CN111658820A - 一种促进骨再生的可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进骨再生的可注射水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程材料技术领域。本发明提供了一种基于甲基丙烯酸壳聚糖和帕米磷酸镁纳米粒子的生物活性纳米复合水凝胶，用于生物活性离子和生物因子的局部递送和按需同时释放。本发明制备的纳米复合水凝胶具有良好的可注射性和有效的应力松弛性，从而使水凝胶易于注射，适应形状不规则的骨缺损。水凝胶释放的镁离子促进人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的成骨分化和碱性磷酸酶(ALP)的活化。此外，释放出的骨诱导因子BMP‑2，以进一步促进hMSC成骨分化。结果表明，这些可注射的纳米复合水凝胶介导了多种治疗因子的优化释放，并通过微创手术有效促进原位骨再生。

Description

一种促进骨再生的可注射水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种促进骨再生的可注射水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程材料技术领域。
背景技术
蛋白类的生长因子、小分子药物、基因和生物活性离子等治疗药物的递送和长期给药，对于有效治疗许多病理疾病至关重要，用同一载体同时递送这些性质迥异的不同药物仍然具有挑战性。水凝胶具有独特的三维交联聚合物网络，包含广泛的化学成分和物理性质，在药物递送应用中得到广泛应用。然而，由于水凝胶中的载体分子具有固有的渗透性和有限的网络相互作用，通常是通过蛋白质类生长因子等大分子来实现持续传递，而小分子药物和生物活性离子的传递仍然是一个挑战。
骨是一个复杂的组织，骨的形成和重塑是由细胞、细胞外基质、生物力学力和生物因子之间良好调节的相互作用所控制的。因此，有效的骨组织工程需要多学科的方法，并且至少需要三个关键组成部分：成骨细胞、成骨因子和骨诱导和/或骨传导支架。骨细胞通常来源于间充质干细胞，存在于多种组织中，包括骨髓基质和脂肪组织。尽管许多生长因子和信号分子已经被证明可以调节成骨分化，但骨形态发生蛋白(BMPs)被认为是体内外最有效的成骨诱导因子，发明人发现BMP-9是14种BMPs中最有效的成骨因子。因此，BMP-9介导的MSCs与理想的支架材料一起，可以显著促进骨再生，修复骨缺损和骨折不愈合。
一个最佳的支架可以是骨传导和/或骨诱导的，并为骨细胞增殖和分化为骨细胞提供一个细胞友好的环境。然而，常用的支架通常由生物活性玻璃、磷酸钙(例如羟基磷灰石和β-磷酸三钙)和生物聚合物组成，不具有或限制骨诱导性。因此，开发一种新型支架迫在眉睫，该支架是以骨诱导、细胞友好、可注射干细胞为基础的骨组织工程。在这方面，可注射水凝胶是一种很有吸引力的支架材料，特别是用于填充传统骨移植难以修复的骨缺损。
镁离子(Mg2+)在各种生化过程中起着重要作用，是许多酶的重要辅助因子之一。据报道，Mg2 +能够显著增强成骨细胞的粘附和扩散，促进矿化过程。在发明人之前的研究中，通过进一步研究Mg2+在细胞代谢中的作用，证明了含有Mg2+的纳米复合水凝胶能够有效地促进hMSCs的成骨分化，促进原位骨再生，它也是碱性磷酸酶(ALP)酶活性的关键辅因子。ALP催化磷酸单酯水解生成无机磷酸盐，这对骨矿化至关重要。ALP水平的升高通常可以在骨缺损/愈合部位观察到，因此，ALP可以作为一种再生特异性触发器，用于介导刺激反应性药物传递，促进骨愈合。
因此，本发明采用一种基于甲基丙烯酸壳聚糖和自组装帕米磷酸镁纳米粒子的生物活性纳米复合水凝胶，用于生物活性离子和生物因子的局部递送和按需同时释放，达到联合促进骨再生的目的，为骨再生提供一个可行的实施方案。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种促进骨再生的可注射水凝胶及其制备方法，该水凝胶具有良好的可注射性和有效的应力松弛性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种促进骨再生的可注射水凝胶，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖90％～95％、帕米膦酸盐2％～4％、骨诱导因子BMP-2 1％～2％、氯化镁2％～4％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。
本发明开发了一种生物活性纳米复合水凝胶来介导生长因子的局部释放和再生特异性释放。通过Mg2+和帕米膦酸盐(PAM)之间的动态配位形成的水凝胶具有良好的可注射性和有效的应力松弛，从而使水凝胶易于注射，适应形状不规则的骨缺损。水凝胶中释放的Mg2+能促进hMSCs的成骨分化和ALP的活化。PAM-Mg2+在水凝胶中的自组装纳米结构通过磷酸-Mg2+相互作用稳定了水凝胶网络中的BMP-磷酸，从而有效地减少了BMP的非特异性突发释放。在骨愈合部位，成骨分化细胞ALP表达升高，促进了BMP的去磷酸化(活化)，并加速了BMP的释放，这是由于缺乏磷酸-镁离子的相互作用，这可以进一步促进hMSCs的成骨。这种控制水凝胶中BMP激活和释放的正反馈电路显著增强了水凝胶植入部位的骨再生。本发明为MeCS-PAM-Mg-BMP水凝胶作为一种可注射和有效的药物传递平台，介导各种治疗药物的优化释放，通过微创手术促进解剖深部和封闭性骨缺损的再生提供了一个概念上的证据。
作为本发明所述可注射水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖95％、帕米膦酸盐2％、骨诱导因子BMP-2 1％、氯化镁2％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。
作为本发明所述可注射水凝胶的优选实施方式，所述甲基丙烯酸壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖溶解于乙酸中形成壳聚糖溶液，超声去除气泡，将甲基丙烯酸酐滴加进壳聚糖溶液中，混合均匀，室温反应，反应完成后透析、真空冷冻干燥，即得甲基丙烯酸壳聚糖。
作为本发明所述可注射水凝胶的优选实施方式，所述壳聚糖与乙酸的质量体积比为(1～6)：(50～150)，所述壳聚糖与甲基丙烯酸酐的质量比为(1～6)：(0.1～0.6)，所述乙酸的质量分数为1％～3％。
优选地，所述壳聚糖与乙酸的质量体积比为3：100，所述壳聚糖与甲基丙烯酸酐的质量比为3：0.3，所述乙酸的质量分数为2％。
作为本发明所述可注射水凝胶的优选实施方式，所述超声时间为1～3min，所述滴加时间为1～10min，所述反应时间为4～16h。
优选地，所述超声时间为2min，所述滴加时间为5min，所述反应时间为12h。
作为本发明所述可注射水凝胶的优选实施方式，所述透析为将反应液转入截留分子量为3500Da的透析袋中，先后用蒸馏水、去离子水充分透析。
第二方面，本发明提供了上述可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甲基丙烯酸壳聚糖、帕米膦酸盐、骨诱导因子BMP-2、氯化镁分别溶于PBS缓冲溶液中，形成甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液、氯化镁溶液；
(2)将甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液混合均匀，然后加入氯化镁溶液，充分反应，即得促进骨再生的可注射水凝胶。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，甲基丙烯酸壳聚糖溶液的浓度为200mM～500mM，帕米膦酸盐溶液的浓度为10mM～200mM，骨诱导因子BMP-2溶液的浓度为20mM～400mM，氯化镁溶液的浓度为10mM～200mM
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液、氯化镁溶液的体积比为9:2:1:2。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，反应时间为1～6min。
优选地，反应时间为3min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种基于甲基丙烯酸壳聚糖和帕米磷酸镁纳米粒子的生物活性纳米复合水凝胶，用于生物活性离子和生物因子的局部递送和按需同时释放。本发明制备的纳米复合水凝胶具有良好的可注射性和有效的应力松弛性，从而使水凝胶易于注射，适应形状不规则的骨缺损。水凝胶释放的镁离子促进人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的成骨分化和碱性磷酸酶(ALP)的活化。此外，释放出的骨诱导因子BMP-2，以进一步促进hMSC成骨分化。结果表明，这些可注射的纳米复合水凝胶介导了多种治疗因子的优化释放，并通过微创手术有效促进原位骨再生。
(2)本发明利用甲基丙烯酸壳聚糖、帕米膦酸盐、骨诱导因子BMP-2反应，然后将其与氯化镁混合，由于PAM和Mg2+之间的有效协调驱动，使得凝胶快速形成；负载BMP-2，使其缓慢释放，解决了BMP-2的突然释放可能会导致软组织水肿、炎症、血清和意外的骨形成的问题，从何促进骨形成。本发明的水凝胶材料具有良好的生物相容性，能够负载骨诱导因子，使其能够控制释放。克服了现有用于骨缺损的组织工程支架欠缺的一些问题，多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了单一原有材料性能的不足。
(3)本发明的可注射复合水凝胶提高了骨修复效果，为骨缺损的治疗提供了新思路。本发明制备操作简单，所需的原材料易得，有望在生物医学工程材料领域得到广泛的应用。
附图说明
图1为实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶对hMSCs细胞毒性检测的结果统计图。
图2为实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶中镁离子与BMP-2的释放曲线图。
图3为实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶和实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶对hMSCs增殖检测的结果统计图。
图4为水凝胶对hMSCs细胞的ALP活性影响的结果统计图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 甲基丙烯酸壳聚糖(CSMA)的制备
称量3g的壳聚糖溶解在100mL 2％的乙酸中形成壳聚糖溶液，超声2min以充分去除气泡后，将0.3g的甲基丙烯酸酐缓在5min内缓慢滴加进壳聚糖溶液中，当二者完全混合并且无明显气泡后，室温下搅拌反应12h，然后转入截留分子量为3500Da的透析袋中先后用蒸馏水、去离子水充分透析，经过真空冷冻干燥后即可得到淡黄色的、干燥蓬松的水溶性良好的甲基丙烯酸壳聚糖。
实施例2 CS-PAM-Mg水凝胶的制备
将1.5g的甲基丙烯酸壳聚糖，100mM的帕米膦酸盐和100mM氯化镁溶解在PBS溶液中，以800r/min搅拌反应3min，由于PAM和Mg2+之间的有效协调驱动，作为交联剂稳定CS-PAM聚合网络，使得CS-PAM-Mg纳米复合水凝胶的形成。
实施例3 CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶的制备
一种促进骨再生的可注射水凝胶，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖95％、帕米膦酸盐2％、骨诱导因子BMP-2 1％、氯化镁2％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。其中，甲基丙烯酸壳聚糖的制备方法同实施例1。
本实施例促进骨再生的可注射水凝胶的制备方法为：
(1)将甲基丙烯酸壳聚糖、帕米膦酸盐、骨诱导因子BMP-2、氯化镁分别溶于PBS缓冲溶液中，形成甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液、氯化镁溶液，甲基丙烯酸壳聚糖溶液的浓度为350mM，帕米膦酸盐溶液的浓度为100mM，骨诱导因子BMP-2溶液的浓度为190mM，氯化镁溶液的浓度为95mM；
(2)将甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液混合均匀，然后加入氯化镁溶液，其中，甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液、氯化镁溶液的体积比为9:2:1:2，充分反应3min，即得促进骨再生的可注射水凝胶。
实施例4 CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶的制备
一种促进骨再生的可注射水凝胶，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖90％、帕米膦酸盐4％、骨诱导因子BMP-2 2％、氯化镁4％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。其中，甲基丙烯酸壳聚糖和可注射水凝胶的制备方法同实施例1。
实施例5 CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶的制备
一种促进骨再生的可注射水凝胶，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖92％、帕米膦酸盐3％、骨诱导因子BMP-2 2％、氯化镁3％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。其中，甲基丙烯酸壳聚糖和可注射水凝胶的制备方法同实施例1。
效果例1 细胞毒性试验
利用CCK-8检测细胞活性的方法来评价实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的毒性作用。具体操作步骤如下：首先将人骨髓间充质干细胞(hMSCs)以5000个/孔的密度接种于96孔板中，然后将其置于二氧化碳培养箱中培养贴壁过夜。随后，吸出原有的培养基，换上新鲜的含有不同浓度的CS-PAM-Mg水凝胶的完全培养基，所选的CS-PAM-Mg水凝胶的浓度范围为0～100μg/mL，每个浓度有5个平行。然后在培养箱中培养24h，培养后用PBS将细胞洗涤一次后并向各孔中加入100μL的新鲜培养基(含有10％CCK-8)。置于培养箱中孵育一段时间，最后使用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度，通过以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(阴性对照组吸光度-空白组吸光度)×100％。
结果如图1所示，CS-PAM-Mg水凝胶在各浓度条件下，细胞的存活率都很高，均未对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)产生任何细胞毒性，当浓度达到100μg/mL时，细胞存活率也达到95％。因此，CS-PAM-Mg水凝胶材料具有优良的生物相容性，能够用作安全的凝胶载体用于肿瘤的诊疗研究。
效果例2 Mg2+与BMP-2的释放试验
为了研究实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2纳米复合水凝胶中Mg2+和BMP-2的释放速率，将水凝胶样品放在试管中。向试管中小心加入3.0mL无钙离子和镁离子的PBS缓冲液作为释放介质，将试管置于37℃条件下的恒温振荡水浴箱(上海森信实验仪器有限公司)中进行体外释放实验。振荡速率为100rad/min。每隔一段时间，从上层清液中小心取出1.5mL释放液待测，然后将新鲜的1.5mL PBS缓冲液补加到试管中。所有样本均有三个平行(n＝3)。用镁比色分析试剂盒按厂家规程分析释放的Mg2+量，并使用酶标仪在450nm波长处通过ELISA试剂盒测定上清液中BMP-2的量，计算得到BSA的体外释放曲线。
结果如图2所示，在为期三天的释放研究中，尽管Mg2+与BMP-2最初有少量释放，但是均能维持Mg2+与BMP-2的持续释放，证明CS-PAM-Mg/BMP-2能够有效地控制释放镁离子和BMP-2。
效果例3 细胞增殖实验
在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的α-MEM中，将人骨髓间充质干细胞(hMSCs)以每孔1×104细胞的密度接种到96孔板中)，100U mL-1链霉素和100U mL-1青霉素在37℃的潮湿5％CO2气氛中孵育过夜。将20个含有人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的孔随机分为5组。在这五组中添加50μg ml-1的实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶和实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2的水凝胶纳米颗粒，分别培养1、3、5、7和10天后，将细胞用PBS洗涤3次，后并向各孔中加入100μL的新鲜培养基(含有10％CCK-8)。置于培养箱中孵育一段时间，最后使用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度，通过以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(阴性对照组吸光度-空白组吸光度)×100％。
结果如图3所示，实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶，与第1天和第3天相比，第5、7和10天的hMSCs细胞有明显的增殖，其中第10天的细胞增殖率最高，证明CS-PAM-Mg能够显著的促进骨细胞的增长。实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶与实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶培养相同天数，后者的细胞增殖明显高于前者，证明BMP-2的加入，更能促进细胞的增殖。
效果例4 ALP活性检测
将已灭菌的各组材料：CSMA(甲基丙烯酸壳聚糖)、CSMA-PAM(甲基丙烯酸壳聚糖-帕米膦酸盐)、实施例2制备的CS-PAM-Mg水凝胶、实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶，放置于48孔培养板中。取培养至3代的细胞，使用0.25％胰酶将其从培养瓶中消化下来，再以转速为1000rpm进行离心，时间为5min，弃去上清液，再将含有血清和双抗(青霉素和链的混合液)的α-MEM培养液加入其中，并调整细胞浓度为每毫升含有5×107个细胞。各组样品上种植20μL的上述细胞悬浮液，将其置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育的培养箱中孵育2个小时，再加入500μL的培养液继续的培养至7天和14天。在培养期间，2～3天更换一次培养液，目的是为了细胞能够获得足够的营养。从孔板中将支架取出，再用无菌PBS溶液将水凝胶材料润洗3次，然后将500μL细胞裂解液加入其中，随后将置于温度为4℃的超声细胞破碎仪中进行细胞破碎。对其离心，收集上清液。将500μL ALP底物反应液加入上清液中，在水浴温度为37℃的条件下反应30min，为了终止反应，向反应液中加入500μL的浓度为0.1M的NaOH，随后用紫外可见光分度计测定样品在405nm处的分光度值，计算ALP。每个时间点的每组水凝胶材料至少平行测试3次。
培养至7天和14天的实验结果如图4所示。从图4中可以看出，各实验组细胞的ALP活性随着孵育时间的延长而呈现出增加的趋势。因此，可以说明个实验组均具有利于成骨的分化，其中实施例3制备的CS-PAM-Mg/BMP-2水凝胶的活性最高，说明本发明所述水凝胶材料更有利于成骨分化。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种促进骨再生的可注射水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖90％～95％、帕米膦酸盐2％～4％、骨诱导因子BMP-2 1％～2％、氯化镁2％～4％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。
2.如权利要求1所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：甲基丙烯酸壳聚糖95％、帕米膦酸盐2％、骨诱导因子BMP-21％、氯化镁2％，所述水凝胶的溶液为PBS缓冲溶液。
3.如权利要求1或2所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述甲基丙烯酸壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖溶解于乙酸中形成壳聚糖溶液，超声去除气泡，将甲基丙烯酸酐滴加进壳聚糖溶液中，混合均匀，室温反应，反应完成后透析、真空冷冻干燥，即得甲基丙烯酸壳聚糖。
4.如权利要求3所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖与乙酸的质量体积比为(1～6)：(50～150)，所述壳聚糖与甲基丙烯酸酐的质量比为(1～6)：(0.1～0.6)，所述乙酸的质量分数为1％～3％。
5.如权利要求3所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述超声时间为1～3min，所述滴加时间为1～10min，所述反应时间为4～16h。
6.如权利要求3所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述透析为将反应液转入截留分子量为3500Da的透析袋中，先后用蒸馏水、去离子水充分透析。
7.如权利要求1～6任一项所述的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甲基丙烯酸壳聚糖、帕米膦酸盐、骨诱导因子BMP-2、氯化镁分别溶于PBS缓冲溶液中，形成甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液、氯化镁溶液；
(2)将甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液混合均匀，然后加入氯化镁溶液，充分反应，即得促进骨再生的可注射水凝胶。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，甲基丙烯酸壳聚糖溶液的浓度为200mM～500mM，帕米膦酸盐溶液的浓度为10mM％～200mM，骨诱导因子BMP-2溶液的浓度为20mM～400mM，氯化镁溶液的浓度为10mM～200mM。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，甲基丙烯酸壳聚糖溶液、帕米膦酸盐溶液、骨诱导因子BMP-2溶液、氯化镁溶液的体积比为9:2:1:2。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应时间为1～6min。
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