KR20050071520A - 프로그램 가능한 스캐폴드 및 이의 제조 및 이용 방법 - Google Patents

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KR20050071520A
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cells
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존 로울리
모하메드 헤이드아란
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벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니
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Abstract

본 발명은 상호연결된 공극 및 그 내부에 물리적으로 포획된 생물학적으로 활성인 분자를 갖는 3차원의 스캐폴드인 프로그램 가능한 스캐폴드에 관한 것이다. 스캐폴드는 중합체의 동결건조된 히드로겔이다. 스캐폴드는 플랫폼 상의 어레이에 이용될 수 있으며, 고처리량 및 평형 스크리닝뿐만 아니라 조직 공학을 위해 다양한 조합의 생물학적으로 활성인 분자로 로딩될 수 있다. 본 발명은 또한 스캐폴드의 제조 및 변형 방법에 관한 것이다.

Description

프로그램 가능한 스캐폴드 및 이의 제조 및 이용 방법{Programmable scaffold and methods for making and using the same}
본 발명은 세포 배양용 스캐폴드 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 배양 및 조직 공학용 미세환경의 최적화를 위한 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 분자 및/또는 생물영향(bioaffecting) 분자를 이용하여 프로그램 가능한 스캐폴드에 관한 것이다.
생물학적 연구 및 산업적인 응용에 대한 중요한 도구로서 세포 배양은 전형적으로 세포 부착을 지지하고, 세포 성장용 보조제를 포함하는 배양 배지에서 부착성 세포를 담그는 세포 배양 장치의 표면을 화학적으로 처리함으로써 수행된다. "고정의존성"은 고정 의존성 세포가 고체 표면에 부착될 때 배양에서 단지 분열하며; 세포는 임의의 부착 없는 액체 현탁액에 있을 때에는 분열하지 않는다는 것을 제공한다. 세포 부착의 부위는 개개의 세포를 펼쳐지게 하고, 더욱 많은 성장 인자 및 영양물을 포획하고, 이의 세포골격을 조직화하고, 세포내 액틴 필라멘트 및 세포외 기질 분자에 대한 고정을 제공하게 한다. 그리하여, 충분한 세포 부착을 제공하는 표면은 세포 배양 및 성장에 중요하다.
세포 부착 및 영양물외에, 호르몬 및 단백질 성장 인자가 세포 배양에서 포유동물 세포 성장을 지지하는데 필수적이다. 필요한 호르몬 및 성장 인자는 혈액이 응고된 후에 잔존하는 혈액 유래의 유체인 혈청에 포함된다. 혈청은 세포 성장을 위한 성장 인자의 조합을 포함한다. 혈청이 없는 포유동물 세포는 성장을 멈추고, Go 라 불리는 휴지기에서 유사분열 및 S 상 사이에 통상 정지되게 된다. 다양한 성장 인자가 혈청으로부터 확인되고, 분리되었으나; 여전히 생체내 환경을 적절하게 모방할 세포 배양 대체물을 제조하는 것은 어렵다. 혈청은 비싸며, 단백질 성장 인자가 빨리 성장하는 세포에 의해 신속하게 흡수될 때, 1-3일 마다 교체되어야 할 필요가 있다. 그리하여, 혈청의 부재하에 세포 부착을 촉진하는 세포 배양 시스템을 개발하는데 노력해왔다.
조직 공학은 천연 조직을 재생하는 전략이다. 조직 공학의 내용에서 세포 배양은 추가로 세포 지지체용 3차원의 스캐폴드를 요구한다. 3차원의 다공성 구조를 갖는 스캐폴드는 많은 조직 배양 응용, 예를 들면, 연골세포 배양에서 전제조건인데, 이는 상기 세포가 그렇지 않으면 2차원의 단층 세포 배양에서 이의 세포 형태 및 표현형 발현을 상실하기 때문이다. 천연 조직을 재생하기 위해, 3차원 기질의 품질이 세포 부착 및 성장에 매우 영향을 줄 수 있으며, 조직 재생 또는 합성의 성공을 결정할 수 있다. 최적의 기질 물질은 세포 결합, 세포 증식, 세포 특이적인 표현형의 발현, 및 세포의 활성을 촉진할 수 있다.
조직 공학 및 세포의 이식에서의 성공은 원하는 치료학적 이점을 전달하기 위해 생존능의 유지, 분화된 표현형, 및 몸과의 융화에 의존한다. 전구 세포의 모든 유형의 기능성 조직으로의 유지 및 발생은 상이한 세포 유형, 세포 유형의 조합, 물리적인 환경, 가용성 환경 및 적당한 세포 신호전달 및 세포 상호작용을 요구한다. 고처리량 및 고평형(high parallel) 스크리닝이 조직 발생에 대한 미세환경의 적당한 조합을 발견하기 위해 요구된다.
수 많은 세포 배양 및 조직 공학용 다공성 스캐폴드가 문헌에 개시되었다. Shea 등 (Nature Biotechnology, Vol. 17, 페이지 551-554 (June 1999))에는 기체 거품형성에 의해 제조되고, 플라스미드로 포획된 매우 다공성인 3차원의 폴리(락티드-코-글리콜리드) 스캐폴드가 개시된다. Petronis 등 (Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 12, 페이지 523-528 (2001))에는 간세포 시험관내 배양을 위한 밀리미터 이하 규모의 지형 구조를 갖는 티타니아 세라믹 스캐폴드가 개시되는데; 상기 티타니아 세라믹은 미세다공성이며, 생체적합성이며, 세포 응집에 도움이 된다. 스캐폴드의 제조 방법은 반복된 산화, 마스킹, 및 에칭을 요한다. Kim 등 (Fibers and Polymers 2001, Vol. 2, No. 2, 페이지 64-70)에는 생물학적 안정성을 증가시키고, 기계적 특성을 증진시키기 위해 EDC 및 NHS를 이용하여 동결건조 및 가교에 의해 제조된 3차원의 다공성 콜라겐/키토산 스폰지가 개시된다.
그러나, 상기 스캐폴드의 어느 것도 세포 부착을 지지하지 못한다. 강한 세포 부착이 요구될 때, 특히 상기 고정 의존성 포유동물 세포 배양에 대해, 스캐폴드는 세포 부착을 지지하도록 변형되어야 한다. 상기 문제를 해결하기 위해, 세포 부착 촉진 분자가 공유 결합에 의해 상기 스캐폴드 상에 고정화되어, 상기 세포가 리간드에 부착할 수 있게 된다. 예를 들면, Kobayashi 등 (Biomaterials 1991, Vol. 12 October, 747-751)에는 세포 부착을 촉진하기 위해 폴리(비닐 알코올)(PVA) 히드로겔의 표면 상에 디이소시아네이트, 폴리이소시아네이트, 및 시아노겐 브로마이드에 의한 세포-부착성 단백질의 공유 고정화가 개시된다. Kobayashi 등 (Current Eye Research Vol. 10, No. 10,1991, 899-908)에는 각막 세포 부착 및 증식을 촉진하기 위해 PVA 히드로겔 시트 상에 세포 부착성 단백질 및 분자의 공유 고정화가 개시된다. 그러나, 공유 변형은 스캐폴드 물질 및 리간드의 바람직한 물리적 및 화학적 성질을 변경할 수 있는 복잡성 및 가공 단계를 첨가한다. ECM 분자는 소수성 중합체, 예를 들면, PGA, PLA, PCL, 및 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌의 모든 공중합체 상에 무작위로 흡착될 수 있다는 것이 입증되었다. 그러나, 물리적인 흡착은 제어하기 어려운데, 이는 표면에 일정한 세포 부착을 요하는 방법 및 분석에서 이의 이용을 문제 있게 만든다.
도 1은 주사전자현미경하에 본 발명의 동결건조된 히드로겔 스캐폴드의 상호연결된 공극 구조를 나타낸다.
도 2는 접종시 본 발명의 스캐폴드를 통해 균일하게 분포되고 키운 MTT-염색된 MC3T3 세포를 보여준다.
도 3은 본 발명의 피브로넥틴-변형된 스캐폴드에서의 세포 부착 및 세포 성장을 보여주는 반면, 음성 대조군, 즉, 비변형된 스캐폴드 및 알부민-변형된 스캐폴드가 세포 부착 또는 세포 성장을 지지하지 않는다는 것을 보여준다.
도 4는 본 발명의 ECM 변형된 스캐폴드에서 세포 부착 및 세포 성장을 보여주는 반면, 음성 대조군, 즉, 비변형된 스캐폴드는 세포 부착 및 세포 성장을 지지하지 않는다는 것을 보여준다.
발명의 요약
본 발명은 세포 부착을 촉진하거나 또는 세포 신호전달 기능을 갖는 분자의 조합을 이용하여, 세포 배양용 프로그램 가능한 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 히드로겔을 포함하는 다공성 스캐폴드를 생성하고, 상기 다공성 스캐폴드를 생물학적으로 활성인 분자로 주입하는 것을 포함한다. 다음, 주입된 스캐폴드는 동결건조되거나 또는 건조되어 생물학적으로 활성인 분자는 상기 다공성 스캐폴드내에 포획된다. 주입된 스캐폴드는 필요시 동결건조 전에 염을 제거하기 위해 세정되며, pH 조절된다.
생성된 다공성 스캐폴드는 3차원의 세포 또는 조직 배양을 허용하며, 상호연결된 매우 다공성인 구조를 갖는다. 상기 다공성 스캐폴드는 중합체, 세라믹스, 금속, 또는 복합체를 포함하는 다양한 물질로 제조될 수 있다. 상기 물질은 생체적합성, 생분해성 또는 비생분해성일 수 있다. 상기 특성은 스캐폴드에 대한 최종적인 용도에 의존할 것이다.
허용가능한 중합체에는 알기네이트, 히알루론산, 아가로스, 콜라겐, 키토산, 키틴, 폴리트리메틸렌 카보네이트, 폴리 히드록시부티레이트, 아미노산 기재 폴리카보네이트, 폴리 비닐클로라이드, 폴리비닐 알코올, 폴리 메틸메타크릴레이트, 폴리 푸마레이트, 폴리HEMA, 폴리스티렌, PTFE, 폴리 에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜 기재 중합체 및 이의 유도체가 포함된다. 생분해성 중합체에는 폴리 락티드, 글리콜리드, 카프로락톤, 오르토에스테르, 및 이의 공중합체가 포함된다.
다공성 스캐폴드는 전형적으로 이에 제한되지 않고, 가교된 알기네이트, 변형된 알기네이트, 히알루론산 또는 변형된 히알루론산을 포함하는 중합체의 동결건조된 히드로겔이다.
생물학적으로 활성인 분자에는 세포외 기질 (ECM) 분자, 기능성 펩티드, 세포에 신호를 전달할 수 있는 프로테오글리칸 및 당단백질, 성장 인자, 최적 세포 기능을 위한 분자, 및 이의 조합 또는 유도체가 포함된다. ECM 분자에는 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 트롬보스폰딘 1, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 골 타액단백질, 연골 기질 단백질, 피브로노겐, 피브린, 피브룰린, 뮤신, 엔탁틴, 오스테오폰틴, 플라스미노겐, 레스트릭틴, 세르글리신, SPARC/오스테오넥틴, 베르시칸, 메로신, 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 폰 빌리브란트 인자, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알루론산, 카드헤린, 콘넥신, 셀렉틴을 포함하는 세포 부착 분자, 또는 이의 조합이 포함된다. 성장 인자에는 이에 제한되지 않고, 표피 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판 유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 형질전환 성장 인자-β, 조혈 성장 인자, 인터루킨, 및 이의 조합이 포함된다. 기타 성장 인자는 당업계에 주지되어 있다. ECM 및/또는 성장 인자(들)의 2개 이상의 분자의 조합은 또한 이용될 수 있는데, 이는 성장 인자와 근접하여 특정 세포 유형의 부착을 허용하며, 성장 인자 및 ECM 사이의 상호작용 연구를 허용하거나, 또는 제어된 성장 또는 선발을 허용한다. 따라서, 미세환경이 생성될 수 있다. 수 개의 또는 다스 또는 수 백의 상이한 유형의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 더욱 복잡한 미세환경이 또한 생성될 수 있다. 프로그램 가능한 스캐폴드는 신호 전달 경로의 활성화 또는 저해를 통해 세포에서 매우 특이적인 생물학적 반응의 야기와 관련된 사건의 연구를 허용한다.
또한, 프로그램 가능한 스캐폴드를 이용하여 조직 공학을 포함하는 다양한 목적을 위해 다양한 세포의 생존능, 표현형, 및 유전적 발현을 제어 및 유지하고, 고처리량 및 평형 스크리닝 방법을 포함하는 스크리닝 방법에 프로그램 가능한 스캐폴드를 이용하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한, 용액 스팟을 형성하기 위해 플랫폼 상에 적당한 중합체의 용액을 분배하고, 가교된 히드로겔의 스팟을 형성하기 위해 상기 용액 스팟을 가교하고, 가교된 히드로겔의 스팟을 동결건조하여 스캐폴드의 어레이를 형성하는 것을 포함하는 스캐폴드의 어레이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 가교 반응 혼합물은 디아민 및 카보디이미드를 포함할 수 있다. 상기 카보디이미드는 히알루론산 또는 알기네이트에 대해 약 25% 내지 약 200% 몰비, 더욱 특히 약 50% 내지 약 100% 몰비의 작용기의 양의 EDC일 수 있다. 라이신 또는 아디프산 디히드라지드와 같은 디아민은 히알루론산 또는 알기네이트에 대해 약 2% 내지 약 100% 몰비, 더욱 특히 약 10% 내지 약 40% 몰비의 작용기의 양일 수 있다. 상기 히드로겔 용액은 추가로 이에 제한되지 않고, 카보디이미드에 대해 약 1:50 내지 50:1, 바람직하게는 카보디이미드(EDC)에 대해 약 1:10 내지 4:1의 비로 HoBt, NHS, 또는 설포 NHS를 포함하는 공반응물(coreactant)을 포함할 수 있다.
프로그램 가능한 스캐폴드 및 이를 포함하는 어레이는 키트의 성분일 수 있다. 상기 키트는 전형적으로 원하는 작업, 예를 들면, 세포 또는 조직 배양 스크리닝 작업의 상황에서 이용 및 취급을 용이하게 하기 위해 디자인된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 키트는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 키트는 세포 배양 환경이 이용자의 특정 요구에 맞도록 수개의 생물학적으로 활성인 분자를 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 상호연결된 공극을 가지며, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 이용하여 비공유적으로 변형된 세포 배양용 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 상호연결된 공극 구조는 세포 및 조직 성장을 안내하고 지지한다. 상기 공극 구조는 그 위에 세포가 3차원적으로 자신의 ECM를 놓을 수 있는 물리적인 표면을 제공한다. 더욱이, 다공성 구조는 스캐폴드의 중심에 개선된 영양물 수송을 제공하며, 세포 집단 크기를 제한하여 영양의 부족으로 인한 괴사 중심으로 잠재적으로 발전할 수 있는 큰 세포 집단의 형성을 막을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명과 관련하여 이용된 3차원의 스캐폴드는 직경이 약 50 내지 약 700㎛, 특히, 약 75 내지 약 300㎛의 공극 크기를 갖는다. 생물학적으로 활성인 분자를 이용한 비공유 변형에 적합한 스캐폴드에서 다공률은 약 50% 내지 약 98%, 특히 약 80% 내지 약 95%이다.
스캐폴드는 세포 성장, 또는 기타 세포 기능에 필요한 상호작용을 제공하기 위해 생물학적으로 활성인 분자를 이용하여 비공유적으로 변형된다. 상기 스캐폴드내에, 생물학적으로 활성인 분자는 다공성 구조내에 포획되나, 중합체성 스캐폴드에 공유적으로 부착되지는 않는다. 생물학적으로 활성인 분자에는 이에 제한되지 않고, ECM 분자, 기능성 펩티드, 세포에 신호를 전달할 수 있는 프로테오글리칸 및 당단백질, 성장 인자, 및 기타 최적의 세포 기능을 위한 분자, 및 이의 조합이 포함된다.
본 발명의 스캐폴드가 ECM 분자를 이용하여 기능화될 때, 이는 세포 형태 및 조직 발생에 대한 지지 및 안내를 제공한다. 천연 ECM은 세포가 상호혼합되어 결합된 단백질 및 다당류의 비공유 3차원의 망상 조직이다. 천연 ECM은 매우 수화되어, 확산을 허용하고, 성장 인자 및 세포 부착 분자와 같은 분자에 결합하여 세포에 대한 현시(presentation)를 허용한다. 본 발명은 매우 수화가능한 구조, 즉, 동결건조된 다당류 히드로겔 상에 ECM 분자를 첨가함으로써 생체 모방형(biomimetic) 3차원 환경을 제공한다.
포획된 생물학적으로 활성인 분자는 비독성, 생체적합성이어야 하며, 스캐폴드는 조직 발생 동안 세포 수축에 저항하기 위해 기계적으로 안정한 크고, 상호연결된 공극을 갖는 매우 다공성이어야 한다. 스캐폴드가 성장 인자로 비공유적으로 변형될 때, 세포 성장 및 세포 배양을 위한 세포 상호작용 신호전달을 제공한다.
스캐폴드는 적당한 중합체의 히드로겔의 동결건조로부터 제조된다. 상기 중합체는 생체적합성, 생분해성 또는 비생분해성이다. 하나의 구현예에서, 스캐폴드는 세포 접종에 적합한 가교된 알기네이트 또는 히알루론산의 동결건조된 히드로겔이다. 스캐폴드의 공극 크기 및 분포는 pH, 히드로겔의 농도, 또는 가교제의 양을 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
알기네이트는 β-(1→4)-연결된 D-만뉴론산(M) 및 α-(1→4)-연결된 L-굴루론산(G) 잔기를 포함하는 선형의 비분지형 중합체이다. 알기네이트는 갈조류에 의해 생산된다. 알기네이트는 칼슘 이온의 존재하에 겔화되는 열적으로 안정한, 저온 경화 겔화제이다. 상기 겔은 결국 분해될 수 있지만, 용융 없이 열 처리될 수 있다. 본 발명의 스캐폴드에 이용된 알기네이트 다당류 히드로겔은 몇 가지 바람직한 특성을 가진다: 이는 3차원의 스캐폴드로 용이하게 가교되고, 가공되며; 이는 공유 변형을 위한 중합체 골격 상에 편리한 작용기를 가지며; 상기 물질은 이의 천연 상태에서 세포에 대해 비부착성이다.
히알루론산은 실제로 모든 조직에서 다양한 농도로 존재하는 천연 뮤코 다당류이다. 히알루론산, 및 이의 염 또는 유도체, 또는 일반적으로 다당류의 수용액은 현저한 점도, 미끄러움, 및 마찰을 감소시키는 능력의 특징이 있다.
상기 다당류는 히드로겔을 형성할 때 가교 반응을 시작하기 위해 가교 분자로서 디아민 또는 디히드라지드를 이용하고, 표준 카보디이미드 화학을 이용하여 공유적으로 가교될 수 있다. 예를 들면, [G. Prestwich 등, Controlled Chemical modification of hyaluronic acid: synthesis, applications, and biodegradation of hydrazide derivatives, J. Controlled Release, 1998,53, 페이지 93-103]를 참고한다. 히드로겔은 모든 반응물을 제거하기 위해 철저하게 세정되고, 내부에 동결되고, 동결건조되어 3차원의 상호연결된 공극 망상 조직을 형성할 수 있다.
하나의 구현예에서, 스캐폴드는 공유 부착에 의해 플랫폼의 표면 상에 느슨하게 제공되거나 또는 표면에 부착될 수 있다. 히드로겔 기재 스캐폴드는 플랫폼 표면의 더렵혀지지 않은(non-fouling) 다당류 코팅 또는 기판 표면에서 종결되는 아미노기를 통해 지지체 기판에 공유적으로 부착될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 중합체성 히드로겔이 팽창하고, 생물학적으로 활성인 분자가 얽히도록, 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 용액으로 주입됨으로써 추가로 변형된다. 스캐폴드가 생물학적으로 활성인 분자의 용액으로 주입되고 이어서 동결건조될 때, 생물학적으로 활성인 분자 및 중합체 스캐폴드 양자는 생물학적으로 활성인 분자의 재용해에 저항하기에 충분할 정도로 복잡한 상호연결되고, 상호통과하는 중합체 망상 조직을 생성하기 위해 붕괴된다. 그리하여, 생물학적으로 활성인 분자는 스캐폴드내에 물리적으로 상호 꼬이게 된다. 상기 얽힘은 내부에 포획된 성장 인자 및 작은 분자의 서방성에 대한 기초일 수 있는 반면, 고분자량 ECM 분자는 히드로겔 스캐폴드와 안정하게 통합하고, 세포 부착 및 펼침을 유지하기에 충분하게 긴 중합체 사슬을 가진다. 이론에 구속됨이 없이, 생물학적으로 활성인 분자의 길이는 스캐폴드 상에 이의 형태를 결정하는데 중요할 수 있다. 세포-부착성 분자가 히드로겔 망상 조직과 물리적으로 얽힐 정도로 충분히 길지 않다면, 상기 분자는 세포 부착에 대한 고정장치로서 작용할 수 있다. 그러나, 상기 더 짧은 분자는 스캐폴드로부터 가용성, 서방성 인자로서 작용하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 생물학적으로 활성인 분자는 융합 단백질을 포함한다. 전술한 바와 같이, 스캐폴드에 주입되는 생물학적으로 활성인 분자는 너무 작아서 스캐폴드에 얽힐 수 없다. 상기 상황을 조정하기 위해, 생물학적으로 활성인 분자가 단백질이라면, 상기 단백질은 펩티드 서열에 융합되어 물리적으로 더 길고, 다공성 스캐폴드에 더욱 얽히게 되는 펩티드를 제조할 수 있다. 생물학적으로 활성인 분자에 융합되는 펩티드 서열은 자체로 히드로겔 스캐폴드내로 혼입되는 2 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 융합 단백질을 초래하는 생물학적으로 활성인 분자일 수 있다. 대안적으로, 생물학적으로 활성인 분자에 융합되는 펩티드 서열은 특정의 원하는 세포 배양 환경에 대해 생물학적으로 활성이 아닐 수 있다(즉, 생물학적으로 불활성).
융합 단백질의 제조 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 전형적으로 재조합 DNA 기술 및 숙주 세포에서 재조합 DNA의 발현을 포함한다. 적합한 숙주의 대표적인 예로서, 하기를 언급할 수 있다: 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 진균 세포, 예를 들면, 효모; 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9; 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS 또는 Bowes 흑색종; 아데노바이러스; 식물 세포 등. 적당한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당업자의 범위내로 생각된다.
융합 단백질을 제조하기 위해 이용되는 재조합 구축물은 핵산 서열이 정방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있는 벡터, 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 구현예의 바람직한 양태에서, 상기 구축물은 또한 예를 들면, 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함한다. 고등 진핵세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터내로 삽입함으로써 증가된다. 수 많은 적당한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있으며, 시판된다.
프로모터 영역은 선택성 마커를 갖는 CAT (클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 기타 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 2개의 적당한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특정명의 박테리아 프로모터에는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp가 포함된다. 진핵세포 프로모터에는 CMV 즉시 초기(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스 유래의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I가 포함된다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준내에 있다.
숙주 세포에서 구축물은 재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물을 생산하기 위해 통상적인 방식으로 이용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 펩티드 합성기에 의해 합성하여 제조될 수 있다.
성숙 단백질은 적당한 프로모터의 조절하에 포유동물 세포, 효모, 박테리아, 또는 기타 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 번역 시스템이 또한 본 발명의 DNA 구축물 유래의 RNA를 이용하여 상기 단백질을 제조하는데 이용될 수 있다. 원핵세포 및 진핵세포 숙주에 이용되는 적당한 클로닝 및 발현 벡터는 이의 개시가 본원에 참고로 포함된 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]에 기재된다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제원점 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선택성 마커, 예를 들면, 대장균의 암피실린 내성 유전자 및 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) TRP1 유전자, 및 하류 구조 서열의 전사를 이끌기 위해 고 발현된 유전자 유래의 프로모터를 포함할 것이다. 상기 프로모터는 여러가지 중에서, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK)와 같은 해당과정 효소, 알파-인자, 산 포스파타제, 또는 열충격 단백질을 코딩하는 오페론으로부터 유래될 수 있다. 이종의 구조 서열은 번역 개시 및 종결 서열, 바람직하게는 번역된 단백질의 세포주강 또는 세포외 배지내로의 분비를 이끌 수 있는 리더 서열과 함께 적당한 단계에서 모아진다. 임의로, 이종 서열은 원하는 특성, 예를 들면, 발현된 재조합 산물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
스캐폴드가 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 용액으로 수화되면, 스캐폴드는 물 또는 적당한 완충액으로 철저히 세정하여 pH를 조절하고, 염을 제거한 후, 동결 및 다시 동결건조될 수 있다. 상기 변형은 공유 결합을 요하지 않는다. 방법은 간단하나, 여전히 더욱 양호하지 않다면, 유사한 생물학적으로 활성인 특성을 스캐폴드에 첨가한다. 생물학적으로 활성인 분자는 스캐폴드 상에 배양된 세포에 정보를 전달할 수 있으며, 배양된 세포 상에 세포 부착 상호작용의 원인이 된다.
일반적으로 스캐폴드에서 포획에 적합한 생물학적으로 활성인 분자는 스캐폴드의 다공성 구조내에 단지 포획된 스캐폴드내에 상호 꼬이도록, 큰 분자량 및 적합한 공간 배치를 가진다. 생물학적으로 활성인 분자는 또한 가용성일 수 있는데, 이 경우에 더 큰 고분자와 함께, 스캐폴드내에서 가역적으로 포획될 수 있다. 접촉 또는 상호작용이 포획된 생물분자 및 스캐폴드 상에 배양된 세포 사이에 발생할 때, 상기 상호작용은 포획된 생물학적으로 활성인 분자를 스캐폴드외로 당기기에 충분하지 않을 수 있다.
하나의 구현예에서, 스캐폴드는 어레이를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 어레이된 스캐폴드는 플랫폼의 표면 상에 연속적인 방식으로 위치화 또는 펴질 수 있다. 플랫폼은 폴리스티렌 슬라이드 또는 다중웰 플레이트일 수 있다. 스캐폴드는 다중웰 플레이트의 웰 내부와 같은 플랫폼에 느슨하게 위치하거나, 또는 플랫폼 상의 유도화된 표면, 또는 표면 코팅을 통해 플랫폼에 고정화될 수 있다. 스캐폴드는 또한 표면 코팅에 공유적으로 부착될 수 있다. 상기 코팅은 일반적으로 더렵히지지 않은 다당류일 수 있다. 상기 표면은 또한 스캐폴드의 제조 동안 가교에 소모되지 않은 스캐폴드 중합체의 작용기와 공유적으로 연결될 수 있는 표면 상에 위치한 아미노기를 가질 수 있다.
슬라이드 기재 스캐폴드 어레이는 특히 상이한 불용성 조건 상에서 가용성 환경을 시험하는데 유용한데, 예를 들면, 수 개의 세포 유형의 조합에 대해 하나의 배양 배지 조건을 시험하거나, 또는 스캐폴드 내에 상이한 ECM 또는 펩티드 성분을 시험하는데 유용하다. 다중웰 플레이트 기재 마이크로어레이는 약학 산업에 관심 있는 동일하게 조작된 조직 발현 분자, 예를 들면, G-단백질 연관 수용체, cAMP, 시토크롬 P450 활성에 대해 수 개의 상이한 약물을 시험하는데 적합하다. 더욱이, 본 발명의 어레이는 수 개의 시험 화합물의 시험관내 스크리닝을 동시에, 또는 다양한 세포 유형에 대해 동시에 단일 화합물을 시험하는데 유용할 수 있다. 상기 스캐폴드 및 조작된 조직 어레이는 시험, 스크리닝 및 배양 목적의 기타 장치와 조합 및 커플링될 수 있다. 예를 들면, 스캐폴드의 어레이는 생물학적으로 활성인 고분자의 임의의 및 모든 조합이 원하는 생물학적 반응, 예를 들면, 증식, 분화, 혈관신생을 이끄는 특정 신호전달 경로를 시작하고, 생체내 또는 시험관내 조직 공학에 대한 임의의 조건의 스캐폴드를 대량생산하기 위해 환경의 스크리닝을 위해 스캐폴드에 비공유적으로 첨가되게 한다.
본 발명은 또한 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 키트는 중합체 및 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함한다. 상기 중합체는 가교되고/수화되고, 동결건조되어 다공성 스캐폴드를 생성할 것이다. 히드로겔내로 혼입되는 키트의 생물학적으로 활성인 분자는 개개로 포장될 수 있으며, 이는 용액 중에 존재하거나 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자의 용액은 동결건조된 히드로겔을 수화시키고, 또한 생물학적으로 활성인 분자를 스캐폴드내로 혼입하여 적합한 세포 배양 환경을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 키트 이용자가 생물학적으로 활성인 분자(들)을 혼입하기 전에 히드로겔 스캐폴드를 제조할 필요가 없도록, 미리 형성된 다공성 히드로겔 스캐폴드 및 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함한다. 상기 키트는 또한 프로그램 가능한 스캐폴드가 다양한 세포 환경 요구에 기초하여 수 많은 이용자에게 맞추어지도록, 수 개 내지 다스의 생물학적으로 활성인 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 시험 분자에 대한 생체내 반응 또는 반응에서 세포의 기능을 분석하는 다양한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 시험 분자는 프로그램 가능한 스캐폴드를 제조하기 위해 이용된 생물학적으로 활성인 분자와 동일하다. 생체내 반응을 분석하는 방법은 또한 시험 분자인 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 이용하여 본원에 기재된 세포 배양 환경을 생성하는 것을 포함한다. 세포는 이어서 환경에 접종되며, 접종된 세포 배양 환경은 이어서 생체내 세팅내로 주입된다. 세포 기능, 증식 또는 생존은 시험 분자에 대한 반응에서 직접 또는 간접으로 분석될 수 있다. 세포 배양 환경은 세포 분석 전에 생체 검사 받을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생물학적으로 활성인 분자 및 시험 화합물은 동일하지 않다. 시험 분자에는 이에 제한되지 않고, 펩티드 또는 이의 단편, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 프로테오글리칸, 당단백질, 지질, 천연 및 합성 중합체, 및 독소, 약물 및 약물 후보물질과 같은 화합물이 포함된다.
본 발명은 또한 생체내 세팅에서 본 발명의 세포 배양 환경으로 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 주입 전에, 세포 배양 환경은 특정 세포를 이끄는 능력을 갖거나, 또는 갖는 것으로 의심되는 생물학적으로 활성인 분자를 포함한다. 세포 배양 환경은 또한 대상체로부터 스캐폴드로 들어가면 이끌린 세포를 결합할 수 있는 생물학적으로 활성인 분자를 포함한다. 그리하여, 상기 "유도 환경(homing environment)"은 생체내 세팅내로 무세포로 주입될 수 있다. 원하는 세포가 유도 환경을 침투하는데 적당한 시간을 허용한 후에, 환경은 대상으로부터 제거되고, 신규로 침투된 세포는 시험관내 세팅에서 분리되어 배양될 수 있다. 대안적으로, 유도 환경이 생체내 세포로 접종되면, 환경은 환자로부터 제거되어 동일한 환자 또는 전혀 다른 환자의 또 다른 위치로 재주입될 수 있다. 본 발명의 하나의 특정 구현예에서, 유도 환경의 생물학적으로 활성인 분자는 다양한 유형의 줄기 세포, 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 간 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 섬(islet) 줄기 세포, 유방 줄기 세포 및 골수 줄기 세포를 끌기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드 및 마이크로어레이를 제조하는 방법은 하기 실시예에서 더욱 상세히 기재된다. 하기 실시예는 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 이성적인 당업자에게 발생하는 것과 같은 이성적인 변이가 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 본원에서 행해질 수 있다.
실시예 1-본 발명의 다공성 스캐폴드의 제조
3 그램의 알기네이트 (MVG 알기네이트, ProNova, Norway)를 100 ml MES 완충액 (pH 6.0)에 천천히 용해하여 3% w/v 알기네이트 용액 (또는 라이신의 이용을 위해 pH 6.5)을 수득하였다.
설포-N-히드록시숙신이미드(Sulfo-NHS) 164 mg (MW 217.13, Sigma) 및 100 mg 아디프산 이수화물(AAD, MW 174)을 50 ml 3% w/v 알기네이트 용액에 첨가하여 15% 가교를 수득하였다.
알기네이트 용액 (25 ml)을 50 ml 원추형 플라스크에 쏟고, 365 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드(EDC, MW 191.7, Pierce)를 신속하게 첨가하여 가교 반응을 시작하였다.
상기 용액을 상하가 바뀌고, 뒤집힌 바닥을 갖는 측면에 2 mm 스페이서를 갖는 뒤집힌 페트리 디쉬에 신속하게 쏟았다. 이는 알기네이트를 균일한 두께로 겔화시키기 위해 2 mm 간격에 의해 분리된 평형 표면을 제공하였다. 상기 물질을 밤새 겔화시켰다.
히드로겔이 형성되었으며, 6 mm 생체검사 펀치에 의해 수 개의 6 mm x 2 mm 디스크로 펀치하였다. 겔 디스크를 탈이온수에서 5회의 물 교환으로 3시간 동안 세정하여 염 및 반응물을 걸렀다. 겔 디스크를 플라스틱 표면 상에 위치하고, -70℃에서 4시간 동안 동결하고, 밤새 동결건조하여 본 발명의 3차원의 다공성 스캐폴드를 수득하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 생물영향 분자를 이용한 추가의 변형에 유용한 상호연결된 공극 구조를 갖는 3차원의 스캐폴드를 수득하였다. 다공성 구조가 동결 동안 형성된 얼음 결정으로부터 유래하고, 상기 얼음 결정이 동결건조될 때, 얼음 결정에 의해 남겨진 공간은 상호연결된 다공성 구조를 형성하는 것이 가능하였다. 반응 동안 가교되지 않은 히드로겔에서 카르복시(-COOH)기는 스캐폴드의 추가의 변형에 대한 잠재적인 자리를 제공할 수 있다.
실시예 2-본 발명이 다공성 스캐폴드의 제조
0.1 M MES 완충액 (pH 6.0) 중의 2% (w/v) 알기네이트 용액 및 2% (w/v) 히알루론산 (HA) 용액을 각각 110 mg AAD/50 ml 알기네이트/HA 용액으로 HoBt 및 AAD 용액과 함께 첨가하였다. 이어서, 0.1 MES 완충액에 용해된 EDC를 알기네이트 용액 또는 히알루론산 용액에 첨가하여 각각 195 mg EDC/10 ml 알기네이트/HA로 가교 반응을 시작하였다. 상기 용액을 신속하게 용기내로 쏟고, 밤새 겔화시켰다.
히드로겔이 용기내에 형성되었고, 수개의 6 mm x 2 mm 디스크로 펀치하였다. 겔 디스크를 물 및 PBS 완충액에서 세정하여 염 및 반응물을 걸러 냈다. 겔 디스클를 동결하고, 밤새 동결건조하였다.
가교된 알기네이트 또는 히알루론산의 동결건조된 히드로겔로서 상호연결된 공극 구조를 갖는 3차원의 스캐폴드를 수득하였다. 반응 동안 가교되지 않은 히드로겔에서 카르복시(-COOH)기는 스캐폴드의 추가의 변형에 대한 잠재적인 자리를 제공할 수 있다. 상호연결된 공극을 갖는 스캐폴드는 본 발명에서 생물영향 분자로의 추가의 변형에 대해 유용하였다.
실시예 3-본 발명의 마이크로어레이의 제조
실시예 1의 단계 1-3을 따른 후에, 겔화 용액을 HA-코팅된 폴리스티렌 슬라이드 상에 설치된 50-웰 실리콘 개스킷의 웰내로 분배하였다. 알기네이트 히드로겔은 3차원의 어레이된 배치에서 가교될 뿐만 아니라 또한 슬라이드의 표면에도 가교되었다. 모든 50개의 웰이 겔화 용액으로 채워지기 전에 알기네이트가 가교된다면, pH를 증가시키거나 또는 상이한 시간에 반응물을 첨가함으로써 겔화 과정을 늦출 수 있다. 슬라이드를 동결 및 동결건조하였다.
3차원의 스캐폴드를 고 평형 및 고처리량 스크리닝 및 세포 배양을 허용하는 슬라이드 표면에 어레이 및 공유적으로 부착하였다.
실시예 4-본 발명의 마이크로어레이의 제조
알기네이트 (MVG 알기네이트, ProNova, Norway) 용액 2% (w/v)을 0.1 M MES 완충액 (pH 6.5)에 알기네이트를 천천히 용해함으로써 수득하였다. 히드록실 벤조티아졸 68.3 mg (HoBt, H-2006, Sigma) 및 110 mg AAD를 50 ml 2% w/v 알기네이트 용액에 첨가하여 카르복시기의 25% 가교를 수득하였다. 3 ml 부피의 알기네이트 용액 분취량을 반응을 위해 10 ml 플라스틱 튜브에 쏟았다. 피펫 팁이 바닥에 맞도록 튜브의 상단을 잘라냈다. EDC 58 mg (MW 191.7, Pierce)을 3 ml 2% 알기네이트 용액에 첨가하여 가교 반응을 시작하였다. 알기네이트 용액을 신속하게 흡입하고, 0.5% 또는 1.0% 알기네이트 코팅된 슬라이드 상에 위치한 50-웰 개스킷의 웰내로 분배하고, 웰의 가장자리를 넘지 않고 동일한 웰에서 2-3회 분배를 반복하였다. 용액의 pH를 변하는 가교 반응 속도에 대해 조절하였다.
겔화 알기네이트 용액으로 로딩된 슬라이드를 약 20-60분 동안 겔화시켰다. 개스킷을 더 두꺼운 겔에 대해 쌓았다. 슬라이드를 -70℃에서 수 시간 또는 밤새 동결하고, 건조시까지 동결건조하였다.
스캐폴드를 슬라이드 상에 완전히 어레이하였다. 증가된 pH는 겔화 전에 용액의 취급을 허용할 정도로 충분히 겔화 역학의 속도를 낮추었다. 대개의 경우에 겔을 파괴시키지 않고, 슬라이드의 표면에 부착된 겔을 유지하면서 개스킷을 제거하였다. 본 발명의 완전히 어레이된 3차원의 스캐폴드를 수득하였다.
실시예 5-본 발명의 마이크로어레이의 제조
실시예 4의 단계를 반복하였으나; 가교 반응을 시작하기 위해 EDC를 첨가하기 전에 알기네이트 용액 분취량의 pH를 5.5, 6.0, 6.5, 및 7.0으로 조정하였다. 겔화 과정의 품질 및 시간을 관찰하고 기록하였다. 특히, pH 7.0을 갖는 알기네이트 용액은 겔화 품질 및 겔화 시간 사이의 양호한 균형을 수득하였다.
실시예 6-본 발명의 마이크로어레이 상에 세포의 접종
1 x 106 세포/ml로 현탁액 중의 MC3T3 세포를 스캐폴드 상에 접종하였다. 10㎕의 세포 현탁액을 각각의 스캐폴드가 3 mm의 직경 및 1 mm의 두께(부피가 약 7㎕임)를 갖는 스캐폴드 상에 접종하였다. 3개의 스캐폴드 어레이를 100 mm 페트리 디쉬의 바닥에 부착하고, 층류 후드 UV 공급원하에 멸균을 위해 20-30분 동안 방치하였다.
세포 현탁액은 모세관 작용으로 인해 스캐폴드에 들어가며, 세포는 스캐폴드의 공극을 통해 분포되었다. 20ml의 10% FBS 포함 배지를 세포 배양용 슬라이드를 포함하는 페트리 디쉬에 첨가하였다.
48 시간 후에, 세포를 MTT로 염색하고, 디지털 이미지를 기록하였다. 세포를 또한 공초점 현미경 및 위상차 현미경하에 관찰하였다.
도 2에 보여주는 바와 같이, 본 발명의 어레이된 스캐폴드 상에 접종된 세포는 스캐폴드를 통해 균일하게 분포되었으며, 세포는 알기네이트 스캐폴드와 상호작용 없이 동결건조된 스캐폴드의 열린 공극 구조에 용이하게 들어갔다. 상기 도 2는 또한 스캐폴드의 상호연결성을 입증한다.
실시예 7-비변형된 스캐폴드 상에 세포의 접종
MC3T3 세포의 세포 현탁액을 0.5, 1.0, 5.0, 및 1 x 106 세포/ml로 제조하였다. 세포 현탁액의 60㎕의 분취량을 세포 현탁액으로 로딩된 피펫의 팁을 스캐폴드의 중앙에 위치하고, 세포 현탁액을 스캐폴드내로 분배함으로써 24-웰 플레이트 상에 마이크로어레이의 각각의 스캐폴드(56.5㎕ 부피) 상에 접종하였다.
배양 배지 (0.5 ml)를 각 웰에 첨가하고, 세포를 적당한 조건하에 배양하였다. 20시간 후에, 세포를 관찰을 위해 MTT 10% (v/v)로 염색하였다.
접종된 세포를 전체 두께에 따라 알기네이트 스캐폴드를 통해 분배하였고, 세포는 주로 세포의 덩어리로서 존재하였다. 초점면이 현미경 상에서 변할 때, 새로운 세포 응집체가 초점에 나타났다. 서로에 대한 세포의 부착은 알기네이트 스캐폴드에 부착할 수 없는 세포에 가장 기인하는 것 같다.
스캐폴드의 초기 세포 농도 및 다공성 구조는 세포 접종 분포에 영향을 주었다. 공극이 적을수록, 더 큰 공극의 스캐폴드에서 응집체보다 더 적은 세포를 갖는 세포 응집체가 많아졌다. 더 큰 공극의 스캐폴드는 더 큰 덩어리의 세포 및 더 적은 수의 세포를 가졌다. 본 발명의 3차원의 스캐폴드가 세포 접종 및 3차원의 세포 성장 및 세포 배양에 유용하다는 것을 입증하였다.
실시예 8-본 발명의 변형된 스캐폴드 상에 세포 배양
가교된 알기네이트 및 히알루론산의 동결건조된 히드로겔의 스캐폴드에 산 완충액 중의 0.1mg/ml 콜라겐 I 용액으로 주입하였다. 주입된 스캐폴드를 세정하지 않거나 또는 4시간 동안 PBS 및 물에서 세정하였다. 세정되거나 세정되지 않은 스캐폴드를 수 시간 동안 -70℃에서 동결하고, 동결건조하였다.
4 x 106 세포/ml의 트립신 처리된 MC3T3 세포 (50 ㎕)를 P200 Pipetteman 으로 각각의 스캐폴드에 접종하여 대략 스캐폴드당 200,000개 세포의 세포 밀도를 수득하였다. 세포 현탁액을 피펫 팁에 채우고, 피펫의 말단이 스캐폴드를 통과할 때, 세포 현탁액을 동시에 스캐폴드내로 주입하였다. 세포로 접종된 스캐폴드를 200㎕ 배양 배지 (aMEM + 10% FBS)를 갖는 플레이트에 옮기고, 37℃ 인큐베이터에서 유지하고, 연속적으로 관찰하였다.
세포를 트립신 처리하고, 세포 성장의 계산을 위해 수집하였다. 대안적으로, 스캐폴드 상에 키운 세포를 현미경하에 관찰하고, 세포 형태 및 세포 성장에 대한 조사를 위해 매일 샘플링하였다. 그 위에 키운 세포를 갖는 스캐폴드를 MTT와 같은 세포 생존능을 위한 통상적인 방법에 의해 염색하였다. 임의의 스캐폴드 상에 접종되지 않은 세포 현탁액을 대조군으로서 동일한 조건하에 관찰하였다. Molecular Probes사의 키트 L-3224를 세포 생존능의 분석에 이용하였다.
세포 부착 및 세포 성장을 본 발명의 콜라겐으로 변형된 알기네이트 또는 히알루론산 스캐폴드에서 관찰한 반면, 콜라겐이 없는 스캐폴드는 세포 부착 및 세포 성장을 지지하지 않았다. 세포는 세포 증식에 필요한 변형된 스캐폴드에 부착 및 펼쳐져 있는 반면; 비변형된 스캐폴드에서의 세포는 스캐폴드에 부착될 수 없기 때문에 다세포 응집체로서 존재하였다.
본 발명의 비공유적으로 변형된 ECM 분자를 갖는 스캐폴드는 세포 부착 및 세포 성장을 지지한 반면, 비변형된 스캐폴드는 세포 부착 및 세포 성장을 지지하지 않았다. 본 발명의 비공유 변형 방법은 세포 기능, 예를 들면, 세포 부착 및 세포 성장을 촉진하였다.
실시예 9-본 발명의 변형된 스캐폴드 상에서 세포 배양
히드로겔 알기네이트 스캐폴드를 피브로넥틴 (PBS 중의 인간 피브로넥틴, Becton Dickinson Labware) 또는 소 혈청 알부민(BSA, 분획 V, Sigma IIA-7906)으로 변형하였다. 피브로넥틴은 세포 부착(adhesion) 및 세포 부착(attachment)을 촉진하는 것으로 알려진 ECM 단백질인 반면, 크기에서 피브로넥틴과 유사한 큰 단백질인 BSA는 세포 부착(adhesion) 및 세포 부착(attachment)을 촉진시키는 임의의 공지된 성질을 가지지 않는다. 스캐폴드에 주입하는 피브로넥틴 또는 BSA 용액의 농도는 양자 모두 100 ㎍/ml이었다. 상기 용액으로 주입한 후에, 스캐폴드를 동결 및 동결건조하였다.
이어서, 스캐폴드를 100,000개 세포/스캐폴드로 MC3T3 세포로 접종하였다. 세포로 접종된 스캐폴드를 적당한 조건하에 배양하고, 연속적으로 관찰하고, 세포 생존능의 말기에 MTT로 염색하였다.
도 3에 보여주는 바와 같이, 세포 부착은 본 발명의 피브로넥틴-변형된 스캐폴드에서 관찰된 반면, 알부민-변형된 스캐폴드 및 비변형된 스캐폴드는 상기 세포 부착을 지지하지 않거나, 또는 세포 부착을 촉진시키지 않았다. 세포 성장은 또한 본 발명의 피브로넥틴-변형된 스캐폴드에서 관찰된 반면, 알부민-변형된 스캐폴드 및 비변형된 스캐폴드는 세포 성장을 지지하지 않았다.
실시예 10-본 발명의 어레이된 스캐폴드에서 세포 배양
폴리스티렌 슬라이드를 폴리에틸렌이민(PEI) 및 히알루론산 (HA)으로 코팅하였다. Grace Biolab 사의 마스크를 이용하여 EDC/AAD 가교된 HA 스캐폴드를 어레이하였다.
동결건조된 스캐폴드 어레이를 인간 피브로넥틴 (100㎍/ml, BD Labware), 마우스 라미닌 (100㎍/ml, BD Labware) 및 콜라겐 IV (100㎍/nl, BD Labware)을 각각 포함하는 ECM 분자를 포함하는 용액으로 수화하였다. 이어서, 수화된 스캐폴드 어레이를 동결하고, 동결건조하여 변형된 스캐폴드 어레이를 수득하였다.
다음, MC3T3 세포를 스캐폴드 상에 접종하였다 (2 x 106 세포/ml). 슬라이드 저장소를 5 ml의 배양 배지로 채우고, 3-4일 동안 배양하였다. 세포를 생존능을 위해 MTT로 염색하였다. 세포를 또한 핵의 형광 염색을 위해 프로피디움 요오디드로 염색하고, 사진을 위해 Universal Imaging System 하에 관찰하였다.
도 4에 보여주는 바와 같이, 세포는 본 발명의 마이크로어레이의 변형된 스캐폴드에 부착되었으나, 비변형된 스캐폴드에서는 어떠한 세포 부착 또는 세포 성장도 관찰되지 않았다. 본 발명의 ECM 분자-변형된 스캐폴드는 세포 부착 및 세포 성장을 지지하였으며, 어레이에 있을 때, 상기 변형된 스캐폴드는 세포 부착, 세포 신호전달 및/또는 세포 성장을 촉진하는 미세환경에 대한 스크리닝에서 유용하였다.
실시예 11-본 발명의 변형된 어레이된 스캐폴드에서 세포 배양
본 발명의 어레이된 알기네이트 스캐폴드를 인간 피브로넥틴(100㎍/ml), 또는 마우스 라미닌 (Gibep)(100㎍/ml), 또는 Matrigel (Becton Dickinson)(50㎍/ml)로 변형하였다. ECM 또는 Matrigel 용액(1 ㎕)을 이용하여 각각의 스캐폴드를 주입하였다.
MatrigelTM은 세포외 기질 성분에 풍부한 종양인 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종으로부터 추출된 가용화된 기저막 제제의 시판되는 용액(Becton Dickinson Bioscience)이다. MatrigelTM의 주요 성분은 라미닌에 이은 콜라겐 IV, 엔탁틴, 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸이다. MatrigelTM은 또한 EHS 종양에서 천연적으로 발생하는 TGF-β 섬유아세포 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 및 기타 성장 인자를 포함한다. 실온에서, MatrigelTM은 포유동물 세포 기저막을 닮는 생물학적으로 활성인 기질 물질을 제조하기 위해 중합한다. 그리하여, MatrigelTM은 정상적인 및 형질전환된 고정화 의존성 내피 및 이에 제한되지 않고, 뉴런, 간세포, Sertoli 세포, 유방 내피, 흑색종 세포, 혈관내피세포, 갑상선 세포 및 모낭 세포를 포함하는 기타 세포 유형의 부착 및 분화에 대해 효과적이다.
스캐폴드를 스캐폴드당 100,000개 세포로 HEPG2 세포 또는 MC3T3 세포로 접종하고, 1주 동안 10% 혈청 포함 배지에서 배양하였다. 스캐폴드를 유지하고, 연속적으로 관찰하였다. 세포를 세포 생존능을 위해 MTT로 염색하고, 또한 위상차 현미경으로 기록하였다.
본 발명의 ECM- 또는 Matrigel-변형된 스캐폴드는 상이한 조직(간세포 및 뼈모세포) 및 상이한 종(마우스 및 인간) 유래의 세포의 세포 부착 및 세포 성장을 지지하였다. 변형된 스캐폴드의 어레이는 상이한 세포 유형뿐만 아니라 상이한 세포 배양 환경에 대한 세포 배양용 미세환경에 대한 평형 및 고처리량 스크리닝을 허용하였다.
실시예 12-본 발명의 변형된 어레이된 스캐폴드에서 세포 배양
본 발명의 어레이된 알기네이트 스캐폴드를 PBS 중의 100, 30, 10, 3, 및 1 ㎍/ml의 인간 피브로넥틴, 또는 PBS 중의 100, 30, 10, 3, 및 1 ㎍/ml의 마우스 라미닌 (Gibco), 또는 100, 30, 10, 3, 및 1 ㎍/ml의 마우스 콜라겐 IV로 변형하였다.
스캐폴드를 스캐폴드당 100,000개 세포의 세포로 접종하고, 배양하고, 연속적으로 관찰하였다. 본 발명의 ECM-변형된 스캐폴드는 다양한 농도에서 세포의 세포 부착 및 세포 성장을 지지하였다. 변형된 스캐폴드의 어레이는 상이한 세포 유형뿐만 아니라 상이한 세포 배양 환경에 대한 세포 배양용 미세환경에 대한 평형 및 고처리량 스크리닝을 허용하였다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허 출원 일련번호 제10/259,817호(2002.9.30 출원)의 일부계속출원이다.

Claims (27)

  1. 하기 단계를 포함하는, 세포 배양 환경을 제조하는 방법:
    a) 중합체를 가교하여 히드로겔을 형성하는 단계;
    b) 상기 히드로겔내에 공극을 형성하는 단계; 및
    c) 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 상기 다공성 히드로겔내에 비공유적으로 혼입하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 중합체는 알기네이트, 변형된 알기네이트, 히알루론산, 변형된 히알루론산, 아가로스, 콜라겐, 키토산, 키틴, 폴리비닐 알코올, 폴리트리메틸렌 카보네이트, 폴리 히드록시부티레이트, 아미노산 기재 폴리카보네이트, 폴리 비닐클로라이드, 폴리HEMA, PTFE, 폴리 에틸렌 글리콜, 폴리 메틸메타크릴레이트, 폴리 푸마레이트, 폴리프로필렌 글리콜 기재 중합체 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 공극을 형성하는 단계는 상기 히드로겔을 동결 및 동결건조하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 비공유적으로 혼입하는 단계는 상기 동결건조된 히드로겔을 상기 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 용액으로 수화하고, 상기 수화된 다공성 히드로겔을 건조 또는 동결건조하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자는 세포외 기질 (ECM) 분자, 성장 인자, 세포 신호전달 분자 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자는 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 분자 및 하나 이상의 세포 신호전달 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 ECM은 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 트롬보스폰딘 1, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 골 타액단백질, 연골 기질 단백질, 피브로노겐, 피브린, 피브룰린, 뮤신, 엔탁틴, 오스테오폰틴, 플라스미노겐, 레스트릭틴, 세르글리신, SPARC/오스테오넥틴, 베르시칸, 폰 빌리브란트 인자, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알루로난, 메로신, 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 세포 부착 분자, 카드헤린, 콘넥신 및 셀렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 성장 인자는 산성 섬유아세포 성장인자, 염기성 섬유아세포 성장인자, 혈소판 유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 형질전환 성장 인자-β, 조혈 성장 인자 및 인터루킨으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자가 다공성 히드로겔 스캐폴드에 비공유적으로 부착되는 것을 특징으로 하는, 다공성 히드로겔 스캐폴드 및 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 세포 배양 환경.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 히드로겔은 알기네이트, 변형된 알기네이트, 히알루론산, 변형된 히알루론산, 아가로스, 콜라겐, 키토산, 키틴, 폴리비닐 알코올, 폴리트리메틸렌 카보네이트, 폴리 히드록시부티레이트, 아미노산 기재 폴리카보네이트, 폴리 비닐클로라이드, 폴리HEMA, PTFE, 폴리 에틸렌 글리콜, 폴리 메틸메타크릴레이트, 폴리 푸마레이트, 폴리프로필렌 글리콜 기재 중합체 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 환경.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 히드로겔은 공유적으로 가교된 것을 특징으로 하는 세포 배양 환경.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자는 세포외 기질(ECM) 분자, 성장 인자, 세포 신호전달 분자 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 환경.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자는 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 분자 및 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 환경.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 ECM은 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 트롬보스폰딘 1, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 골 타액단백질, 연골 기질 단백질, 피브로노겐, 피브린, 피브룰린, 뮤신, 엔탁틴, 오스테오폰틴, 플라스미노겐, 레스트릭틴, 세르글리신, SPARC/오스테오넥틴, 베르시칸, 폰 빌리브란트 인자, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, 히알루로난, 메로신, 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 세포 부착 분자, 카드헤린, 콘넥신 및 셀렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 환경.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 성장 인자는 산성 섬유아세포 성장인자, 염기성 섬유아세포 성장인자, 혈소판 유래 성장 인자, 신경 성장 인자, 형질전환 성장 인자-β, 조혈 성장 인자 및 인터루킨으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 환경.
  16. 제 9 항의 세포 배양 환경을 포함하는 어레이.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 어레이는 각각이 동일한 구성 성분으로 구성된 하나 이상의 세포 배양 환경을 포함하는 것을 특징으로 하는 어레이.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 어레이는 각각이 상이한 구성 성분으로 구성된 하나 이상의 세포 배양 환경을 포함하는 것을 특징으로 하는 어레이.
  19. 하기 단계를 포함하는, 세포 배양 방법:
    a) 제 9 항의 세포 배양 환경에 세포를 접종하는 단계; 및
    b) 상기 환경내의 상기 세포를 적당한 세포 배양 조건하에 유지하는 단계.
  20. 하기 단계를 포함하는, 하나 이상의 시험 화합물에 반응하여 세포 기능을 분석하는 방법:
    a) 하나 이상의 비공유적으로 부착된 생물학적으로 활성인 분자가 상기 시험 분자인, 제 9 항의 세포 배양 환경에 세포를 접종하는 단계;
    b) 적당한 조건하에 상기 세포 배양 환경에 상기 세포를 유지하는 단계; 및
    c) 상기 세포 배양 환경에서 상기 유지에 대한 상기 배양된 세포의 반응을 측정하는 단계.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 세포는 시험관내 세팅에서 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 적당한 조건은 세포 배양 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 세포는 생체내 세팅에서 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 적당한 조건하에 상기 세포를 유지하는 것은 대상에서 상기 세포 배양 환경을 유지하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 하기 단계를 포함하는, 세포 기재 생체내 이식물을 제조하는 방법:
    a) 시험관내 세팅에서, 제 9 항의 세포 배양 환경에 세포를 접종하는 단계; 및
    b) 상기 세포 배양 환경의 상기 세포를 적당한 세포 배양 조건하에 유지하는 단계.
  26. 하기를 포함하는 키트:
    a) 다공성 히드로겔을 형성하는 능력을 갖는 중합체; 및
    b) 하나 이상의 생물학적으로 활성인 분자.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 중합체는 다공성 히드로겔로서 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
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