CN1694955A - 可设计的支架及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可设计支架，为具有互相连接的孔并在其中物理截留有生物活性分子的三维支架。该支架为聚合物的冻干水凝胶。支架可以阵列方式位于平台上，并负载多种生物活性分子的组合，用于高通量和平行筛选以及组织工程。本发明还涉及制备和修饰支架的方法。

Description

可设计的支架及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请是2002年9月30日递交的美国专利申请No.10/259,817的继续部分申请。
发明领域
本发明涉及用于细胞培养的支架及其制备和使用方法。本发明尤其涉及可用细胞外基质(ECM)分子和/或生物效应分子设计的(programmable)支架，对细胞培养和组织工程的微环境进行优化。
发明背景
作为生物学研究与工业应用的重要工具，进行细胞培养通常要对细胞培养装置表面采取化学处理，以支持细胞粘附并使粘附细胞浸没于含有细胞生长补料的培养基中。″贴壁依赖″指的是在培养中贴壁-依赖性细胞只有附着于固体表面时才会分裂，处于液体悬浮液内而没有任何附着物时该细胞不会分裂。细胞粘附部位使得单个细胞能够扩展，获取更多的生长因子和营养，组建细胞骨架，并为胞内肌动蛋白丝和胞外基质分子提供固着点。因此，能提供充分的细胞粘附的表面对细胞培养和生长至关重要。
除细胞粘附和营养外，激素和蛋白生长因子对于支持在细胞培养中的哺乳动物细胞生长也是必不可少的。必需的激素和生长因子包含于血清中，血清是来源于血液、为血液凝固后剩余的流体。血清含有细胞生长所需的生长因子的组合。除去血清的哺乳动物细胞停止生长，并通常以静态形式停滞于有丝分裂期和S期之间，称之为G0期。已经从血清中分离和鉴定出多种生长因子，但仍很难制备充分模拟体内环境的细胞培养的取代物。血清很昂贵，且每1-3天就需要更换，因为蛋白生长因子很快被生长迅速的细胞所吸收。因此，已经致力于开发促进无血清时细胞粘附的细胞培养体系。
组织工程是一种再生天然组织的技术。组织工程范畴的细胞培养还需要支撑细胞的三维支架。具有三维多孔结构的支架是许多组织培养应用例如软骨细胞培养所必备的，因为否则采用二维单层细胞培养，这些细胞就会失去其细胞形态和表型表达。三维基质的质量可能会极大影响用于再生天然组织的细胞的粘附和生长，并决定组织再生或合成的成功与否。适当的基质材料将会促进细胞结合、细胞增殖、细胞特异表型的表达以及细胞活性。
组织工程和细胞移植成功与否，取决于存活力的保持、分化的表型以及与为提供目的疗效的机体的整合。祖细胞要维持并发育成各种功能性组织，需要不同类型的细胞、细胞类型的组合、物理环境、可溶环境和适当的细胞信号及细胞间相互作用。需要高通量和高平行的筛选，以寻找适于组织发育的微环境组合。
文献公开了大量用于细胞培养和组织工程的多孔支架。Shea等人( Nature Biotechnology，Vol.17，551-554页(1999年6月))公开了高度多孔的三维丙交酯乙交酯共聚物(poly(lactide-co-glycolide))支架，其由气体发泡制成并截留(entrapped)质粒。Petronis等人( Journal of Materials Science： Materials in Medicine，12，523-528页(2001))公开了具有亚毫米级拓扑结构的二氧化钛陶瓷支架，用于肝细胞的体外培养；该二氧化钛陶瓷是微孔性的、生物适应性材料，可诱导细胞聚集，制备该Petronis等人的支架的方法需要重复的氧化、遮蔽和蚀刻。Kim等人( Fibers and Polymers 2001，Vol.2，No.2，64-70页)公开了通过冻干和用EDC和NHS交联制备三维多孔的胶原/脱乙酰壳多糖海绵状物，以提高生物稳定性和增强机械性能。
但是这些支架不支持细胞粘附。当需要较强的细胞粘附时，特别是对于贴壁-依赖性哺乳动物细胞的培养，必须修饰支架以支持细胞粘附。为解决这一问题，将细胞粘附促进分子通过共价结合固定于支架上，以便细胞可以附着在这些配基分子上。例如，Kobayashi等人( Biomaterials 1991，Vol.12 October，747-751)公开了通过二异氰酸酯、聚异氰酸酯和溴化氰，将细胞粘附蛋白共价固定于聚(乙烯醇)(PVA)水凝胶表面，以促进细胞粘附。Kobayashi等人( Current Eye Research Vol.10，No.10，1991，899-908)公开了将细胞粘附蛋白和分子共价固定于PVA水凝胶片层上，以促进角膜细胞的粘附和增殖。共价修饰增加了操作的复杂性和步骤，并有可能造成支架材料和配基应有的物理和化学性质的改变。已证明ECM分子随机吸附疏水性聚合物例如PGA、PLA、PCL以及所有聚酯、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯的共聚物。然而，物理吸附很难控制，使其在需要细胞持久粘附于表面的方法中的应用遭到质疑。
                         发明摘要
本发明提供一种方法，用于制备可设计的细胞培养支架，其具备促进细胞粘附或有细胞信号传递功能的分子组合。该方法涉及制备包含水凝胶的多孔支架，用含生物活性分子的溶液浸渗该多孔支架。然后冻干或干燥浸渗的支架以便将生物活性分子截留于多孔支架内。必要时，冻干前先洗涤该浸渗的支架以除去盐并调整pH。
所得多孔支架容许进行三维细胞或组织培养，具有互相连通的高孔隙度结构。该多孔支架可使用多种材料包括多聚物、陶瓷、金属或复合物制备而成。这些材料可以是生物适合的、生物可降解的或非生物可降解的。这些属性将取决于该支架的最终用途。
适当的多聚物包括海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、胶原、脱乙酰壳多糖、壳多糖、聚碳酸亚丙基酯、多羟丁酸(poly hydroxybutyrate)、基于氨基酸的聚碳酸酯，聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚富马酸酯(poly fumarate)、聚HEMA、聚苯乙烯，PTFE、聚乙二醇或基于聚丙二醇的多聚物及其衍生物。生物可降解的聚合物包括聚丙交酯、乙交酯、己内酯、原酸酯类及其共聚物。
多孔支架一般为多聚物的冻干水凝胶，包括但不限于交联的海藻酸盐、修饰的海藻酸盐、透明质酸或修饰的透明质酸。
生物活性分子包括细胞外基质(ECM)分子、功能肽、能传递细胞信号的蛋白多糖和糖蛋白、生长因子、适应细胞功能的分子及其组合或其衍生物。ECM分子包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、血小板反应蛋白1、玻连蛋白、弹性蛋白、肌腱蛋白、聚集蛋白聚糖、集聚蛋白骨唾液蛋白、软骨基质蛋白、fibronogen、纤维蛋白、fibulin、粘蛋白、巢蛋白(entactin)、骨桥蛋白、纤溶酶原、restrictin、丝甘蛋白聚糖、SPARC/骨连接蛋白、多功能蛋白聚糖、分区蛋白、骨桥蛋白、骨连接蛋白、von Willebrand因子、硫酸肝素多糖、蛋白聚糖、透明质酸，细胞粘附分子包括钙粘蛋白、连接蛋白、选择素及其组合。生长因子包括但不限于表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、转化生长因子-β、造血生长因子、白细胞介素及其组合。本领域已知其它生长因子。可以使用两或多分子的ECM和/或生长因子组合，这使某一特定类型的细胞附着点与生长因子非常接近，容许进行生长因子和ECM相互作用研究或控制生长或选择。由此可创造一种微环境。也可以创造更复杂的微环境，包含几种或几十种或几百种不同种类的生物活性分子。该可设计的支架容许通过活化或抑制信号传导途径，对引发高度特异性的生物学反应相关事件进行研究。
用该可设计支架还可控制和维持应用于多种目的包括组织工程在内的多种细胞的存活力、表型和基因表达，该可设计支架还可应用于筛选方法包括高通量和平行筛选方法。
本发明进一步提供制备支架阵列的方法，其包括将适当的多聚物溶液分配于平台上形成溶液点，交联溶液点形成交联水凝胶点，冻干交联水凝胶点形成支架阵列。交联反应混合物可含有联胺和碳二亚胺。碳二亚胺可以是EDC，官能团与透明质酸或海藻酸盐的摩尔数比为大约25％-大约200％，优选官能团与透明质酸或海藻酸盐的摩尔数比为大约50％-大约100％。联胺例如赖氨酸或己二酸二酰肼，官能团与透明质酸或海藻酸盐的摩尔数比大约为2％-100％，优选官能团与透明质酸或海藻酸盐的摩尔数比大约10％-40％。水凝胶溶液可进一步包含共反应剂，包括但不限于HoBt、NHS或磺基NHS，其与碳二亚胺的比约为1∶50-50∶1，优选与碳二亚胺(EDC)的比约为1∶10-4∶1。
该可设计的支架与含有该支架的阵列均可作为试剂盒组分。通常设计试剂盒以简化应用及所需的操作处理，例如细胞或组织培养筛选操作。在一个实施方案中，本发明的试剂包含一种或多种生物活性分子。在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒包含几种生物活性分子，以便按用户的特定需要定制细胞培养环境。
                        附图简述
图1显示在扫描电镜下本发明冻干水凝胶支架互相连通的孔状结构。
图2显示接种后，MTT-染色的MC3T3细胞均匀分布并生长于本发明整个支架上。
图3显示本发明纤连蛋白-修饰的支架上的细胞粘附和细胞生长，而阴性对照，即未修饰的支架和白蛋白-修饰的支架不支持细胞粘附和细胞生长。
图4显示本发明ECM分子-修饰的支架上的细胞粘附和细胞生长，而阴性对照，即未修饰的支架不支持细胞粘附和细胞生长。
                         发明详述
本发明提供方法，用于制备具有用至少一种生物活性分子非共价修饰的互相连通的孔的细胞培养支架。这些相互连通的孔结构引导并支持细胞和组织生长。该孔结构提供物理表面，细胞可以在三维上将其自身的ECM铺展于该表面上。而且，多孔结构可改善营养向支架中心的运输，限制细胞集落的大小，避免由于缺乏营养形成大的细胞集落并发展成坏死中心。
优选地，本发明所使用三维支架的孔大小为直径约50-约700μm，优选约75-约300μm。适于生物活性分子非共价修饰的支架孔隙度百分比约为50％-约98％，优选约80％-约95％。
用生物活性分子非共价修饰支架以提供细胞生长或其它细胞功能所需要的相互作用。在支架内，生物活性分子被截留于多孔结构内，而不是通过共价键结合在聚合支架上。生物活性分子包括但不限于，ECM分子、功能肽、能传递细胞信号的蛋白多糖和糖蛋白、生长因子、适宜细胞功能的其它分子及其组合。
本发明支架用ECM分子功能化后，为细胞形态和组织发育提供支持并引导。天然的ECM是蛋白和多糖结合在一起形成的非共价三维网络，内部混有细胞。天然的ECM是高度水合的，允许扩散，并结合分子例如生长因子和细胞粘附分子，将其提呈给细胞。本发明通过向高度水合结构即冻干的多糖水凝胶上加入ECM分子，提供仿生(biomimetic)的三维环境。
截留的生物活性分子应是无毒的、生物适合的，并且支架必须是高度多孔的，具有大的相互连通的孔且机械稳定，以对抗在组织发育期间的细胞收缩。支架用生长因子非共价修饰时，可提供细胞生长和细胞培养的细胞交互作用信号。
支架通过冻干适当的多聚物水凝胶而制备。该多聚物是生物适合的、生物可降解的或生物不能降解的。在一个实施方案中，支架为交联的海藻酸盐或透明质酸的冻干水凝胶，其易于接种细胞。可通过改变pH值、水凝胶浓度或交联剂的量来调整支架的孔大小和分布。
海藻酸盐是线性、不分枝的多聚物，含有β-(1→4)-连接的D-甘露糖醛酸(M)和α-(1→4)-连接的L-古罗糖醛酸(G)残基。海藻酸盐由褐海藻产生。在钙离子存在时海藻酸盐是热稳定的冷固胶凝剂。这种凝胶可经热处理而不熔化，尽管其最后可以降解。用于本发明支架的海藻酸盐多糖水凝胶具有若干良好性质：它们可轻易地被交联并加工成三维支架；它们聚合物主链上具有适当的官能团用于共价修饰；材料在天然状态下不粘附细胞。
透明质酸是一种天然粘多糖，以不同浓度存在于几乎所有组织中。透明质酸的水溶液、盐或其衍生物或多糖，通常特征在于其显著的粘性、滑爽以及减低磨擦的能力。
这些多糖作为交联分子与联胺(diamine)或二酰肼(dihydrazide)共价交联，制作水凝胶时利用标准碳二亚胺化学作用启动交联反应。参见例如G.Prestwich等人， Controlled Chemical modification of hyaluronic acid：synthesis，applications，and biodegradation of hydrazide derivatives，J.Controlled Release，1998，53，93-103页。彻底洗涤水凝胶以除去所有反应剂，冷冻，冻干形成三维相互连通的孔网状物。
在一个实施方案中，支架可以松散地提供于某一平台表面，或通过共价连接附着于表面上。基于水凝胶的支架共价连接在支持介质上，其或者通过被覆于平台表面无污(non-fouling)的多糖，或者通过终止于介质表面的氨基基团。
本发明支架通过用含有至少一种生物活性分子的溶液浸渗(impregnated)，以便聚合水凝胶膨胀并且生物活性分子缠结而进一步得到修饰。当支架用生物活性分子溶液浸渗并被冻干时，生物活性分子和多聚物支架都会破裂(collapse)，产生互相连接和互相贯通的聚合物网状物，其为络合的，且足以抵抗生物活性分子再溶解。因此生物活性分子在物理上与支架多聚物缠绕在一起。聚合物缠绕是控制其中截留的生长因子和小分子释放的基础，高分子量ECM分子具有足够长的聚合链，可与水凝胶支架稳定整合以支持细胞粘附和扩展。不受理论的束缚，生物活性分子的长度是决定其在支架上的形式的关键。如果细胞-粘附分子的长度不足以与水凝胶网状物物理缠绕，这些分子就不能成为细胞粘附的锚定分子。不过这些较小的分子可以作为可溶的由支架控制释放的因子。
在本发明的一个实施方案中，所述的生物活性分子包括融合蛋白。如上所述，将被植入支架的生物活性分子可能太小而不能在支架中缠结。为了适应这种情况，如果生物活性分子是蛋白质，则可以将该蛋白质与肽序列融合以产生物理上更长的并且更容易缠结入所述的多孔支架的肽。预被融合到所述的生物活性分子的肽序列本身可以是生物活性分子，从而产生掺入到水凝胶支架中的包含至少两种生物活性分子的融合蛋白质。或者，将被融合到所述生物活性分子的肽序列可以不是对特定的目的细胞培养环境生物活性的(即生物惰性的)。
制备融合蛋白质的方法本领域众所周知，通常涉及重组DNA技术和重组DNA在宿主细胞中表达。作为合适的宿主的代表性实例有细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如Drosophlia S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。根据本发明的教导本领域技术人员可以选择合适的宿主。
用于制备融合蛋白的重组构建体包含载体，如质粒或病毒载体，其中可以以正向或反向插入核酸序列。在该实施方案优选方面，所述的构建体进一步包含调节序列，包括但不限于例如与所述序列可操作性连接的启动子。通过在载体中插入增强子序列可以增加高等真核细胞转录编码本发明多肽的DNA。大量的合适的载体和启动子为本领域技术人员所熟知并且为商业可获得的。
可以使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其他带有选择标记的的载体从任何目的基因中选择启动子区域。两种合适的载体为pKK232-8和pCM7。特别指定的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV即早期启动子、HSV腺苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子和小鼠金属硫蛋白启动子-I。本领域技术人员能够选择合适的载体和启动子。
可以常规方式使用宿主细胞中的构建体来制备由重组序列编码的基因产物。或者，本发明的多肽可以通过常规的肽合成仪合成制备。
可以在哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌或其他细胞中在合适的启动子的控制下表达成熟蛋白。也可以使用来自本发明的DNA构建体的RNA利用无细胞翻译体系制备该蛋白。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体描述于Sambrook等人的Molucular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，其内容在此引用以供参考。
通常，重组表达载体包括复制起点和转化宿主细胞的选择标记，例如，大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1基因，以及来自高表达基因的启动子，用于指导下游结构基因的转录。所述的启动子可以来自编码糖酵解酶例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的操纵子、α因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等。异源结构序列与翻译起始和终止序列，优选地，与能指导被翻译的蛋白分泌入周质间隙或细胞外培养基的前导序列，合适组装。可选地，所述的异源序列可以编码包括赋予目的特性例如稳定或简化纯化表达的重组产物的N-末端识别肽的融合蛋白。
一旦支架被含有生物活性分子的溶液水合，用水或适当的缓冲液彻底洗涤支架，以调整pH并除去盐，然后再冷冻和冻干。修饰不需要共价结合。本方法虽然简单，但仍使支架增添了相似或更好的生物学活性。生物活性分子向培养于支架上的细胞传达信息，引起培养细胞的细胞粘附相互作用。
适于支架截留的生物活性分子一般具有较大的分子量和适当的空间构型，以便它们能在支架内相互缠绕，简单地截留于支架的多孔结构内。生物活性分子还可以是可溶的，此时其与较大的大分子一起可逆截留于支架内。当截留的生物分子和支架上培养的细胞发生接触或相互作用时，这种相互作用可能不足以将截留的生物活性分子从支架中拉出。
在一个实施方案中，支架可以用于制备阵列。阵列支架可以采用连续的方式固定或分布于平台表面。平台可以是聚苯乙烯滑面(slide)或多孔平板。支架可以松散地放置于平台上，例如在多孔平板的板孔内，或借助平台衍生(derivatized)表面或表面涂层固定于平台上。支架可共价结合在表面涂层上。涂层通常是非污(non-fouling)多糖。表面通常具有氨基基团，位于表面上，可与支架多聚物的官能团共价连接，该官能团在制备支架的交联过程中没有被用尽。
基于滑面的支架阵列，特别适用于针对不同的非可溶条件对可溶环境进行测试，例如针对若干细胞类型的组合对一种培养基条件进行测试、或在支架内测试不同ECMs或多肽组分。基于多孔平板的阵列，适于针对表达制药业关注分子例如G-蛋白偶联受体、cAMP、细胞色素P450活性的同一工程组织，对若干不同的药物进行测试。另外，本发明的阵列可用于几种测试化合物的体外同时筛选，或同时针对多种细胞类型测试单一化合物。这些支架和工程组织阵列，可与其它用于测试、筛选、培养的装置互相组合和结合。例如，支架阵列允许任意或所有生物活性大分子的组合非共价结合于支架上，既可用于环境筛选以启动特异信号途径引导需要的生物反应，例如增殖、分化、血管生成，也可大量制备体内或体外组织工程所需的任何条件的支架。
本发明还提供试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含多聚物和至少一种生物活性分子。所述的多聚物然后可进行交联/水合来产生多孔支架。将掺入水凝胶的所述试剂盒的生物活性分子单独包装，他们可以在溶液中或者他们可以冻干的形式包装。所述至少一种生物活性分子的溶液然后将用于水合所述的冻干的水凝胶并且也可用于将所述的生物活性分子掺入支架中，制备定制的细胞培养环境。在另一实施方案中，所述的试剂盒包含预制的多孔性水凝胶支架和至少一种生物活性分子，以至于试剂盒用户不必在掺入生物活性分子之前制备水凝胶支架。该试剂盒还包含若干，多至数十种生物活性分子，使得所述可设计的支架可根据大量用户基于多种细胞培养环境进行定制。
本发明还提供多种检测响应至少一种测试分子的体内反应或细胞功能的方法。在一个实施方案中，所述的测试分子与用于制备可设计支架的生物活性分子相同。检测体内反应的方法包括制备如上所述的细胞培养环境，至少一种生物活性分子也是所述的测试分子。然后将细胞接种到所述环境中，并将接种细胞培养环境植入体内环境。然后可以直接或间接检测响应所述测试分子的细胞功能、增殖或存活。可以在细胞检测之前活组织检查。在另一实施方案中，所述的生物活性分子和测试化合物不同。测试化合物包括但不限于肽或其片段、多肽、糖类、蛋白聚糖、糖蛋白、脂类、天然和合成的多聚物和化学化合物，如毒素、药物和药物候选物。
本发明还提供将细胞从体内环境移到本发明的细胞培养环境的方法。在一个实施方案中，所述的细胞培养环境包含具有或怀疑具有吸引特定细胞能力的生物活性分子。所述的细胞培养环境也可包含一旦结合的细胞从受试者体内进入支架可以结合吸引的细胞的生物活性分子。因此，该“归巢环境”将被无细胞植入体内环境。在使目的细胞渗透到所述的归巢环境中的足够时间后，然后将所述的环境移出受试者，然后可在体外环境中分离新渗透的细胞并进行培养。或者，一旦归巢环境在体内接种了细胞，可将该环境移出患者并重新植入同一患者的另外部位或者植入不同的患者。在本发明的特定实施方案中，归巢环境的生物活性分子可以用于吸引多种干细胞，例如但不限于肝干细胞、造血干细胞、神经干细胞、心脏干细胞、胰岛干细胞、乳腺干细胞和骨髓干细胞。
在实施例中更详细描述了制备本发明支架和微阵列的方法。下列实施例仅用于说明而非限制本发明范围。在此可以例如由适当的技术人员引进适当的变化而不背离本发明范围。
                      实施例
           实施例1.本发明多孔支架的制备。
将3克海藻酸盐(MVG海藻酸盐，ProNova，Norway)缓慢溶解于100毫升MES缓冲液(pH6.0)中，以获得3％w/v的海藻酸盐溶液(或使用赖氨酸时为pH6.5)
向50毫升3％w/v海藻酸盐溶液中加入164毫克磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)(MW217.13，Sigma)和100毫克己二酸二水合物(AAD，MW174)以获得15％交联。
向50毫升锥形瓶中注入25毫升海藻酸盐溶液，迅速加入365毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC，MW 191.7，Pierce)启动交联反应。
将溶液迅速注入倒置的培养皿中，培养皿顶盖向下，倒置的皿底上放置2毫米厚的垫片。从而提供具有均一厚度的平行表面，由2毫米缝隙与胶化海藻酸盐隔开。使材料胶化过夜。
水凝胶形成，用6毫米的活检穿孔器打成若干6毫米×2毫米的圆盘。凝胶圆盘用去离子水漂洗3小时，换5次水，洗去盐和反应剂。凝胶圆盘置于塑料表面上，-70℃冷冻4小时，冻干过夜以获得本发明的三维多孔支架。
如图1所示，得到具有连通孔结构的三维支架，其可用于采用本发明生物效应分子进一步修饰。多孔结构可能来源于冷冻期间形成的冰晶，冰晶被冻干时，冰晶留下的间隙形成互连的多孔结构。反应期间未交联的水凝胶羧基(-COOH)基团可提供支架进一步修饰的潜在位点。
            实施例2.本发明多孔支架的制备
向处于0.1M MES缓冲液(pH6.0)中2％(w/v)的海藻酸盐溶液和2％(w/v)的透明质酸(HA)溶液内，分别加入HoBt和AAD溶液，浓度为110毫克AAD/50毫升的海藻酸盐/透明质酸溶液。然后将溶于0.1MES缓冲液的EDC分别加到海藻酸盐溶液或透明质酸溶液内，浓度为195毫克EDC/10毫升的海藻酸盐/透明质酸，启动交联反应。然后迅速将该溶液注入容器内，使其胶化过夜。
在容器中形成水凝胶，并冲压成若干6毫米×2毫米的圆盘。在水和PBS缓冲液内漂洗凝胶圆盘以浸出盐和反应剂。冷冻凝胶圆盘并冻干过夜。
得到具有连通孔结构的海藻酸盐或透明质酸交联的冻干水凝胶的三维支架。反应期间未交联的水凝胶羧基(-COOH)基团可提供支架进一步修饰的潜在位点。具有连通孔的支架可用于采用本发明生物效应(bioaffecting)分子进一步修饰。
              实施例3.本发明微阵列的制备
按照实施例1步骤1-3进行，然后，将凝胶溶液分装入固定于HA包被的聚苯乙稀滑面(slide)上50-孔硅垫片的孔内。海藻酸盐水凝胶不但交联成三维阵列构型，而且与滑面表面交联。若在凝胶溶液充满全部50孔之前海藻酸盐已胶化，可通过增加pH值或在不同时间加入反应剂来延缓胶化过程。冷冻并冻干滑面。
三维支架阵列共价结合于滑面上，允许进行高平行和高通量筛选以及细胞培养。
              实施例4.本发明微阵列的制备
将海藻酸盐(MVG海藻酸盐，ProNova，Norway)缓慢溶解于0.1MMES缓冲液(pH6.5)中，得到2％(w/v)的海藻酸盐溶液。向50毫升2％w/v的海藻酸盐溶液中加入68.3毫克羟基苯并噻唑(HoBt，H-2006，Sigma)和110毫克AAD，获得25％的羧基交联。将3毫升体积海藻酸盐溶液等分部分注入一个10毫升的塑料试管中进行反应。截去试管顶部以便吸头可触及底部。向3毫升2％海藻酸盐溶液中加入58毫克EDC(MW191.7，Pierce)，启动交联反应。迅速吸出海藻酸盐溶液，分装于置于0.5％或1.0％海藻酸盐-包被的滑面上50-孔垫片的孔内，同一孔内重复分装2-3次，不能超过孔边。调整溶液pH值以改变交联反应速度。
将正在胶化的海藻酸盐溶液包被的滑面胶化约20-60分钟。要得到较厚的凝胶可累加垫圈。滑面在-70℃冷冻数小时或过夜，冻干至干燥。
支架排列于滑面上。提高pH可足以延缓胶化动力学，允许胶化前进行溶液处理。大多数情况下移去垫片不会坏凝胶，使凝胶仍附着于滑面表面。由此得到本发明完整排列的三维支架。
             实施例5.本发明微阵列的制备
重复实施例4的步骤，但在加入EDC启动交联反应前，调整海藻酸盐溶液的pH至5.5，6.0，6.5和7.0。观察并记录胶化过程的质量和时间。具体地，使用pH7.0的溶液在胶化质量和胶化时间之间得到较好的平衡。
             实施例6.在本发明微阵列上接种细胞
在将1×106细胞/ml的MC3T3细胞悬液接种支支架上。在直径为3毫米、厚1毫米(体积约7μl)的各支架上接种10μl细胞悬液。将3个支架阵列连接在100毫米培养皿的底部，并置于层流罩超静台紫外光源下灭菌20-30分钟。由于毛细管作用细胞悬液进入支架并见细胞遍及分布于支架的各个孔内。向含有滑面的培养皿内加入20毫升含10％FBS的培养基用于细胞培养。
48小时后，细胞用MTT染色并记录数码图像。细胞也可在共聚焦显微镜和相差显微镜下进行观察。
如图2所示，接种于本发明阵列支架上的细胞均匀分布于整个支架，细胞轻易地进入冻干支架张开的孔状结构内，而与海藻酸盐支架不发生相互作用。这也表明了支架的互相连通性。
              实施例7.在未修饰支架上接种细胞
方法：
将MC3T3细胞制备成0.5，1.0，5.0和1×106细胞/毫升的细胞悬液。通过使用装有细胞悬液的移液器吸头向支架中央上样，使细胞悬液分散到支架内，在每个24-孔板微阵列中的支架(体积56.5μl)上接种60μl细胞悬液等分部分。
向每孔内加入培养基(0.5毫升)并在适当条件下培养细胞。20小时后，用10％(v/v)的MTT对细胞进行染色并观察。
接种的细胞分布遍及整个厚度的海藻酸盐支架内，细胞主要以细胞集落(clump)存在。随着显微镜下聚焦平面发生变化，新的细胞集合体出现在视野中心。细胞彼此之间的粘附很可能是由细胞不能附着在海藻酸盐支架上所致。
原始细胞浓度和支架多孔结构会影响接种细胞的分布。与孔隙较大支架的聚集体相比，孔隙越小，具有较少细胞的细胞聚集体越多。支架的孔隙越大，细胞集落越大，而数目较少。以上表明本发明的三维支架可用于细胞接种、三维细胞生长和细胞培养。
           实施例8.在本发明修饰支架上进行细胞培养
海藻酸盐和透明质酸交联的冻干水凝胶支架，在酸性缓冲液中用0.1mg/ml的胶原I溶液浸渗。浸渗的支架可不经洗涤，或用PBS和水洗涤4小时。将洗涤或未经洗涤的支架置于-70℃冷冻数小时，冻干。
50μl胰蛋白酶消化的4×106细胞/毫升的MC3T3细胞，用p200移液器向各支架上接种，得到每支架约200,000个细胞的细胞密度。用移液吸头吸取细胞悬液，在吸头末端刺穿支架的同时将细胞悬液注入支架内。接种有细胞的支架转移到含200μl培养基(aMEM+10％FBS)的平板内，在37℃孵箱中维持并连续观察。
细胞可经胰蛋白酶消化，收集并计数细胞生长。或者，在显微镜下观察支架上生长的细胞，每天采样用于细胞形态和细胞生长检查。有细胞生长的支架，可采用常规方法例如MTT染色，测定细胞存活力。在相同条件下，观察没有接种任何支架的细胞悬液作为对照。使用利用分子探针的L-3224试剂盒测定细胞存活力。
在本发明用胶原修饰的海藻酸盐或透明质酸支架上，观察到细胞粘附和细胞生长，而无胶原支架不支持细胞粘附和细胞生长。细胞在修饰的支架上附着并扩展，这是细胞增殖所必需的，而在未修饰的支架上，细胞以多细胞聚集体形式存在，因为它们不能粘附到支架上。
本发明有非共价修饰ECM分子的支架支持细胞粘附和细胞生长，而未修饰支架不支持细胞粘附和细胞生长。因此，本发明的非共价修饰方法可增强例如细胞的细胞粘附和细胞生长等功能。
       实施例9.在本发明修饰支架上进行细胞培养
用纤连蛋白(人纤连蛋白于PBS中，购自Becton DickinsonLabware)或牛血清白蛋白(BSA，fraction V，Sigma IIA-7906)修饰水凝胶海藻酸盐支架。纤连蛋白属ECM蛋白，已知可促进细胞粘附和细胞附着，而BSA是一种大小类似于纤连蛋白的大蛋白，不具有支持细胞粘附和细胞附着的任何已知特性。用于浸渗支架的纤连蛋白和BSA溶液的浓度均为100μg/ml。支架经溶液浸渗后，冷冻并冻干。
然后向支架上接种MC3T3细胞，100,000细胞/支架。接种有细胞的支架在适当条件下培养并连续观察，最后通过MTT染色测定细胞存活力。
如图3所示，在本发明的纤连蛋白-修饰的支架上观察到细胞粘附，而用白蛋白修饰的支架或未修饰的支架不支持这种细胞的粘附或促进细胞粘附。在本发明的纤连蛋白修饰的支架上观察到细胞生长，而在用白蛋白修饰的支架或未修饰的支架不支持细胞生长。
         实施例10.在本发明阵列支架中进行细胞培养
聚苯乙稀滑面用聚乙烯亚胺(PEI)和透明质酸(HA)包被。使用来自Grace Biolab的护面(masks)排列EDC/AAD交联的HA的支架。
冻干的支架阵列用含有ECM分子的溶液水合，分别包括人纤连蛋白(100μg/ml，BD Labware)、小鼠层粘连蛋白(100μg/ml，BD Labware)、胶原IV(100μg/ml，BD Labware)。然后，冷冻并冻干该水合的支架阵列，得到修饰的支架阵列。
然后在支架上接种MC3T3细胞(2×106细胞/毫升)。用5毫升培养基注满滑面贮液槽(slide reservoir)，培养3-4天。细胞用MTT染色测定存活力。细胞也可用碘化丙锭染色，荧光染色核，在照相通用成像系统下观察。
如图4所示，细胞粘附着本发明修饰的微阵列支架，而在未修饰支架上没有观察到细胞附着或细胞生长。本发明ECM分子修饰的支架支持细胞粘附和细胞生长，而且这些修饰支架处于阵列中时，可用于筛选促进细胞粘附、细胞信号传递和/或细胞生长的微环境。
       实施例11.在本发明的修饰阵列支架上进行细胞培养
用100μg/ml人纤连蛋白，或100μg/ml小鼠层粘连蛋白(Gibep)，或50μg/ml Matrigel(Becton Dickinson)修饰本发明的阵列海藻酸盐支架。每一支架用1μl ECM或Matrigel溶液浸渗。
MatrigelTM是一种增溶化基膜制剂的商品化溶液，从富含细胞外基质组分的肿瘤，即Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取获得。MatrigelTM它的主要成份是层粘连蛋白，其次是胶原IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖。MatrigelTM还含有TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物以及其他EHS肿瘤中天然存在的生长因子。室温下，MatrigelTM聚合生成类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。因此MatrigelTM对于普通和转化的贴壁依赖性上皮细胞，以及其他类型细胞的附着和分化是有效的，所述的其它细胞类型包括但不限于神经细胞、肝细胞、支持细胞、乳腺上皮细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞和毛囊细胞。
每支架接种有100,000个HEPG2细胞或MC3T3细胞的支架，在含10％血清的培养基中培养1周。维持支架并连续观察。细胞经MTT染色测定细胞存活力，并也可用相差显微镜记录。
本发明ECM或Matrigel修饰的支架支持来自不同组织(肝细胞和成骨细胞)和不同种属(小鼠和人)细胞的细胞粘附和细胞生长。修饰的支架阵列容许对适于不同细胞类型细胞培养的微环境，以及不同细胞培养环境进行高平行和高通量的筛选。
       实施例12.在本发明的修饰阵列支架上进行细胞培养
用处于PBS中的100、30、10、3和1μg/ml的人纤连蛋白，或处于PBS中的100、30、10、3和1μg/ml的小鼠层粘连蛋白(Gibco)或100、30、10、3和1μg/ml的小鼠胶原IV修饰本发明的阵列海藻酸盐支架。
在支架上接种细胞，每支架100,000细胞，培养并连续观察。本发明ECM修饰的支架支持各种浓度细胞的细胞粘附和细胞生长。修饰的支架阵列容许对适于各种细胞类型细胞培养的微环境，以及各种细胞培养环境进行高平行和高通量的筛选。

Claims (27)

1.制造细胞培养环境的方法，该方法包括：
a)交联多聚物形成水凝胶；
b)在该水凝胶内形成孔；及
c)在该水凝胶内非共价掺入至少一种生物活性分子。
2.权利要求1所述的方法，其中所述多聚物选自海藻酸盐、修饰的海藻酸盐、透明质酸、修饰的透明质酸、琼脂糖、胶原、脱乙酰壳多糖、壳多糖、聚乙烯醇、聚碳酸亚丙基酯、多羟丁酸、基于氨基酸的聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚HEMA、PTFE、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚富马酸酯或基于聚丙二醇的多聚物，以及其衍生物。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的形成孔包括冷冻和冻干该水凝胶。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的非共价掺入所述至少一种生物活性分子包括：用含有所述的至少一种生物活性分子的溶液水合所述冻干水凝胶，并干燥和冻干该水合的多孔水凝胶。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的至少一种生物活性分子选自细胞外基质分子(ECM)、生长因子、细胞信号分子及其衍生物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述至少一种生物活性分子包括至少一种细胞外基质分子(ECM)和至少一种细胞信号分子。
7.权利要求6所述的方法，其中所述ECM选自：纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、血小板反应蛋白1、玻连蛋白、弹性蛋白、肌腱蛋白、聚集蛋白聚糖、集聚蛋白、骨唾液蛋白、软骨基质蛋白、fibronogen、纤维蛋白、fibulin、粘蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白、纤维溶酶原、restrictin、丝甘蛋白聚糖、SPARC/骨连接蛋白、多功能蛋白聚糖、von willebrand因子、硫酸肝素多糖、hyaluronan，分区蛋白、骨桥蛋白、骨连接蛋白、细胞粘附分子、钙粘蛋白、连接蛋白和选择素。
8.权利要求5所述的方法，其中所述生长因子选自酸性成纤维生长因子、碱性成纤维生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、转化生长因子-β、造血生长因子和白细胞介素。
9.细胞培养环境，包括：多孔水凝胶支架和至少一种生物活性分子，其中所述至少一种生物活性分子非共价结合于该多孔水凝胶支架上。
10.权利要求9所述的细胞培养环境，其中所述水凝胶包括多聚物，其选自海藻酸盐、修饰的海藻酸盐、透明质酸、修饰的透明质酸、琼脂糖、胶原、脱乙酰壳多糖、壳多糖、聚乙烯醇、聚碳酸亚丙基酯、多羟丁酸、基于氨基酸的聚碳酸酯，聚氯乙烯、聚HEMA、PTFE、聚乙二醇聚甲基丙烯酸甲酯、聚富马酸酯、基于聚丙二醇的多聚物及其衍生物。
11.权利要求9所述的细胞培养环境，其中所述水凝胶为共价交联。
12.权利要求9所述的细胞培养环境，其中所述至少一种生物活性分子选自细胞外基质分子(ECM)、生长因子、细胞信号分子及其衍生物。
13.权利要求12所述的细胞培养环境，其中至少一种生物活性分子包括至少一种细胞外基质分子(ECM)和至少一种生长因子。
14.权利要求13所述的细胞培养环境，其中所述ECM选自：纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、血小板反应蛋白1、玻连蛋白、弹性蛋白、肌腱蛋白、聚集蛋白聚糖、集聚蛋白、骨唾液蛋白、软骨基质蛋白、fibronogen、纤维蛋白、fibulin、粘蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白、纤维溶酶原、restrictin、丝甘蛋白聚糖、SPARC/骨连接蛋白、多功能蛋白聚糖、von willebrand因子、硫酸肝素多糖、hyaluronan、分区蛋白、骨桥蛋白、骨连接蛋白、细胞粘附分子、钙粘蛋白、连接蛋白和选择素。
15.权利要求13所述的细胞培养环境，其中所述生长因子选自酸性成纤维生长因子、碱性成纤维生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、转化生长因子-β、造血生长因子和白细胞介素。
16.一种阵列，其包含权利要求9所述的细胞培养环境。
17.权利要求16所述的阵列，其中所述阵列包含一种以上的所述细胞培养环境，所说的一种以上的细胞培养环境中的每一种均由相同组分组成。
18.权利要求16所述的阵列(支架)，其中所述阵列包含一种以上的所述细胞培养环境，所说的一种以上的细胞培养环境中的每一种均由已知组份组成。
19.细胞培养方法，包括：
a)向权利要求9所述的细胞培养环境中接种细胞；和
b)在适当的细胞培养条件下，在所述细胞培养环境内维持所述细胞。
20.测定对至少一种测试分子  响应的细胞功能的方法，该方法包括：
a)向权利要求9所述的细胞培养环境中接种细胞，其中所述至少一种非共价结合的生物活性分子为所述的测试分子；
b)在适当的细胞培养条件下，在所述细胞培养环境内维持所述细胞；和
c)确定该培养细胞对在所述细胞培养环境中进行所述维持的响应。
21.权利要求20所述的方法，其中所述细胞体外接种。
22.权利要求21所述的方法，其中所述适当的条件包括细胞培养条件。
23.权利要求20所述的方法，其中所述细胞体内接种。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的在适当条件下维持所述细胞包括在受试者内维持所述的细胞培养环境。
25.用于生产基于细胞的体内移植物的方法，该方法包括：
a)在体外环境中，在权利要求9所述的细胞培养环境内接种细胞；并且
b)在适当的细胞培养条件下在所述细胞培养环境中维持所述细胞。
26.试剂盒，包括
a)多聚物，该多聚物能够形成多孔水凝胶；和
b)至少一种生物活性分子，
该试剂盒用于产生细胞培养环境。
27.权利要求26所述的试剂盒，其中所述多聚物以多孔水凝胶的形式存在。
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