KR101219646B1 - 아가로스를 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 3차원 지지체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아가로스를 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 3차원 지지체에 관한 것이다.
본 발명의 다공성 3차원 지지체의 제조방법은 공극 유도 물질인 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조한 후, 이를 지지체를 형성하는 생체재료의 주원료와 함께 성형틀에 주입하여 가압성형하는 단계와 상기 성형물을 급속 냉각한 후, 동결건조시킨 다음 이를 에탄올로 고정시킨 후, 50℃ 이상의 물에 담구어 아가로스를 제거함으로써 다공성 및 통기성이 형성된 3차원 지지체를 제조하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 지지체 내부에 공극뿐 아니라 공극 간의 연결 통로가 형성되도록 한 다공성 3차원 지지체의 제조방법이 제공되며, 지지체 표면에 부착한 조직의 세포가 지지체 내부로 침투하는 효과를 증대시킬 수 있게 되어 재생의 효율을 증대시킬 수 있는 다공성 3차원 지지체가 제공된다.

Description

아가로스를 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 3차원 지지체{METHOD FOR THE PREPARATION OF 3D SCAFFOLDS WITH POROSITY USING THE AGAROSE, 3D SCAFFOLDS WITH POROSITY PREPARED BY THE SAME}

본 발명은 아가로스를 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 3차원 지지체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아가로스를 이용하여 공극 및 통기성 조절 효과를 증대시킨 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 3차원 지지체에 관한 것이다.

일반적으로, 가열 시 아가로스는 물에 녹는 성질과 생체적합성 등 중요한 특징을 가지므로 재생의학, 약물탐색, 바이오센서와 같은 여러 다양한 생물학 연구 분야에서 중요한 재료로 사용되고 있다.

본 발명과 같은 분야로 재생의학을 위한 연구 및 개발 측면에서 보면 아가로스는 뼈, 연골, 간, 뇌, 기타 장기 등 여러 형태의 조직재생연구에 사용되어 오고 있다.

고분자 생체재료인 실크, 인회석(apatide, 아파타이트), 콜라겐, 수산화인회석(HA, hydroxyapatite), 그리고 칼슘포스페이트(calcium phosphate) 등은 인체에서 조직을 대신하거나 재생을 돕는 방식으로 현재 많이 응용되고 있다.

특히 조직재생 분야에 응용되는 생체재료의 경우 인체에 적용 시 세포의 증식 및 침투를 통하여 결손된 조직의 재생을 돕고자 함이 주요 목적이다.

이를 위하여 생체재료는 세포가 침투하고 증식할 수 있는 공간이 필요하며 이러한 공간을 만들어 주기 위하여 생체재료 제조 시 염을 처리하는 방법이 주로 이용되고 있다.

그러나 염을 이용한 지지체 제조방법은 공극의 크기를 조절할 수 있다는 장점이 있으나 염과 염사이의 공극 간의 연결, 즉 통기성이 부족하다는 단점을 가지고 있다.

이러한 통기성 조절 효율의 저하는 결과적으로 지지체 외부의 세포가 지지체 내부로 침투하지 못하는 결과를 가져와 실제 인체적용에서 조직의 재생효율을 떨어뜨리는 결과를 초래하게 된다.

즉, 기존의 개발방법은 세포부착 및 증식효과 증대를 위하여 지지체 외부에 생착한 세포가 내부로 침투하는 기능이 결여가 되어있으며 이와 같은 이유로 조직재생을 목적으로 하는 의료용소재개발에는 지극히 제한적인 한계를 나타내고 있다.

본 발명은 상기 종래의 지지체가 가지는 문제점을 해소하기 위한 것으로서, 저온의 온도에서 물에 녹는 성질을 가지는 아가로스를 이용하여 통기성이 우수한 다공성 3차원 지지체를 제조하는 방법을 안출해내고, 이를 통해 세포부착과 증식 효과를 증대시킨 다공성 3차원 지지체를 제공하게 된다.

본 발명의 다공성 3차원 지지체의 제조방법은 공극 유도 물질인 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조한 후, 이를 3차원 지지체인 생체재료의 주원료 (본 고안에서는 실크를 이용한 3차원 지지체 제조)에 혼합하여 준다.

이때 주원료에 적당한 비율로 첨가된 하이드로 겔은 실제 주원료의 분자와 분자 사이에 위치하게 된다.

이를 성형틀에 주입하여 가압성형한 후, 급속히 냉각 (4℃)하여 하이드로 겔과 원재료가 서로 분리되는 것을 방지한다. 다음으로 동결건조한 지지체는 에탄올을 사용하여 고정하고, 이를 50℃ 이상의 물에 담구어 아가로스를 제거함으로써 다공성 및 통기성이 형성된 3차원 지지체를 제조하는 것으로 구성된다.

상기 아가로스 겔에는 아가로스가 0.5 ~ 2.0 질량%의 농도로 함유되는 것이 특징이다.

상기 성형틀에 주입시, 염을 추가로 첨가하여 제조하기도 한다.

상기 지지체를 형성하는 주재료로 실크 피브로인을 사용함을 특징으로 하며,이때, 상기 아가로스겔과 실크 피브로인은 1 : 1 ~ 5 중량비로 구성되는 것이 특징이다.

본 발명의 다공성 3차원 지지체는 아가로스를 이용하되, 상기 제조방법에 의해 제조됨으로써, 공극이 형성되며, 우수한 통기성을 갖는 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 지지체 내부에 공극뿐 아니라 공극 간의 연결 통로가 형성되도록 한 다공성 3차원 지지체의 제조방법이 제공된다.

또한, 지지체 표면에 부착한 조직의 세포가 지지체 내부로 침투하는 효과를 증대시킬 수 있게 되어 재생의 효율을 증대시킬 수 있는 다공성 3차원 지지체가 제공된다.

도 1은 아가로스를 이용한 다공성 3차원 지지체 개발 모식도.
도 2는 아가로스 제거 후 지지체의 물리적 크기 변화를 나타낸 도면.
도 3은 지지체로서 공극과 통기성에 대한 물리적 성질을 나타낸 도면.
도 4는 아가로스 겔을 이용한 지지체의 공극형성정도를 전자현미경으로 나타낸 도면.
도 5는 아가로스 겔 처리 농도별 공극형성비율을 나타낸 도면.
도 6은 아가로스 겔 처리 비율별 공극형성비율을 나타낸 도면.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

조직재생을 위한 생체재료로서 3차원 지지체는 결손된 조직의 수복에 효과적으로 작용하여 손상된 조직을 보호할 뿐 아니라 재생을 유도하는 것으로 알려져 있다.

이에 여러 생체적합성 고분자물질들을 이용한 지지체에 대하여 여러 발명이 진행되고 있다.

그러나 이러한 지지체들은 필수 요소인 통기성과 일부 유사한 물리적 특성이 부족하여 실질적인 응용에 한계를 가지고 있다.

따라서, 본 발명에서는 생체적합성이라는 생물학적인 특성을 가지는 아가로스를 이용하여 3차원 세포배양 지지체 제조에 응용함으로써 통기성을 증가시키는 특성을 나타내는 제조방법을 확립하였고, 이와 동시에 세포의 침투가 가능하도록 다공성과 통기성을 동시에 가지는 지지체 조성을 개발함으로써 재생의학의 기본이 되는 3차원 배양기술을 한 단계 더 발전시키기 위한 새로운 발명으로서의 충분한 가치를 띄게 된다.

또한, 3차원 세포배양을 위한 지지체가 가져야 할 중요한 물리적인 요소는 공극의 크기, 통기성, 그리고 지지체의 강도와 연성 등이 있다.

우선 공극의 크기와 공극간의 연결 통로인 통기성은 세포가 지지체에 접착하여 증식하기 위한 가장 중요한 요소이다.

기존에는 공극을 조절하는 방법으로는 염을 주로 사용하는데 이는 크기를 조절할 수 있고 물에 잘 녹는 특성을 이용하여 쉽게 지지체에서 제거할 수 있기 때문이다.

그러나, 현재 아직까지도 통기성 조절이 어려운 지지체는 외부에 부착 및 증식된 세포가 지지체의 내부로는 침투하지 못하는 문제점을 가지고 있다.

결국 이런 문제로 인하여 의료용 신소재 개발이 더딘 것이 사실이다.

본 발명은 수화 아가로스 이용하거나 상기와 같은 염을 함께 이용하여 제조된 3차원 구조의 지지체에서 공극 및 통기성을 조절하는 방법을 개발한 것으로서 여러 다양한 세포 배양 및 조직 재생이 가능하도록 하기 위하여 다음과 같은 발명의 특징을 가지고 있다.

첫째, 최적의 공극과 통기성을 조절할 수 있는 3차원 세포배양 지지체 조성을 확립

둘째, 효과적으로 아가로스 겔과 염을 제거하기 위한 조건을 확립

셋째, 기존의 방법과 비교하여 아가로스 겔로 통기성을 향상시킨 본 발명의 지지체의 경우 대상 세포의 부착 및 증식율 증가 효과

마지막으로, 다양한 세포의 증식을 통한 조직 재생 효과 도입 등 이상의 차별적 특징을 가진다.

구체적으로 설명하면, 본 발명에서는 3차원 지지체 제조 시 다공성과 통기성 부여의 물질로서 수화 아가로스를 이용하여 3차원 세포배양 구조체로서 지지체를 제조하는 방법을 발명한 것이다.

이를 검증하고자, 본 발명에서는 대조군으로서 순수 실크만을 사용하여 제조한 3차원 지지체와 실크와 아가로스 겔의 비율을 각 1:1부터 8:1까지 다양화하여 특성을 비교함은 물론 아가로스의 농도별 (0.5 질량%에서 2.0 질량%까지)로 지지체 제조방법을 달리하여 하기의 실험단계들을 통해 다공성과 통기성을 관찰하여 비교·분석하였다.

1) 실크용액에 수화 아가로스를 다양한 농도와 비율로 혼합한 후 성형하여 지지체를 제조하는 단계,

2) 상기 단계 1)에서 제조된 지지체에 에탄올을 처리하여 고정하고 멸균한 다음 그 구조적 특성을 비교하는 단계

3) 상기 단계 2)에서 제조된 지지체에 저온 온수를 첨가하여 아가로스를 제거하는 조건을 확립하는 단계

4) 상기 단계 3)에서 건조 과정을 통하여 대조군인 실크만을 사용한 재료와 비교하여 형태적 변화를 측정하는 단계

5) 상기 단계 4)에서 확인된 지지체에 전자현미경을 통하여 대조군과 아가로스 겔을 혼합한 각 지지체의 공극 및 특성 비교 단계

6) 상기 단계 4)에서 배지에 적응된 각 지지체의 공극 및 특성 비교 단계

7) 상기 단계 4)에서 각 지지체의 에탄올 흡수율을 측정하여 공극 및 통기성을 비교하여 가장 이상적인 제조비율을 확립하는 단계

상기 실험결과를 토대로, 본 발명에서 제조된 3차원 지지체에는 통기성과 공극형성이라는 두 장점을 동시에 부여됨으로써 조직재생을 목적으로 하는 의료용소재 개발의 개선된 제조 방법으로 적용가능하게 된다.

즉, 조직공학적 방법을 통하여 개발하고자 하는 의료용 소재로서 조직 재생을 위한 세포가 쉽게 지지체 내부로 침투할 수 있도록 하여 재생의학의 효과를 증대시키는 중요 수단으로서의 가치를 가짐을 알 수 있다.

또한, 아가로스와 공극을 조절하는 방법으로 사용되었던 염(염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 등과 같은 염)을 함께 사용하여 제조된 지지체의 경우 염처리만을 사용하여 제조한 지지체와는 달리 다공성과 통기성을 동시에 가짐으로써 3차원 세포배양을 가능하게 한 것만으로도 중요한 발명되며, 제조 시 발생할 수 있는 잔류성 문제있어서도 아가로스는 천연고분자이기 때문에 생체적합성을 가지기 때문에 이 문제에 대해서도 문제점이 없음을 알 수 있다.

이에 더 나아가 개발된 재료는 실제 인체적용에서 손실된 조직의 수복율을 증가시킬 수 있다는 것 역시 중요한 본 발명의 특징이자 효과이다.

따라서, 본 발명을 적용한 의료용 소재개발에서도 기존 개발 방법에서 사용되어진 염 처리방법의 한계를 극복하여 다양한 개발에 폭넓게 적용하는 효과를 기대할 수 있게 된다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 염처리 또는 수화 아가로스 병합을 통한 다공성과 통기성 지지체 확인

도 1은 3차원 지지체 제조 시 기존의 방법이 염을 처리하는 방법과 본 발명의 특징인 아가로스 겔을 이용하는 방법의 차이를 나타낸 모식도로서, 이를 통해 본 발명의 특징인 통기성 조절의 효과를 예측할 수 있었다.

기존의 3차원 지지체는 제조 과정에 염을 처리함으로써 공극의 크기를 조절한다.

즉, 해당하는 공극의 크기는 지지체 사용 시 첨가한 염의 크기와 동일함을 알 수 있다.

또한, 천연 고분자인 실크 뿐 아니라 여러 합성 고분자 재료를 이용한 3차원 지지체 제조에서 동일한 방법을 사용하고 있다.

이 경우 장점은 비교적 간단하게 (염이 물에 잘 녹기 때문에 이 특성을 이용해 제조 과정에서 물을 첨가하여 염을 녹여내면 끝나는 단순한 과정) 염을 제거 할 수 있고 공극의 크기를 일정하게 마음대로 조절 할 수 있다는 것이다.

다만 문제는 이 방법을 사용할 경우 공극과 공극간의 연결 통로인 통기성을 조절 할 수 없음이 단점이다.

통기성은 3차원 지지체에서 세포가 증식하고 이동하기위한 중요한 통로로서 인간의 신체로 치면 혈관과 같은 기능을 가지는 것이다.

즉 통기성이 없다면 외부에 부착된 세포가 지지체 내부로 이동이 불가능하여 지지체로서 역할이 어렵고 결국은 사용 범위가 제한적일 수 밖에 없다.

이러한 기존 3차원 지지체 제조방법 (염을 이용하는 방법)의 단점을 극복한 것이 본 발명이다.

아가로스 겔은 수화겔로서 온도에 의해 고체와 액체의 조절이 가능하다.

3차원 지지체 제조 과정에서 염을 처리하는 방법과 동일하게 수화된 아가로스 겔 (Hydrogel)을 염과 함께 처리 한 다음 염처리만을 이용한 방법과 유사하게 50℃ 이상의 물에서 녹여내면 된다.

이때 사용된 수화 아가로스 겔은 액체 상태로 함께 지지체로 제조되기 때문에 비율에 따라 내부에 고르게 존재할 수 있게 되고 상온 이하의 온도가 되면 고체상으로 다시 고온의 물을 처리하면 다시 수화되어 지지체 본 재료의 손실 없이 제거가 가능해 진다.

이 경우 결과적으로 제거된 아가로스 겔 만큼의 지지체 내부 공극 및 통기성이 되는 것이다.

본 설명과 같이 아가로스 겔과 염을 동시에 처리하면 통기성과 공극조절의 동시효과를 나타내게되어 3차원 지지체의 효용 및 범위를 증대시키는 결과를 가져온다.

1) 염처리 단독 지지체 : 지지체 제조를 위한 주재료(실크 피브로인 등)에 원하는 공극 크기의 염을 처리하였다.

이후 성형틀에서 고정하고 고체화한 지지체는 물을 첨가해 줌으로써 염을 제거 할 수 있게 되었다.

염이 제거된 지지체는 주재료 이외에 염이 제거된 만큼의 공극이 발생하였다.

2) 아가로스 겔과 염 동시 처리 지지체 : 공극 유도 물질인 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조한 후, 이를 생체재료의 주원료 실크에 혼합하였으며, 이때 주원료에 첨가된 하이드로 겔은 상기 주원료의 분자와 분자 사이에 위치하게 된다.

여기서 염을 추가로 첨가하여 혼합재료를 제조하였다.

상기 혼합재료를 성형틀에 주입하여 가압성형한 후, 급속히 냉각 (4℃)하여 하이드로 겔과 원재료가 서로 분리되는 것을 방지한 다음으로 동결건조한 지지체는 에탄올을 사용하여 고정하고, 이를 50℃ 이상의 물에 담구어 아가로스를 제거함으로써 다공성 및 통기성이 형성된 3차원 지지체를 제조하였다.

여기서 50℃ 이상의 물에서 녹여내면 지지체는 주재료 이외에 아가로스와 염이 제거된 만큼의 공극이 발생하였다.

이 경우 지지체는 위의 경우와 달리 통기성을 동시에 가지게 됨을 알 수 있었다.

<실시예 2> 아가로스 제거 후 지지체 물리적 크기 변화

1. 실험방법

실크 피브로인 용액과 1 질량%의 수화 아가로스 겔을 2:1 중량비로 첨가하여 12-well culture plate를 사용하여 성형하였고 우선 4℃에서 1 질량%의 수화 아가로스 겔이 고체의 겔화가 되도록 하였다.

다음으로 동결건조 방법을 사용하여 지지체를 제조하였고 에탄올을 1시간 동안 첨가하였으며 이후 완전히 에탄올이 제거될 수 있도록 건조하였다.

다음으로 건조된 지지체는 아가로스 겔을 제거하기 위하여 50℃의 수조에서 8시간 동안 담가두었다.

이를 건조한 최종 결과물이 도 2에서 나타낸 바와 같다.

3. 실험결과

도 2에 나타나 있듯이, 아가로스를 제거전과 비교하여 아가로스가 제거된 다음의 지지체는 그 크기가 현저히 줄어 들었음을 알 수 있었다.

이는 지지체 내부에 존재하던 아가로스의 양 (약 50%, 2:1의 비율이기 때문에)이 제거되었기 때문이다.

도 2에 나타낸 지지체는 완전히 건조된 형태를 보이는 것으로서 다시 배지 등을 첨가할 경우 내부의 통기성 만큼의 액체가 스며들어 원상태의 부피로 회복가능하게 된다.

이는 본 발명의 지지체 내부에 공극 및 통기성이 존재함을 보여주는 결과이다.

<실시예 3> 본 발명인 지지체로서의 공극과 통기성에 대한 물리적 성질 비교

상기 실시예 2의 결과를 토대로 지지체 주재료인 실크 피브로인과 아가로스의 비율을 1:1로 하여 지지체를 제조하였다.

그 결과, 도 3에 나타나 있듯이, 건조된 경우 그 부피가 줄어든 현상을 보이나 다시 수분을 재흡수한 지지체의 경우 부피가 내부 공극과 통기성의 크기만큼 확장되는 현상을 나타냄을 알 수 있었다.

이는 본 발명의 지지체 내부에 공극 및 통기성이 존재함을 보여주는 결과이다.

<실시예 4> 아가로스를 이용한 지지체의 공극형성정도 확인

상기 실시예 3의 결과에 대한 정확한 공극 및 통기성의 크기를 비교하기 위하여 전자현미경을 사용하여 공극형성정도를 확인하였다.

전자현미경 촬영에 사용된 지지체는 도 2의 지지체의 건조된 상태의 지지체를 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타나 있듯이, 아가로스를 이용할 경우 공극과 통기성의 조절에 효과가 있음을 알 수 있었다.

즉, 지지체 제조 시 사용되는 염의 역할과 동일하게 아가로스 겔 역시 동일한 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 아가로스 처리 농도별 공극형성비율 분석

도 3에서 보여준 것과 같이 제조된 지지체들에서 아가로스 겔의 농도에 따른 효과를 검증하였다.

아가로스 겔의 비율이 높을수록 그만큼 지지체 내부에 혼합되는 아가로스의 양이 많아지고 이를 제거할 경우 아가로스 겔의 농도만큼 공극과 통기성이 발생하는 원리이다.

도 3의 지지체에서 건조된 지지체의 무게를 일단 측정하였다.

이후 건조된 지지체에 에탄올을 첨가하여 지지체가 완전히 에탄올을 흡수할 수 있도록 하였고 이에 대한 에탄올이 흡수된 지지체 무게를 각각 측정하였다.

순수 실크만을 이용해 제조한 지지체의 무게변화를 1로 보았을 때 각 지지체가 나타낸 무게의 변화를 비율로 표시하였다.

그 결과, 도 5에 나타나 있듯이, 아가로스를 0.5 질량% 보다 1.0 질량% 이상 처리된 지지체에서 공극율 및 통기성이 향상되는 결과를 확인할 수 있었다.

그러나 1.0 질량%와 1.5 질량%는 동일한 효과를 보였으며 2.0 질량%는 이 보다 감소하였다.

따라서, 1.0 질량% 농도의 아가로스 겔이 지지체 제조 시 공극 및 통기성 조절에 가장 효과적임을 알 수 있었다.

<실시예 6> 아가로스 처리 비율별 공극형성비율 분석

도 3에서 보여준 것과 같이 제조된 지지체들에서 실크 피브로인 용액과 아가로스 겔 용액의 비율에 따른 효과를 검증하였다.

도 3의 지지체에서 건조된 지지체의 무게를 일단 측정하였다.

이후 건조된 지지체에 에탄올을 첨가하여 지지체가 완전히 에탄올을 흡수할 수 있도록 하였고 이에 대한 에탄올이 흡수된 지지체 무게를 각각 측정하였다.

순수 실크만을 이용해 제조한 지지체의 무게변화를 1로 보았을 때 각 지지체가 나타낸 무게의 변화를 비율로 표시하였다.

그 결과, 도 6에 나타나 있듯이 아가로스의 비율이 높을수록 즉 양이 많을수록 공극율과 통기성이 우수함을 확인할 수 있었다.

따라서, 아가로스 겔 용액은 3차원 지지체 제조 시 공극형성을 유도함으로써, 이는 기존의 방식인 염 처리의 효과와 유사함을 알 수 있으며, 특히 본 발명의 가장 큰 특징인 통기성 조절에 효과적임을 알 수 있었다.

Claims (6)

1. 공극 유도 물질인 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조한 후, 이를 지지체를 형성하는 조직재생용 생체재료와 함께 성형틀에 주입하여 가압성형하는 단계; 및
   상기 성형물을 급속 냉각한 후, 동결건조시킨 다음 이를 에탄올로 고정시킨 후, 50℃ 이상의 물에 담구어 아가로스를 제거함으로써 다공성 및 통기성이 형성된 3차원 지지체를 제조하는 단계;를 포함하여 구성되는,
   다공성 3차원 지지체 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 아가로스 겔에는 아가로스가 0.5 ~ 2.0 질량%의 농도로 함유됨을 특징으로 하는,
   다공성 3차원 지지체 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 성형틀에 주입시, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 중 선택된 염을 추가로 첨가하여 제조됨을 특징으로 하는,
   다공성 3차원 지지체 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 생체재료는 실크 피브로인(silk fibroin)인,
   다공성 3차원 지지체 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 아가로스 겔과 상기 실크 피브로인은 1 : 1 ~ 5 중량비로 구성됨을 특징으로 하는,
   다공성 3차원 지지체 제조방법.
6. 삭제

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