CN1453354A - 在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法。该方法采用预先将细胞生长因子与生物大分子溶液物理混合，然后利用“接枝－涂层”技术将混有细胞生长因子的生物大分子溶液稳定地涂层在生物材料表面，使细胞生长因子物理分散于生物大分子涂层中，制备出复合有细胞生长因子的活性生物材料。包埋于生物大分子涂层中的细胞生长因子能够稳定地存在于生物材料表面，并具有良好的生物活性。该方法操作简单、重复性好、无不良副作用，所制备的含有细胞生长因子的活性生物材料对细胞的生长和活性有良好的促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物生物材料与细胞生长因子的复合技术，具体说是关于在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法
背景技术
组织工程是指将种子细胞接种于可降解的支架中并将支架移植于体内帮助人体修复受损组织的现代治疗技术。对于制备组织工程支架的生物材料，除了要求其表面能够促进细胞的粘附以外，还要求其能够促进细胞的增殖和分化。实现这一目的的方法是制备复合有细胞生长因子的生物材料。细胞生长因子是一类通过细胞间信号传递影响细胞活动的多肽类信号分子。它对细胞具有促进或抑制其分裂增殖、迁移、分化和基因表达的作用。生长因子均为多肽类蛋白质大分子，其制备过程复杂，价格较昂贵，但很小浓度的生长因子就会对细胞的生理活动有重要的调节作用，因此生长因子被广泛用来调节细胞的生长过程。生长因子与生物材料的复合是组织工程领域中的重要的研究课题之一。复合有生长因子的生物活性材料可以更好地促进细胞的增殖，诱导细胞向特定的组织或器官分化。因此在组织工程技术中，该类生物活性材料是对通常的细胞相容性材料的发展与提高，可以更好地促细胞生长与分化，而且其作用的靶向性更为专一。将生长因子与生物材料复合如直接将细胞生长因子溶液涂层于生物材料表面，则材料表面的生长因子很容易流失；且在疏水性的聚合物材料表面生长因子水溶液也无法均匀铺展。采用化学接枝的方法将生长因子化学固定在材料表面，一方面需要较高浓度的生长因子溶液作为反应液从而使成本过高、生长因子的利用率降低，另一方面化学反应极易破坏生长因子的天然构象从而使其活性降低。
发明内容
本发明的目的是提供在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法，以制备复合有细胞生长因子的活性生物材料。
本发明的在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法，具体步骤为：
1)将聚合物生物材料浸入浓度为10～40％的过氧化氢溶液中，在紫外光辐照下氧化，氧化温度20～80℃，时间0.1～10小时，在材料表面引入大分子过氧化氢团，去离子水冲洗，除去游离的过氧化氢分子；
2)氮气保护下，将材料浸于浓度为0.1～50v％的丙烯酸、甲基丙烯酸或其它含羧基的乙烯基单体的溶液中，在亚铁离子存在下，引发单体在材料表面的接枝聚合反应，亚铁离子的浓度为0.0001～0.01摩尔/L，反应温度20～60℃，时间20～80分钟，反应后去离子水洗涤；
3)将材料浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，在0～40℃温度下，反应1～24小时，使材料表面的羧基活化；
4)将细胞生长因子与浓度为1～100mg/ml的生物大分子溶液物理混合，其中细胞生长因子的含量为1μg-10mg/ml；
5)将步骤(3)制备的材料取出，浸入步骤(4)制备的混合有细胞生长因子的生物大分子溶液中，使材料表面活化后的羧基与生物大分子中的氨基发生缩合反应，反应时间1～24小时，反应后将材料取出后直接干燥。
本发明中的聚合物生物材料主要是但不限于聚乳酸，可以采用如聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)等常用聚合物生物材料。聚合物生物材料的形态包括二维的平面膜和三维的多孔支架。
所说的生物大分子包括明胶、胶原、壳聚糖、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺等含有氨基的生物大分子。
所说的细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL)等。
本发明的方法操作简单、重复性好、无不良副作用，该方法在材料表面引入的细胞生长因子被物理包埋于生物大分子涂层中，使生长因子受到了生物大分子的保护，其天然构像得以维持，因而能够随生物大分子涂层稳定地存在于生物材料表面，并具有较高的生物活性，可提高生长因子的利用效率，同时由于包埋在生物大分子涂层中的生长因子向材料表面以外的释放需要穿过生物大分子涂层的阻碍，因此具有缓慢释放的效果。
附图说明
图1软骨细胞在未改性的PLLA膜、胶原涂层的PLLA膜、复合有BMP的PLLA膜以及复合有bFGF的PLLA膜表面的MTT活性随培养时间的变化曲线。接种密度60000/孔，24孔培养板。
图2a软骨细胞在复合有BMP的PLLA膜表面的光学显微镜照片。接种密度40000/cm2，培养时间2天，苏木精染色。
图2b软骨细胞在复合有bFGF的PLLA膜表面的光学显微镜照片。接种密度40000/cm2。培养时间2天，苏木精染色。
图3软骨细胞在未改性的PLLA多孔支架、胶原涂层的PLLA多孔支架、复合有BMP的PLLA多孔支架以及复合有bFGF的PLLA多孔支架中的MTT活性。接种密度600×104/ml。
图4a软骨细胞在复合有BMP的PLLA多孔支架中的激光共聚焦显微镜照片。接种密度600×104/ml，培养时间2星期，FDA染色。
图4b软骨细胞在复合有bFGF的PLLA多孔支架中的激光共聚焦显微镜照片。接种密度600×104/ml，培养时间2星期，FDA染色。
具体实施方式
通过下述实施例可更好地理解本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
骨形态发生蛋白(BMP)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在聚-L-乳酸(PLLA)平面膜表面的引入。
将BMP或bFGF与胶原/乙酸溶液(pH＜4)均匀混合，得到了含有BMP或bFGF的胶原溶液，其中胶原溶液浓度为2.5mg/ml，BMP和bFGF的浓度分别为0.3mg/ml和900单位/ml。
将PLLA平面膜浸于30％的过氧化氢溶液中，在250w的紫外灯照射下氧化1小时，氧化温度为50℃。去离子水清洗以除去游离的过氧化氢。在氮气保护下，将光氧化后的PLLA平面膜浸于浓度为5v％的甲基丙烯酸溶液中(含有0.0015摩尔/L的硫酸亚铁胺)，在30℃下引发甲基丙烯酸在PLLA膜表面的接枝聚合反应，反应时间1小时，从而在材料表面引入羧基。将PLLA膜浸于10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，反应温度为4℃，反应时间为4小时，反应过程中材料表面的羧基被活化。然后将PLLA膜浸入上述含有BMP或bFGF的胶原/乙酸溶液中，4℃下反应24小时。反应后将PLLA膜从胶原溶液中取出，并保留物理涂附在材料表面的胶原溶液，直接干燥，在PLLA膜表面得到均匀稳定的并含有BMP或bFGF的胶原涂层。
图1为含有BMP或bFGF的PLLA平面膜表面软骨细胞的MTT活性，由图可看出引入细胞生长因子以后的PLLA膜表面软骨细胞的MTT活性与空白对照相比明显提高。图2a、图2b分别为软骨细胞在含有BMP或bFGF的PLLA膜表面的光学显微镜照片，由图可见活性PLLA膜表面的软骨细胞分布均匀，铺展良好。
实施例2
骨形态发生蛋白(BMP)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在PLLA多孔支架中的引入。
将BMP或bFGF与胶原/乙酸溶液(pH＜4)溶液混合均匀，得到了含有BMP或bFGF的胶原溶液，其中胶原溶液浓度为2.5mg/ml，BMP和bFGF的浓度分别为0.3mg/ml和900单位/ml。
将PLLA多孔支架浸于30％的过氧化氢溶液中，通过抽真空的方法使支架中的空气放出，然后恢复压力将过氧化氢溶液压入支架内部，在250w的紫外灯照射下氧化1小时，氧化为温度50℃。通过离心的方法将支架中的过氧化氢溶液去除。将去离子水压入支架内部，然后离心去除，反复多次以清洗多孔支架中的过氧化氢。在氮气保护下，将光氧化后的PLLA支架浸于浓度为10v％的甲基丙烯酸溶液中(含有0.0015摩尔/L的硫酸亚铁胺)，将甲基丙烯酸溶液压入多孔支架内部，在30℃下引发甲基丙烯酸在PLLA多孔支架内部表面的接枝聚合反应，反应时间1小时，从而在材料表面引入羧基。将去离子水压入支架内部，然后离心去除，反复多次以清洗多孔支架中未反应的甲基丙烯酸单体。将PLLA多孔支架浸于10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，并将液体压入支架内部。反应温度为4℃，反应时间为4小时，反应过程中材料表面的羧基被活化。离心去除多孔支架中的EDAC溶液，将多孔支架浸入上述含有BMP或bFGF的胶原/乙酸溶液中，并将液体压入支架内部，4℃下反应24小时。反应后将PLLA多孔支架从胶原溶液中取出，干燥，在PLLA多孔支架内部得到均匀稳定的且含有BMP或bFGF的胶原涂层，从而制备了含有细胞生长因子的活性多孔支架。
图3为含有细胞生长因子的PLLA多孔支架内部的软骨细胞的MTT活性，由图可见引入细胞生长因子以后支架内部软骨细胞的活性明显提高。激光共聚焦显微镜照片显示(图4a、图4b)，含有细胞生长因子的PLLA支架内部的软骨细胞分布均匀，铺展良好。上述结果表明引入细胞生长因子BMP或bFGF的PLLA多孔支架材料具有优良的细胞相容性。
Claims (4)
1.在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法，包括以下步骤：
1)将聚合物生物材料浸入浓度为10～40％的过氧化氢溶液中，在紫外光辐照下氧化，氧化温度20～80℃，时间0.1～10小时，在材料表面引入大分子过氧化氢团，去离子水冲洗，除去游离的过氧化氢分子；
2)氮气保护下，将材料浸于浓度为0.1～50v％的丙烯酸、甲基丙烯酸或其它含羧基的乙烯基单体的溶液中，在亚铁离子存在下，引发单体在材料表面的接枝聚合反应，亚铁离子的浓度为0.0001～0.01摩尔/L，反应温度20～60℃，时间20～80分钟，反应后去离子水洗涤；
3)将材料浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，在0～40℃温度下，反应1～24小时，使材料表面的羧基活化；
4)将细胞生长因子与浓度为1～100mg/ml的生物大分子溶液物理混合，其中细胞生长因子的含量为1μg-10mg/ml；
5)将步骤(3)制备的材料取出，浸入步骤(4)制备的混合有细胞生长因子的生物大分子溶液中，使材料表面活化后的羧基与生物大分子中的氨基发生缩合反应，反应时间1～24小时，反应后将材料取出后直接干燥。
2.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法，其特征是所说的聚合物生物材料包括聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)等聚合物生物材料。
3.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法，其特征是所说的生物大分子包括明胶、胶原、壳聚糖、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺等含有氨基的生物大分子。
4.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面引入细胞生长因子的方法，其特征是所说的细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL)等。
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