TWI601817B - 細胞培養製品及其製造方法 - Google Patents

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Description

細胞培養製品及其製造方法
本發明係關於一種細胞培養製品，特別是關於一種包含親水性共聚物層的細胞培養製品。
一般的細胞培養製品通常包含基板、聚甲基丙烯酸(polymethacrylate)層以及特定的胜肽鏈。聚甲基丙烯酸層係設置於基板上，且特定的胜肽鏈係結合於聚甲基丙烯酸層的表面上。
上述一般的細胞培養製品係藉由結合於聚甲基丙烯酸層上的胜肽鏈與欲培養的細胞表面的受體(receptor)結合，使細胞得以貼附於聚甲基丙烯酸層的表面上，而不易漂浮於細胞培養液中，造成欲培養的細胞死亡。然而，聚甲基丙烯酸層本身親水性差，不易使細胞貼附於聚甲基丙烯酸層的表面上，造成細胞漂浮於細胞培養液中，甚至死亡。
另一方面，在自然環境下，由於未分化的幹細胞與組織之間具有一定範圍的彈性應力，此彈性應力可誘導未 分化的幹細胞分化成為特定細胞。然而，一般的細胞培養製品只能利用額外加入的細胞生長因子及細胞分化因子，來誘導幹細胞分化成特定種類的細胞。加入細胞生長因子及細胞分化因子雖能誘導幹細胞分化，卻不易精確調控幹細胞分化的專一性，且難以同時促進上述特定細胞的增生。
因此，目前亟需一種新穎的細胞培養製品及其製造方法，以解決一般細胞培養製品所產生的問題，例如細胞增生效率不佳以及幹細胞分化不易調控。
本發明係提供一種細胞培養製品及其製造方法，用以解決一般細胞培養製品的問題，並且提升幹細胞及分化細胞的增生，以增進幹細胞分化的專一性。
本發明之一態樣係提供一種細胞培養製品。此細胞培養製品包含基板、親水性共聚物層以及複數個胜肽鏈。
基板具有一表面，且親水性共聚物層係設置於基板之表面上。親水性共聚物層係由複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成。胜肽鏈係分別結合於親水共聚物層之一表面上。
根據本發明之實施例，上述聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)。
根據本發明之實施例，上述具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
根據本發明之實施例，在上述親水性共聚物層中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。
根據本發明之實施例，在上述親水性共聚物層中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元的含量百分比分別為約85%、10%及5%。
根據本發明之實施例，上述親水性共聚物層具有一彈性係數。根據本發明之實施例，上述彈性係數係介於約1kPa至100kPa。
根據本發明之實施例，上述胜肽鏈包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。根據本發明之實施例，上述寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。根據本發明之實施例，上述蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
根據本發明之實施例，上述胜肽鏈的胺基酸係藉由醯胺鍵分別結合於具有羧酸基團的單元。
本發明之另一態樣係提供一種細胞培養製品的製造方法。此製造方法包含提供具有一表面的基板。形成親水性共聚物層於基板上，其中親水性共聚物層係經由共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合 而成。進行交聯反應，使親水性共聚物層中的複數個聚乙烯醇單元彼此交聯。分別結合複數個胜肽鏈於親水性共聚物層之一表面上。
根據本發明之實施例，上述製造方法更包含製備親水性共聚物溶液，且將親水性共聚物溶液塗佈在基板之表面上，形成親水性共聚物層。
根據本發明之實施例，上述親水性共聚物溶液包含親水性共聚物，此親水性共聚物之濃度為約0.05~0.2wt%。
根據本發明之實施例，上述聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)。
根據本發明之實施例，上述具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
根據本發明之實施例，上述胜肽鏈包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。
根據本發明之實施例，上述寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的片段(CS-1)或玻璃體粘連蛋白(vitro nectin,VN)。
根據本發明之實施例，上述蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
根據本發明之實施例，進行交聯反應係利用戊二醛(glutaraldehyde)在硫酸水溶液中與親水性共聚物層中的聚乙烯醇單元進行交聯反應。根據本發明之實施例，進行交 聯反應更包含控制交聯反應的交聯反應時間，以調控親水性共聚物層之彈性係數。根據本發明之實施例，上述交聯反應時間為約0.5小時至48小時。根據本發明之實施例，上述彈性係數係介於約1kPa至100kPa。
本發明之又一態樣係提供一種培養未分化幹細胞的方法。此培養方法包含提供細胞培養製品，此細胞培養製品包含基板、位於基板上的親水性共聚物層以及複數個分別結合於親水性共聚物層的胜肽鏈。其中，親水性共聚物層係經由共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有羧酸基團的單元共聚合而成。培養複數個未分化的幹細胞於細胞培養製品上及化學成分確定的細胞培養液中，其中未分化的幹細胞係結合於細胞培養製品上的胜肽鏈。持續在化學成分確定的細胞培養液中培養未分化的幹細胞至少五代(passages)。
根據本發明之實施例，上述幹細胞包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。
根據本發明之實施例，上述胜肽鏈包含纖維黏連蛋白的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
根據本發明之實施例，在上述親水性共聚物層中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。
根據本發明之實施例，在上述化學成分確定的細胞 培養液中更包含一細胞生長因子及一轉化生長因子。
根據本發明之實施例，在上述化學成分確定的細胞培養液中，持續培養未分化的幹細胞至少十代。
本發明之再一態樣係提供一種調控幹細胞分化的方法。此調控方法包含提供細胞培養製品，此細胞培養製品包含基板、位於基板上的親水性共聚物層、以及複數個分別結合於親水性共聚物層的胜肽鏈。其中親水性共聚物層係經由共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有羧酸基團的單元共聚合而成。調控親水性共聚物層之交聯反應時間，令使親水性共聚物層具有特定的彈性係數。培養複數個未分化的幹細胞於細胞培養製品上及化學成分確定的細胞培養液中，其中未分化的幹細胞係結合於細胞培養製品上的胜肽鏈。利用具有特定彈性係數範圍的親水性共聚物層誘導未分化的幹細胞進行分化作用，令使未分化的幹細胞分化成為預期的細胞株。
根據本發明之實施例，上述組合蛋白包含α6β1組合蛋白、αVβ3組合蛋白、αVβ5組合蛋白或其組合。
根據本發明之實施例，上述幹細胞包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。
根據本發明之實施例，上述胜肽鏈包含纖維黏連蛋白的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
根據本發明之實施例，在上述化學成分確定的細胞培養液中更包含細胞生長因子及轉化生長因子。
根據本發明之實施例，上述特定的彈性係數係介於約1kPa至100kPa。
根據本發明之實施例，上述預期的細胞株(cell line)包含神經細胞(neural cell)、肌肉細胞(muscle cell)或成骨細胞(osteoblast)。
100a、100b、100c‧‧‧細胞培養製品
110、210‧‧‧基板
111、121、125、127、211、221‧‧‧表面
120a、120b、120c、220a、220b、220c‧‧‧親水性共聚物層
122‧‧‧第一彈性層
124‧‧‧第二彈性層
126‧‧‧第三彈性層
130、230‧‧‧胜肽鏈
310‧‧‧交聯反應液
410、420、430、440、510、520、530、610、620、630、 640‧‧‧步驟
710‧‧‧細胞群
720‧‧‧細胞
721‧‧‧受體
D1、D2‧‧‧厚度
第1A~1C圖係根據本發明之實施例所繪示的細胞培養製品100a~100c的剖面圖；第2圖係根據本發明之實施例所繪示的製造細胞培養製品的階段剖面圖；第3圖係根據本發明之實施例所繪示的交聯步驟示意圖；第4圖係根據本發明之實施例所繪示的製造細胞培養製品的階段流程圖；第5圖係根據本發明之實施例所繪示的培養未分化幹細胞的階段流程圖；第6圖係根據本發明之實施例所繪示的調控幹細胞分化的階段流程圖；第7A圖係根據本發明之實施例所繪示的利用細胞培養製品110培養細胞的俯視圖；第7B圖係根據本發明之實施例所繪示的利用細胞 培養製品110培養細胞的剖面圖；以及第8圖(a)係利用一般細胞培養製品培養細胞的影像，且第8圖(b)係係根據本發明之實施例所提供的細胞培養製品培養細胞的影像。
接著以實施例並配合圖式以詳細說明本發明，在圖式或描述中，相似或相同的部分係使用相同之符號或編號。在圖式中，實施例之形狀或厚度可能擴大，以簡化或方便標示，而圖式中元件之部分將以文字描述之。可瞭解的是，未繪示或未描述之元件可為熟習該項技藝者所知之各種樣式。
本文所使用之術語僅是用於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明。如本文所使用，單數形式"一"(a、an)及"該"(the)意欲亦包括複數形式，除非本文另有清楚地指示。應進一步瞭解，當在本說明書中使用時，術語"包含"(comprises及/或comprising)指定存在所述之特徵、整數、步驟、運作、元件及/或組份，但並不排除存在或添加一或多個其它特徵、整數、步驟、運作、元件、組份及/或其群組。本文參照為本發明之理想化實施例(及中間結構)之示意性說明的橫截面說明來描述本發明之實施例。如此，吾人將預期偏離該等說明之形狀之由於(例如)製造技術及/或容差的改變。因此，不應將本發明之實施例理解為限於本文所說明之特定區域形狀，而將包括起因於(例如)製造之形狀 改變，且該等圖中所說明之區域本質上為示意性的，且其形狀不意欲說明設備之區域的實際形狀且不意欲限制本發明之範疇。
第1A~1C圖係根據本發明之實施例所繪示的細胞培養製品100a~100c的剖面圖。
在第1A圖中，細胞培養製品100a包含基板110、親水性共聚物層120a及胜肽鏈130。基板110具有表面111，且親水性共聚物層120a係設置於基板110之表面111上。親水性共聚物層120a係由聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成。胜肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120a之表面121上。
在本發明之實施例中，聚乙烯醇衍生物單元包含乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)；且具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
在本發明之實施例中，親水性共聚物層120a之材料具有化學式1所示之通式：
其中，R為甲基(methyl group)、乙基(ethyl group) 或乙醯基(acetyl group)；x、y及z係分別表示聚乙烯醇單元、聚乙醯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元的含量。
在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120a中的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120a中的含量百分比分別為約85%、10%及5%。
在本發明之實施例中，親水性共聚物層120a具有一彈性係數。此彈性係數係介於1kPa至100kPa。
胜肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120a之表面121上。由於胜肽鏈130係由胺基酸所組成，且具有許多胺基，因此胜肽鏈130上的胺基可與具有羧酸基團的單元上的羧酸基反應形成醯胺鍵結。上述胜肽鏈130包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
第1B圖的細胞培養製品100b與第1A圖相似。在第1B圖中，細胞培養製品100b包含基板110、親水性共聚物層120b及胜肽鏈130。基板110具有表面111，且親水性共聚物層120b係設置於基板110之表面111上。親水性共聚物層120b係由聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有一羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成。胜 肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120b之表面125上。
在本發明之實施例中，聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)；且具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
在本發明之實施例中，親水性共聚物層120b之材料具有化學式1所示之通式：
其中，R為甲基(methyl group)、乙基(ethyl group)或乙醯基(acetyl group)；x、y及z係分別表示聚乙烯醇單元、聚乙醯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元的含量。
在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120b中的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120b中的含量百分比分別為約85%、10%及5%。
第1B圖與第1A圖的相異處在於，第1B圖中親水性共聚物層120b係由第一彈性層122及第二彈性層124所構成。第一彈性層122及第二彈性層124皆係由聚乙烯醇 單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，惟第一彈性層122及第二彈性層124之彈性係數皆不相同。由於第一彈性層122及第二彈性層124具有相異之彈性係數，可藉此控制親水性共聚物層120b之彈性係數。在本發明之實施例中，親水性共聚物層120b之彈性係數係介於約1kPa至100kPa。
胜肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120b之表面125上。由於胜肽鏈130係由胺基酸所組成，且具有許多胺基，因此胜肽鏈130上的胺基可與具有羧酸基團的單元上的羧酸基反應形成醯胺鍵結。上述胜肽鏈130包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
第1C圖的細胞培養製品100c與第1B圖相似。在第1C圖中，細胞培養製品100c包含基板110、親水性共聚物層120c及胜肽鏈130。基板110具有表面111，且親水性共聚物層120c係設置於基板110之表面111上。親水性共聚物層120c係由聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成。胜肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120c之表面127上。
在本發明之實施例中，聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)；且 具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
在本發明之實施例中，親水性共聚物層120c之材料具有化學式1所示之通式：
其中，R為甲基(methyl group)、乙基(ethyl group)或乙醯基(acetyl group)；x、y及z係分別表示聚乙烯醇單元、聚乙醯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元的含量。
在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120c中的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120c中的含量百分比分別為約85%、10%及5%。
第1C圖與第1B圖的相異處在於，第1C圖中親水性共聚物層120c係由第一彈性層122、第二彈性層124及第三彈性層126所構成。第一彈性層122、第二彈性層124及第三彈性層126皆係由聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元共聚合而成，惟第一彈性層122、第二彈性層124及第三彈性層126之彈性係數皆不相同。由於第一彈性層122、第二彈性層124及第三彈性層 126具有相異之彈性係數，可藉此控制親水性共聚物層120c之彈性係數。在本發明之實施例中，親水性共聚物層120c之彈性係數係介於約1kPa至100kPa。
胜肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120c之表面127上。由於胜肽鏈130係由胺基酸所組成，且具有許多胺基，因此胜肽鏈130上的胺基可與具有羧酸基團的單元上的羧酸基反應形成醯胺鍵結。上述胜肽鏈130包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
第2圖係根據本發明之實施例所繪示的製造細胞培養製品的階段剖面圖。
在第2圖(a)中，提供具有表面211的基板210，且在基板210的表面211上形成親水性共聚物層220a。其中親水性共聚物層220a係經由共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有羧酸基團的單元共聚合而成。在本發明之實施例中，聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)；且具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
在本發明之實施例中，更包含先製備親水性共聚物溶液，且將親水性共聚物溶液塗佈在基板210之表面211 上，形成親水性共聚物層220a。此親水性共聚物溶液包含親水性共聚物，親水性共聚物之濃度為約0.05~0.2wt%。在第2圖(a)中，親水性共聚物層220a具有一厚度(D1)，其大於9微米。
在第2圖(b)中，進行交聯反應，使第2圖(a)的親水性共聚物層220a中的聚乙烯醇單元彼此交聯，形成親水性共聚物層220b。在本發明之實施例中，利用戊二醛(glutaraldehyde)在一硫酸水溶液中與親水性共聚物層中的聚乙烯醇單元進行交聯反應。藉由進行交聯反應，及控制交聯反應時間，可調控親水性共聚物層220b之彈性係數。在本發明之實施例中，交聯反應時間為約0.5小時至48小時，且親水性共聚物層220b之彈性係數係介於約1kPa至100kPa。在本發明之實施例中，親水性共聚物層200b具有一厚度(D2)，其範圍為約2.0~9.0微米。
在交聯反應中，先將第2圖(a)的結構浸於交聯反應液310中，使第2圖(a)的親水性共聚物層220a反應成為親水性共聚物層220b，如第3圖所示。在本發明之實施例中，交聯反應液310包含0.1wt%的戊二醛(glutaraldehyde)、1.0wt%的硫酸(H2SO4)及20.0wt%的硫酸鈉(Na2SO4)。上述交聯反應係如反應流程(scheme)1所示： 反應流程1
在反應流程1中，親水性共聚物中的聚乙烯醇單元會在硫酸的作用下，與戊二醛進行反應，形成具有乙縮醛基(acetal group)的交聯的親水性共聚物。隨著交聯反應的時間愈長，親水性共聚物層的交聯程度愈高，其彈性係數亦隨之增加。請參考表1，隨著交聯反應的時間愈長，親水性共聚物層的含水量愈少。若將親水性共聚物層乾燥後再浸潤，則交聯反應時間愈長的親水性共聚物層的厚度差異愈小。
在第2圖(c)中，分別結合胜肽鏈230於親水性共聚物層220c的表面221上。胜肽鏈230係由胺基酸聚合而成，其骨架一端具有胺基(-NH2)，且部份胺基酸具有胺基(-NH2)側鏈。當胜肽鏈230呈一級結構時，胜肽鏈230上的胺基會與親水性共聚物層220c中的羧酸基團反應，形成醯胺鍵結。其中，胜肽鏈230上的胺基可為胜肽鏈230之一端，或胺基酸的側鏈。且每一胜肽鏈230係分別結合於親水性共聚物層220c的表面221上。
當胜肽鏈230呈二級以上結構時，胜肽鏈230的部份胺基可能暴露於胜肽鏈230的二級以上結構之表面。這些暴露於胜肽鏈230表面的胺基會與親水性共聚物層220c中的羧酸基團反應，形成醯胺鍵結。其中，胜肽鏈230上的胺基可為胜肽鏈230之一端，或胺基酸的側鏈。且每一胜肽鏈230係分別結合於親水性共聚物層220c的表面221上。
在本發明之實施例中，胜肽鏈230包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的片段(CS-1)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
上述分別結合胜肽鏈於親水性共聚物層的表面上係如反應流程(scheme)2所示：
在反應流程2中，親水性共聚層的表面僅簡略的繪示一羧酸基。然而，在親水性共聚物層的實際結構中，親水性共聚物層的表面應包含許多羧酸基團，且羧酸基團皆可進行反應流程2所示的反應，將許多胜肽鏈分別結合於親水性共聚物層之表面上。胜肽鏈上的胺基會與親水性共聚物層中的羧酸基團反應，形成醯胺鍵結。其中，胜肽鏈上的胺基可為胜肽鏈之一端，或胺基酸的側鏈。且每一胜肽鏈係分別結合於親水性共聚物層的表面上。
第4圖係根據本發明之實施例所繪示的製造細胞 培養製品的階段流程圖。第4圖的步驟410~440係配合第2圖的製造細胞培養製品的階段剖面圖，以揭露製造細胞培養製品的各個階段。
在步驟410中，提供具有表面211的基板210。接著形成親水性共聚物層220a於基板210之表面211上，其中親水性共聚物層220a係經由共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，如步驟420所述。在本發明之實施例中，聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)；且具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。請參考第2圖(a)，親水性共聚物層220a具有一厚度(D1)，其大於9微米。
在本發明之實施例中，更包含先製備親水性共聚物溶液，且將親水性共聚物溶液塗佈在基板之表面上，形成親水性共聚物層220a。此親水性共聚物溶液包含親水性共聚物，親水性共聚物之濃度為約0.05~0.2wt%。
在步驟430中，進行交聯反應，使親水性共聚物層220a中的聚乙烯醇單元彼此交聯，形成親水性共聚物層200b。在本發明之實施例中，利用戊二醛(glutaraldehyde)在一硫酸水溶液中與親水性共聚物中的聚乙烯醇單元進行交聯反應。藉由進行交聯反應，及控制交聯反應時間，可調控親水性共聚物層200b之彈性係數。在本發明之實施例中，交聯反應時間為約0.5小時至48小時，且親水性共聚 物層200b之彈性係數係介於約1kPa至100kPa。請參考第2圖(b)，親水性共聚物層200b具有一厚度(D2)，其範圍為約2.0~9.0微米。
步驟440係分別結合胜肽鏈230於親水性共聚物層220c的表面221上。在本發明之實施例中，胜肽鏈230包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的片段(CS-1)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
第5圖係根據本發明之實施例所繪示的培養未分化幹細胞的階段流程圖。在第5圖中，步驟510~530係說明利用第1A圖的細胞培養製品100a進行培養細胞的各個階段。
在步驟510中，先提供細胞培養製品100a。細胞培養製品100a包含基板110、位於基板110上的親水性共聚物層120a以及分別結合於親水性共聚物層120a的胜肽鏈130。其中，親水性共聚物層120a係經由共聚反應，將聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元共聚合而成。在本發明之一實施中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元於親水性共聚物層120a中的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。在本發明之一實施中，胜肽鏈包含纖維黏連蛋白的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
在步驟520中，培養未分化的幹細胞於細胞培養製 品100a上及化學成分確定的細胞培養液中，其中未分化的幹細胞係結合於細胞培養製品100A上的胜肽鏈130。在本發明之一實施中，幹細胞包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。在本發明之一實施中，在化學成分確定的細胞培養液中更包含一細胞生長因子及一轉化生長因子。
在步驟530中，持續在化學成分確定的細胞培養液中培養未分化的幹細胞至少五代(passages)。在本發明之一實施中，化學成分確定的細胞培養液中，持續培養未分化的幹細胞至少十代。
第6圖係根據本發明之實施例所繪示的調控幹細胞分化的階段流程圖。在第6圖中，步驟610~640係說明利用第1A圖的細胞培養製品100a調控幹細胞分化的各個階段。
在步驟610中，提供細胞培養製品100a。細胞培養製品100a包含基板110、位於基板110上的親水性共聚物層120a、以及分別結合於親水性共聚物層120a的胜肽鏈130。其中親水性共聚物層120a係經由共聚反應，將聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元共聚合而成。在本發明之實施例中，聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元在親水性共聚物層120a中的含量百分比分別為約65~98.7%、0~30%及1.3~5%。在本發明之實施例中，胜肽鏈包含纖維黏連蛋白 的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
在步驟620中，調控親水性共聚物層120a之交聯反應時間，令使親水性共聚物層120a具有特定的彈性係數。藉由控制交聯反應時間，可調控親水性共聚物層120a之彈性係數。在本發明之實施例中，交聯反應時間為約0.5小時至48小時，且親水性共聚物層120a之彈性係數係介於約1kPa至100kPa。
在步驟630中，培養未分化的幹細胞於細胞培養製品100a上及化學成分確定的細胞培養液中，其中未分化的幹細胞係結合於細胞培養製品100a上的胜肽鏈130。在本發明之實施例中，幹細胞包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及誘導式多功能幹細胞(iPSCs)。
在步驟640中，加入組合蛋白(integrin)，且利用具有特定彈性係數範圍的親水性共聚物層120a誘導未分化的幹細胞進行分化作用，令使未分化的幹細胞分化成為預期的細胞株。在本發明之實施例中，在化學成分確定的細胞培養液中更包含細胞生長因子及轉化生長因子。在本發明之實施例中，預期的細胞株(cell line)包含神經細胞(neural cell)、肌肉細胞(muscle cell)或成骨細胞(osteoblast)。
在本發明之實施例中，當親水性共聚物層的彈性係數為約1kPa時，可誘導未分化的幹細胞分化成為神經細胞。當親水性共聚物層的彈性係數為約10kPa時，可誘導未分化的幹細胞分化成為肌肉細胞。當親水性共聚物層的 彈性係數為約100kPa時，可誘導未分化的幹細胞分化成為成骨細胞。
在本發明之實施例中，藉由控制交聯反應時間，可調控親水性共聚物層之彈性係數。表2係表示實施例1~5及比較例1之彈性係數。
由表2可知，隨著交聯反應時間愈長，親水性共聚物層的彈性係數愈大。實施例1的交聯反應時間為0.5小時，其親水性共聚物層的彈性係數最小(11.1)。而實施例5的交聯反應時間為48小時，其親水性共聚物層的彈性係數最大(91.2)。相較於比較例1的疏水性材料(TCPS)，本發明之實施例1~5可藉由控制乾燥時間，調控親水性共聚物層的彈性係數。
另一方面，當親水性共聚物層的交聯反應時間愈 長，其彈性係數愈高，且培養於其上的幹細胞的分化比例亦隨之提升，請參考表3。表3係表示實施例6~11及比較例2之幹細胞分化比例(differentiation ratio)。
由表3可知，隨著親水性共聚物層的交聯反應時間愈長，則親水性共聚物層的彈性係數愈大，且培養於此親水性共聚物層上的幹細胞的分化比例愈大。實施例6的交聯反應時間為1小時，其幹細胞的分化比例最低。而實施例11的交聯反應時間為48小時，其幹細胞的分化比例最高(60%)。相較於比較例2，本發明之實施例可藉由控制交聯反應時間，調控親水性共聚物層的彈性係數，並且可顯著提升幹細胞的分化效率。
第7A圖係利用第1A圖的細胞培養製品100a培養細胞的俯視圖。細胞培養製品包含基板110及親水性共聚物層120a，且許多細胞群710係培養於親水性共聚物層120上。在本發明之實施例中，細胞群710包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。
在本發明之實施例中，親水性共聚物層120a係經由共聚反應，將聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元共聚合而成。聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)，且具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
第7B圖係利用第1A圖的細胞培養製品100a培養細胞的剖面圖。在第7B圖中，細胞培養製品100a包含基板110、親水性共聚物層120a及胜肽鏈130。其中，親水性共聚物層120a係位於基板110之上，且胜肽鏈130係分別結合於親水共聚物層120a之表面上。
細胞720係培養於親水性共聚物層120a上。細胞720具有許多受體721，且受體721可藉由專一性的交互作用力與親水性共聚物層120a之表面上的胜肽鏈130結合，而固定於親水性共聚物層120a之表面上。
在本發明之實施例中，細胞720包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。 在本發明之實施例中，胜肽鏈130包含寡胜肽、多胜肽、蛋白質或其組合。寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
在本發明之實施例中，親水性共聚物層120a係經由共聚反應，將聚乙烯醇單元、聚乙烯醇衍生物單元及具有羧酸基團的單元共聚合而成。聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)，且具有羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
第8圖(a)係利用比較例2的細胞培養製品培養細胞的影像，其中比較例2係購自Corning且型號為Corning Synthemax。在第8圖(a)中，利用比較例2的細胞培養製品培養細胞時，細胞群(箭頭處)的密度較為鬆散。
第8圖(b)係利用實施例7的細胞培養製品培養細胞的影像，其中實施例7中親水性共聚物層的交聯反應時間為4小時。相較於第8圖(a)，利用實施例7的細胞培養製品培養細胞時，細胞群(箭頭處)的密度較為緊密。
在本發明之實施例中，細胞培養製品係藉由分別結合於親水性共聚物層上的胜肽鏈與欲培養的細胞表面的受體(receptor)結合，使細胞得以貼附於親水性共聚物層的表面上，而不易漂浮於細胞培養液中，造成欲培養的細胞死亡。由於親水性共聚物層具有較佳的親水性，使細胞不易 漂浮於細胞培養液中，以增加培養細胞的存活率。
另一方面，在自然環境下，由於未分化的幹細胞與組織之間具有一定範圍的彈性應力，此彈性應力可誘導未分化的幹細胞分化成為特定細胞。本發明之實施例所提供的細胞培養製品能利用調控親水性共聚物層的彈性係數，藉此誘導幹細胞分化成特定種類的細胞，並且增進幹細胞的分化比例。
雖然本發明之實施例已揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當以後附之申請專利範圍所界定為準。
100a‧‧‧細胞培養製品
110‧‧‧基板
111、121‧‧‧表面
120a‧‧‧親水性共聚物層
130‧‧‧胜肽鏈

Claims (32)

  1. 一種細胞培養製品，包含：一基板，其具有一表面；一親水性共聚物層，設置於該基板的該表面上，其中該親水性共聚物層係由複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有一羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，該親水性共聚物層具有一介於約1kPa至100kPa的彈性係數；以及複數個胜肽鏈，各個該些胜肽鏈結合於該親水性共聚物層之一表面上。
  2. 如請求項1所述之細胞培養製品，其中該些聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)。
  3. 如請求項1所述之細胞培養製品，其中該些具有該羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
  4. 一種細胞培養製品，包含：一基板，其具有一表面；一親水性共聚物層，設置於該基板的該表面上，其中該親水性共聚物層係由複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有一羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，該親水性共聚物層具有一介於約1kPa至100 kPa的彈性係數，在該親水性共聚物層中，該些聚乙烯醇單元、該些聚乙烯醇衍生物單元及該些具有該羧酸基團的單元的含量百分比分別為約65~98.7%、小於或等於30%及1.3~5%；或其中該親水性共聚物層係由複數個聚乙烯醇單元及複數個具有一羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，在該親水性共聚物層中，該些聚乙烯醇單元及該些具有該羧酸基團的單元的含量百分比分別為約65~98.7%及1.3~5%；以及複數個胜肽鏈，各個該些胜肽鏈結合於該親水性共聚物層之一表面上。
  5. 如請求項1所述之細胞培養製品，其中在該親水性共聚物層中，該些聚乙烯醇單元、該些聚乙烯醇衍生物單元及該些具有該羧酸基團的單元的含量百分比分別為約85%、10%及5%。
  6. 如請求項1所述之細胞培養製品，其中該些胜肽鏈包含一寡胜肽、一多胜肽、一蛋白質或其組合。
  7. 如請求項6所述之細胞培養製品，其中該寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的一CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的一片段。
  8. 如請求項6所述之細胞培養製品，其中該蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
  9. 如請求項1所述之細胞培養製品，其中該些胜肽鏈的一胺基酸係藉由一醯胺鍵分別結合於該些具有該羧酸基團的單元。
  10. 一種細胞培養製品的製造方法，包含：提供一基板，該基板具有一表面；形成一親水性共聚物層於該基板上，其中該親水性共聚物層係經由一共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有一羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，該親水性共聚物層具有一介於約1kPa至100kPa的彈性係數；進行一交聯反應，使該親水性共聚物層中的該些聚乙烯醇單元彼此交聯；以及分別結合複數個胜肽鏈於該親水性共聚物層之一表面上。
  11. 如請求項10所述之製造方法，更包含製備一親水性共聚物溶液，且將該親水性共聚物溶液塗佈在該基板之該表面上，形成該親水性共聚物層。
  12. 如請求項11所述之製造方法，其中該親水性共聚物溶液包含一親水性共聚物，該親水性共聚物之濃度為約0.05~0.2wt%。
  13. 如請求項10所述之製造方法，其中該些聚乙烯醇衍生物單元包含聚乙烯基乙酯(polyvinyl acetate)、聚乙烯基甲基醚(polyvinyl methyl ether)或聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)。
  14. 如請求項10所述之製造方法，其中該些具有該羧酸基團的單元包含衣康酸(itaconic acid)。
  15. 如請求項10所述之製造方法，其中該些胜肽鏈包含一寡胜肽、一多胜肽、一蛋白質或其組合。
  16. 如請求項10所述之製造方法，其中該寡胜肽包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)的片段(CS-1)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)的片段。
  17. 如請求項10所述之製造方法，其中該蛋白質包含纖維黏連蛋白(fibronectin,FN)或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
  18. 如請求項10所述之製造方法，其中進行該交聯反應係利用戊二醛(glutaraldehyde)在一硫酸水溶液中與該親水性共聚物層中的該些聚乙烯醇單元進行該交聯反應。
  19. 如請求項10所述之製造方法，其中進行該交聯反應，更包含：控制該交聯反應的一交聯反應時間，以調控該親水性共聚物層之該彈性係數。
  20. 如請求項19所述之製造方法，其中該交聯反應時間為約0.5小時至48小時。
  21. 一種培養未分化幹細胞的方法，包含：提供一細胞培養製品，該細胞培養製品包含一基板、一位於該基板上的親水性共聚物層、以及複數個分別結合於該親水性共聚物層的胜肽鏈，其中該親水性共聚物層係經由一共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有一羧酸基團的單元共聚合而成，該親水性共聚物層具有一介於約1kPa至100kPa的彈性係數；培養複數個未分化的幹細胞於該細胞培養製品上及一化學成分確定的細胞培養液中，其中該些未分化的幹細胞係結合於該細胞培養製品上的該些胜肽鏈；以及持續在該化學成分確定的細胞培養液中培養該些未分化的幹細胞至少五代(passages)。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該些幹細胞包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。
  23. 如請求項21所述之方法，其中該些胜肽鏈包含纖維黏連蛋白的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
  24. 一種培養未分化幹細胞的方法，包含：提供一細胞培養製品，該細胞培養製品包含一基板、一位於該基板上的親水性共聚物層、以及複數個分別結合於該親水性共聚物層的胜肽鏈，其中該親水性共聚物層係經由一共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有一羧酸基團的單元共聚合而成，該親水性共聚物層具有一介於約1kPa至100kPa的彈性係數，在該親水性共聚物層中，該些聚乙烯醇單元、該些聚乙烯醇衍生物單元及該些具有該羧酸基團的單元的含量百分比分別為約65~98.7%、小於或等於30%及1.3~5%；或其中該親水性共聚物層係由複數個聚乙烯醇單元及複數個具有一羧酸基團(carboxylic group)的單元共聚合而成，在該親水性共聚物層中，該些聚乙烯醇單元及該些具有該羧酸基團的單元的含量百分比分別為約65~98.7%及1.3~5%； 培養複數個未分化的幹細胞於該細胞培養製品上及一化學成分確定的細胞培養液中，其中該些未分化的幹細胞係結合於該細胞培養製品上的該些胜肽鏈；以及持續在該化學成分確定的細胞培養液中培養該些未分化的幹細胞至少五代(passages)。
  25. 如請求項24所述之方法，在該化學成分確定的細胞培養液中更包含一細胞生長因子及一轉化生長因子。
  26. 如請求項24所述之方法，在該化學成分確定的細胞培養液中，持續培養該些未分化的幹細胞至少十代。
  27. 一種調控幹細胞分化的方法，包含：提供一細胞培養製品，該細胞培養製品包含一基板、一位於該基板上的親水性共聚物層、以及複數個分別結合於該親水性共聚物層的胜肽鏈，其中該親水性共聚物層係經由一共聚反應，將複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個具有一羧酸基團的單元共聚合而成；調控該親水性共聚物層之一交聯反應時間，令使該親水性共聚物層具有一特定的彈性係數，該特定的彈性係數係介於約1kPa至100kPa；培養複數個未分化的幹細胞於該細胞培養製品上及一化學成分確定的細胞培養液中，其中該些未分化的幹細胞係結合於該細胞培養製品上的該些胜肽鏈；以及 加入一組合蛋白(integrin)，且利用具有該特定彈性係數範圍的該親水性共聚物層誘導該些未分化的幹細胞進行分化作用，令使該些未分化的幹細胞分化成為一預期的細胞株。
  28. 如請求項27所述之方法，其中該組合蛋白包含α6β1組合蛋白、αVβ3組合蛋白、αVβ5組合蛋白或其組合。
  29. 如請求項27所述之方法，其中該些幹細胞包含人類成體幹細胞(human adult stem cells)、人類胎兒幹細胞(hFSCs)、人類胚胎幹細胞(hESCs)及人類誘導式多功能幹細胞(hiPSCs)。
  30. 如請求項27所述之方法，其中該些胜肽鏈包含纖維黏連蛋白的CS-1片段或玻璃體粘連蛋白(vitronectin,VN)。
  31. 如請求項27所述之方法，在該化學成分確定的細胞培養液中更包含一細胞生長因子及一轉化生長因子。
  32. 如請求項27所述之方法，其中該預期的細胞株(cell line)包含神經細胞(neural cell)、肌肉細胞(muscle cell)或成骨細胞(osteoblast)。
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