KR102057925B1

KR102057925B1 - 다기능성 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102057925B1
Application number: KR1020170158417A
Authority: KR
Inventors: 고원건; 김은경; 조강희; 임한휘; 공혜연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2019-12-20
Also published as: KR20190060326A

Abstract

본 발명은 3차원의 생물학적 분석 시스템을 제공할 수 있는 다기능성 나노섬유 스캐폴드에 관한 것으로, 본 발명에 따른 스캐폴드는 정렬된 나노섬유 구조를 통해 세포가 자라는 표면에 물리적 배향성을 제공하고, 금속 증착을 통해 스캐폴드 표면에 전도성을 부여하여 보다 효과적인 세포 및 조직 분화를 이룰 수 있으며, 또한 생화학적 자극 요인인 성장인자 등의 방출물질을 하이드로젤 내부에 탑재함으로써 세포 및 조직 분화를 더욱 촉진하는 다중 자극 제공이 가능한 하나의 스캐폴드를 제공할 수 있다.

Description

다기능성 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조방법{Multifunctional nanofiber scaffolds and preparation method thereof}

본 발명은 3차원의 생물학적 분석 시스템을 제공할 수 있는 다기능성 나노섬유 스캐폴드에 관한 것이다.

심근조직, 신경조직 등에 큰 손상을 입게 될 경우 자체적인 치유가 일어나지 않으며 의학적 방안으로도 결손부위의 회복이 어렵다. 이러한 결손부위의 회복을 위해 조직공학적 접근으로 심근세포 및 신경세포를 통한 조직의 형성이나 줄기세포의 분화가 연구되고 있다.

상기 조직 형성 및 세포 분화에는 실제 심근 및 신경조직의 환경 및 생체 내부와 유사한 환경 제공하는 것이 효과적이라고 알려져 있는데, 실제 심근 및 신경조직의 경우 배향성을 가지는 정렬된 조직으로 구성되어 있고 이러한 정렬된 조직을 통해 심근의 박동 및 신호의 전달이 이루어지게 된다. 또한 심근 및 신경조직은 인체 내에서 특수하게 전도성이 있는 환경에서 존재하여 전기적 신호를 바탕으로 심장을 구성하는 각 심근조직이 동시에 박동하며 신경조직 간 신호 전달도 전기적인 방식으로 이루어진다. 이러한 배향성, 전도성을 지닌 실제 조직 특성에 따라 유사한 환경을 제공할 때 심근 및 신경조직의 회복을 보다 증진시킬 수 있다.

한편 성장인자는 생체 내에서 세포에 특별한 자극을 제공하는 물질로 생체 환경에서 발생하는 단백질이다. 이러한 성장인자는 세포에 화학적 자극을 제공하여 조직의 형성 및 분화를 촉진한다. 조직 형성 및 세포 분화에 주요한 영향을 미치는 요소들인 배향성, 전도성, 성장인자 제공을 각각 독립적으로 수행하는 연구는 많이 진행되어 왔다. 그러나, 실제 생체 내 심근조직 및 신경조직의 환경을 완벽히 모사한다고 할 수 없으며, 배향성, 전도성과 함께 세포에 화학적 자극을 제공하는 성장인자의 방출기능이 하나의 스캐폴드 내에서 이루어지는 것은 조직공학적으로 매우 우수한 스캐폴드로 예상되지만 현재까지 제작된 사례는 전무한 상황이다.

따라서, 보다 나은 심근 및 신경 조직 회복을 위하여, 배향성, 전도성 및 성장인자 방출 기능을 모두 복합적으로 수행할 수 있는 스캐폴드의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 배향성, 전도성 및 성장인자 방출 기능을 모두 복합적으로 수행할 수 있는 하나의 스캐폴드를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 배향성을 갖는 나노섬유; 및 3차원 망상 구조의 하이드로젤을 포함하며, 상기 나노섬유는 금속이 증착된 형태이고, 상기 하이드로젤은 방출물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드 박막을 제공한다.

또한 본 발명은 생체적합성 고분자 용액을 전기방사법에 의해 배향성을 갖는 나노섬유로 제조하는 단계; 상기 제조된 나노섬유 상에 금속을 증착하는 단계; 방출물질을 포함하는 하이드로젤 전구용액을 1차 가교하는 단계; 및 상기 금속이 증착된 나노섬유를 1차 가교된 하이드로젤 전구용액 상에서 2차 가교하는 단계를 포함하는 스캐폴드 박막의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 스캐폴드 박막을 하나 이상 포함하는 마이크로어레이 및 상기 스캐폴드 박막을 하나 이상 포함하는 바이오센서를 제공한다.

본 발명에 따른 스캐폴드는 정렬된 나노섬유 구조를 통해 세포가 자라는 표면에 물리적 배향성을 제공하고, 이에 따라 배향된 세포 및 조직을 형성하며 금속 증착을 통해 스캐폴드 표면에 전도성을 부여, 실제 조직과 유사한 전기적 특성으로 보다 효과적인 세포 및 조직 분화를 이룰 수 있다. 또한 생화학적 자극 요인인 성장인자 등의 방출물질을 하이드로젤 내부에 탑재함으로써 확산을 통한 성장인자의 서방형 방출 기능을 가져 세포 및 조직에 지속적인 화학적 자극을 제공, 세포 및 조직 분화를 촉진할 수 있다. 이러한 다중 자극 제공이 하나의 스캐폴드 내에서 동시에 일어나 복합적인 효과를 얻을 수 있으며 간단한 제조과정을 가진다. 제작된 스캐폴드는 결손부위를 회복하기 위한 심장 패치 및 신경 그래프트 등으로 적용이 가능하다.

도 1은 실시예에 따른 배향성을 가진 나노섬유를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 실시예에 따라 제조된 배향성을 가진 나노섬유의 SEM사진이다.
도 3은 실시예에 따라 제조된 금이 증착된 나노섬유의 SEM 사진이다.
도 4는 실시예에 따른 스캐폴드 박막을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 5는 실시예에 따라 제조된 스캐폴드 박막의 SEM사진이다.
도 6은 실시예예 따라 제조된 스캐폴드에서의 세포배양을 수행한 결과이다.
도 7은 실시예에 따라 제조된 스캐폴드 박막의 성장 인자 방출거동을 측정한 결과이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용할 수 있지만, 구성요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 스캐폴드를 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 스캐폴드는 배향성을 지니며 전도성 표면을 가지는 나노섬유가 방출물질을 포함하는 하이드로젤 위에 결합되어 다중 자극 제공이 가능한 이점이 있다.

이러한 본 발명에 따른 스캐폴드는, 배향성을 갖는 나노섬유; 및 3차원 망상 구조의 하이드로젤을 포함하며, 상기 나노섬유는 금속이 증착된 형태이고, 상기 하이드로젤은 방출물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 나노섬유의 종류는 세포와 같은 생체물질을 고정시키며 독성을 띄지 않는 생체적합성 고분자라면 특별히 제한하지 않으나, 구체적으로 예를 들면 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리톨산(PGA), 폴리[(락틱-co-글리콜산)](PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리에스테르우레탄(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리(에틸렌-co-비닐 알코올)(PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 하이드로젤은 통상의 고분자의 라디칼 중합을 통해 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 실시에서는 광중합 방식을 통한 하이드로젤의 형성이 진행되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 하이드로젤의 종류는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리아크릴아미드(PAAM), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프롤락톤(PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴리아크릴아세테이트 및 폴리비닐클로라이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것일 수 있다.

상기 금속은 고 전도성이면서 생체에 위해를 가하지 않는 종류라면 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 알루미늄(Al) 및 철(Fe) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다. 또한, 상기 금속은 증발 증착법(evaporative deposition), 스퍼터 증착법(sputter deposition), 전자빔 물리적 기상 증착법(electron beam physical vapor deposition), 펄스 레이저 증착법(pulsed laser deposition), 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition) 및 습식 코팅(wet coating) 중 하나 이상의 방법으로 증착된 것일 수 있으며, 이외에도 고분자 섬유에 금속의 증착을 일으킬 수 있는 다양한 방법에 의해 증착된 것일 수 있다. 증착된 금속은 세포 및 조직에 전도성이 있는 환경을 제공하여 전기적 자극요소로 사용될 수 있다.

상기 방출물질은 심근 조직 분화에 영향을 주는 물질이라면, 특별히 제한하지 않으며, 이러한 물질로는 화학적 약물, 단백질, 특히 성장인자 등이 있다. 구체적으로 예를 들면, 상기 성장인자는 방출물질은 5-아자시티딘, 비오틴, 판토테네이트, 인슐린, 덱사메타손, 아이소부틸메틸잔틴, 인도메타신, 트리코스타틴 A, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 리놀레산, 아스코르브산, 보바인세럼알부민, 5-브로모-2'데옥시우리딘, β-글리세로인산, 자가분비 운동성 인자(Autocrine motility factor), 뼈 형성 단백질(Bone morphogenetic proteins, BMPs), 표피생장인자(Epidermal growth factor, EGF), 적혈구 생성 촉진 인자(Erythtopoietin, EPO), Fibroblast growth factor(FGF), 섬유아세포 증식인자(Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), 과립구 마크로파지콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 성장 분화 인자(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 간세포암 유래 성장인자(Hepatoma derived growth factor, HDGF), 인슐린유사성장인자Insulin-like growth factor, IGF), 세포분열자극인자(migration-stimulating factor), 마이오스타틴(Myostatin, GDF-8), 신경성장인자(Nerve growth factor, NGF), and other 뉴로트로핀(neutrophins), 혈소판유래증식인자(Platelet derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), 전환 성장 인자 알파(Transforming growth factor alpha, TGF-α), 전환 성장 인자 베타(Transforming growth factor beta, TGF-β), 혈소판 표피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PGF) 및 Fetal bovine somatotrophin(FBS)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 방출물질 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것일 수 있다. 이러한 방출물질은 화학적 및 생화학적 자극 요소로 세포 및 조직의 활성과 분화를 유도할 수 있다.

또한 실험에 영향을 줄 수 있는 각종 생체물질을 하이드로젤 내에 함유시킬 수 있다. 이러한 방출물질은 화학적 및 생화학적 자극 요소로 세포 및 조직의 활성과 분화를 유도할 수 있다.

본 발명의 스캐폴드 박막은 생체물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기'생체물질'이란 분석대상물질을 선택적으로 인식하여 생물학적 상호작용 및 인식반응을 일으켜 신호를 발생시키는 역할을 하는 생물유래성 물질을 의미한다. 한 구체예에서, 생체분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 세포, 조직, 단백질, 지질, 탄수화물 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 생체분자의 하나로 예시한 단백질은 분석대상물질과 반응할 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 제한되지 않으나, 분석대상물질의 종류에 따라 달라질 수 있다. 한 구체예에서, 상기 단백질은 효소, 항원 또는 항체일 수 있다. 예를 들어 분석대상물질이 당이나 지질인 경우 상기 단백질은 이들과 반응할 수 있는 효소일 수 있으며, 분석대상물질이 항체 또는 항원인 경우 상기 단백질은 이들과 결합할 수 있는 항원 또는 항체일 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 스캐폴드 박막의 제조방법을 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 스캐폴드 박막의 제조방법은, 생체적합성 고분자 용액을 전기방사법에 의해 배향성을 갖는 나노섬유로 제조하는 단계; 상기 제조된 나노섬유 상에 금속을 증착하는 단계; 방출물질을 포함하는 하이드로젤 전구용액을 1차 가교하는 단계; 및 상기 금속이 증착된 나노섬유를 1차 가교된 하이드로젤 전구용액 상에서 2차 가교하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 나노섬유 층을 형성하기 위해서 전기방사법을 사용한다. 전기방사를 통해 다양한 고분자 물질의 3차원 섬유 구조체를 형성할 수 있으며, 세포의 부착이 용이하고 회전식 집전판의 사용을 통해 배향성을 가진 섬유를 형성하여 나노 및 마이크로 단위의 배향된 표면을 제공할 수 있다. 특히 나노 및 마이크로 단위의 섬유는 세포에게 실제 인체 내와 유사한 3차원적인 구조로 인식되어 생체를 보다 잘 모사할 수 있다.

구체적으로 예를 들어, 먼저 나노섬유를 구성할 물질을 적절한 용매에 녹여 주사기에 넣고, 주사기 내의 용액을 일정한 속도로 배출시키는 주입기에 장착시킨다. 용액은 고전압이 걸리는 금속으로 된 가느다란 원통형 바늘로 주입되며 접지가 이루어진 바닥으로 전기적 힘에 의해 용액이 잡아당겨지고 이 때 용매는 증발되며 나노섬유가 바닥에 쌓이게 된다. 일정량 쌓인 나노섬유를 적정 크기로 잘라 사용할 수 있다. 여기서 접지된 바닥을 접지된 회전식 막대로 대체하여, 일정 속도로 막대를 회전시키면서 전기방사를 진행할 경우 전기적 힘에 의해 방출되는 섬유가 막대에 쌓이는데 막대의 회전에 의해 쌓이는 모양이 회전방향으로 직선형을 띄며 고회전 시 나노섬유가 지속적으로 회전방향을 따라 평행하게 형성되게 된다. 일정량 쌓인 나노섬유는 일렬로 정렬된 평행한 직선 형태를 띠면서 평행 정도는 접지된 막대의 회전 속도에 의해 조절이 가능하다. 여기서 섬유의 밀도는 섬유가 적층되는 기판의 종류에 의해 결정되며, 전기가 잘 통하는 기판 위에서는 고밀도, 전도도가 낮은 기판에서는 저밀도로 적층된다. 이때 기판으로는 스테인리스스틸, 금속, 합금, 유리, 실리콘, 종이 등의 기판을 사용하여 실시가 가능하다. 평행한 나노섬유 층은 접촉하는 세포 및 조직에게 물리적인 배향성을 제공하여 그 방향을 따라 배향된 세포 및 조직을 형성하고 물리적 자극요소로 사용될 수 있다.

이러한 배향된 나노섬유체에 금속을 증착시키게 되는데, 여기에 사용될 수 있는 금속으로는 금, 은 등이 있으며 그 외에도 고 전도성이면서 생체에 위해를 가하지 않는 종류면 모두 가능하다. 예를 들면, 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 알루미늄(Al) 및 철(Fe) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다. 또한, 상기 금속은 증발 증착법(evaporative deposition), 스퍼터 증착법(sputter deposition), 전자빔 물리적 기상 증착법(electron beam physical vapor deposition), 펄스 레이저 증착법(pulsed laser deposition), 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition) 및 습식 코팅(wet coating) 중 하나 이상의 방법으로 증착된 것일 수 있으며, 이외에도 고분자 섬유에 금속의 증착을 일으킬 수 있는 다양한 방법에 의해 증착된 것일 수 있다. 증착된 금속은 세포 및 조직에 전도성이 있는 환경을 제공하여 전기적 자극요소로 사용될 수 있다.

상기 금속이 증착된 나노섬유는 방출물질이 탑재된 방출형 하이드로젤과 결합되는데, 하이드로젤은 통상의 고분자의 라디칼 중합을 통해 합성될 수 있다. 상기 하이드로젤은 높은 수분함량을 가진 3차원 고분자 망상구조를 가진 탄성체로써 수분을 장시간 함유할 수 있으며 작은 물질의 투과가 가능하다.

예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 광중합 방식을 통한 하이드로젤의 형성이 진행되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 광가교 방식의 하이드로젤 전구체 용액을 가교할 때 광원에 노출시키는 시간의 조절로 경화 정도를 조절할 수 있고, 짧은 1차 광가교를 통해 하이드로젤을 형성한 후 그 위에 전기방사 나노섬유를 얹어 2차 광가교를 진행할 경우, 나노섬유와 하이드로젤이 합쳐진 형태로 경화가 진행된다. 이 때 성장인자를 함유한 하이드로젤 전구체 용액으로 하이드로젤을 형성하면 성장인자가 3차원 망상 구조의 하이드로젤 내부에 탑재되게 되며, 높은 수분 함유량으로 인해 단백질 변성을 최소화 한 상태에서 서서히 방출되어 세포에 자극을 제공하게 된다.

구체적으로, 말단에 중합되어 사슬이 이어지는 것이 가능한 작용기가 달린 친수성의 하이드로젤 단량체와 광중합개시제로 구성된 하이드로젤 전구체 용액에 성장인자를 넣은 후 짧은 시간 자외선을 조사하여 하이드로젤 전구체 용액을 1차적으로 일부 가교시키고, 이러한 부분적으로 경화된 하이드로젤 위에 금속이 증착된 나노섬유를 얹고 한번 더 자외선을 조사하여 잔류 하이드로젤 전구체를 충분히 가교시키면 나노섬유에 스며든 전구체 용액과 아랫부분의 1차 가교 하이드로젤이 하나의 하이드로젤 형태로 결합되어 나노섬유가 하이드로젤에 고정된다.

상기 친수성 고분자는 전구용액 100중량부에 대하여 20 내지 80중량부로 포함될 수 있으며 하이드로젤의 수분함량이 50 내지 97%가 될 수 있어 생물질의 구조 및 활성을 유지시킬 수 있다. 또한 하이드로젤의 단량체 분자량 조절을 통하여 방출 거동을 조절할 수 있는데, 단량체의 분자량이 클수록 하이드로젤 내의 3차원 그물망 형태의 기공(pore)이 커지므로 내부에 담지된 물질을 빠르게 외부로 보낼 수 있으며 단량체의 분자량이 작을수록 물질의 방출을 느리게 유도할 수 있다.

상기 하이드로젤의 종류는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리아크릴아미드(PAAM), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프롤락톤(PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴리아크릴아세테이트 및 폴리비닐클로라이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것일 수 있다.

본 발명의 스캐폴드 박막은 상기된 바와 같이 나노섬유의 배향성을 통한 물리적 자극, 고전도성의 금속물질을 통한 전기적 자극, 그리고 생물질 탑재 및 방출제어를 통한 화학적 자극을 제공하는 기능의 부여에 따라, 다중 자극을 제공하는 효과적인 심근조직 및 신경조직 재생용 스캐폴드로써 활용이 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명의 스캐폴드 박막을 하나 이상 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명에서 마이크로어레이라 함은 고속 스크리닝 방법을 이용하여 다량의 생물학적 물질을 분석해 내는 복합적인 랩온어칩(lab-on-a-chip)을 의미한다. 일반적으로 마이크로어레이는 유리 기판 또는 실리콘 기판과 같은 고체 기판 상에 생체물질이 고정되어 있는 형태를 의미하나, 본 발명에서는 별도의 기판이 존재하지 않고 스캐폴드 박막만으로 구성된 경우도 포함한다. 본 발명의 스캐폴드 박막이 기판 상에 형성되는 경우, 기판으로는 유리 기판이나 실리콘 기판뿐만 아니라 유연성을 갖는 플라스틱 기판 또한 이용가능하다. 상기 마이크로어레이에는 다양한 생체물질이 고정되어 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로어레이는 세포 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이, 단백질마이크로어레이, 항체 마이크로어레이, 탄수화물 마이크로어레이, DNA 마이크로어레이 등을 모두 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 스캐폴드 박막을 하나 이상 포함하는 바이오센서를 제공한다. 바이오센서는 특정한 물질, 즉 분석대상물질에 대해 반응할 수 있는 생체물질과 생리화학적 탐지 물질이 결합하여 검체 내에 검색대상물질이 존재하는 경우 발생하는 생물학적 상호작용 또는 인식반응을 측정이나 정량이 보다 용이한 신호, 예컨대 전기적, 광학적, 자기적 신호 등으로 변환시킴으로써 검체 내의 분석대상물질의 존재나 양, 또는 활성을 탐지할 수 있는 장치를 의미한다. 여기에서 분석대상물질은 항원, 혈당, DNA와 같은 생체물질 뿐만 아니라 신약후보물질과 같은 일반적인 화학물질을 포함한다. 본 발명의 바이오센서에서는 이러한 분석대상 물질에 대해 반응할 수 있는 세포, 조직, 단백질, DNA 등의 생체물질이 3차원의 스캐폴드 박막 상의 특정 위치에 고정되어 있으므로, 특정 위치에서의 전기적 또는 광학적 신호를 탐지함으로써 생체 환경과 유사한 환경에서의 분석대상물질의 존재나 양, 또는 활성을 손쉽게 분석해 낼 수 있게 된다. 본 발명의 바이오센서는 바이오칩 또는 미세유체장치 등의 형태를 취할 수 있으며, 그에 따라 기판이나 미세유체채널 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 분석대상물질과 생체물질 간의 상호작용을 측정이 용이한 신호로 변화해 줄 수 있는 탐지 물질을 추가로 포함할 수 있다. 여기에서 탐지물질은 예를 들어, 상기 분석대상물질과 생체분자 간의 반응 산물과 반응하여 형광의 방출 또는 발색을 유도하거나 전기적 신호를 나타낼 수 있는 물질일 수 있다. 예를 들어, 분석대상물질의 독성을 탐지하고자 하는 경우 본 발명의 스캐폴드에 생체물질로서 여러 종류의 세포들을 고정하고, 특정 위치마다 분석대상물질을 처리한 후, 세포의 생존 여부를 살아있는 세포에만 부착되는 녹색형광을 띠는 DiOC18(3)과 죽은 세포에만 선택적으로 부착되는 붉은 형광을 띠는 프로피디움 아이오다이드를 탐지물질로 사용하여 특정 위치에서의 발색 현상을 분석함으로써 분석대상물질의 특정 세포에 대한 독성을 손쉽게 탐지할 수 있다. 유사한 방법으로, 분석대상물질에 대한 각기 다른 세포의 반응성을 탐지할 수 있게 된다.

이하, 실시예 및 도면를 통하여 상기 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 : 스캐폴드 박막 제조

(1) 배향성을 가진 나노섬유체 제작

폴리카프로락톤(PCL, Sigma-Aldrich) 1g을 Trifluoroethanol(TFE, Sigma-Aldrich) 5mL에 혼합한 후 80℃에서 12시간 두어 폴리카프로락톤을 완전히 녹였다. 그런 다음 전기방사법을 이용하기 위해 제조된 폴리카프로락톤 혼합 용액을 상온에서 식힌 후 10mL 주사기에 넣고 0.5mL/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 접지된 원통형의 스테인리스스틸 드럼을 1600rpm으로 회전시키고 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10kV의 전압을 흘려주었다. 이때, 전압 차이로 인해 접지된 스테인리스스틸 드럼으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 나노섬유는 드럼의 회전을 따라 집적되면서 배향성을 가지게 되며 반복적인 집적으로 인해 다량의 나노섬유가 정렬되어 형성되었다. 생성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃, 진공 상태에서 24시간 정도 두었다. 도 1은 전기방사법 및 회전식 집천판에 의해 배향성을 가진 나노섬유를 제조하는 과정을 보여주는 모식도이며, 도 2는 상기 과정으로 제조된 나노섬유의 SEM사진이다.

(2) 금 증착

상기 제조된 배향성을 가진 나노섬유에 전도성을 부여하기 위해 금속 증착기를 이용하여 금을 증착하였다. 상기 배향된 나노섬유를 유리 기판에 고정시킨 후 금속 증착기에 넣고 9.0x10^-6 토르로 감압한 후 텅스텐의 줄 발열로 금을 증발시킨 후 0.4-0.6Ås^-1의 속도로 총 14nm 만큼 금 입자를 증착시켰다. 도 3은 금이 증착된 나노섬유의 SEM 사진이다.

(3) 하이드로젤(분자량 3400 PEGDA)의 제조

하이드로젤을 형성하기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG, 분자량 3400, Sigma-Aldrich)을 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(PEGDA)로 개질하는 과정을 수행하였다. 먼저, PEG 10g을 테트라하이드로퓨란(THF, 덕산 100mL에 혼합한 후 60℃에서 30분간 섞어주어 완전히 녹인 후 아크릴로일클로라이드(Acryloyl Chloride, Merck)를 4ml 첨가하고 5시간 동안 반응을 진행하였다. 그런 다음 미반응 물질을 제거하기 위해 혼합용액을 12시간동안 4℃에서 석출시키고 상층액을 제거한 후 100mL의 THF를 다시 첨가하여 60℃에서 30분간 섞어주어 완전히 녹였다. 그런 다음 12시간동안 4℃에서 한번 더 석출시켜 상층액을 제거하고 진공상태에서 24시간 건조하여 분자량 3400 PEGDA를 얻어내었다. 분자량 3400 PEGDA 용액은 분자량 3400 PEGDA 0.5g을 0.5mL 증류수에 녹여 제조하였다.

(4) 스캐폴드 박막의 제작

광중합개시제인 2-하이드록시-2-메틸프로피오펜온(2-hydroxy-2-methylpropiophenone, HOMPP, Sigma-Aldrich) 50μL와 분자량 575 PEGDA 250μL, 분자량 3400 PEGDA 용액 750μL, 전환 성장 인자 베타 1(Transforming growth factor beta 1, TGF-β1, R&D Systems) 50ng을 혼합하여 하이드로젤 구조체 전구용액을 제조하였다. 하이드로젤을 형성하기 위해서 상기 하이드로젤 구조체 전구용액을 가로 1cm, 세로 1cm, 높이 1mm의 사각형 주형에 주입하고 365nm 파장을 가진 UV광을 18Wcm-2의 출력으로 1초 동안 조사하였다. UV에 조사된 전구용액은 가교결합이 일어나는데, 1초 조사를 통해 전구용액이 전부 가교되지 않아 일부 전구용액이 잔류하게 된다. 여기에 상기 제조된 나노섬유 층을 얹고 1초 동안 추가 UV조사하여 완전히 가교시켜 스캐폴드 박막을 제조하였다. 도 4는 하이드로젤을 1차 가교한 후 나노섬유와 결합 후 2차가교하는 과정을 개략적으로 보여주는 모식도이다. 도 5는 상기 과정으로 제조된 스캐폴드 박막의 SEM사진이다.

실험예 1: 스캐폴드 상에서의 세포 배양 실험

세포를 배양하기 위한 배지는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Sigma-Aldrich)에 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Sigma-Aldrich)와 항균/항진균성 용액(antibiotic/antimycotic solution, Sigma-Aldrich)을 혼합한 용액을 사용하였다. 1 x 10⁵ cells/ml의 비율로 세포가 포함된 용액 20μL를 스캐폴드 위쪽에 가했다. 온도는 37℃, 95%의 대기와 5%의 이산화탄소로 이루어진 배양기에서 배양하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었으며, 생존한 세포를 녹색 형광으로, 죽은 세포를 붉은 형광으로 염색하는 Live/Dead assay를 통해 확인한 결과, 대부분 녹색 형광으로 나타나 형성된 스캐폴드에서 세포의 배양이 잘 이루어짐을 확인하였다.

실험예 2: 스캐폴드 상에서의 성장 인자 방출거동 파악 실험

상기 실시예에서 제조된 스캐폴드의 성장 인자 방출거동을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저 제조된 스캐폴드 박막을 PBS용액 2mL에 담그고 37℃에서 보관하였다. 1일, 4일, 7일 및 14일차에서 각각 PBS를 포집하고 하이드로젤을 새 PBS용액 2mL에 담가 다시 37℃에서 보관하였다. 포집된 PBS용액을 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 방출된 전환 성장 인자 베타 1(TGF-β1)의 양을 측정하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7을 보면, 14일이 경과하여도 성장 인자의 방출이 원활히 진행됨을 확인할 수 있다.

Claims

배향성을 갖는 나노섬유; 및
3차원 망상 구조의 하이드로젤을 포함하며,
상기 나노섬유는 전도성 금속이 증착된 형태이고,
상기 하이드로젤은 내부에 방출물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드 박막.
제1항에 있어서,
상기 나노섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리톨산(PGA), 폴리[(락틱-co-글리콜산)](PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리에스테르우레탄(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리(에틸렌-co-비닐 알코올)(PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것인 스캐폴드 박막.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리아크릴아미드(PAAM), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프롤락톤(PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴리아크릴아세테이트 및 폴리비닐클로라이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것인 스캐폴드 박막.
제1항에 있어서,
상기 전도성 금속은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 알루미늄(Al) 및 철(Fe) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 스캐폴드 박막.
제1항에 있어서,
상기 방출물질은 5-아자시티딘, 비오틴, 판토테네이트, 인슐린, 덱사메타손, 아이소부틸메틸잔틴, 인도메타신, 트리코스타틴 A, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 리놀레산, 아스코르브산, 보바인세럼알부민, 5-브로모-2'데옥시우리딘, β-글리세로인산, 자가분비 운동성 인자, 뼈 형성 단백질(BMPs), 표피 생장 인자(EGF), 적혈구 생성 촉진 인자(EPO), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구 마크로파지콜로니 자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자(GDF9), 간세포 생장 인자(HGF), 간세포암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린유사 성장 인자(IGF), 세포분열 자극 인자, 마이오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀(neutrophins), 혈소판유래 증식 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 전환 성장 인자 알파(TGF-α), 전환 성장 인자 베타(TGF-β), 혈소판 표피 성장 인자(VEGF) 및 태반 성장 인자(PGF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 방출물질 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것인 스캐폴드 박막.
제1항에 있어서,
생체물질을 추가로 포함하는 스캐폴드 박막.
제6항에 있어서,
상기 생체물질은 세포, 조직, 단백질, 지질, 탄수화물 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 스캐폴드 박막.
생체적합성 고분자 용액을 전기방사법에 의해 배향성을 갖는 나노섬유로 제조하는 단계;
상기 제조된 나노섬유 상에 전도성 금속을 증착하는 단계;
방출물질을 포함하는 하이드로젤 전구용액을 1차 가교하는 단계; 및
상기 전도성 금속이 증착된 나노섬유를 1차 가교된 하이드로젤 전구용액 상에서 2차 가교하는 단계를 포함하는 스캐폴드 박막의 제조방법.
제8항에 있어서,
전도성 금속의 증착은 증발 증착법, 스퍼터 증착법, 전자빔 물리적 기상 증착법, 펄스 레이저 증착법, 화학적 기상 증착법 및 습식 코팅 중 하나 이상의 방법으로 증착하는 것을 특징으로하는 스캐폴드 박막의 제조방법.
제1항의 스캐폴드 박막을 하나 이상 포함하는 마이크로어레이.
제1항의 스캐폴드 박막을 하나 이상 포함하는 바이오센서.