CN106237384B - 复合梯度浓度生物活性因子组织支架、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架及其制备方法。所述支架包括：支架基体以及分布在所述支架基体上的生物活性因子涂层；并且，在所述涂层平面上的至少两个不同区域内的生物活性因子的含量不同；其制备方法包括：采用静电喷雾技术等将生物活性因子溶液喷滴至支架基体上形成活性因子涂层，且在静电喷雾过程中，喷射头和支架基体在一定时段内以不同速度相对移动，从而使形成的活性因子涂层平面上的不同区域内的生物活性因子含量不同。本发明的制备方法精度高，稳定性好，可便捷地调控梯度图案，同时梯度分布持续时间长，且所获梯度支架可很好地模拟体内三维空间和梯度微环境，为干细胞的迁移、分化等研究提供了更好研究平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织工程支架材料及其制备方法，特别涉及一种复合梯度浓度生物活性因子组织工程支架、其制备方法及应用，例如作为干细胞迁移、分化载体的用途，属于生物医学材料领域。
背景技术
神经诱导材料在神经再生和修复过程中具有重要作用。胶原电纺纤维因为能够模拟细胞外基质的结构和成分，是很好的神经导管材料。除了神经搭接和引导作用外，生物活性因子的加入更能促进神经环路的形成和损伤功能的修复。
在神经发育和修复过程中，梯度分布的生物活性物质具有至关重要的作用。梯度分布的神经营养因子可以引导神经锥的延伸生长。近年来研究发现基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)和CXCR4信号通路在神经干细胞的维持和归巢中起着很重要的作用。而研究表明干细胞在特定时间、位置的迁移、凋亡、分化等同样受梯度分布的物理化学信号的调控。例如在神经退行性疾病、脑部肿瘤病变区，形成的新的微环境分泌SDF1α，招募内源性神经干细胞向病变部位迁移；而脊髓损伤后，星形胶质细胞增生引发SDF1α上调，促进内源性神经干细胞或移植神经干细胞向损伤部位迁移。
目前，研究干细胞在梯度分布生物活性分子作用下的迁移、分化情况等多采用传统的微流控技术，但此技术不能很好地模拟细胞在体内的三维细胞外基质微环境。
开发复合梯度分布生物活性物质的支架材料是新一代神经诱导支架的目标。但现有梯度支架材料往往存在梯度浓度精度不高，稳定性不好，持续时间短等局限。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的主要目的在于提供一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架的制备方法，其具有精度高，稳定性好，可便捷地调控梯度图案，同时梯度分布持续时间长等特点。
本发明的另一重要目的在于提供一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架，其可以很好地模拟体内三维空间和梯度微环境，对细胞，特别是干细胞的迁移、分化等研究提供了更好的平台。
本发明的再一重要目的在于提供所述复合梯度浓度生物活性因子组织支架的用途。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明的一实施方案之中提供了一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架，其包括：支架基体以及分布在所述支架基体上的生物活性因子涂层；并且，在所述涂层平面上的至少两个不同区域内的生物活性因子的含量不同。
较为优选的，所述支架基体主要由胶原纤维形成，所述胶原纤维的直径为100～1000nm。
较为优选的，所述生物活性因子包括具有胶原特异结合区的融合表达因子(CBD融合表达因子)。
例如，所述融合表达因子可以包含：SDF1α，以及，与SDF1α连接的、具有胶原特异结合能力的多肽。
例如，所述融合表达因子还可以包含：BDNF，以及，与BDNF连接的、具有胶原特异结合能力的多肽。
进一步的，所述支架基体采用胶原电纺纤维膜。
进一步的，所述纤维支架的厚度为0.05mm～0.1mm。
进一步的，所述胶原纤维无规则排列。
进一步的，所述活性因子涂层内融合表达因子的含量为0.1ng～10ng/cm2。
本发明的一实施方案之中还提供了一种制备所述复合梯度浓度生物活性因子组织支架的方法，其包括：
提供所述支架基体，
以及，将生物活性因子溶液施加至所述支架基体上，形成所述活性因子涂层；
且在所述涂层平面上的至少两个不同区域内的生物活性因子溶液的施加量不同。
在一较为优选的实施方案之中，该制备方法包括：采用静电喷雾工艺将生物活性因子溶液喷滴到所述支架基体表面，其中，静电纺丝设备的喷射头的喷射方向与所述支架基体表面相垂直，喷射头与支架基体的距离为0.8cm～2cm，电压为3KV～5KV，流速为0.05mL/h～0.1mL/h。
在一较为优选的实施方案之中，在静电喷雾过程中，使所述喷射头和支架基体至少在两 个时段内沿第一方向和/或第二方向以不同速度相对移动，其中第一方向、第二方向均与所述支架基体表面平行，且第一方向与第二方向相垂直。
在一较为优选的实施方案之中，在静电喷雾过程中，所述喷射头喷射出的液滴直径为450～550μm。
在一较为优选的实施方案之中，所述生物活性因子溶液采用浓度为0.2nM～20nM的融合表达因子水溶液。
前述任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架于培养细胞中的用途。
进一步的，所述细胞包括CXCR4高表达的干细胞，所述干细胞包括神经干细胞和/或骨髓间充质干细胞，但不限于此。
本发明的一实施方案之中还提供了一种细胞培养设备，其包括细胞培养池，所述细胞培养池内分布有前述的任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架。
本发明的一实施方案之中还提供了一种制备所述细胞培养设备的方法，其包括：
提供前述的支架基体，并将所述支架基体固定在基材表面，
在所述支架基体周围环绕设置具有设定高度的细胞池壁，从而在所述基材表面与细胞池壁之间围合形成细胞培养池，且使所述支架基体分布于细胞培养池内，
采用前述的任一种方法在所述支架基体上形成所述活性因子涂层。
本发明的一实施方案之中还提供了一种细胞培养方法，其包括：将待培养的细胞接种在前述的任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架上，并在适合孵育所述细胞的环境中使所述细胞迁移和/或分化。
本发明的一实施方案之中还提供了一种装置，其包括前述的任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架或前述的细胞培养设备。
本发明通过采用改良的静电喷雾技术，实现细小液滴垂直喷落，并采用胶原材料作为接收平台，控制其移动来实现生物活性因子在不同位置的喷落量，从而实现高精度和良好稳定性的梯度分布的活性因子。同时对因子进行基因改造，使之与具有胶原特异结合能力的短肽融合表达，获得的CBD融合表达因子可实现与胶原支架的特异结合，从而提高胶原支架上梯度分布的持续时间。将复合梯度分布因子的胶原支架固定在玻璃片上，并在材料周围固定液池壁，形成培养池，用于细胞培养。所培养的细胞为CXCR4高表达的干细胞，如神经干细胞、骨髓间充质干细胞等。可很好地模拟体内梯度环境来研究干细胞的迁移、分化等。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：提供的复合梯度分布生物活性因子的支架 材料的制备方法精度高，稳定性好，可便捷地调控梯度图案，同时梯度分布持续时间长，且所获梯度支架作为干细胞迁移、分化的载体可很好地模拟体内三维空间和梯度微环境，对干细胞的迁移、分化等研究提供了更好的研究平台。
附图说明
图1A是本发明一实施方案之中利用改良静电喷雾法制备梯度分布生物活性因子涂层的示意图；
图1B是本发明一实施方案之中一种胶原电纺纤维的扫描电镜图片；
图1C是本发明一实施方案之中分布于胶原电纺纤维上的静电喷雾液滴的荧光显微镜图片；
图2是本发明一实施例之中生物活性因子涂层的荧光显微镜照片及荧光强度曲线图(加荧光染色罗丹明)；
图3A是本发明一实施例之中复合SDF1α梯度涂层的胶原纤维膜SDF1α释放曲线；
图3B是本发明一实施例之中复合SDF1α梯度涂层的胶原纤维膜不同区域SDF1α含量曲线；
图3C是本发明一实施例之中复合CBD-SDF1α梯度涂层的胶原纤维膜不同区域SDF1α释放曲线；
图4A-4B是本发明一实施例之中以复合梯度SDF1α涂层的胶原纤维膜为载体进行神经干细胞培养的细胞活动轨迹图；
图4C-4D是本发明一实施例之中以复合梯度SDF1α涂层的胶原纤维膜为载体进行神经干细胞培养的细胞终点角度直方图；
图4E是本发明一实施例之中以复合梯度SDF1α涂层的胶原纤维膜为载体进行神经干细胞培养的趋化指数图；
图5A是本发明一实施例之中神经干细胞在复合CBD-SDF1α梯度涂层的胶原纤维膜上培养一天后呈现梯度分布的荧光显微镜照片，其中A所示为平缓线性梯度分布，B所示为陡峭线性梯度分布，C所示为跳跃梯度分布；
图5B是本发明一实施例之中神经干细胞在复合CBD-SDF1α梯度涂层的胶原纤维膜上培养一天后的细胞数目统计图；
图6A-图6B分别是本发明一实施例之中神经干细胞在复合CBD-SDF1α梯度涂层的胶原 纤维膜上培养七天后Tuj-1+、GFAP+细胞的荧光显微镜照片；
图6C是本发明一实施例之中神经干细胞在复合CBD-SDF1α梯度涂层的胶原纤维膜上培养七天后Tuj-1+、GFAP+细胞的细胞数目统计图；
图7A是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的构建示意图，其中胶原结合区(collagen binding domain，CBD)通过一个linker连接融合到SDF-1α的C-末端；
图7B-图7C分别是本发明一典型实施例中采用Tricine-SDS-PAGE方法和Westernblot方法对纯化获得的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的体外鉴定图。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架的制备方法，其包括：提供支架基体，以及，采用静电喷雾技术等方式将生物活性因子溶液，例如CBD融合表达因子水溶液喷滴至所述支架基体上，形成所述活性因子涂层。
优选的，在静电喷雾过程中，使所述喷射头和支架基体至少在两个时段内沿第一方向和/或第二方向以不同速度相对移动，其中第一方向、第二方向均与所述支架基体表面平行，且第一方向与第二方向相垂直，从而使所形成的活性因子涂层平面上的不同区域内的生物活性因子的含量不同。
在一些实施例中，在第一方向和/或第二方向上，喷射头与支架基体的相对移动速度可以是递增、递减，或是在某些时段递增而在某些时段递减，或者是在某些时段在一个方向上保持匀速，而在另一个方向上保持递增或递减，其相对运动的模式可以依据实际需要而具体调整。
其中，所述支架基体优选采用胶原纤维膜，特别是胶原电纺纤维膜，其可以通过业界已知的任何合适方式制取，例如，可以某些基材，例如玻璃板作为接收板，并以胶原溶液进行静电纺丝，从而获得所述支架基体。
在本发明中，所述的融合表达因子系通过对生物活性因子，例如基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)、脑源性神经营养因子BDNF等进行基因改造，使其与具有胶原特异结合能力的短肽collagen binding domain(CBD)融合表达而获得(参考“Linear orderedcollagen scaffolds loaded with collagen-binding brain-derived neurotrophicfactor improve the recovery of spinal cord injury in rats”，Tissueengineering:Part A,2009,15(10):2927-2935.)。
例如，所述CBD融合表达因子可包含：SDF1α，以及，与SDF1α连接的、具有胶原特 异结合能力的多肽。
例如，所述CBD融合表达因子可包含：BDNF，以及，与BDNF连接的、具有胶原特异结合能力的多肽。
例如，在一些实施例中，一种CBD融合表达因子(CBD-SDF-1α)可以包含基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)及具有胶原特异结合能力的多肽，并具有如下所示的氨基酸序列，即：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKGSAGSAAGSGGTKKTLRT。
进一步的，CBD-SDF-1α的表达及纯化过程可包括：
Ⅰ、CBD-SDF-1α表达载体的构建、鉴定及转化
参阅图7A，从Genbank中查找获得人SDF-1α的成熟肽基因序列，从人成纤维细胞总mRNA中扩增获得SDF-1α成熟肽基因，通过PCR的方法将CBD序列及linker序列拼接到SDF-1α序列的C-末端，在引物中引入Nco I和Xho I酶切位点，通过双酶切的方法将CBD-SDF-1α基因插入到pET28a载体中，连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂布到含有卡那霉素(Kana)抗性的LB平板上，挑选阳性克隆，通过基因测序的方法鉴定阳性克隆，抽提质粒备用。将测序正确的质粒转化到表达菌株大肠杆菌BL21中，通过Kana抗性的LB平板筛选阳性克隆。挑选阳性克隆放到含Kana抗性的5ml LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中，以200rpm的转速培养12h后，加入终浓度为10％的甘油，-80℃冻存保种。
Ⅱ、CBD-SDF-1α的表达及纯化
将表达CBD-SDF-1α的BL21表达菌种涂布到Kana抗性的LB平板上，挑选阳性克隆到Kana抗性的5ml LB液体培养中，在37℃的恒温摇床中以200rpm的转速培养12小时；然后将这5ml菌液转接到含kana抗性的200mL LB液体培养基的三角瓶中放大培养，以同样的温度和转速在恒温摇床中进行培养，待培养至菌液OD值达到0.6～0.8之间时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，继续培养5h后，10000g、4℃离心10min收集菌体。用20ml PBS重选菌体，然后在冰上以150w的功率，超声20min破碎菌体，12000g、4℃离心20min收集包涵体。将包涵体重悬于20ml的包涵体洗涤液中(2M urea,20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,2％Triton-X100，pH 8.0)，在相同的超声条件下超声5min,重复三次，充分洗涤包涵体。将洗净的包涵体溶解后，通过AKTA prime plus 5.0系统利用镍亲和层析柱(His-Trap affinity columns，GE)采用柱上复性的方法对进行纯化。纯化获得的目的蛋白通过Tricine-SDS-PAGE及Western blot的方法进行鉴定。洗脱的蛋白在PBS中充分透析后，通过超滤浓缩的方法进行浓缩(超滤膜分子量5kDa)，然后BCA试剂盒测定其浓度，0.22μm滤膜过滤除菌后分装冻存于-80℃；24小时后在冻干机中冻干过夜，冻干粉保存于-80℃。图1B-图1C中为冻干粉重新溶解后的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α(同样方法制备的天然的SDF-1α)的电泳(图7B)及WB(图7C)鉴定图，可见获得了纯度较高的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α。
相应的，本发明的另一个方面提供了一种利用前述方法制备的复合梯度浓度生物活性因子组织支架，其包括：支架基体(例如主要由胶原纤维形成的支架基体,纤维支架的厚度为0.05mm～0.1mm，胶原纤维直径为100～1000nm，且胶原纤维无规则排列)；以及，分布在所述支架基体上的生物活性因子涂层，并且在所述涂层平面上的至少两个不同区域内所含生物活性因子的浓度不同。
本发明的又一个方面还提供了所述复合梯度浓度生物活性因子组织支架于培养细胞、例如CXCR4高表达的干细胞中的用途。这些干细胞包括但不限于神经干细胞和/或骨髓间充质干细胞。
在一些实施例中，可以基于所述复合梯度浓度生物活性因子组织支架而形成一种细胞培养设备，其可包括细胞培养池，所述细胞培养池内，例如池底可分布有前述的任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架。
所述细胞培养装置可通过业界已知的任何合适方法制备，例如，可以在基材，例如玻璃片上进行胶原静电纺丝，并采用粘合剂固定，同时以粘合剂形成细胞培养池，且使所述支架基体分布于细胞培养池内，而后采用前述的任一种方法在所述支架基体上形成所述活性因子涂层。
在一些实施例中，还可提供一种细胞培养装置，其包括前述的任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架或前述的细胞培养设备。
当然，在所述装置中，还可包含其它细胞培养所需的材料，例如业界所知的适用缓冲液或其它各种辅助添加物质，另外还可包含说明文档等。
在一些实施例中，还提供了相应的细胞培养方法，例如，可以将待培养的细胞接种在前述的任一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架上，并在适合孵育所述细胞的环境中使所述细胞迁移和/或分化。
前述“适合孵育所述细胞的环境”包含适合细胞孵育的缓冲液体系，合适的温度、湿度条件等，这些都是本领域人员依据常识可以知悉和获取的。
以下将结合附图及若干实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：复合梯度分布CBD-SDF1α的胶原电纺纤维支架(亦可简称胶原梯度支架或梯度支架)的制备
1.梯度分布CBD-活性因子胶原支架的制备
首先以玻璃片为接收平台，进行胶原(浓度为0.2g/mL，溶剂为六氟异丙醇)静电纺丝(参考“Electrospinning of collagen nanofibers:effects on the behavior ofnormal human keratinocytes and early-stage wound healing.”，Biomaterials,2006,27(8):1452-1461.)，作为支架材料模型(其形貌请参阅图1B)；同时表达纯化具有胶原特异结合区CBD-SDF1α(参考Tissue engineering:Part A,2009,15(10):2927-2935.)作为活性因子模型，不含胶原特异结合区的NAT-SDF1α作为对照。采用改良的静电喷雾技术将CBD-SDF1α梯度喷滴到胶原电纺纤维膜上，示意图如图1A所示，具体过程如下：将一定浓度的CBD-SDF1α水溶液(2nM)加入1mL注射器中，通过微量注射泵控制流速为0.1mL/h，缓慢挤出到喷射头，喷射头与接收平台即胶原电纺纤维膜间距离约为1cm,施加电压约4KV。在此条件下获得稳定的静电喷雾液滴，并垂直喷射到下方的胶原电纺膜上。参阅图1C，可见液滴大小约为500μm，大小均匀。再请参阅图1A，以接收平台长度方向为X方向，宽度方向为Y方向。先控制X方向移动使得静电喷雾喷落一行，移动Y方向，再控制X方向滴落一行，如此循环。调节X,Y方向的移动速度，可得到不同浓度梯度分布的的生物活性因子涂层，例如：控制接收平台沿X方向的移动速度为15mm/min,Y方向的移动速度分别为10mm/mim,15mm/min,20mm/min,30mm/min,40mm/min,可得到平缓线性梯度分布的活性因子涂层Ⅰ；或者，控制接收平台沿X方向的移动速度为15mm/min,Y方向移动速度分别为15mm/min,30mm/min,60mm/min,120mm/min,240mm/min,可得到陡峭线性梯度分布的活性因子涂层Ⅱ；或者，控制接收平台沿X方向间歇性移动,Y方向移动速度为15mm/min，可得到跳跃梯度分布的活性因子涂层Ⅲ。
2.梯度分布活性因子的表征
将荧光染色罗丹明加入到CBD-SDF1α水溶液中，采用上述参数进行静电喷雾，通过荧光显微镜在同一曝光强度下连续拍摄拼接得到涂层的整体形貌，并将材料分成5个区域，采用Image J软件测定荧光强度，得到X方向荧光强度的分布，证实了平缓线性梯度分布涂层Ⅰ(斜率为-7.2)，陡峭线性梯度分布涂层Ⅱ(斜率为-8.7)和跳跃梯度涂层Ⅲ的形成(参阅图2)。
3.梯度分布CBD-SDF1α的表征
经测试，制备的CBD-SDF1α、NAT-SDF1α与胶原涂层的解离常数分别为0.37μM和1.09 μM，说明CBD-SDF1α能够与胶原特异结合。分别制备CBD-SDF1α、NAT-SDF1α线性梯度涂层的胶原电纺纤维，37℃孵育3h。将复合梯度分布CBD-SDF1α、NAT-SDF1α的胶原电纺纤维支架在300mL PBS缓冲液中进行释放，隔天取液，使用SDF1αElisa试剂盒进行检测，图3A可见CBD-SDF1α能够实现缓慢释放。此外，将复合梯度分布CBD-SDF1α、NAT-SDF1α的胶原电纺纤维膜分成3个区域，加入anti-His(1:2000,Sigma)100μL,37℃孵育2h,接着PBS洗5次后加入anti-mouse IgG-FITC(1:2000,Sigma)避光孵育30min。然后PBS洗5次，然后加入TMB进行显色,2M H2SO4终止反应后,用酶标仪读取A450的值。图3B可见实现了梯度浓度的结合，证实了CBD-SDF1α梯度涂层的形成。进一步，将复合梯度分布CBD-SDF1α的胶原电纺纤维膜分成3个区域，加入200mL PBS缓冲液中进行释放，隔天取液，使用SDF1αElisa试剂盒进行检测，图3C可见CBD-SDF1α梯度涂层能够实现不同区域的浓度梯度。
实施例2：以实施例1所获复合梯度分布CBD-SDF1α的胶原电纺纤维支架作为载体进行神经干细胞培养
Ⅰ、复合梯度分布CBD-SDF1α的胶原电纺纤维支架的制备
参照实施例1，在玻璃片上进行胶原静电纺丝，再采用道康宁3140硅酮粘合剂固定，室温条件下固化24h，形成具有2cm壁高的细胞培养池；75％乙醇灭菌处理过夜，然后使用大量的去离子水浸泡、清洗，然后晾干。按照实施例1中的方法复合CBD-SDF1α线性梯度涂层。37℃孵育3h。然后将样品浸泡于10ug/mL的多聚赖氨酸PBS溶液中1h,PBS清洗。
II、胶原梯度支架材料进行神经干细胞的培养
出生12h的SD乳鼠分离出海马，剪碎，加干细胞培养液用钝头粗口滴管轻轻吹打直到组织团块消失，400目尼龙膜过滤，转移到培养瓶中成球培养。传代4次后将神经球消化成单细胞，接种于前述胶原梯度支架上，接种密度为5×105-1×106。
III、胶原梯度支架材料可促进神经干细胞的迁移
(1)梯度支架材料上神经干细胞活体细胞示踪
前述梯度支架材料上种植神经干细胞后采用激光共聚焦显微镜的活细胞工作站进行细胞示踪。每5min拍摄一次，拍摄6h。采用软件Volocity得到细胞一系列的X,Y坐标。参阅图4可见，神经干细胞可以感受到CBD-SDF1α涂层的影响，并向高浓度方向移动。
(2)梯度支架材料上神经干细胞梯度分布
神经干细胞培养一天后，担载神经干细胞的支架材料用4％多聚甲醛室温固定30min， PBS浸洗3遍；0.08％Triton X-100孵育10min,PBS浸洗3遍；5％BSA室温封闭30min，PBS洗3次；50μg/mL Hoechst 33342核衬染10min,PBS洗3次，通过荧光显微镜在同一曝光强度下连续拍摄拼接得到细胞的整体形貌。分成五个区域进行细胞个数统计，参阅图5A-图5B所示，神经干细胞在CBD-SDF1α缓慢线性梯度涂层Ⅰ、CBD-SDF1α陡峭线性梯度涂层Ⅱ、CBD-SDF1α跳跃梯度涂层Ⅲ胶原支架上分别呈现缓慢线性梯度分布(斜率为-21)、陡峭线性梯度分布(斜率为-52)和跳跃梯度分布。5％BSA缓慢线性梯度涂层的胶原支架材料(对照)上神经干细胞大体均匀分布。说明梯度分布CBD-SDF1α的胶原电纺纤维膜可诱导神经干细胞梯度分化。
(3)梯度支架材料上神经干细胞分化的神经元、星形胶质细胞梯度分布
神经干细胞培养七天后，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS浸洗3遍；0.08％TritonX-100孵育10min,PBS浸洗3遍；5％BSA室温封闭30min，PBS洗3次；孵育TUj-1,GFAP一抗，4℃，过夜，PBS洗3次；二抗孵育37℃，40min，PBS洗3次；50μg/mL Hoechst 33342核衬染10min,PBS洗3次，通过荧光显微镜在同一曝光强度下连续拍摄拼接得到细胞的整体形貌。参阅图6A-图6C所示，神经干细胞分化所得的神经元和星形胶质细胞数量沿梯度X轴方向呈现梯度减少的趋势。
因而，本实施例的组织支架可很好地模拟体内三维空间和梯度微环境，并可诱导神经干细胞向高浓度方向迁移，使得神经干细胞在梯度支架上细胞数量呈现梯度分布，而神经干细胞分化的神经元、星形胶质细胞也呈现梯度分布。
此外，本案发明人还参照前述方法，对基于CBD-BDNF融合表达因子(参考Tissueengineering:Part A,2009,15(10):2927-2935.)而构建的类似组织支架的细胞培养性能进行了测试，发现该支架亦可很好的诱导神经干细胞向神经元梯度分化。
综上可以看到，本发明采用改良的静电喷雾技术和基因改造活性因子，制备了复合梯度浓度分布生物活性因子的组织支架，梯度涂层的精度高，稳定性好，且可实现长时间的缓慢释放，维持时间长。并且，所获复合浓度梯度的生物活性因子组织支架可很好地模拟体内三维空间和梯度微环境，并获得良好细胞培养效果。
应当理解，上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合梯度浓度生物活性因子组织支架，其特征在于包括支架基体以及分布在所述支架基体上的生物活性因子涂层，并且在所述涂层平面上的至少两个不同区域内的生物活性因子的含量不同；
所述支架基体主要由胶原纤维形成，所述胶原纤维的直径为100～1000nm；
所述生物活性因子采用具有胶原特异结合区的融合表达因子，所述融合表达因子包含SDF1α或BDNF以及与SDF1α或BDNF连接的、具有胶原特异结合能力的多肽。
2.根据权利要求1所述的复合梯度浓度生物活性因子组织支架，其特征在于：所述支架基体采用胶原电纺纤维膜。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的复合梯度浓度生物活性因子组织支架，其特征在于：所述活性因子涂层中融合表达因子的含量为0.1ng～10ng/cm2。
4.权利要求1-3中任一项所述复合梯度浓度生物活性因子组织支架的制备方法，其特征在于包括：
提供支架基体；以及
采用静电喷雾工艺将生物活性因子溶液喷滴到所述支架基体表面，其中静电纺丝设备的喷射头的喷射方向与所述支架基体表面相垂直，喷射头与支架基体的距离为0.8cm～2cm，电压为3KV～5KV，流速为0.05mL/h～0.1mL/h，喷射头喷射出的液滴直径为450～550μm，并且在静电喷雾过程中使所述喷射头和支架基体至少在两个时段内沿第一方向和/或第二方向以不同速度相对移动，所述第一方向、第二方向均与所述支架基体表面平行，所述第一方向与第二方向相垂直，形成活性因子涂层，在所述涂层平面上的至少两个不同区域内的生物活性因子溶液的施加量不同。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述生物活性因子溶液采用浓度为0.2nM～20nM的融合表达因子水溶液。
6.权利要求1-3中任一项所述的复合梯度浓度生物活性因子组织支架于培养细胞中的用途，所述细胞包括CXCR4高表达的干细胞，所述干细胞包括神经干细胞和/或骨髓间充质干细胞。
7.一种细胞培养设备，其特征在于包括细胞培养池，所述细胞培养池内分布有权利要求1-3中任一项所述的复合梯度浓度生物活性因子组织支架。
8.权利要求7所述细胞培养设备的制备方法，其特征在于包括：
提供支架基体，并将所述支架基体固定在基材表面，所述支架基体主要由胶原纤维形成，所述胶原纤维的直径为100～1000nm，
在所述支架基体周围环绕设置具有设定高度的细胞池壁，从而在所述基材表面与细胞池壁之间围合形成细胞培养池，且使所述支架基体分布于细胞培养池内，
采用权利要求4-5中任一项所述方法在所述支架基体上形成所述活性因子涂层。
9.一种细胞培养方法，其特征在于包括：
将待培养的细胞接种在权利要求1-3中任一项所述的复合梯度浓度生物活性因子组织支架上，并在适合孵育所述细胞的环境中使所述细胞迁移和/或分化。
10.一种细胞培养装置，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的复合梯度浓度生物活性因子组织支架或权利要求7所述的细胞培养设备。
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