS上的X射线能谱分析数据(EDS)和元素地图(图2c)表明，由于GO-HPGS的包覆可以检测到硫的存在。图2d中的FTIR数据分别给出了不同样品的特征峰。在PCL-HPGS上有-OH和-SO3峰，PCL-GO上有-OH峰，PCL-GO-HPGS上有-OH峰和-SO3峰，证实了上述样品的成功包覆。纯PCL上的水接触角(图2e)约为129°。用不同的样品涂覆后，呈超亲水性。如图2f和表1所示，通过XPS进一步验证了2D纳米片在PCL纳米纤维上的成功包覆。根据图2f中的XPS测量扫描光谱，PCL-HPGS纤维上存在丰富的硫元素，PCL-GO-HPGS纤维上存在氮、硫元素，表明HPGS和GO-HPGS纳米片分别包覆在PCL纤维上。如图2g和2i所示，样品(浸泡在细胞培养基中)上的元素N1s含量与图2f和2h相比有所增加。因此，表明这些支架可以很容易地从环境中吸收氨基酸基肽或蛋白质分子，这对于通过调整介质进而调节和规范IPS细胞的生长和分化至关重要。在包覆GO-HPGS纳米片后，支架对氨基酸基肽和其他小分子具有更好的吸收能力，可进一步用于操纵IPS细胞的命运。
表1.PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS表面各元素的原子百分比
表1中，“-medium”表示在培养基中浸泡24小时后的样品。
上述结果表明，本发明成功制得了HPG、HPG-N3、HPGS、GO、GO-HPG、GO-HPGS。并以GO-HPGS纳米片为涂层，以具有良好的生物相容性和可降解性的聚己内酯(PCL)纤维为基材，成功制得了GO-HPGS纳米片包覆的PCL纤维(即PCL-GO-HPGS)。
实验例2：对IPS细胞生物活性影响的表征
1、实验方法
(1)细胞培养。小鼠的诱导多能干细胞(IPS细胞)购自美国Lonza。培养板涂覆层浓度为5μg/cm2的粘连蛋白(溶剂为PBS缓冲液)。细胞的培养环境为37℃，含有95％空气和5％CO2饱和湿度气氛中，当细胞生长到70-80％后，用Accutase传代和收集。
(2)细胞相容性测试。在96孔板的中，将IPS细胞分别接种到PCL、PCL-HPGS、PCL-GO、PCL-GO-HPGS(实施例1制得)样品上，密度为1×104细胞/cm2。用CalceinAM/ethidiumhomodimer-1染料(活/死细胞活力测定)培养3天后，对细胞的活力进行评估。
在37℃下孵育30分钟后，用DPBS洗涤。用荧光显微镜(Zeiss Z1)观察，获得图像。活细胞和死细胞分别以绿色和红色标记。
分别在接种第1天、第3天和第5天用细胞计数试剂盒-8(CCK-8试剂盒)检测IPS细胞的增殖情况。在96孔板的每个孔中加入10μl CCK-8溶液，在37℃下孵育4h，用微板阅读器在450nm波长处测定每个样品的吸光强度。所有实验重复三次，每个样本读取6个平行数据。
(3)细胞形态观察。用phalloidin-647/DAPI染色细胞扩展形态和骨架，用DPBS洗涤细胞，然后用4％多聚甲醛固定样品20min。用0.1％Tritonx-100在dpbs中浸泡30min，使细胞膜渗透。然后将样品与phalloidin-647按1：400、与DAPI按1：200稀释，分别孵育45min。用PBS清洗三次后，在倒置共聚焦显微镜下观察样品(Leica SP8，德国)。
2、实验结果
为了评估GO-HPGS纳米片涂层支架是否适合生物应用，本发明使IPS细胞在不同的纳米纤维支架上生长，观察细胞的存活、粘附和增殖情况。图3a为PCL和GO-HPGS纳米片涂层支架上细胞粘附特性的示意图。培养1、3、5天后，使用CCK-8评估IPS细胞在纳米纤维支架上的增殖情况(图3b)。可以看出，培养5天后，PCL-GO支架上的细胞增殖量比PCL提高了50％，PCL-HPGS支架上的细胞增殖量比PCL提高了15％，而本发明PCL-GO-HPGS支架上的细胞增殖量比PCL提高了110％，大于PCL-GO支架与PCL-HPGS支架上细胞增殖率的总和。此外，PCL-GO-HPGS在第3天的活/死细胞染色(图3c)显示细胞均质且互联，状态明显优于PCL-GO、PCL-HPGS和纯PCL。上述结果表明，与PCL-GO和PCL-HPGS支架相比，本发明制得的PCL-GO-HPGS支架对IPS细胞的生长和增殖有协同改善作用。
为进一步研究GO-HPGS包覆纤维与IPS细胞的相互作用，用DAPI(蓝色)染色细胞核，鬼笔环肽(红色)染色F-actin，使用共聚焦显微镜观察。图3d显示，生长在PCL-GO-HPGS上的细胞的表面有更多的细胞伪足，可以提供更多的结合位点供IPS细胞粘附。二维分形维度(2D fractal dimensions，Df)是一种无量纲值，用于量化空间排列的复杂性和细胞骨架的复杂性，可以用来定量评价细胞的粘附特性。利用MATLAB软件根据F-actin染色分析对应的Df(图3e)。GO-HPGS纳米片包覆表面细胞骨架的复杂性表明，GO-HPGS纳米片表面的波状结构和多价HPGS的蛋白质结合亲和力导致细胞有更多的粘附点。Df值的定量分析表明(图3h)，PCL-GO上细胞的Df值比PCL提高了20％，PGL-HPGS上细胞的Df值比PCL提高了5％，PCL-GO-HPGS上细胞的Df值比PCL提高了65％，大于PCL-GO与PCL-HPGS上Df值提高比例的总和。此外，对细胞面积的相关分析表明(图3g)，GO-HPGS纳米薄片涂层表面的细胞扩散面积大于PCL、PCL-GO和PCL-HPGS，这也说明在PCL-GO-HPGS支架上，细胞有更多固定的机会，更有利于促进细胞的运动和粘附。上述结果表明本发明提供的GO-HPGS包覆纤维支架能够为脆弱的IPS细胞提供良好生存环境，与PCL-GO和PCL-HPGS支架相比，本发明制得的PCL-GO-HPGS支架对IPS细胞的粘附有协同增效作用。
在细胞粘附和扩散过程中，肌动蛋白细胞骨架的重排将调节细胞信号通路的改变。细胞扩散性增强常伴有YES关联蛋白(yes associate protein，YAP)移位和YAP反应基因转录激活。其在细胞核的定位导致IPS细胞促进细胞增殖。同时，活化的YAP核易位可介导IPS细胞的干性维持。因此，本发明使用免疫荧光染色进一步研究了PCL和PCL-GO-HPGS上的YAP信号(图3f)。对于PCL，YAP明显位细胞质中，而在PCL-GO-HPGS上，更多的YAP信号存在于细胞核中。图3i的YAP核/细胞质比值也说明更多的YAP在PCL-GO-HPGS上被激活进入细胞核，证明PCL-GO-HPGS可以促进IPS细胞增殖，促进干细胞干性维持。
实验结果表明，本发明制得的PCL-GO-HPGS作为支架与IPS细胞共培养，能够提高IPS细胞的粘附和增殖性能，并能高效的维持IPS细胞的干性，避免过早出现非定向分化。与PCL-GO和PCL-HPGS支架相比，本发明制得的PCL-GO-HPGS支架在促进IPS细胞增殖和粘附上均取得了协同增效的效果。
实验例3：对IPS细胞的神经分化影响的表征
1、实验方法
将IPS细胞用神经元分化培养基在非处理细胞培养皿中培养，培养至2×105个细胞/mL的浓度。将待测支架材料样品(PCL、PCL-HPGS、PCL-GO、PCL-GO-HPGS)加入细胞培养基，加入IPS细胞，在37℃，5％CO2培养箱中孵育细胞，使它们在待测支架薄膜表面形成胚状体(EB)。第二天，用新鲜的分化培养基培养EB，将EB转移到15毫升的锥形管中，在200×g下旋转1分钟。后将EB重新悬浮在新鲜的MIPS细胞分化培养基中，并将其重新植在一个新的未处理的细胞培养皿中。第二天，将EB分为4个新的培养皿，新鲜分化培养基配以0.5μm视黄酸(Sigma-Aldrich)和200ng/mL Sonic Hedgehog C25II重组小鼠蛋白。7天后，用神经元标记物βIII微管蛋白(Tuj1)对细胞进行染色。分化12天后，细胞表达成熟神经元标记微管相关蛋白2(MAP2)和神经元特异性胞核蛋白(NeuN)。
2、实验结果
Nanog、Sox2、OCT4和SSEA1是保护未分化IPS细胞干性的关键转录因子，参与IPS细胞自我更新发育的调节，可决定IPS细胞命运。为了更好地表明重新编辑的细胞的原始性和干性，本发明在培养第3天观察了四个原始干细胞标记Nanog、Sox2、OCT4和SSEA1染色阳性的细胞群落(图4a)。在PCL-GO-HPGS上生长的群落比在纯PCL上生长的群落大，说明GO-HPGS可以促进IPS细胞的增殖。从图4b、4c的相对荧光强度可以看出，PCL-GO-HPGS支架可以很好地保持干细胞干性，效果优于纯PCL。群落干性标记荧光强度与上述YAP核易位结果一致。图4d、4f为PCL和PCL-GO-HPGS上生长的Nanog和Sox2从中心到边缘的强度分布图，图4e和4g分别为PCL和PCL-GO-HPGS上OCT4和SSEA1。PCL的群落半径约为80μm,PCL约为120μm,。同时，集落边缘处的荧光强度比中心处的荧光强度更强，说明在生长培养基中，向外的细胞可以从培养基中吸收更多的抑制剂，更好地保持干性。GO-HPGS纳米片涂层纤维支架上的群落边缘信号强于纯PCL，说明GO-HPGS可以积累包括分化抑制剂在内的蛋白质，提升细胞功能。
如图5a所示，制备胚状体并将其接种在纳米纤维支架上，然后向神经元突分化。巢蛋白(Nestin)是神经细胞中经常表达的一种中间丝蛋白，常用于轴突径向生长发育早期的细胞分裂。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是中枢神经系统中同一家族的中间丝蛋白，主要在星形胶质细胞和室管膜细胞中表达。为了研究不同支架上IPS细胞的分化过程，将GFAP和Nestin在神经分化培养基中培养5天后染色观察(图5b)。所有支架上均为种子胚体，未见明显的神经突和轴突。图5c中Nestin的相对荧光强度分析表明纯PCL和GO-HPGS涂层支架内Nestin的平均表达无显著差异。然而，对比图5d中GFAP的表达发现，IPS细胞向星形胶质细胞的分化主要发生在PCL和PCL-GO上，与PCL上的IPS细胞相比，PCL-GO上IPS细胞的GFAP表达降低了11％，PCL-HPGS上IPS细胞的GFAP表达降低了80％，而本发明PCL-GO-HPGS上IPS细胞的GFAP表达降低了90％，显著高于PCL-GO和PCL-HPGS。上述结果表明，与PCL-GO和PCL-HPGS支架相比，本发明制得的PCL-GO-HPGS支架抑制IPS细胞向星形胶质细胞的分化能力具有显著提高的效果。星形胶质细胞的增多可使谷氨酸转运体电流减少，可能对神经元和轴突的发育不利。图5e-5h为分别在PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS上生长的胚体从中心到边缘的GFAP和Nestin的强度分布曲线，胚体半径在40-110μm。同时，集落边缘的红色Nestin的荧光强度比中心的更强，这意味着向外的细胞可以从培养基中吸收更多的分化因子和激素。结果显示，在PCL-GO-HPGS上GFAP信号的分布和水平最低，说明本发明的PCL-GO-HPGS支架能够显著抑制IPS细胞GFAP的表达，进而抑制其向星形胶质细胞分化，与图5d的结论一致。
本发明进一步评估了胚状体接种于GO-HPGS纳米片涂层纤维支架后的神经分化活动，研究了早期神经标记物IIIβ-tubulin(Tuj1)。Tuj1是神经元微管组分中唯一表达的，代表再生轴突和神经丝。图6a展示了早期神经元标记蛋白Tuj1的免疫荧光照片，以及培养7天后相应的二维分形维数(Df)和荧光强度图，过程如图5a所示。免疫染色图显示PCL-GO-HPGS较其他样品神经元分化率高，轴突延长。这些神经元突在PCL、PCL-HPGS、PCL-GO和PCL-GO-HPGS纤维结构上分布良好，易于识别。对图6b中神经元突分布的统计分析表明，PCL-GO-HPGS表面可以促进神经元突伸长。通过对Tuj1染色进行MATLAB分析，得到二维分形维数(Df)和荧光强度图，证明GO-HPGS纳米片涂层支架上的神经元突附着和伸长效果较好，相比纯PCL支架具有更致密更长的神经元突。
为了进一步研究棘的数量和分布，本发明利用image J(图6c)分析从EB中心到边缘的神经突交点的变化。PCL-GO-HPGS上的交点数量是纯PCL的5倍左右。与此同时，相交数从半径100-400μm开始逐渐增加，然后下降到边缘。图6d中每个区域的神经元突交点数也表明，随着EB中心向边缘的变化，PCL-GO-HPGS的根尖节点和棘数量最多。图6e中的Df值表明了对神经突空间排列的量化。GO-HPGS纳米片涂层纤维支架上的神经元具有较高的空间排列复杂性，如分支类型和分支数量。如图6f所示，Tuj1在PCL上的相对表达水平仅为PCL-GO-HPGS的一半。PCL-GO-HPGS上每个EB的平均神经元突起数(232±52)远大于PCL的(12±10)(图6g)。此外，神经突长度从PCL(101±34μm)变化到PCL-GO-HPGS(345±109μm)(图6h)，验证了GO-HPGS纳米片涂层纤维支架在体外可以使神经突显著伸长。
本发明进一步建立了IPS细胞从EB向神经细胞分化的时间轴过程，将IPS细胞置于悬浮液中培养，形成富含神经祖细胞的EB，随后在支架上进行EB贴壁培养，第5-7天产生Tuj1阳性的未成熟神经元，1周后分化成对NeuN和MAP2阳性的成熟神经元。NeuN主要表达于神经核中，MAP2是神经生成-微管组装过程中的关键微管蛋白。图7a显示纯PCL分化14天后少量轴突/微管萌发。然而，可以观察到生长良好的神经微管和微丝在GO-HPGS纳米薄片涂层支架上扩散，这表明GO-HPGS纳米薄片可以促进成熟神经突的形成。图7c的相对荧光强度表明，在PCL-GO-HPGS支架上，NeuN和MAP2的平均表达增加。图7b的荧光共定位分析显示了MAP2(红色)和NeuN(绿色)信号在荧光显微镜图像中的分布，可以用来判断两个探针是否共分布，可以看出，PCL-GO-HPGS上红色和绿色信号的分布最为离散；与图7d中的曼德斯共域系数(Manders’colocalization coefficients，MCC)和图7e中的皮尔逊相关系数(Pearson’s correlation coefficient，PCC)结论一致。上述系数的值越小，表示共定位的相关性越小。由于NeuN蛋白主要表达在细胞核中，MAP2与NeuN在PCL-GO-HPGS上的共定位越少，说明MAP2在轴突微管中的表达越多，表明PCL-GO-HPGS上比纯PCL上有更多成熟的神经元突。
实验结果表明，本发明制得的PCL-GO-HPGS作为支架与IPS细胞共培养，能够促进IPS细胞形成的胚状体向神经元细胞的定向分化，同时抑制IPS细胞向星形胶质细胞分化。与PCL-GO和PCL-HPGS支架相比，本发明制得的PCL-GO-HPGS支架在抑制IPS细胞向星形胶质细胞分化上取得了显著提高的效果。
综上，本发明制备了一种具有生物相容性和多价聚阴离子的超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯2D纳米材料(GO-HPGS)，并以该2D纳米材料为涂层对PCL纤维进行改性制得了纳米纤维复合材料(PCL-GO-HPGS)，该纳米纤维复合材料能够介导IPS细胞的粘附、增殖和分化。实验证明，本发明制得的PCL-GO-HPGS作为支架可以提高IPS细胞的粘附和增殖性能，并能高效的维持IPS细胞的干性，避免过早出现非定向分化。在神经分化阶段，该PCL-GO-HPGS支架能够促进IPS细胞形成的胚状体向神经元细胞的定向分化，并同时抑制IPS细胞向星形胶质细胞分化。本发明提供的PCL-GO-HPGS纳米纤维复合材料可以作为一种新的具有超支化分子多价键及可促进生物粘附性能的纳米纤维支架，在干细胞分化及神经组织再生等疾病治疗中具有广阔的应用前景。
Claims (21)
1.一种纳米纤维复合材料，其特征在于：它是用超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯对聚己内酯纤维进行表面涂覆后得到的材料；
所述超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯是以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物，其中，叠氮化超支化聚甘油为超支化聚甘油上的羟基被叠氮基取代后所得的产物。
2.根据权利要求1所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述表面改性时，叠氮化超支化聚甘油和氧化石墨烯的质量比为(0.01～100)：1；表面改性时的条件为：温度100～150℃，时间0.1～48h；
和/或，所述叠氮化超支化聚甘油为超支化聚甘油上5％～20％的羟基被叠氮基取代后所得的产物；
和/或，所述超支化聚甘油的分子量为5000～10000g.mol-1，PDI<2，支化度为40％～60％。
3.根据权利要求2所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述表面改性时，叠氮化超支化聚甘油和氧化石墨烯的质量比为(1～50):1；表面改性时的条件为：温度120℃，时间6h；
和/或，所述叠氮化超支化聚甘油为超支化聚甘油上11％的羟基被叠氮基取代后所得的产物；
和/或，所述超支化聚甘油的分子量为7200g.mol-1，PDI<1.2，支化度为50％。
4.根据权利要求3所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述表面改性时，叠氮化超支化聚甘油和氧化石墨烯的质量比为10:1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯是将以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物再进行磺化后所得，所述磺化的步骤为：将以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物加入有机溶剂中，分散均匀，得分散液，然后加入SO3·吡啶配合物，反应，即得。
6.根据权利要求5所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述有机溶剂为DMF，所述分散液的浓度为0.5～1.5mg/mL；所述以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物与SO3·吡啶配合物的质量比为1：(5～15)；所述反应的温度为50～70℃，反应的时间为36～72h。
7.根据权利要求6所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述分散液的浓度为1mg/mL；所述以叠氮化超支化聚甘油为改性剂对氧化石墨烯进行表面改性所得的产物与SO3·吡啶配合物的质量比为1：10.75；所述反应的温度为60℃，反应的时间为48h。
8.根据权利要求1～4任一项所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述聚己内酯纤维是以聚己内酯为原料，通过静电纺丝法制得的纤维。
9.根据权利要求8所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述聚己内酯的分子量为60～100kDa。
10.根据权利要求9所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述聚己内酯的分子量为80kDa。
11.根据权利要求8所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述静电纺丝法的制备工艺为：将聚己内酯溶于有机溶剂，得到聚合物溶液，然后通过静电纺丝，得到聚己内酯纤维。
12.根据权利要求11所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述有机溶剂为1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，所述聚合物溶液的浓度为0.05～0.30g/mL。
13.根据权利要求12所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述聚合物溶液的浓度为0.10g/mL。
14.根据权利要求1～4任一项所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述纳米纤维复合材料的涂层厚度为5～15nm。
15.根据权利要求14所述的纳米纤维复合材料，其特征在于：所述纳米纤维复合材料的涂层厚度为10nm。
16.权利要求1～15任一项所述纳米纤维复合材料的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)用O2等离子体处理聚己内酯纤维；
(2)将超支化聚甘油表面改性氧化石墨烯分散到溶剂中，得到分散液；所述溶剂为水或醇类溶剂；
(3)将步骤(1)处理后的聚己内酯纤维浸入步骤(2)所得分散液中，然后取出，干燥，即得。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述处理时间为0.5～3min；
和/或，步骤(2)中，所述溶剂为水，所述分散液的浓度为0.5～3mg/mL；
和/或，步骤(3)中，所述浸入时间为0.5～5min。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述处理时间为1min；
和/或，步骤(2)中，所述分散液的浓度为1mg/mL；
和/或，步骤(3)中，所述浸入时间为1min。
19.一种组织工程修复材料，其特征在于：它是以权利要求1～15任一项所述纳米纤维复合材料作为组织工程支架，负载诱导多能干细胞或神经细胞后所得。
20.权利要求1～15任一项所述纳米纤维复合材料在制备组织工程支架中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：所述组织工程支架能够促进诱导多能干细胞的粘附和增殖；
和/或所述组织工程支架能够促进诱导多能干细胞干性的维持；
和/或，所述组织工程支架能够促进诱导多能干细胞形成的胚状体向神经元细胞定向分化，促进神经元细胞的成熟，促进神经元细胞表达微管相关蛋白2和神经元特异性胞核蛋白；
和/或，所述组织工程支架能够抑制诱导多能干细胞中胶质纤维酸性蛋白的表达，抑制诱导多能干细胞向星形胶质细胞分化。
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