CN113456894B - 一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法：配制明胶溶液静电纺丝制备纤维膜，然后置于戊二醛饱和蒸汽交联、干燥获得明胶纤维膜；明胶纤维膜浸于吡咯单体溶液中加入过硫酸铵溶液混合后反应，然后将明胶纤维膜清洗、干燥获得聚吡咯/明胶纤维支架。本发明提供的聚吡咯/明胶纤维膜支架能够以无线刺激方式诱导骨髓间充质干细胞MSCs神经分化，避免了向人体内部植入时存在导线而引起的排斥或者感染问题，在临床和神经组织修复工程中具有重要意义。

Description

一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法及其产品
技术领域
本发明属于医用材料制备技术领域，具体涉及一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法及其产品。
背景技术
神经系统退行性疾病，也叫神经系统变性疾病。疾病种类庞杂且常见，如运动神经元病、帕金森病、阿尔茨海默氏病，额颞叶痴呆、路易体痴呆等，这些疾病对人类的生命健康安全产生严重威胁。目前临床上针对神经损伤的治疗方法较多，主要包括细胞移植、神经缝合、自体或异体神经移植、神经营养因子注射和基因疗法等，但是治疗效果不一。随着生物材料的发展和组织工程技术的日益成熟，神经组织工程在治疗神经退行性疾病方面显示出了巨大的潜力。
神经组织工程由干细胞，支架和诱导、促进细胞生长的因子三个部分组成，其目的是模拟细胞微环境来获取足够的神经元细胞用于自体移植以治疗神经退行性疾病。但是由于自体来源有限、异体移植存在伦理道德等问题，神经元细胞获取成为神经组织工程的关键性问题。骨髓间充质干细胞（MSCs）是具有分化为多种细胞类型潜能的中胚层多能干细胞。目前的研究发现，MSCs具有分化成脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、肝细胞和神经细胞的潜能。因此，间充质干细胞由于其来源广泛、种类众多、易于存活及分离的优点，成为了神经组织工程最重要的干细胞来源之一。
临床上电刺激属于非药物治疗方法，对于疾病的预防、延缓和治疗都具有安全、经济和方便的特点，具有重要的社会价值和经济价值，已经广泛的应用于镇痛、促进伤口愈合和神经肌肉再训练中。在神经组织工程中，电刺激研究也越来越得到国际学术界的重视，电刺激手段为组织工程中的种子细胞的刺激诱导提供了一种可行性的手段，相较于化学因子诱导方法，电刺激诱导具有不可比拟的优势，因为电刺激具有损伤小、实施方法容易、不涉及免疫反应、参数可控、可联合其他方法进行使用等优点。比如，中国专利文献CN111939473A公开了一种无线电刺激诱发神经康复再生的装置，能诱发断损后的神经再生，打通神经信号传导的通路，可以恢复障碍肢体的正常功能；无源植入子微小化设计，减少植入后的损伤；在刺激训练后无需二次手术，降低病人痛苦。另外，中国专利文献CN111408046A公开了一种促进体内神经修复的电刺激系统，包括纳米发电机、导线和电极，该系统电刺激源结构简单、材料环保、取材广泛、易于柔性化和微型化，可由身体的运动和力自驱动发电的优势。
水凝胶是神经组织工程最有前途的支架材料之一。水凝胶具有较高的含水量，在杨氏模量上与天然软组织相似，能够提供一个动态的细胞外基质微环境。然而，大部分水凝胶支架由不可降解的合成聚合物构成，作为异物留在人体内会可能会引发体内炎症、排斥反应等不良反应。因此，可降解水凝胶的开发利用具有巨大的潜力。同时，考虑到电刺激在神经组织工程中的前景，如何开发一种能够产生电刺激同时还能够生物降解的生物材料成为神经组织工程中一个重大的挑战。
发明内容
针对目前导电水凝胶生物相容性和材料降解性差的问题，本发明提供一种聚吡咯/明胶纤维支架，在超声波作用下产生的电刺激和支架自身的三维结构下能够对间充质干细胞的神经分化产生促进作用。
本发明的另一目的在于，提供一种上述纤维支架的制备方法，通过静电纺丝和化学交联的方式制备，方法简单，反应条件易于实现。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制明胶溶液静电纺丝制备纤维膜，然后置于戊二醛饱和蒸汽交联、干燥获得明胶纤维膜；
（2）明胶纤维膜浸于吡咯单体溶液中加入过硫酸铵溶液混合后反应，然后清洗、干燥获得聚吡咯/明胶纤维支架。
步骤（1）中，所述明胶溶液的浓度为25-35%w/v。
所述明胶溶液的溶剂为甲酸溶液、乙酸溶液或N,N-二甲基甲酰胺。
所述静电纺丝参数如下：针头内径为21G-26G，电压为15-25 kV，接收器和针头距离为12-20cm。
步骤（1）中，交联时间为1-2h，交联温度为20-30℃。
步骤（2）中，所述吡咯单体溶液的溶剂为异丙醇。
步骤（2）中，所述吡咯单体和过硫酸铵的摩尔比为2:1。
步骤（2）中，所述反应温度为0-10℃。
一种上述制备方法获得的聚吡咯/明胶纤维支架。
一种上述聚吡咯/明胶纤维支架作为医用材料的用途。所述医用材料用于诱导间充质干细胞向神经细胞分化。
一种利用上述聚吡咯/明胶纤维支架诱导间充质干细胞分化的方法，包括以下步骤：将间充质干细胞悬液接种于聚吡咯/明胶纤维支架上，间歇超声处理下培养。
所述间充质干细胞悬液的密度为104-105cell/mL。
所述超声处理为：超声功率400W，2次/天，间隔6h，每次8min。
本发明具有以下优点：
本发明利用静电纺丝技术制备出具有高压电效应的明胶纤维膜，然后通过浸涂-干燥法在其上负载了一层聚吡咯导电水凝胶制得了PPy/Gelatin纤维支架。与电沉积等其他方法相比，制备方法简单，无需进行电解池和电极的设计，无需外接电源，不易造成环境污染；所用材料皆具有生物相容性和良好的生物降解性，具有临床应用前景。本发明制备的纤维支架在超声波作用下，明胶形变引发的压电效应可以产生电刺激，促进间充质干细胞的分化，其外层的导电材料聚吡咯水凝胶可以很好的将电刺激导出成电流，促进后续的分化。本发明提供的聚吡咯/明胶纤维膜支架能够以无线刺激方式诱导骨髓间充质干细胞MSCs神经分化，避免了向人体内部植入时存在导线而引起的排斥或者感染问题，在临床和神经组织修复工程中具有重要意义。
附图说明
图1是明胶纤维负载聚吡咯前后的SEM图；
图2是PPy/Gelatin纤维膜、Gelatin纤维膜和PPy在PBS中的降解率图；
图3是对接种到TCP、PPy/Gelatin纤维膜支架样品上细胞进行细胞骨架和细胞核的染色图；
图4是对接种到PPy/Gelatin纤维膜支架样品上细胞进行细胞活死染色图；
图5是不同培养条件下第7d、14d、21d时几种神经细胞标志物mRNA相对含量。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 聚吡咯/明胶纤维支架的制备
（1）将明胶粉末溶于80%（w/v）乙酸溶液中，在42℃条件下磁力搅拌1 h至完全溶解，制备浓度为30%（w/v）的明胶溶液；使用注射器吸取5 mL左右的明胶溶液，插入规格为21G的针头，置于纺丝机中，设置纺丝参数：距离12 cm，电压18 kV。纺丝结束后，获得的明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中，在25℃下交联1-2 h，再将纤维膜置于60℃烘箱中干燥30min，获得交联明胶纤维膜；
（2）将吡咯单体溶于异丙醇中，使异丙醇和吡咯摩尔比为10:1，使其成为A液，将明胶纺丝膜浸入配置好的A液中，使其刚好浸没，然后向其中快速倒入配制好的B液（0.137 g/mL (NH4)2S2O8溶液），其中，A液和B液的体积比为1:2。0-4℃冰浴条件下聚合10min后，从所得水凝胶中取出明胶纤维膜，并在超声波浴下在去离子水和异丙醇中清洗；然后冷冻干燥获得PPy/Gelatin纤维支架；
步骤（1）获得的交联明胶纤维膜和PPy/Gelatin纤维膜支架的SEM图如图1所示，由SEM图可以看出，PPy/Gelatin中纤维膜表面均匀包覆水凝胶，直径约为2 μm。
对比例1 交联明胶纤维膜的制备
按照实施例1中的条件制备交联明胶纤维膜，不同在于明胶溶液的浓度为20%（w/v）。通过SEM图可知，得到的明胶纤维发生一定程度的黏连，且纤维直径较不均匀。
按照实施例1中的条件制备交联明胶纤维膜，不同在于纺丝电压为30 kV。通过SEM图可知，得到的明胶纤维直径过于细长。
这说明在非本发明范围内的明胶浓度和纺丝参数会影响明胶纤维的直径和状态，从而影响PPy/Gelatin纤维支架的压电性。
对比例2 压电纤维支架的制备
（1）明胶纤维膜的制备与实施例1（1）相同；
（2）将吡咯单体溶于异丙醇中，使异丙醇和吡咯摩尔比为10:1，使其成为A液，将明胶纺丝膜浸入配置好的A液中，使其刚好浸没，然后向其中快速倒入配制好的B液（0.137 g/mL (NH4)2S2O8溶液），其中，A液和B液的体积比为1:2。20℃下聚合10 min后，共混溶液仍是液体，并没有形成固体状水凝胶。
这说明，反应温度将影响吡咯单体的聚合，需在本发明设定的温度下才能获得固体状水凝胶。
实施例4 不同制备方法的聚吡咯/明胶纤维支架对间充质干细胞分化影响
采用实施例1中制备的聚吡咯/明胶纤维支架，分别接种培养到第二代的小鼠骨髓间充质干细胞单细胞悬液（104-105 cell/mL），然后将细胞-支架复合材料置于24孔板中，37℃，5% CO2湿化培养箱中孵育48 h；然后进行超声处理：功率400 W，一天2次，每次8 min，两次间隔6h。接种细胞21天后，对细胞-支架复合材料上的细胞裂解处理提取RNA，对几种特定的神经标志物进行PCR扩增。
实施例5 聚吡咯/明胶纤维支架的降解特性
将实施例1中制备的聚吡咯/明胶纤维支架膜（PPy/Gelatin）以及实施例1中制备的交联明胶纤维膜（Gelatin）和聚吡咯（PPy）精确称重后放在培养皿中，加入PBS缓冲液（pH= 7.2）并放置于37℃摇床培养箱中震荡，转速为100 r/min。分别振荡7天、14天和21天后后冷冻干燥并称重，计算降解率。不同样品降解率如图2所示，说明本发明制备的纤维支架降解率符合间充质干细胞的分化要求，适于临床应用。
应用例1 聚吡咯/明胶纤维支架的生物相容性
（1）在紫外线照射下，依次采用75%酒精、PBS溶液浸没实施例1制备的聚吡咯/明胶纤维支架进行灭菌处理，再浸泡于培养基中置于恒温37℃的培养箱备用；
（2）将培养到第二代的小鼠骨髓间充质干细胞单细胞悬液（104-105 cell/mL），按照细胞悬液与培养基的比例为1:40接种到聚吡咯/明胶纤维支架上，然后将细胞-支架复合材料置于24孔板中，37℃，5% CO2湿化培养箱中孵育48 h；然后进行超声处理：功率400 W，一天两次，每次8min，两次间隔6 h；
（3）培养至第6天，进行骨架和细胞核染色，如图3所示；对细胞进行有无超声波处理10天后，对接种到不同样品上的细胞进行活死荧光染色，如图4所示。从图中可以看出，在超声波作用下，PPy/Gelatin纤维膜支架上其细胞增殖效果良好，证明其有良好的生物相容性。
应用例2 聚吡咯/明胶纤维支架在间充质干细胞分化中的应用
（1）在紫外线照射下，依次采用75%酒精、PBS溶液浸没实施例1制备的聚吡咯/明胶纤维支架和交联明胶纤维膜，进行灭菌处理，再浸泡于培养基中置于恒温37℃的培养箱备用；
（2）将培养到第二代的小鼠间充质干细胞以DMEM培养基制成单细胞悬液（1.0×104-105cell/mL），按照细胞悬液与培养基的比例为1:40接种到聚吡咯/明胶纤维支架、明胶纤维膜和细胞爬片（TCP）上，然后将细胞-支架复合材料置于24孔板中，37℃，5% CO2湿化培养箱中孵育48h；然后进行超声处理：功率400W，一天两次，每次8min，两次间隔6h；同时设置无超声的对照。
接种细胞7天、14天、21天后，对接种到不同样品上的细胞裂解处理提RNA，对几种特定的神经标志物进行PCR扩增，结果如图5所示：在超声波作用下，聚吡咯/明胶纤维支架能够有效促进间充质干细胞向神经元分化，可显著促进NSCs向神经元（β微管蛋白III）、微管蛋白2和星形胶质细胞（GFAP）的分化，上调β微管蛋白Ⅲ、微管蛋白2和GFAP的表达，其分化效果远高于无超声波作用的样品以及超声波作用下的交联明胶纤维膜和TCP。

Claims (4)

1.一种利用聚吡咯/明胶纤维支架诱导间充质干细胞神经分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：将间充质干细胞悬液接种于聚吡咯/明胶纤维支架上，间歇超声处理下培养；
所述聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制明胶溶液静电纺丝制备纤维膜，然后置于戊二醛饱和蒸汽交联、干燥获得明胶纤维膜；
（2）明胶纤维膜浸于吡咯单体溶液中加入过硫酸铵溶液混合后反应，然后清洗、干燥获得聚吡咯/明胶纤维支架；
步骤（1）中，所述明胶溶液的浓度为25-35%w/v；
所述静电纺丝参数如下：针头内径为21G-26G，电压为15-25kV，接收器和针头距离为12-20cm；
步骤（2）中，反应温度为0-10℃；
所述间充质干细胞悬液的密度为104-105cell/mL；所述超声处理为：超声功率400W，2次/天，间隔6h，每次8min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述明胶溶液的溶剂为甲酸溶液、乙酸溶液或N,N-二甲基甲酰胺。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，交联时间为1-2h，交联温度为20-30℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述吡咯单体溶液的溶剂为异丙醇；所述吡咯单体和过硫酸铵的摩尔比为2:1。
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