CN101692986A - 一种具有生物活性的人工硬脑膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有生物活性的人工硬脑膜，是由纳米仿生支架及附着于其上的水溶胶构成，所述水溶胶内包覆有细胞因子和/或药物；所述纳米仿生支架至少包含相连的两层结构，面向大脑的结构层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的结构层为亲水性的纳米细胞支架层。本发明还提供了所述人工硬脑膜的制备方法，包括如下步骤：制备电纺溶液、含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；用静电纺和生物打印制备人工硬脑膜。本发明同时利用生物打印技术和静电纺丝技术制作的人工脑膜，细胞因子可以做到有效按浓度和位置要求分布，脑膜化过程是最快最适当的，同时，由于用生物打印技术可以精确定位和定量，减少了随之而来的药物不良反应。

Description

一种具有生物活性的人工硬脑膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有生物活性的人工硬脑膜及其制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

硬脑膜缺损在神经外科临床工作中常见，工业、交通、战争等原因造成的开放性颅脑损伤、肿瘤的侵蚀、先天性脑膜缺损及其它颅脑疾患原因均可引发硬脑膜缺损。硬脑膜缺损需及时修补以防脑脊液外溢，防止脑的膨出和大气压的压迫，否则将危及人体生命。硬脑膜缺损还能引发颅内感染、脑粘连、皮下积液等并发症，经常会引起如癫痛、头痛、脑功能障碍等疾病。

目前硬脑膜的代用品虽有很多，修复硬脑膜的材料可分为：自体筋膜、同种异体材料、天然及人工合成材料、异种材料4类。目前市场上现有技术产品各有其优缺点：

①目前自体筋膜重建硬脑膜仍然是临床应用的标准，但术后早期脑脊液漏及皮下积液的发生率仍然较高，易导致粘连等并发症，可能引起供区不愈或功能障碍。

②同种异体和异种材料无法完全避免免疫排斥，残留的抗原会导致不同程度的炎症反应，造成纤维变性和脑粘连。易对脑组织产生瘫痕，刺激。同种异体材料来源受限，难以形成商业化生产。同时由于异体或异种来源，无法安全避免带来病毒传播的危险。例如来源于牛的材料的人工脑膜，因欧洲疯牛病发生后，其来源大打折扣，而安全性也大受怀疑。

③合成的天然材料基本为天然胶原蛋白。但蛋白来源使其无法完全避免免疫排斥。行修补时所用胶原蛋白容易被吸收，无法起着充分隔离头皮软组织与脑组织作用而不利于之后的颅骨修补手术等问题，不利于术后处理。

④不可吸收材料/部分吸收材料的不可吸收部分对受体永远是异物，可能导致慢性炎症反应、术区感染、延期出血，在颅脑敏感区，会产生对中枢的压迫并引起其它并发症。

⑤不可吸收/部分吸收材料长期存在于体内，还会产生不同程度的结缔组织增生包裹，更严重的是溶胀碎裂和植入后周围组织愈着形成纤维性包裹，即所谓“膜片致癌”。

⑥不同的不可吸收材料还各有不足：如金属类还不利于CT、核磁及放射检查和治疗；硅橡胶生有凝血、吸收类脂物后会溶胀碎裂，抗张强度差等问题，涤纶布类外面可形成较厚的瘫痕，其下方易与脑粘连等缺点；碳纤维本身机械性能有限。

⑦已有的可吸收人工脑膜产品在降解速度、降解性能上在有一定缺陷，临床应用范围有限。

总之，目前人工脑膜在临床应用上都存在着不足，缺少一种具有可被完全吸收、且具有良好的柔韧性、弹性及生物组织相容性、防止脑粘连等综合品质较高的人工脑膜产品。现有产品不利于大规模产业化生产及临床推广。

发明内容

本发明的目的是克服现有人工硬脑膜产品的不足，提供一种可被完全吸收、具有良好的柔韧性、弹性及生物组织相容性、防止脑粘连、可完全降解吸收且降解速度适中、能促进硬膜化过程、不带病毒、无免疫排斥的、可根据需要任意裁剪、制备成本较低、生产周期短、保存、运输容易、临床应用操作简单、应用范围广泛的具有生物活性的人工硬脑膜。

本发明的另一目的是提供上述人工硬脑膜的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种具有生物活性的人工硬脑膜，由纳米仿生支架及附着于其上的水溶胶构成，所述水溶胶内包覆有细胞因子和/或药物。

所述人工硬脑膜至少包含相连的两层结构，面向大脑的一层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的一层为亲水性的纳米细胞支架层；所述面向大脑的一层和背向大脑的一层之间还可以有过渡层；任意两个相邻层之间的连接方式优选通过电纺连接。

所述亲水性的纳米细胞支架层由静电纺制成，即背向大脑面的电纺层，为细胞支架层，是为了有效诱导干细胞及成纤维细胞的迁入，该层则采用生物相容性好的亲水性材料，再者，通过静电纺丝参数调整，设计上控制平均孔径达到20～100μM范围。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

所述面向大脑的一层为防粘连层，采用疏水性材料，不利于细胞的迁入，从而达到防粘连的目的；本发明对制备该层材料的静电纺丝参数进行调整，控制防粘连电纺层孔径在3μM以下。材料的孔隙孔径在纳米以下，比细胞小一到二个数量级，从而阻止细胞进入，防止脑粘连产生。因为人体细胞直径平均在10～20μM，一般成纤维细胞直径在20～30μM之间。脑膜主要分布成纤维细胞及其分泌的胶原纤维，平均孔径在3μM以下，已经可以有效的防止脑粘连的产生。静电纺纤维得到的孔隙大小分布很大程度上依赖于纤维直径，已知纤维直径减小时，孔径也在同时减小。据已发表的文献，纤维直径在4～10μM时，孔径为20～45μM。文献报道，静电纺再生丝素纤维非织造织物的平均孔径可达到2μM。

在细胞支架层和防粘连层之间还可以通过静电纺丝技术增加过渡层。所述过渡层在细胞支架层和防粘连层之间起过渡作用，其孔径为细胞支架层孔径和防粘连层孔径之间；所用材料可以是细胞支架层和防粘连层两层材料的混合，也可以是其它材料。过渡层的孔径可以是非均一的，从细胞支架层到防粘连层，不断调整参数，其孔径逐渐变小；材料也可以是非均一的，实现方法可以参照细胞支架层或防粘连层。加入过渡层，是因为细胞支架层和防粘连层所用的材料性质和孔径相差比较大，仅管目前已有直接连接不同孔径性能的静电纺丝层的报道，但在实际工艺操作过程中，增加过渡层，可以使细胞支架层和防粘连层两层接连更为自然稳固。由上述说明不难看出，过渡层并非本发明人工硬脑膜的一个必不可少的功能层，即使没有过渡层本发明也仍然可以实施，但过渡层的加入可以从制备工艺上使得本发明更好地实施，因此是一个优选方案。

所述细胞因子是对成纤维细胞的粘附、迁移、增殖、分化起作用的因子，如碱性成纤维细胞生长因子。由于人工脑膜的主要作用是在硬膜再生之前起到密封脑、防止脑脊液漏、保护脑的作用，纳米仿生支架已经为成纤维细胞的粘附、迁移、增殖、分化提供了良好的支架，同时由于细胞因子的作用，可以加速硬膜化的过程。本发明优选的细胞因子是对硬膜化过程有促进作用的因子，如碱性成纤维因子，碱性成纤维细胞因子是目前公认的可以诱导成纤维细胞生长增殖并加速硬膜化过程的细胞因子，其它如：白细胞介素，集落刺激因子，TNF、血小板源生长因子等细胞因子也有文献报导，有加速脑硬膜化过程的作用。本发明通过下文将述及的制备方法将这些细胞因子成功包覆于水溶胶内。

所述止血和防粘连药物、抗感染药物或抗肿瘤药物的一种或药学常规可混合使用的几种药物的混合物，但通过本发明的制备方法以及材料的选择将这些药物成功包覆于水溶胶内，共同构成人工脑膜的优良产品。所述药物优选：止血因子、曲尼斯特、放线菌素D、尼莫司汀、长春新碱、氨苄西林等。

止血药物可以起到迅速止血，加快愈合，而防粘连药物则可进一步减少脑粘连的产生。因为硬脑膜的修复在很多情况下是因为脑肿瘤而导致的，而脑肿瘤的复发将导致硬脑膜的再次损伤。在静电纺电纺溶液中加入抗肿瘤药物如放线菌素D、尼莫司汀等都可以降低脑肿瘤的复发率。在因脑肿瘤而导致的硬脑膜修复手术中，加入这类药物可大大降低脑肿瘤的复发率。抗感染药物可选自抗生素，如氨苄西林，螺旋霉素，磺胺，喹诺酮类抗生素等可防止细菌感染，在临床上可降低脑膜移植的感染率。

本发明的人工硬脑膜的制备是通过静电纺制得纳米仿生支架、利用生物打印技术将水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架、水溶胶固化后即得人工硬脑膜。所述生物打印技术是近年来出现的新技术。生物打印能按预定计划精确定位，这和打印技术的特点是一致的。生物打印与一般打印的不同仅在于其墨水和接受打印的纸张不一样。生物打印的纸片是在体内可降解的生物纸片；生物打印的“生物墨水”是特制的细胞溶液或有生物活性的细胞因子溶液。生物打印技术是将这种特制溶液喷射到可生物降解的生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺序的堆叠。由于使用了打印技术，可以将细胞或/和细胞因子组成的生物墨水精确的结合到预定部位；而按特定的堆叠方式的生物纸片则会形成三维结构。理论上如果所用的生物墨水是细胞溶液，则形成三维的组织结构和器官，最后生物纸片降解，细胞保留下来，形成立体结构，例如，活的三维组织、血管和器官。但是生物打印技术仍处于基础研究的阶段，相关文献也集中于理论探讨层面，还没有出现直接利用细胞通过生物打印技术制备人工器官的具体技术方案，也没有任何采用生物打印技术成功制备人工硬脑膜的相关报道。本发明基于上述理论，通过大量实验总结得到生物墨水的具体组成、生物纸片的具体组成和制备方法、三维结构的最终实现方案，从而解决了通过生物打印方法制备人工硬脑膜的技术难题。

本发明利用生物打印技术制备人工硬脑膜的方法包括以下步骤：

(1)制备电纺溶液、含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；所述纳米纺生支架纺成至少两层结构，面向大脑的一层纺成疏水性的防粘连层，背向大脑的一层纺成亲水性的细胞支架层；

(3)用喷墨打印机将含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得人工硬脑膜。

上述方法中，步骤(2)和(3)可重复一次或者更多次，以得到不同厚度的硬脑膜。

所述“制备含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液”也可以在步骤(2)和步骤(3)之间进行，不影响本发明的实现。

所述水溶胶溶液中加入细胞因子和/或药物；所述细胞因子或药物同前所述。

所述水溶胶可以是以下聚合物制成的水溶胶：多糖类聚合物，如淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖；多肽类聚合物，如胶原、聚L～赖氨酸或聚L～谷胺酸；合成的亲水高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N～聚代丙烯酰胺。上述聚合物制备的水溶胶通过改变温度、酸碱度、经紫外线照射或者加入交联剂(固化液)等方法，可由液态转变为固态。

所述电纺溶液是一种或两种以上聚合物混合的电纺溶液，亲水性聚合物材料选自硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸、改性纤维素、海藻酸、淀粉、纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、亲水性聚氨酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚乙烯醇或聚丙交酯；疏水性聚合物材料选自疏水性聚氨酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯或聚对苯二甲酸乙二酯。由于目前高分子材料改性研究在不断发展，原本亲水性材料改性为疏水或疏水材料改性为亲水都越来越常见，范围也越来越广。

将上述材料溶于一定的溶剂，形成电纺液，就可以通过静电纺丝技术制得纳米仿生支架。

上述电纺溶液的溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们的任意混合物。上述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝的相关技术，例如材料与溶剂的重量比例等参照现有技术。

所述防粘连层的静电纺的优选工艺参数为：

微量注射泵的速率为0.1～5.0毫升/小时，高压发生器的电压为5～40KV，接收距离为5.0～30.0厘米。细胞支架层的静电纺的工艺参数为：0.5～20.0毫升/小时，调节高压发生器的电压为10～45KV，调节接收装置的接收距离为5.0～30.0厘米。此处通过静电纺制备得到纤维直径平均孔径在3μM或以下，纤维直径在50～1000nM之间。

所述疏水性的电纺溶液可选择疏水性的L～聚乳酸和ε～己内酯，两者重量比为50∶50或30∶70或70∶30，作为共聚高分子材料，数均分子量是150000～500000，溶于六氟异丙醇或二氯甲烷；可用溶液总重量百分比8～14％的聚己内酯的氯仿/甲醇混合溶液；或者其他合适的聚合物及溶剂。

疏水性电纺支架层作为“生物纸片”，可在其上打印止血和防粘连药物、抗感染药物及抗肿瘤药物，也可用混纺纺入，具体的混纺方法可以参考现有技术的相关内容。

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.1～10毫升/小时，调节高压发生器的电压为10～45KV，调节接收装置的接收距离为10～40厘米，并将纤维接收为膜状结构。

此处通过静电纺制备得到纤维直径平均孔径在3μM或以下。纤维直径在50～1000nM之间。

所述亲水性的电纺溶液选择的亲水性材料作制备细胞支架层，可以选用亲水性聚氨酯或者天然明胶、纤维素、壳聚糖、硫酸软骨素等亲水性材料；优选的方案：亲水性聚氨酯，与/或天然明胶，硫酸软骨素、聚乙二醇，重量比20～80∶80～20，纺丝液为溶液总重量的3～15％；或者用亲水性聚氨酯与天然明胶，或硫酸软骨素，重量比20～80∶80～20，纺丝液为溶液总重量的3～15％；也可选用其他合适聚合物及溶剂，亲水性的纳米细胞支架层孔径为20～200μM。纳米细胞支架层纤维直径介于5～200μM。

以亲水性纳米支架层作为生物纸片，可以在其上打印细胞因子，止血药物、防粘连药物、抗感染药物或抗肿瘤药物。

所述亲水性电纺支架层的静电纺丝参数如下：接收距离从15～25cm，电压15～45KV，纤维平均直径在500～10000nm开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺细胞支架层。

所述电纺溶液中添加药物或因子的优选方案是：含有溶液质量百分比浓度为0.001～0.05％的碱性成纤维细胞成长因子，溶液质量百分比浓度为3％的苄氨西林，溶液质量百分比浓度为0.001～0.05％的止血因子，在用于因脑肿瘤而导致的脑膜修复手术中，可以包含有0.01～5％的尼莫司汀。

所述过渡层溶液中的静电纺丝参数如下：接收距离从10～30cm，电压10～45KV，开启静电纺丝，在已纺好的防粘连层上继续纺过渡层，在过渡层上继续纺细胞支架层。

过渡层可以添加药物或因子，也可以不添加。

因为过渡层所采用的工艺参数是在细胞支架层和防粘连层之间，所以，由于过渡层的连接，可能使制备的防粘连层和细胞支架层之间的接连有缓冲区，孔径和材料变化不至于过于突兀，从而影响人工脑膜产品的应用效果。

优选方案为：聚氨酯与透明质酸的质量比为70∶30，纺丝液质量分数为10％。纤维平均直径在500～20000nm。

上述用生物打印制备所述双层人工脑膜更具体的步骤是：

1、制备防粘连层：制备防粘连层的电纺溶液、含有药物或止血因子的水溶胶溶液和交联剂溶液；

(1)将配置好的0.1M交联剂溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印。

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得防粘连层的纳米仿生支架；所用静电纺丝参数为前述的防粘连层静电纺参数。

(3)用喷墨打印机将含有止血因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

步骤(2)、(3)可以重复，直到得到适合厚度的防粘连层。关闭静电纺丝和打印。调整静电纺丝和打印的材料和参数。

2、制备细胞支架层：制备细胞支架层的电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液；

(1)在纺好的防粘连层上，继续接收静电纺丝，制得细胞支架层的纳米仿生支架，所制得的细胞支架层仍浸于前述的交联剂溶液中；这里所采用的静电纺丝参数是细胞支架层的电纺参数，电纺参数同上。

(3)用喷墨打印机将含有碱性成纤维细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

(2)、(3)可重复以得到合适的厚度。

制得的产品经清洗、灭菌，包装后贮存，本发明人工硬脑膜保存、运输容易。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(一)本发明提供了一种新的修复硬脑膜的材料，解决了现有产品易发生脑粘连、易带病毒、易产生免疫排斥等缺陷，本发明硬脑膜具有以下优点：

1、机械特性能满足适应症对抗拉伸强度及柔韧性的要求。

2、双层设计，内侧面(即面向大脑的一面)光滑，能防粘连，能起着很好地隔离头皮软组织与脑组织的作用，外侧面(即背向大脑的一面)和侧边则为多孔结构，允许细胞长入；可促使尽早自体成纤维细胞以及某些未分化的细胞向胶原内部沁润生长浸润，促使脑膜早日修复。利于日后进行颅骨修复手术。

3、能够在新生组织生成后被完全吸收的，避免了膜片致癌。

4、不含活细胞成分，不使用外源细胞和蛋白，免除了因此而带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险；能杜绝疾病传播。

5、使用的材料是目前已经证实对人体无毒无害的安全生物材料，具有良好的生物组织相容性，无异物排斥反应，无毒性反应，无致癌、致畸作用。不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险，也不会带来其它毒害作用；

6、人工脑膜材料来源充分，成本较低，避免了天然材料来源不足，成本高，改性复杂的缺点，贮存运输简单。

7、人工脑膜的制备方法工艺步骤简化，生产时间短，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，产品标准容易实现，产品可实现低成本、高效率的产业化生产。

8、根据本发明制备的人工脑膜临床应用简单，由于在处理中没有引入戊二醛等毒性物质，在临床应用时不需要再进行严格的浸泡和清洗，也因此避免了由于提前浸泡造成的预选尺寸不够而使产品报废的情况。

(二)本发明成功利用生物打印技术将碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子等细胞因子按设计要求，精确结合于纳米支架上。采用生物打印技术结合纳米支架，可以达到细胞因子有效按所的浓度和精确位点结合，可以同时结合多种不同浓度、不同分布的不同细胞因子，纳米支架同时作为细胞因子缓释控制体系，细胞因子可控释放。这样可以最大限度模拟体内生理环境，形成有利于成细胞迁移、聚集、分化的微环境，吸引成纤维细胞进入硬脑膜缺损部位，并聚集、分化，加速了硬膜化过程；与没有加入细胞因子的人工脑膜相比，或者与单纯用混纺技术加入细胞因子的人工脑膜相比，其过程大为缩短。因此，可在临床上加速创伤愈合，缩短病程，减轻病人痛苦。

(三)本发明用生物打印将药物加入了人工脑膜，比单纯利用静电纺丝技术的人工脑膜相比，可有效防止感染、防粘连、防脑肿瘤复发。此种效应与没有加入药物的人工脑膜相比，其感染率大为降低，脑粘连发生率和脑肿瘤复发率大为降低。而且，由于用生物打印技术可以精确定位，加入的药物的量可以按需要调节，比如急性感染期浓度更高(即人工脑膜表面)，慢性感染期(即人工脑膜里)浓度低，这不仅减轻了药物的用量，更重要的是，在颅脑敏感区降低药物用量之后，减少了随之而来的药物不良反应。

附图说明

图1实施例1制得的人工脑膜结构示意图，1为细胞支架层，2为碱性成纤维细胞因子，3为防粘连层，4为抗生素，5为止血和防粘连药物。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

(1)制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液：

电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-己内酯，两者比值为50∶50，作为共聚高分子材料，数均分子量是260000，溶于六氟异丙醇。

交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。

含有细胞因子的水溶胶溶液采用止血因子藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液中止血因子的质量百分比浓度为10ppm。

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架：

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时，调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用并将纤维接收为膜状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

纺丝和打印重复5次，制得防粘连层厚度约0.2mm。

此处通过静电纺制备得到纤维直径平均300nm。

2、制备细胞支架层

制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；

采用亲水性材料，聚乙二醇与硫酸软骨素质量比为70∶30，纺丝液质量分数为9％，交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。

含有细胞因子的水溶胶溶液采用碱性成纤维细胞因子的藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液中碱性成纤维因子的质量百分比浓度为100ppm。

(1)将配置好的0.1M氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用并将纤维接收为膜状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

(3)用喷墨打印机将含有碱性成纤维细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。制得的人工脑膜见图1所示，1为细胞支架层，2为碱性成纤维细胞因子，3为防粘连层，4为抗生素，5为止血和防粘连药物。

纺丝和打印重复10次，制得防粘连层厚度约0.4mm

纤维平均直径在10μm

3、清洗，灭菌，包装。

实施例2

1、制备防粘连层

(1)制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液：

电纺液选择疏水性的L-聚乳酸和ε-己内酯，两者比值为50∶50，作为共聚高分子材料，数均分子量是260000，溶于六氟异丙醇。

交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。

含有细胞因子的水溶胶溶液采用止血因子藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液中止血因子的质量百分比浓度为10ppm。

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架：

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为5毫升/小时，调节高压发生器的电压为30KV，调节接收装置的接收距离为20厘米，用并将纤维接收为膜状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

纺丝和打印重复5次，制得防粘连层厚度约0.2mm。

此处通过静电纺制备得到纤维直径平均300nm。

2、制备过渡层：

(1)制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液：

电纺液选择以下方案：聚氨酯与透明质酸的质量比为70∶30，纺丝液质量分数为10％。混合氨苄西林，浓度为3％。得到均一溶液。。

交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。

含有细胞因子的水溶胶溶液采用止血因子藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液中止血因子的质量百分比浓度为10ppm。

将配置好的0.1M氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印；将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中；本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架：

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为4毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用并将纤维接收为膜状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

(3)用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

纺丝和打印重复3次，制得防粘连层厚度约0.1mm。.

纤维平均直径在5μm。

3、制备细胞支架层

制备电纺溶液、含有药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；

采用亲水性材料，聚乙二醇与硫酸软骨素质量比为70∶30，纺丝液质量分数为9％，交联剂溶液选用0.1M氯化钙溶液。

含有细胞因子的水溶胶溶液采用碱性成纤维细胞因子的藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液中碱性成纤维因子的质量百分比浓度为100ppm。

(1)将配置好的0.1M氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作止血因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；

将上述溶液加入静电纺装置的注射器中，调节微量注射泵的速率为0.8毫升/小时，调节高压发生器的电压为20KV，调节接收装置的接收距离为11厘米，用并将纤维接收为膜状结构。静电纺丝20分钟，关闭静电纺丝。

(3)用喷墨打印机将含有碱性成纤维细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

纺丝和打印重复15次，制得防粘连层厚度约0.3mm。.

纤维平均直径在10μm。

3、清洗，灭菌，包装。

实施例3

用实施例1制得的硬脑膜进行犬动物实验：

实验犬体重15～20KG，年龄1.5～2岁，雌雄不拘，共5只。以氯胺酮肌肉注射全麻，麻醉剃毛后，将动物置于专用手术台上，腹卧位。用2％碘酒和75％酒精消毒。动物头顶正中，纵向切开。用剥离器分离骨膜，暴露双顶部颅骨板，用高速磨钻磨开颅骨，双顶部形成骨窗。用小剪刀剪掉双侧顶部3cm×3cm大小的矩形硬脑膜，制造出顶部的硬脑膜缺损。在暴露的脑表面电灼，造成6个1mm×1mm大小的损伤点。将用本发明实施例1所制备的人工脑膜修剪成相应形状及尺寸的修补材料，防粘连层向脑表面，用4/0无损伤丝线间断缝合，针距4mm，修补于犬顶部的缺损。用圆针4号丝线缝合肌肉。术后对动物进行常规的喂养及观察。术后动物恢复良好，切口愈合良好，无脑脊液漏，无癫痫发生。术后进食进水正常，动物的户外活动正常，没有发现运动障碍，存活至预定期限。

术后12个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位1cm范围切取标本，使其包括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本后，可见人工脑膜与硬脑膜的连接处对合平整，无分界，已完全愈合，仅见缝合的丝线。原生硬脑膜之间未见明显充血，出血等排异反应。

实施例4

用实施例2制得的硬脑膜进行新西兰兔动物实验：

实验的动物施行顶部开颅，人为制造部分硬脑膜缺损及脑组织损伤，然后以人工脑膜分别实施硬脑膜修补术。术后对动物进行常规的喂养及观察。术后动物恢复良好。术后12个月，动物以手术部位为中心，在大于手术部位1cm范围切取标本，使其包括人工脑膜及周边硬脑膜及内面的脑组织。切取出标本后，可见内侧表面可见上皮细胞覆盖，上皮下可见纤维组织增生，纤维母细胞增生，胶原纤维增多，致使材料内带血运的新生组织增生，宿主新生组织侵入，材料降解，总量明显减少，内部可见毛细血管。新老组织界面无中性粒细胞，淋巴细胞等炎症细胞反应，界面处无囊壁形成。蛛网膜及脑组织正常。

Claims (10)

1.一种具有生物活性的人工硬脑膜，其特征是由纳米仿生支架及附着于其上的水溶胶构成，所述水溶胶内包覆有细胞因子和/或药物；所述纳米仿生支架至少包含相连的两层结构，面向大脑的结构层为疏水性的防粘连电纺层，背向大脑的结构层为亲水性的纳米细胞支架层。

2.如权利要求1所述的人工硬脑膜，其特征在于所述防粘连电纺层和纳米细胞支架层之间还有过渡层。

3.如权利要求2所述的人工硬脑膜，其特征在于纳米细胞支架层孔径为20～200μM；防粘连电纺层孔径在3μM以下；所述过渡层孔径在纳米细胞支架层孔径和防粘连电纺层孔径之间。

4.如权利要求1或2或3所述的人工硬脑膜，其特征在于所述细胞因子是对硬膜化过程有促进作用的细胞因子；所述药物是止血药物、防粘连药物、抗感染药物或抗肿瘤药物的一种或药学常规可混合使用的几种药物的混合物。

5.如权利要求4所述的纳米仿生人工硬脑膜，其特征在于所述对硬膜化过程有促进作用的细胞因子选自白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、血小板源生长因子或碱性成纤维细胞因子的一种或几种。

6.如权利要求1或2或3所述的人工硬脑膜，其特征在于所述电纺层或支架层均是采用支架材料通过静电纺丝技术制备得到，所述支架材料为聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、聚氨基甲酸酣、聚L～乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚对二恶酮、丙交酯、乙交酯、丁内酯、戊内酯、己内酯、环氧乙烷、环氧丙烷、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖或褐藻酸的任意一种或两种以上材料的混合物。

7.一种权利要求1或2或3所述人工硬脑膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备电纺溶液、含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液和交联剂溶液；

(2)用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；所述纳米纺生支架纺成至少两层结构，面向大脑的一层纺成疏水性的防粘连层，背向大脑的一层纺成亲水性的细胞支架层；

(3)用喷墨打印机将含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述含有细胞因子和/或药物的水溶胶溶液的制备在步骤(2)和步骤(3)之间进行。

9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于步骤(2)和(3)重复若干次。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述水溶胶是以多糖类聚合物、多肽类聚合物或合成的亲水高分子聚合物制成的水溶胶；所述多糖类聚合物为淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖；所述多肽类聚合物为胶原、聚L～赖氨酸或聚L～谷胺酸；所述合成的亲水高分子聚合物为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚N～聚代丙烯酰胺；

所述电纺溶液的溶剂为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一种或者它们任意比例的混合物。

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