KR101195867B1 - 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법 - Google Patents

스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방출제어가 가능한 미세패턴 된 나노섬유 스캐폴드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3차원적 나노섬유 스캐폴드 박막 상에 패터닝된 하이드로겔 구조로 인해 나노섬유에 포함된 방출물질의 방출거동이 조절되므로 생체 외에서 생체 내의 환경과 유사한 3차원 구조를 세포에게 제공하는 한편, 생리활성성분 혹은 화학물질을 일정 기간 동안 지속적으로 방출하여 보다 효율적이고 관리가 편한 세포배양으로 기초적인 세포생물학 연구뿐만 아니라 마이크로미터 크기로 세포들을 규칙적으로 배양해야 하는 조직공학, 초고속 다중 분석용 바이오센서 등에 이용이 가능하다.

Description

스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법{Method for controlling release behavior of material from micropatterned nanofiber scaffold}
본 발명은 방출제어가 가능한 미세패턴 된 나노섬유 스캐폴드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3차원적 나노섬유 스캐폴드 박막 상에 패터닝된 하이드로겔 구조로 인해 나노섬유에 포함된 방출물질의 방출거동이 조절되므로 생물학적 분석 시스템과 조직공학에 좀 더 유용하게 이용될 수 있는 방출제어가 가능한 미세패턴 된 나노섬유 스캐폴드에 관한 것이다.
바이오센서의 제작이나 검진을 위한 생물학적 분석에서 생물분자의 적절한 배열은 필수적이며, 보다 효율적인 생물학적 분석을 가능하게 한다. 단백질이나 세포의 패턴 형성은 특정 위치에서의 단백질이나 세포의 반응을 관찰할 수 있으며, 다른 단백질이나 세포들과의 불필요한 교란 없이 실시간으로 관찰할 수 있는 장점을 갖는다.
이러한 생물분자의 패턴은 여러 미세가공기술을 이용하여 형성하는데, 포토리소그래피와 소프트리소그래피가 주로 이용된다. 이러한 방법을 이용하면 비교적 간단하고 간편한 공정을 통해서 패턴을 얻을 수 있다. 포토리소그래피는 단백질과 세포를 패터닝 하는데 매우 널리 이용되고 있는 방법이다. 주로 UV를 이용하는 방법으로 빛에 반응하는 광 개시반응을 기본 원리로 빛에 노출된 영역은 광 개시반응이 일어나고, 빛에 노출되지 않은 영역은 광 개시반응이 일어나지 않는 것을 이용한다(J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4432). 생체 응용범위에서 포토리소그래피에 주로 이용되는 물질로는 친수성 고분자를 이용하는데, 친수성 고분자로 생성된 하이드로겔은 높은 수분함량과 생체적합성으로 인해 생물학적으로 응용되고 있다(Adv. Mater. 2006, 18, 1345). 고분자 하이드로겔은 수분함량이 높으며 생체적합성이 뛰어나다는 점에서 효소나 세포 등의 바이오 물질들을 고정하는데 널리 사용되고 있다. 특히 폴리에틸렌글리콜 하이드로겔은 수중에 있을 때, 단백질과 같은 다른 물질이 부착하는 것을 막는 성질을 가지고 있기 때문에 단백질이나 세포 등의 물질의 부착을 막는 물질로 사용된다. 또한 친수성 고분자와 광중합개시제를 혼합한 용액을 UV로 조사하는 포토리소그래피의 간단한 과정을 통해서 하이드로겔을 만들어 낼 수 있으며, UV의 선택적으로 조사할 수 있는 포토마스크의 모양을 통해, 우리가 원하는 형태로 제조가 가능하다는 장점을 가지고 있다(Langmuir 2001, 17, 5440). 또한 하이드로겔 내부에 단백질이나 세포를 고정하는 방법도 사용될 수 있다(US2005/0169962). 하이드로겔 내부에 세포를 고정할 경우, 실제 몸에서와 비슷하게 3차원 배양이 가능하여, 세포로부터 보다 정확한 정보를 얻을 수 있으며, 효소를 고정할 경우는 환경적인 요인으로부터 효소의 변성을 방지하고 기질과의 반응을 증가시켜 강한 시그널을 측정할 수 있다는 장점들을 가지고 있다(Langmuir 2004, 20. 270).
생물학적 분석에서 생물분자의 패턴 형성도 중요하지만 효율을 높이고, 보다 발전된 형태로 만들기 위해서는 3차원적 구조를 필요로 한다. 하지만, 포토리소그래피나 소프트리소그래피를 이용한 대부분의 생물분자 패터닝은 2차원의 기판 표면 위에 여러 생물분자들을 고정화 시키고 있다. 생물분자들이 실제 동물 신체 내에서는 2차원 표면이 아닌 단백질, 다당류 등을 포함한 세포외기질(extracellular matrix, ECM)로 구성된 3차원 구조의 하이드로겔 내부에 고정되어 있으므로, 2차원 시스템에 고정된 생물분자들은 실제와는 다른 부자연스러운 환경에 존재하게 된다. 따라서 2차원 시스템에 고정된 생물분자들의 신약과 같은 개체대상물질과의 반응은 실제 신체 내에 존재하는 단백질이나 세포들의 반응과는 크게 다를 수 있어 부정확한 정보를 제공해 주게 될 가능성이 매우 높아진다. 이와 같은 2차원 시스템의 단점을 보완하고자 최근 들어 많은 연구자들이 3차원 시스템을 개발하고 있다.
3차원 구조를 형성하는 방법 중 전기방사법은 간단하여 다목적으로 사용되는 방법으로 연속적인 섬유를 형성하는데 사용된다(Advanced Materials 2004, 16, 1151). 이 방법으로 생성된 나노섬유 스캐폴드는 부피당 넓은 표면적 비를 가지며, 인체 내의 세포외기질과 유사한 구조를 가지므로 인체의 조직을 대체하는데 적당하다(Journal of Biomedical Materials Research 2002, 60, 613). 또한, 이러한 구조는 세포간의 상호작용(Biomaterials 2006, 27, 3136)과 세포의 분화를 증진시키기도 한다(Biomaterials 2008, 29, 3357).
또한, 바이오칩 측면에서 살펴보면 분석에 이르기 전까지 세포를 3차원 구조에서 배양하는 것이 필수적인데, 이를 위해서는 세포가 요구하는 영양분을 공급해주는 것이 필요하다. 따라서 일반적으로 배지의 교환으로 영양분을 공급해주는데, 이러한 배지의 교환의 수를 줄이거나 없애면 보다 효율적인 세포배양이 될 것이며, 일시적인 영양분의 과다공급보다는 일정량의 지속공급이 세포 배양 측면에서 유리하기 때문에 전기방사된 섬유 내에 영양분 등을 함유시키는 방법을 이용하여 지속적 영양분 공급을 하기도 한다.
조직공학적 측면에서 살펴보면, 인체 내 환경에서 요구하는 패터닝된 3차원적 구조에서 배양된 세포를 삽입하면 일정 기간 동안은 영양을 공급받을 수 있는 혈관이 생성되지 않기 때문에 외부에서 영양을 공급해야 세포들이 계속해서 역할을 다 할 수 있다. 따라서 영양을 공급하기 위해서는 외부에서 다시 인체로 영양분을 인위적으로 공급해야 하지만 스캐폴드 내에서 영양분을 일정 기간 동안 방출시킨다면 이러한 어려움을 해결할 수 있다. 이를 위해, 스캐폴드에 영양분뿐만 아니라 치료제 등의 약물을 넣어 방출시키거나(US2006/0204441), 전기방사된 섬유를 자체적으로 방출제어 하기 위해 공축 전기방사(Coaxial electrospinning)한다(US2010/0055154).
그러나, 스캐폴드에 포함된 방출물질은 빠른 속도로 방출되어 여전히 외부에서 추가적인 양분 공급을 요구하며, 공축 전기방사는 공정이 복잡하고, 대량 생산이 어려운 단점이 있다.
본 발명의 목적은 3차원적 생물학적 분석 시스템에서 고정된 세포에 일정기간 지속적으로 방출물질을 제공할 수 있는 방출제어가 가능한 미세패턴 된 나노섬유 스캐폴드 박막을 제조함에 있어 나노섬유와 하이드로겔의 특성을 조절하여 상기 방출물질의 방출거동을 제어하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 방출물질을 포함한 나노섬유로 형성된 3차원적 스캐폴드 상에 하이드로겔을 소정의 형태로 패터닝함에 있어서,
상기 하이드로겔 내 3차원 그물망 형태의 포어 크기를 제어하는 단계를 포함하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법을 제공한다.
본 발명은 대량생산에 용이한 일반적인 전기방사를 이용하여 생성된 나노섬유 상에 고분자 하이드로겔이 패터닝 되어 있어 하이드로겔 내의 3차원 그물망 형태의 포어 크기를 조절함으로써 방출물질의 방출거동을 간단하게 제어할 수 있다.
또한, 생체 내 환경과 유사한 3차원 구조를 제공하므로 전기방사된 나노섬유를 바로 이식하거나, 세포를 배양한 후 이식하는 경우 일반적으로 일정기간 동안은 영양을 공급받을 수 없으나, 나노섬유에 포함된 방출물질(영양분)이 하이드로겔을 통해 서서히 일정기간 동안 방출되어 세포에 제공하므로 외부에서 별도로 영양분을 공급해주지 않아도 되는 장점이 있다.
따라서 본 발명의 방출물질이 함유된 패터닝된 스캐폴드는 기초적인 세포생물학 연구뿐만 아니라 바이오센서, 조직공학 등에 이용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 패터닝된 스캐폴드 박막의 제조공정을 간략히 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 패터닝된 스캐폴드 박막의 거시적 모양을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 스캐폴드 내에서 세포들이 3차원의 형태로 배양되는 형태를 나타내는 공초점현미경 사진도이다.
도 4는 본 발명의 방출물질을 포함한 스캐폴드에서의 방출거동을 예시적으로 도시한 공정도이다.
도 5는 본 발명의 방출물질을 포함한 스캐폴드를 PEG 하이드로겔로 패터닝한 경우, PEGDA 분자량에 따른 방출 거동 조절 능력을 도시한 그래프이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 방출물질을 포함한 나노섬유로 형성된 3차원적 스캐폴드 상에 하이드로겔을 소정의 형태로 패터닝함에 있어서,
상기 하이드로겔 내 3차원 그물망 형태의 포어 크기를 제어하는 단계를 포함하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법에 관한 것이다.
본 발명의 스캐폴드 박막에 있어서, 3차원적 스캐폴드는 다수의 포어를 형성하고 있는 3차원적 오픈 셀 매트릭스로 하이드로겔에 의해 패턴화되며, 하이드로겔은 3차원적 스캐폴드의 구획을 나누고, 나노섬유에서 방출된 방출물질이 거쳐 지나가도록 한다.
따라서, 나노섬유에 함유된 방출물질은 상기 3차원적 오픈 셀 매트릭스의 포어를 통해 확산되고, 하이드로겔 내의 3차원 그물망 형태의 포어로 방출되는 것이다.
그러므로, 3차원적 스캐폴드의 포어 및/또는 하이드로겔 내의 그물망 형태의 포어의 크기를 제어함으로써 방출물질의 방출거동이 조절될 수 있다.
즉, 상기 3차원적 스캐폴드의 포어의 크기나 부피는 나노섬유를 형성할 때, 나노섬유의 직경이나 밀도의 변화를 통해 조정할 수 있다.
또한, 하이드로겔의 포어는 하이드로겔 제조를 위한 친수성 고분자의 분자량 변화를 통해 방출거동을 조절할 수 있다. 즉, 분자량이 클수록 나노 크기의 3차원 그물망 형태의 포어가 커지게 되어 나노섬유에서 방출되는 물질을 좀 더 쉽게 외부로 보낼 수 있다. 반면 분자량이 작을수록 방출물질의 속도가 감소하게 된다.
바람직하게는, 상기 친수성 고분자는 258 내지 20000의 분자량을 갖는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 방출제어가 가능한 미세패턴 된 나노섬유 스캐폴드 박막에 있어서, 방출물질의 방출거동 제어를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에서 "3차원적 스캐폴드"는 나노섬유의 집합체가 3차원적 오픈 셀 매트릭스를 형성하고 있는 구조를 말한다. 상기 3차원적 오픈 셀 매트릭스는 다수의 포어를 형성하고 있으며, 이들 포어는 소정의 모양, 크기 및 부피를 갖고 있다.
포어의 크기나 부피는 나노섬유를 형성할 때, 나노섬유의 직경이나 밀도의 변화를 통해 조정할 수 있다. 예를 들어, 전기방사법을 이용한 나노섬유의 제조에서 직경은 고분자용액의 농도, 유속 그리고 사용되는 전압을 조절하여 조정할 수 있다. 밀도는 전기방사법에서 나노섬유가 적층되는 기판의 종류에 따라서 조정가능하다. 전기가 잘 통하는 기판 위에서는 고밀도, 전기전도도가 비교적 낮은 기판 위에는 저밀도로 적층된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 나노섬유의 밀도를 비교적 높게 하기 위하여 스테인리스스틸 기판을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기판은 금속, 합금, 유리, 실리콘, 종이 등을 사용할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나, 포어의 크기는 약 25 내지 100㎛ 일 수 있다. 대부분의 세포는 스캐폴드에 고정되어 형질변환이 일어나기 전에는 10 내지 15㎛ 정도의 크기로 존재하기 때문에 포어 내부로 들어가 스캐폴드 내부에 고정되어 성장과 분화가 일어나기에 적당하다.
이러한 3차원적 나노섬유 스캐폴드는 특히 세포가 나노섬유가 만들어낸 오픈 셀의 공간에서, 즉, 세포외기질과 유사한 3차원적 환경에서 배양될 수 있으므로 보다 정확한 생물학적 분석이 가능해진다.
상기 3차원적 스캐폴드는 전기방사법과 같은 공지의 방법에 의해 나노섬유를 이용하여 형성될 수 있다.
상기 나노섬유를 제조하기 위해 사용되는 물질은 나노섬유를 생성할 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
또한, 나노섬유로 형성된 스캐폴드는 생체물질이 나노섬유에 잘 고정되도록 하기 위하여 추가적 변형(modification)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적 변형에는 산소 플라즈마 처리, 라디에이션 그라프팅(Radiation grafting) 방법, 또는 자기조립 단일층(Selfassembly monolayer, SAM) 방법 등이 이용될 수 있다. 산소 플라즈마 처리의 경우 소수성이 큰 나노섬유의 경우 친수성을 증가시키기 위해 사용된다. 라디에이션 그라프팅 방법으로 예를 들어 나노섬유 스캐폴드에 UV 조사로 벤조페논과 아자이드 물질을 사용하여 나노섬유의 표면을 원하는 물질로 변형시킬 수 있도록 반응성을 줄 수 있다. SAM 방법은 하이드록시 작용기가 존재하는 표면과 실란(Silane)의 자발적인 반응을 이용하여 실란과 결합된 부분을 표면에 고정시키는 방법이다. 라디에이션 그라프팅이나 SAM 방법에서는 일반적으로 단백질과 화학적 결합을 하는 물질인 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 결합시켜 사용하게 된다. 이러한 나노섬유로 형성된 스캐폴드에 대한 추가적 변형은 나노섬유 생성 물질의 종류에 상관없이 생체물질이 잘 고정될 수 있도록 해 주므로, 스캐폴드의 제조를 위해 사용될 수 있는 나노섬유 생성 물질의 종류에는 제한이 없다.
한 구체예에서, 나노섬유는 세포와 같은 생체물질을 고정시킬 수 있는 생체 적합성 고분자를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 나노섬유는 이에 제한되는 것은 아니나, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산)) (PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리다이옥산온 (PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄) (PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)] (PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 또는 폴리아닐린 (PAN) 등의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또한, 상기 나노섬유 내에 포함되는 방출물질은 전기방사법을 이용하여 나노섬유에 포함이 되는 물질은 모두 사용가능하나, 활용이 이로운 물질을 사용하는 것을 주 목적으로 한다.
구체적인 예로는 세포의 활성을 촉진하는 물질로, 예를 들어, 자가 운동성 촉진 인자(Autocrine motility factor), 뼈 형성 단백질(Bone morphogenetic proteins, BMPs), 상피세포 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO), 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF), 과립구 집락 자극인자(Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 성장 및 분화 인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포 증식 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 간암 유래 증식 인자(Hepatoma derived growth factor, HDGF), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like growth factor, IGF), 이주 촉진 인자(migration-stimulating factor), 미오스태틴(Myostatin, GDF-8), 신경 성장 요소(Nerve growth factor, NGF) 및 기타 뉴트로핀(neurotrophins), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), 전환 성장 인자 알파(Transforming growth factor alpha, TGF-β), 전환 성장 인자 베타(Transforming growth factor beta, TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PGF), 또는 우태아 소마토트로핀(Fetal Bovine Somatotrophin, FBS) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 성장인자 외에 각종 단백질 등의 생체물질을 방출물질로 섬유 내에 함유시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 3차원적 스캐폴드는 하이드로겔에 의해 패턴화된다. 하이드로겔은 3차원적 스캐폴드의 구획을 나누어주는 역할과 나노섬유에서 방출된 물질이 거쳐 지나가도록 하는 방출거동 조절 역할을 한다. 이는 하이드로겔 내부에 세포나 단백질과 같은 생체물질을 고정시켜 패턴화시키던 종래의 기술(US2005/0169962)과는 달리, 포어를 통한 확산은 용이하게 하면서도 생체물질을 특정 위치에 관찰할 수 있는 패터닝을 가능하게 해 준다.
하이드로겔 합성은 통상의 포토리소그래피에 의한 고분자 중합법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 자외선 노광 하에서 포토마스크를 이용한 고분자의 라디칼 중합법을 통해 합성될 수 있다. 예컨대, 친수성 고분자와 광중합개시제를 혼합한 전구용액을 만든 후, 플라스마 처리한 나노섬유 스캐폴드가 충분히 담기도록 전구용액을 떨어뜨리고, 원하는 형태의 포토마스크를 이용하여 그 위로 UV를 조사하여 하이드로겔 패터닝을 할 수 있다.
상기 친수성 고분자는 전구용액 100 중량부에 대하여 20 내지 80 중량부로 포함될 수 있다. 친수성 고분자의 함량이 상기 범위 내일 때 본 발명의 하이드로겔의 수분함유량이 50 내지 97%이 될 수 있어 만일 추가적인 생체물질을 하이드로겔 내부에 고정시키는 경우 생체물질의 구조 및 활성을 유지시킬 수 있다.
상기 자외선 노광은 10 내지 200 mW에서 0.5 내지 수십 초 동안 실시할 수 있다. 자외선 노광이 충분치 않을 경우 고분자간 가교 결합이 충분히 일어나지 않을 수 있으며 반대로 자외선 노광이 지나칠 경우 라디칼의 확산에 의해 마스크의 형상이 정확하게 하이드로 젤의 외형에 반영되지 않을 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔 합성은 자외선 노광 하에서 포토마스크를 이용할 경우, 광량과 노광되는 면의 형태 조절이 가능하다. 상기 포토마스크의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 하이드로겔을 패터닝하고자 하는 형태에 따라 조절될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 하이드로겔은 스캐폴드 상에 웰 형태로 패터닝될 수 있다. 하이드로겔 상에 웰 형상이 형성되도록 패터닝하게 되면, 이렇게 형성된 웰 내에 생체물질을 가두어 생체 물질을 특정 위치에 패터닝하기에 용이하다. 다른 구체예에서, 상기 하이드로겔은 스캐폴드 상에 기둥 형태로 패터닝 될 수 있다.
상기 하이드로겔을 형성하는 하이드로겔 미세입자의 물리/화학적 성질들은 수용성 고분자의 분자량을 변화시키면서 조절할 수 있다. 예를 들어, PEG 575로 제조된 하이드로 젤은 수분함유량이 약 60%인 반면 PEG 20000으로 제조된 하이드로 젤은 수분함유량이 95%에 이른다. 하이드로겔이 높은 수분함유량을 갖는 경우 효소를 비롯한 다양한 생체물질이 하이드로 젤 내부에 구조 및 활성을 유지한 채 고정될 수 있다.
또한, 이런 분자량 변화를 통해 방출 거동을 조절할 수 있는데, 분자량의 변화를 통해 하이드로겔 내의 3차원 형태의 나노 구조를 조절할 수 있다. 분자량이 클수록 나노 크기의 3차원 그물망 형태의 포어가 커지게 되므로, 나노섬유에서 방출되는 물질을 좀 더 쉽게 외부로 보낼 수 있다. 반면에 분자량이 작을수록 방출 물질의 속도가 감소하게 된다.
바람직하게는, 상기 친수성 고분자는 258 내지 20000의 분자량을 갖는 것일 수 있다.
상기 하이드로겔은 생체물질에 대해 생체적합한 친수성 고분자라면 제한 없이 사용할 수 있다. 대부분의 친수성 고분자는 세포나 단백질이 흡착이나 결합하지 않도록 해 주므로 생체물질의 구획화를 통한 패터닝을 가능하게 한다. 또한, 나노섬유만으로 구성된 스캐폴드는 쉽게 손상되어 취급하기 매우 까다로운데, 하이드로젤을 나노섬유 스캐폴드 상에 패터닝하게 되면 취급성이 우수해지는 효과를 거둘 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 상기 하이드로겔은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리카프로락톤 (PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 또는 무수말레인산/비닐에테르 등의 친수성 고분자, 이들의 공중합체, 또는 이들의 혼합물로 형성되는 것일 수 있다.
본 발명의 방출물질을 포함한 나노섬유로 형성된 3차원적 스캐폴드 및 상기 스캐폴드 상에 소정의 형태로 패터닝된 하이드로겔을 포함하는 패터닝된 스캐폴드 박막은 세포에 영향을 주는 인자가 일시적이 아닌 지속적인 방출과 3차원 구조를 통해 세포를 생체 외에서 생체 내의 환경과 유사하게 패터닝할 수 있게 한다.
또한, 본 발명의 패터닝된 스캐폴드 박막은 기판 위에 고정되어 있는 형태로 존재하거나, 기판에서 분리하여 스캐폴드 박막 자체로 사용될 수 있다. 본 발명의 패터닝된 스캐폴드를 물에 넣어두면 하이드로젤이 기본적으로 물에 있으면 팽윤하는 성질을 가지고 있기 때문에 자연스럽게 기판에서 떨어지게 되므로 스캐폴드의 손상 없이 박막의 분리가 가능하다. 팽윤하는 정도는 사용하는 친수성 고분자의 분자량에 따라 조절이 가능하다. 스캐폴드 박막 자체로 분리하여 사용하는 경우에는 양쪽 면이 모두 개방되어 있어, 활발한 확산이 일어난다. 특히 고분자 하이드로겔 내부에서 자체적으로 확산이 일어나기 때문에 기존의 다른 구조들에 비해 뛰어난 확산을 보여, 단백질이나 세포가 활발한 대사활동을 할 수 있도록 도움을 준다. 또한 이 경우 패터닝된 스캐폴드 박막을 둘 이상 적층하는 것이 가능해 여러 종류의 세포들을 생체물질을 층으로 구분되는 형태로 배양이 가능해지는 장점이 존재한다.
본 발명의 패터닝된 스캐폴드 박막은 3차원적 환경을 제공하면서도 다른 구역에 있는 세포간의 직접적인 접촉이나 영향에 의한 교란을 없앨 수 있으며, 패터닝을 통해 지속적으로 같은 위치의 관찰이 가능해지기 때문에, 실시간 관찰이 가능해지므로 보다 효율적인 생물학적 분석을 가능하게 한다.
기존의 나노섬유 스캐폴드는 쉽게 손상될 수 있기 때문에 조작이 매우 어렵다. 반면, 본 발명의 스캐폴드 박막은 하이드로겔 패터닝을 통해 조작이 용이해 조직공학적 측면에서 우수한 특성을 갖는다. 또한, 몸 속의 대부분의 조직들이 층상 구조를 이루고 있다는 점에서 각각의 박막에 세포를 함유하고 있는 본 발명의 복층 스캐폴드 박막은 실제 조직과 유사한 형태의 재생 조직을 생체에 이식하는 것을 가능하게 해 준다.
본 발명의 패터닝된 스캐폴드 박막은 기판 위에 고정되어 있는 형태로 존재하거나, 기판에서 분리하여 스캐폴드 박막 자체로 사용될 수 있다. 따라서, 스캐폴드 박막 자체로 분리하여 사용하는 경우에는 양쪽 면이 모두 개방되어 있어, 활발한 확산이 일어나므로 활발한 대사활동을 할 수 있도록 도움을 준다. 따라서 패터닝된 스캐폴드 박막을 둘 이상 적층하는 것이 가능해져 동일하거나 상이한 종류의 세포를 각각의 층에 고정시키고 이들간의 상호작용을 분석하거나, 이를 이용하여 생체 내에 이식할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드 박막의 제조방법을 도 1을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
전기방사법은 나노섬유로 스캐폴드를 형성하기 위해 사용하는 기술로 당업계에 잘 알려져 있다(Advanced Materials 2004, 16, 1151). 전기방사법에 의해 방출물질이 함유된 나노섬유로 형성된 스캐폴드를 제조하는 단계에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 스캐폴드를 구성하는 나노섬유의 재료, 즉, 생체적합성 고분자를 적당한 용매에 녹인 고분자 용액과 방출물질을 주사기에 넣고, 주사기 내의 용액을 일정하게 배출시키는 주입기에 장착시킨다. 용액은 고전압이 걸리는 금속으로 된 가느다란 원통형 바늘로 주입되어 접지된 바닥으로 전기적 힘에 의해 용액이 잡아당겨지면서 용매는 증발하고 나노섬유가 바닥에 쌓이게 된다. 일정량이 쌓이게 되면 나노섬유의 잔류 용매를 제거하기 위해 진공상태에 두어 최종적으로 나노섬유 스캐폴드를 얻게 된다.
한 구체예에서, 상기 패터닝된 스캐폴드 박막의 제조방법은 상기 생성된 나노섬유로 형성된 스캐폴드에 산소 플라즈마 처리, 라디에이션 그라프팅 방법, 또는 자기조립 단일층 방법을 추가적으로 실시할 수 있다. 이러한 스캐폴드의 추가적인 변형에 대한 구체적인 설명은 전술한 바와 같다.
다음으로, 상기 스캐폴드 상에 하이드로겔을 소정의 형태로 패터닝하는 단계는 앞서 설명한 바와 같이, 포토리소그래피 또는 소프트리소그래피를 이용하여 하이드로겔을 패터닝할 수 있다. 예를 들어, 포토리소그래피를 이용하는 경우, 친수성 고분자와 광중합개시제를 혼합한 전구용액을 만든 후, 플라즈마 처리한 나노섬유 스캐폴드가 충분히 담기도록 전구용액을 떨어뜨리고, 원하는 형태의 포토마스크를 이용하여 그 위로 적당한 파장의 UV를 조사하여 하이드로겔 패터닝을 한다.
하이드로겔로 패터닝 된 스캐폴드는 최종적으로 멸균시키기 위해 알코올에 일정 시간 담가둔 후 남아있는 알코올을 제거하기 위해 적당한 버퍼로 세척하는 과정을 거쳐 세포나 생체물질을 위한 스캐폴드로 사용하게 된다.
위와 같은 방법으로 제조된 패터닝된 스캐폴드는 세포나 생체물질을 특정위치에 고정시킨 채 생물학적 분석을 하는 것을 가능하게 해 준다. 스캐폴드 상의 세포 부착 위치는 형광물질 부착을 이용한 생존확인 분석방법을 사용하여 확인할 수 있다. 또는, 단백질의 흡착 여부는 형광이 부착된 단백질인 Bovine serum albumin conjugated fluorescein isothiocyanate (FITC-BSA)의 형광현미경 관찰을 통해 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 패터닝된 스캐폴드를 이용하면, 특정 위치에 고정된 세포나 생체물질에 대해 각기 다른 분석대상물질을 처리하고 그들간의 반응 여부를 상기 위치에서의 형광이나 발색과 같은 신호를 분석함으로써 쉽게 알아 낼 수 있게 된다. 즉, 2차원적인 마이크로어레이에서의 분석이 생체 환경과 유사한 3차원적인 공간에서 실현되게 되므로, 세포나 생체물질에 대한 보다 효율적이면서도 정확한 분석이 가능하게 된다.
상기에서와 같은 특성을 갖는 본 발명의 방출제어가 가능한 미세패턴 된 나노섬유 스캐폴드 박막은 바이오센서로 사용할 수 있다.
바이오센서는 특정한 물질, 즉 분석대상물질에 대해 반응할 수 있는 생체물질과 생리화학적 탐지 물질이 결합하여 검체 내에 검색대상물질이 존재하는 경우 발생하는 생물학적 상호작용 또는 인식반응을 측정이나 정량이 보다 용이한 신호, 예컨대 전기적, 광학적, 자기적 신호 등으로 변환시킴으로써 검체 내의 분석대상물질의 존재나 양, 또는 활성을 탐지할 수 있는 장치를 의미한다. 여기에서 분석대상물질은 항원, 혈당, DNA와 같은 생체물질뿐만 아니라 신약후보물질과 같은 일반적인 화학물질을 포함한다. 본 발명의 바이오센서에서는 이러한 분석대상물질에 대해 반응할 수 있는 세포, 조직, 단백질, DNA 등의 생체물질이 3차원의 패터닝된 스캐폴드 박막 상의 특정 위치에 고정되어 있으므로, 특정 위치에서의 전기적 또는 광학적 신호를 탐지함으로써 생체 환경과 유사한 환경에서의 분석대상물질의 존재나 양, 또는 활성을 손쉽게 분석해 낼 수 있게 된다. 본 발명의 바이오센서는 바이오칩 또는 미세유체장치 등의 형태를 취할 수 있으며, 그에 따라 기판이나 미세유체채널 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 분석대상물질과 생체물질 간의 상호작용을 측정이 용이한 신호로 변화해 줄 수 있는 탐지 물질을 추가로 포함할 수 있다. 여기에서 탐지물질은 예를 들어, 상기 분석대상물질과 생체분자 간의 반응 산물과 반응하여 형광의 방출 또는 발색을 유도하거나 전기적 신호를 나타낼 수 있는 물질일 수 있다.
일반적으로 바이오센서를 이용한 정밀 분석을 위해서는 외부 환경과의 차단이 중요하다. 그러나 일반적인 배양에서는 세포에 영양을 공급해 주기 위해서는 외부 환경과의 접촉이 될 수밖에 없다. 그러나 영양물질이 지속적으로 방출되면, 외부 환경과의 접촉 없이 세포 배양을 진행하여 외부 환경과의 접촉이 없으므로 결과의 정확도를 증대시킬 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 전기방사법을 이용한 방출물질을 포함한 나노섬유 스캐폴드의 형성
폴리카프로락톤(PCL, Aldrich) 0.4g을 Trifluoroethanol(TFE, Sigma-Aldrich) 6mL에 혼합한 후 80℃에서 12시간 두어 폴리카프로락톤을 완전히 녹였다. 이 용액을 상온에서 식힌 후 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF, R&D Systerms) 5mg을 혼합하고, 전기방사법을 이용하기 위해 제조된 고분자 혼합 용액을 10mL-주사기에 넣고 0.5mL/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10kV의 전압을 흘려주었다. 전압 차이로 인해 접지된 스테인리스스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 생성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃, 진공 상태에서 24시간 정도 두었다.
<실시예 2> 나노섬유 스캐폴드의 산소 플라즈마 처리
나노섬유 스캐폴드의 친수성을 증가시키기 위해 나노섬유 스캐폴드에 플라즈마 장치를 이용하여 산소 플라즈마를 처리 하였다. 무선주파수 출력은 40W, 압력은 1 × 10-1 mmHg으로 40초 동안 처리해 주었다. 친수성의 증가는 물이나 하이드로겔 전구용액의 침투성을 증가시키기도 하고, 세포의 흡착이 용이하도록 하였다.
<실시예 3> PEG 하이드로겔을 이용한 나노섬유 스캐폴드의 패터닝과 멸균
하이드로겔 구조체는 폴리에틸렌그리콜디아크릴레이트(PEGDA, 분자량 575, Aldrich)를 이용하여 만들어지는데, 전구용액은 광중합개시제인 2-하이드록시-2-메틸프로피오펜온(2-hydroxy-2-methylpropiophenone, HOMPP, Aldrich) 20㎕와 1mL의 PEGDA 용액의 혼합을 통해 제조하였다. 하이드로겔 패턴을 형성하기 위해서 전구용액을 스캐폴드가 충분히 담기도록 가해주고 빛을 통과시키는 부분과 통과시키지 않는 부분으로 이루어진 포토마스크를 스캐폴드 위에 두고 그 위에 365nm 파장을 가진 UV광을 18Wcm-2의 출력으로 0.5초 동안 조사하였다. UV에 조사된 전구용액부분은 가교결합이 일어나 물과 같은 용매에 녹지 않게 되고, UV에 조사되지 않은 부분은 물에 씻겨 나갔다. 패터닝 된 스캐폴드는 멸균 시키기 위해 70% 에탄올에 30분간 담가두어 멸균시키고, 잔여 에탄올을 제거하기 위해 Phosphate buffered saline(PBS, Gibco)용액으로 5번 세척해주었다.
도 2는 실시예 3의 방법에 따라 제조된 패터닝 된 스캐폴드 박막의 거시적 모양을 보여준다.
<실시예 4> 패터닝 된 스캐폴드에서의 세포 배양실험
세포를 배양하기 위한 배지는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma)에 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Sigma)와 1%의 항균/항진균성 용액(antibiotic/antimycotic solution, Sigma)을 혼합한 용액을 사용하였다. 1×105 cells/mL의 비율로 세포 가 포함된 용액을 50㎕ (5×103 cells)를 패터닝된 스캐폴드 위쪽에 가했다. 온도는 37℃, 95%의 대기와 5%의 이산화탄소로 이루어진 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.
도 3은 스캐폴드 내에서 세포들이 3차원의 형태로 배양되는 형태를 공초점현미경을 이용하여 관찰한 이미지를 보여준다.
<실시예 5> PEGDA 분자량에 따른 방출거동 조절실험
폴리카프로락톤(PCL, Aldrich) 0.4g, Rhodamine b(Sigma) 0.05g을 Trifluoroethanol(TFE, Sigma-Aldrich) 6mL에 혼합한 후 80℃에서 12시간 두어 폴리카프로락톤을 완전히 녹였다. 전기방사법을 이용하기 위해 제조된 고분자 혼합 용액을 10mL-주사기에 넣고 0.5mL/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10kV의 전압을 흘려주었다. 전압 차이로 인해 접지된 스테인리스스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 생성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃, 진공 상태에서 24시간 정도 두었다.
나노섬유 스캐폴드의 친수성을 증가시키기 위해 나노섬유 스캐폴드에 플라즈마 장치를 이용하여 산소 플라즈마를 처리하였다. 무선주파수 출력은 40W, 압력은 1 × 10-1 mmHg으로 40초 동안 처리해 주었다. 친수성의 증가는 물이나 하이드로겔 전구용액의 침투성을 증가시켰다.
하이드로겔 구조체는 분자량이 각각 575, 3400인 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(PEGDA, Aldrich)를 이용하여 만들어지는데, 전구용액은 광중합개시제인 2-하이드록시-2-메틸프로피오펜온(2-hydroxy-2-methylpropiophenone, HOMPP, Aldrich) 20㎕와 1mL의 PEGDA 용액의 혼합을 통해 제조하였다. 하이드로겔 패턴을 형성하기 위해서 전구용액을 스캐폴드가 충분히 담기도록 가해주고 그 위에 365nm 파장을 가진 UV광을 18Wcm-2의 출력으로 0.5초 동안 조사하였다.
각각 분자량이 575, 3400인 PEG 하이드로겔로 둘러싸인 스캐폴드와 하이드로겔이 없는 스캐폴드를 PBS용액 2mL에 담그고 5분 간격으로 용액의 흡광도를 측정하여 방출되는 로다민 B(rhodamine B)의 농도를 측정하였다. 로다민의 방출 거동은 다음의 식에 따라 로다민 B의 방출율로 나타내었다.
Figure 112010058683094-pat00001
도 4는 본 발명의 방출물질을 포함한 스캐폴드에서의 방출거동을 예시적으로 도시한 공정도이고, 도 5는 방출물질을 포함한 스캐폴드를 분자량에 따른 각각의 PEG 하이드로겔로 패터닝 했을 때 PEGDA 분자량에 따른 방출 거동 조절 능력을 도시한 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 분자량이 클수록 나노 크기의 3차원 그물망 형태의 포어가 커지게 되어 나노섬유에서 방출되는 물질을 좀 더 쉽게 외부로 방출하였고, 분자량이 작을수록 방출물질의 방출 속도는 감소하였다.

Claims (7)

  1. 방출물질을 포함한 나노섬유로 형성된 3차원적 스캐폴드 상에 하이드로겔을 소정의 형태로 패터닝함에 있어서,
    상기 하이드로겔 내 3차원 그물망 형태의 포어 크기를 제어하는 단계를 포함하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
  2. 제1항에 있어서,
    포어 크기는 하이드로겔 제조를 위한 친수성 고분자의 분자량 크기를 조절하여 제어하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
  3. 제2항에 있어서,
    친수성 고분자의 분자량은 258 내지 20000인 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
  4. 제2항에 있어서,
    친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리카프로락톤 (PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드 및 무수말레인산/비닐에테르로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
  5. 제1항에 있어서,
    하이드로겔이 스캐폴드 상에 웰 형태로 패터닝 되어 있는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
  6. 제1항에 있어서,
    방출물질은 세포 활성 촉진 물질을 포함하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
  7. 제6항에 있어서,
    세포 활성 촉진 물질은 자가 운동성 촉진 인자(Autocrine motility factor), 뼈 형성 단백질(Bone morphogenetic proteins, BMPs), 상피세포 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO), 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor, FGF), 과립구 집락 자극인자(Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 성장 및 분화 인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포 증식 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 간암 유래 증식 인자(Hepatoma derived growth factor, HDGF), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like growth factor, IGF), 이주 촉진 인자(migration-stimulating factor), 미오스태틴(Myostatin, GDF-8), 신경 성장 요소(Nerve growth factor, NGF) 및 기타 뉴트로핀(neurotrophins), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), 전환 성장 인자 알파(Transforming growth factor alpha, TGF-β), 전환 성장 인자 베타(Transforming growth factor beta, TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PGF) 및 우태아 소마토트로핀(Fetal Bovine Somatotrophin, FBS)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 스캐폴드 박막에서 방출물질의 방출거동 제어방법.
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