CN107773785A - 一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法 - Google Patents

一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于骨组织工程领域，具体涉及一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，通过静电纺丝法制备PLLA/明胶纳米纤维，再用交联剂使纳米纤维网交联，然后在纤维膜上种植扩增骨髓间充质干细胞制备细胞层从而获得细胞层/纤维膜复合膜片，并对多层CSM膜片进行复合得到三维结构。本发明解决了目前纳米纤维网造成大面积的骨缺损以及细胞难以渗入密集纤维网，具有良好的亲水性和良好的降解率。

Description

一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法
技术领域
本发明属于骨组织工程领域，具体涉及一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法。
背景技术
目前临床上用于修复或替换缺损骨缺损的治疗方法有三种：自体骨移植、异体骨移植和骨组织工程。自体骨移植会带来新的创伤和无法满足大范围骨缺损需求。异体骨移植因免疫排斥以及供体严重不足受到限值，骨组织工程的方法可以避免以上两种问题，不仅可以在体外大量复制，合适的材料选择可以减轻甚至抑制排异和炎症反应。目前骨组织研究主要集中于生物支架材料、种子细胞及因子的研究。
正确的支架设计对骨组织工程的成功至关重要，理想的骨修复材料支架应具有互通的多孔结构，保证细胞的渗透和成长：支架形态应促进(充质干细胞)MSC的诱导分化；良好的生物相容性和可降解性，降解产物无毒。为了使纳米纤维结构模拟天然骨细胞外基质(ECM)，静电纺丝技术被广泛应用于生物支架材料制备。然而纳米纤维网也暴露了一些缺点，包括制造大面积的骨缺损和细胞难以渗入密集的纳米纤维网中。主要原因是因为纤维的密度和电纺纤维膜的清水性和低降解率的原因。
近年来，构建三维组织最有吸引力的方法是多层细胞片，通过在热敏原移值表面上培养细胞来获取细胞片，并制层管状或层状结构。这种细胞片的优点启发了我们在纳米纤维网上构建细胞层，纳米纤维膜的支撑可以改善细胞层的可操作性，通过纳米纤维网格的纤维布置、组成和直径设计促进BMSC的分化。因此，本发明公开了一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，该方法通过静电纺丝法制备PLLA/明胶纳米纤维，再用交联剂使纳米纤维网交联，然后在纤维膜上种植扩增骨髓间充质干细胞制备细胞层从而获得细胞层/纤维膜复合膜片，并对多层CSM膜片进行复合得到三维结构。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：其制备方法按照如下步骤：
s1，将高分子聚合物聚(L-丙交酯)(PLLA)和明胶溶于有机溶液中，配制成质量百分浓度为20-50％(W/V)的高分子混合溶液，室温连续搅拌24h制得共混溶液；
s2，将共混溶液分别装入10个10ml注射器中，加上5号不锈钢针头，溶液推进速度0.5-5mL/h，电压10-30KV，接收距离10-25cm，采用铜板或者铜网格作为接收器，分别得到随机纳米纤维膜和巢状纳米纤维膜，室温真空干燥24-48小时，得到纤维膜材料；
s3，将纤维膜材料浸泡于含有交联剂的溶液中，2-24小时后，取出材料，室温真空干燥24-48小时，并在4℃干燥箱中保存备用，得到交联纤维膜材料；
s4，将SD大鼠骨髓间质细胞在DMEM培养基中，在温度37℃、湿度80-100％，5％CO2的培养箱中培养；
s5，将纤维膜材料切成块状，用中空塑料盖固定，然后置于24孔细胞培养板中；
s6，将0.25％的胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸将纤维膜进行消化传代，然后接种细胞，接种量为1×105个/每片；
s7，将成骨诱导培养基加入每孔中，每2天换一次；保持细胞在不同纳米纤维网中附着增值3-7天后，从培养板中取出；
s8，将3-5个细胞层/纤维膜复合膜片堆叠在一起构建三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，用PBS缓冲溶液冲洗3-5次，然后用2.5-5％戊二醛溶液固定；
s9，采用去离子水冲洗3次后，采用梯度的乙醇水溶液脱水清洗三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，风干过夜，得到产品。
所述s1中的聚(L-丙交酯)的重均分子量为7-20万。
所述s1中的明胶采用医药级明胶，重均分子粒为5-20万。
所述s1中的有机溶剂采用六氟异丙醇、三氟乙醇、丙酮中的一种或者多种组合。
所述s2中的不锈钢针头的直径为1-5mm。
所述s2中的接收器采用铜板，制得随机纳米纤维膜，所述接收器采用铜网格，制得巢状纳米纤维膜，所述铜网格的目数为60目，网格尺寸400μm×400μm。
所述s3中的含有交联剂的溶液为1-3wt％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2-24wt％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS＝2)与75-95wt％酒精配制而成。
所述s7的成骨诱导培养基由0.05mmol/L的维生素C、10mmol/L的β-甘油磷酸甘油酯和1×10-8mol/L地塞米松制备而成。
所述s9中的梯度的乙醇水溶液的乙醇浓度为30-100％。
作为改进，所述梯度的乙醇水溶液的清洗程序为：
顺序 乙醇浓度 次数
1 30％ 3
2 40％ 3
3 50％ 3
4 60％ 3
5 70％ 3
6 80％ 3
7 90％ 3
8 100％ 3
本发明通过静电纺丝法制备PLLA/明胶纳米纤维，再用交联剂使纳米纤维网交联，然后在纤维膜上种植扩增骨髓间充质干细胞制备细胞层从而获得细胞层/纤维膜复合膜片，并对多层CSM膜片进行复合得到三维结构。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
1.本发明解决了目前纳米纤维网造成大面积的骨缺损以及细胞难以渗入密集纤维网，具有良好的亲水性和良好的降解率。
2.本发明改善细胞层的可操作性，利用纤维的布置和组成促进了扩增骨髓间充质干细胞的分化。
3.本发明具有良好的多孔结构，保证了细胞的渗透与成长，具有良好的生物相容性和可降解性，且降解产物无毒无害。
具体实施方式
结合实施例详细说明本发明，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1
一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：其制备方法按照如下步骤：
s1，将高分子聚合物聚(L-丙交酯)(PLLA)和明胶溶于有机溶液中，配制成质量百分浓度为20％(W/V)的高分子混合溶液，室温连续搅拌24h制得共混溶液；
s2，将共混溶液分别装入10个10ml注射器中，加上5号不锈钢针头，溶液推进速度0.5mL/h，电压10KV，接收距离10cm，采用铜板作为接收器，得到随机纳米纤维膜，室温真空干燥24小时，得到纤维膜材料；
s3，将纤维膜材料浸泡于含有交联剂的溶液中，2小时后，取出材料，室温真空干燥24小时，并在4℃干燥箱中保存备用，得到交联纤维膜材料；
s4，将SD大鼠骨髓间质细胞在DMEM培养基中，在温度37℃、湿度80％，5％CO2的培养箱中培养；
s5，将纤维膜材料切成块状，用中空塑料盖固定，然后置于24孔细胞培养板中；
s6，将0.25％的胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸将纤维膜进行消化传代，然后接种细胞，接种量为1×105个/每片；
s7，将成骨诱导培养基加入每孔中，每2天换一次；保持细胞在不同纳米纤维网中附着增值3天后，从培养板中取出；
s8，将3-5个细胞层/纤维膜复合膜片堆叠在一起构建三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，用PBS缓冲溶液冲洗3次，然后用2.5％戊二醛溶液固定；
s9，采用去离子水冲洗3次后，采用梯度的乙醇水溶液脱水清洗三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，风干过夜，得到产品。
所述s1中的聚(L-丙交酯)的重均分子量为7万。
所述s1中的明胶采用医药级明胶，重均分子粒为5万。
所述s1中的有机溶剂采用六氟异丙醇。
所述s2中的不锈钢针头的直径为1mm。
所述s2中的接收器采用铜板，制得随机纳米纤维。
所述s3中的含有交联剂的溶液为1wt％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4wt％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS＝2)与95wt％酒精配制而成。
所述s7的成骨诱导培养基由0.05mmol/L的维生素C、10mmol/L的β-甘油磷酸甘油酯和1×10-8mol/L地塞米松制备而成。
所述s9中的梯度的乙醇水溶液的乙醇浓度为30-100％。
所述梯度的乙醇水溶液的清洗程序为：
顺序 乙醇浓度 次数
1 30％ 3
2 40％ 3
3 50％ 3
4 60％ 3
5 70％ 3
6 80％ 3
7 90％ 3
8 100％ 3
实施例2
一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：其制备方法按照如下步骤：
s1，将高分子聚合物聚(L-丙交酯)(PLLA)和明胶溶于有机溶液中，配制成质量百分浓度为50％(W/V)的高分子混合溶液，室温连续搅拌24h制得共混溶液；
s2，将共混溶液分别装入10个10ml注射器中，加上5号不锈钢针头，溶液推进速度5mL/h，电压30KV，接收距离25cm，采用铜网格作为接收器，得到巢状纳米纤维膜，室温真空干燥48小时，得到纤维膜材料；
s3，将纤维膜材料浸泡于含有交联剂的溶液中，24小时后，取出材料，室温真空干燥48小时，并在4℃干燥箱中保存备用，得到交联纤维膜材料；
s4，将SD大鼠骨髓间质细胞在DMEM培养基中，在温度37℃、湿度100％，5％CO2的培养箱中培养；
s5，将纤维膜材料切成块状，用中空塑料盖固定，然后置于24孔细胞培养板中；
s6，将0.25％的胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸将纤维膜进行消化传代，然后接种细胞，接种量为1×105个/每片；
s7，将成骨诱导培养基加入每孔中，每2天换一次；保持细胞在不同纳米纤维网中附着增值7天后，从培养板中取出；
s8，将5个细胞层/纤维膜复合膜片堆叠在一起构建三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，用PBS缓冲溶液冲洗5次，然后用5％戊二醛溶液固定；
s9，采用去离子水冲洗3次后，采用梯度的乙醇水溶液脱水清洗三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，风干过夜，得到产品。
所述s1中的聚(L-丙交酯)的重均分子量为20万。
所述s1中的明胶采用医药级明胶，重均分子粒为20万。
所述s1中的有机溶剂采用三氟乙醇。
所述s2中的不锈钢针头的直径为5mm。
所述s2中的接收器采用铜网格，制得巢状纳米纤维膜，所述铜网格的目数为60目，网格尺寸400μm×400μm。
所述s3中的含有交联剂的溶液为3wt％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和74wt％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS＝2)与75wt％酒精配制而成。
所述s7的成骨诱导培养基由0.05mmol/L的维生素C、10mmol/L的β-甘油磷酸甘油酯和1×10-8mol/L地塞米松制备而成。
所述s9中的梯度的乙醇水溶液的乙醇浓度为30-100％。
所述梯度的乙醇水溶液的清洗程序为：
实施例3
一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：其制备方法按照如下步骤：
s1，将高分子聚合物聚(L-丙交酯)(PLLA)和明胶溶于有机溶液中，配制成质量百分浓度为30％(W/V)的高分子混合溶液，室温连续搅拌24h制得共混溶液；
s2，将共混溶液分别装入10个10ml注射器中，加上5号不锈钢针头，溶液推进速度2.5mL/h，电压20KV，接收距离15cm，采用铜网格作为接收器，得到巢状纳米纤维膜，室温真空干燥36小时，得到纤维膜材料；
s3，将纤维膜材料浸泡于含有交联剂的溶液中，20小时后，取出材料，室温真空干燥30小时，并在4℃干燥箱中保存备用，得到交联纤维膜材料；
s4，将SD大鼠骨髓间质细胞在DMEM培养基中，在温度37℃、湿度80-100％，5％CO2的培养箱中培养；
s5，将纤维膜材料切成块状，用中空塑料盖固定，然后置于24孔细胞培养板中；
s6，将0.25％的胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸将纤维膜进行消化传代，然后接种细胞，接种量为1×105个/每片；
s7，将成骨诱导培养基加入每孔中，每2天换一次；保持细胞在不同纳米纤维网中附着增值5天后，从培养板中取出；
s8，将4个细胞层/纤维膜复合膜片堆叠在一起构建三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，用PBS缓冲溶液冲洗4次，然后用4％戊二醛溶液固定；
s9，采用去离子水冲洗3次后，采用梯度的乙醇水溶液脱水清洗三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，风干过夜，得到产品。
所述s1中的聚(L-丙交酯)的重均分子量为14万。
所述s1中的明胶采用医药级明胶，重均分子粒为15万。
所述s1中的有机溶剂采用丙酮。
所述s2中的不锈钢针头的直径为3mm。
所述s2中的接收器采用铜板，制得随机纳米纤维膜，所述接收器采用铜网格，制得巢状纳米纤维膜，所述铜网格的目数为60目，网格尺寸400μm×400μm。
所述s3中的含有交联剂的溶液为2wt％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和12wt％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS＝2)与86wt％酒精配制而成。
所述s7的成骨诱导培养基由0.05mmol/L的维生素C、10mmol/L的β-甘油磷酸甘油酯和1×10-8mol/L地塞米松制备而成。
所述s9中的梯度的乙醇水溶液的乙醇浓度为30-100％。
所述梯度的乙醇水溶液的清洗程序为：
顺序 乙醇浓度 次数
1 30％ 3
2 40％ 3
3 50％ 3
4 60％ 3
5 70％ 3
6 80％ 3
7 90％ 3
8 100％ 3
综上所述，本发明具有以下优点：
1.本发明解决了目前纳米纤维网造成大面积的骨缺损以及细胞难以渗入密集纤维网，具有良好的亲水性和良好的降解率。
2.本发明改善细胞层的可操作性，利用纤维的布置和组成促进了扩增骨髓间充质干细胞的分化。
3.本发明具有良好的多孔结构，保证了细胞的渗透与成长，具有良好的生物相容性和可降解性，且降解产物无毒无害。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：其制备方法按照如下步骤：
s1，将高分子聚合物聚(L-丙交酯)(PLLA)和明胶溶于有机溶液中，配制成质量百分浓度为20-50％(W/V)的高分子混合溶液，室温连续搅拌24h制得共混溶液；
s2，将共混溶液分别装入10个10ml注射器中，加上5号不锈钢针头，溶液推进速度0.5-5mL/h，电压10-30KV，接收距离10-25cm，采用铜板或者铜网格作为接收器，分别得到随机纳米纤维膜和巢状纳米纤维膜，室温真空干燥24-48小时，得到纤维膜材料；
s3，将纤维膜材料浸泡于含有交联剂的溶液中，2-24小时后，取出材料，室温真空干燥24-48小时，并在4℃干燥箱中保存备用，得到交联纤维膜材料；
s4，将SD大鼠骨髓间质细胞在DMEM培养基中，在温度37℃、湿度80-100％，5％CO2的培养箱中培养；
s5，将纤维膜材料切成块状，用中空塑料盖固定，然后置于24孔细胞培养板中；
s6，将0.25％的胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸将纤维膜进行消化传代，然后接种细胞，接种量为1×105个/每片；
s7，将成骨诱导培养基加入每孔中，每2天换一次；保持细胞在不同纳米纤维网中附着增值3-7天后，从培养板中取出；
s8，将3-5个细胞层/纤维膜复合膜片堆叠在一起构建三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，用PBS缓冲溶液冲洗3-5次，然后用2.5-5％戊二醛溶液固定；
s9，采用去离子水冲洗3次后，采用梯度的乙醇水溶液脱水清洗三维多层细胞层/纤维膜复合膜片结构，风干过夜，得到产品。
2.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s1中的聚(L-丙交酯)的重均分子量为7-20万。
3.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s1中的明胶采用医药级明胶，重均分子粒为5-20万。
4.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s1中的有机溶剂采用六氟异丙醇、三氟乙醇、丙酮中的一种或者多种组合。
5.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s2中的不锈钢针头的直径为1-5mm。
6.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s2中的接收器采用铜板，制得随机纳米纤维膜，所述接收器采用铜网格，制得巢状纳米纤维膜，所述铜网格的目数为60目，网格尺寸400μm×400μm。
7.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s3中的含有交联剂的溶液为1-3wt％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2-24wt％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS＝2)与75-95wt％酒精配制而成。
8.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s7的成骨诱导培养基由0.05mmol/L的维生素C、10mmol/L的β-甘油磷酸甘油酯和1×10-8mol/L地塞米松制备而成。
9.根据权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述s9中的梯度的乙醇水溶液的乙醇浓度为30-100％。
10.根据权利要求9所述的一种用于修复骨缺损的细胞层/纤维膜复合膜片的制备方法，其特征在于：所述梯度的乙醇水溶液的清洗程序为：
顺序 乙醇浓度 次数 1 30％ 3 2 40％ 3 3 50％ 3 4 60％ 3 5 70％ 3 6 80％ 3 7 90％ 3 8 100％ 3
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554340A (zh) * 2018-11-27 2019-04-02 华中科技大学 一种基于静电纺丝混合纤维膜构建组织工程角膜缘的方法
CN113456894A (zh) * 2021-05-24 2021-10-01 济南大学 一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法及其产品

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101272814A (zh) * 2005-08-26 2008-09-24 梨花女子大学校产学协力团 通过电纺丝的组织再生用纤维状3-维支架及其制备方法
CN101692986A (zh) * 2009-03-10 2010-04-14 广州迈普再生医学科技有限公司 一种具有生物活性的人工硬脑膜及其制备方法
CN101829361A (zh) * 2009-03-10 2010-09-15 广州迈普再生医学科技有限公司 一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法
CN102166372A (zh) * 2011-02-14 2011-08-31 东南大学 促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101272814A (zh) * 2005-08-26 2008-09-24 梨花女子大学校产学协力团 通过电纺丝的组织再生用纤维状3-维支架及其制备方法
CN101692986A (zh) * 2009-03-10 2010-04-14 广州迈普再生医学科技有限公司 一种具有生物活性的人工硬脑膜及其制备方法
CN101829361A (zh) * 2009-03-10 2010-09-15 广州迈普再生医学科技有限公司 一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法
CN102166372A (zh) * 2011-02-14 2011-08-31 东南大学 促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHIWEI REN ET AL.: "Repairing a bone defect with a three-dimensional cellular construct composed of a multi-layered cell sheet on electrospun mesh", 《BIOFABRICATION》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554340A (zh) * 2018-11-27 2019-04-02 华中科技大学 一种基于静电纺丝混合纤维膜构建组织工程角膜缘的方法
CN113456894A (zh) * 2021-05-24 2021-10-01 济南大学 一种聚吡咯/明胶纤维支架的制备方法及其产品

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