JP2004279204A - バイオチップ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】金属結合性官能基と、炭素数8以下のヘテロ原子を含まないアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が表面に結合しているバイオチップ。
上記分子中の高分子部は末端がヒドロキシ基あるいはメトキシ基で分子量が1,000以上のポリエチレングリコールであることが好ましく、金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基であることが好ましい。
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体分子の非特異的吸着を抑制したバイオチップに関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。
チップ基板には生体分子だけではなく、親水性物質が固定化される方法が発明されている。たとえば特許文献1には区画された部位にDNAが、その他の部分にポリエチレングリコールが固定化されたバイオチップアレイが示されている(特許文献1参照)。DNAが固定化されていない部位への非特異的吸着を抑制し、DNAハイブリダイゼーション、さらには蛋白との相互作用の解析に成功している。しかし、この方法では一旦保護基を全面に固定化した後に紫外線照射により区画化、DNAを固定化した後に周囲部の保護基を外し、反応性官能基であるスクシンイミド基を有するポリエチレングリコールを固定化する。よってチップ作製は非常に煩雑であり、多くのステップが必要である。
【0003】
また、非特許文献1には、ビオチン末端の物質とポリエチレングリコールが混合されて表面に固定化する手法が示されている(非特許文献1参照)。この方法によりビオチンが表面に効率よく導入されるだけでなく、非特異吸着を抑制すると予想される。この発明に用いられたポリエチレングリコールは炭素数11のアルキル鎖、末端に金属結合性官能基であるチオール基が設けられている。しかし、このような化合物は疎水性部のアルキル鎖と親水性部のポリエチレングリコール鎖を有するため、合成は困難である。場合によってはミセルを形成し、バイオチップ表面への結合を制御するのが難しい場合がある
よって、容易にかつ安価に非特異的吸着を抑制されたバイオチップが求められている。
【0004】
【特許文献1】
米国特許6127129号明細書
【非特許文献1】
Jung et.al. Langmuir 16(2000)9421−9432
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを得ることにある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、バックグランドとのコントラストが高く、吸着・結合等の測定が容易に行えるバイオチップを得ることにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
1.金属結合性官能基と、炭素数8以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が表面に結合しているバイオチップ
2.アルキル部の炭素数が4以下である1記載のバイオチップ
3.アルキル部の炭素数が2である1乃至2記載のバイオチップ
4.親水性高分子部の末端がヒドロキシ基あるいはメトキシ基である1〜3いずれか記載のバイオチップ
5.親水性高分子部の分子量が1,000以上である1〜4いずれか記載のバイオチップ
6.親水性高分子部がポリエチレングリコールである1〜5いずれか記載のバイオチップ
7.金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基である1〜6いずれか記載のバイオチップ
8.チップ表面が金である1〜7いずれか記載のバイオチップ
9.チップが金で被覆された透明基板である1〜8いずれか記載のバイオチップ
10.チップが表面プラズモン共鳴で測定される1〜9いずれか記載のバイオチップ
11.チップが表面プラズモン共鳴イメージングで測定される1〜10いずれか記載のバイオチップ
12.チップ上が生体分子を固定化する部分(固定化部)と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、金属結合性官能基と、炭素数8以下アルキル部と、親水性高分子部から成る分子が固定化されている1〜11いずれか記載のバイオチップ
13.チップが金で被覆された水晶発振子である1〜8いずれか記載のバイオチップ
【0007】
本発明のバイオチップは、金属結合性官能基と、炭素数8以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子(以下親水性化合物と表すことがある)が表面に結合している。バイオチップ表面に結合される当該親水性化合物は、X−R1−R2、もしくはR2−R1−X−R1−R2の化合式で表されることが好ましい。ここで、Xは表面の金属に結合するための官能基、R1はアルキル鎖でヘテロ原子を含まないものであり、R2は親水性高分子鎖である。この親水性化合物は、Xによりバイオチップ表面に固定化され、R2の親水性高分子により、チップ表面への非特異的吸着を抑制する。
【0008】
この親水性化合物は区画が分けられてスポットの周囲部のみに固定化される、もしくは他の物質と混合され、チップ全面にわたって固定化される、またはその両方の手段を併用するかは特に限定されるものではない。
【0009】
本発明において、チップの基板は金属であり、特に金属の薄層であることが好ましい。該親水性化合物の化合式のXは金属に直接結合、吸着することのできる官能基である。R1のアルキル鎖は炭素数8以下であることが好ましい。8以下の場合、分子全体に対するアルキル鎖の疎水性が大きな問題とならず、合成が容易となる。8以下でも表面に結合し、表面の親水性を保持するには十分である。
炭素数4以下の場合がさらに好ましく、炭素数2の場合が最も好ましい。
親水性高分子の末端は非特異的吸着を抑制するため反応性が低いことが求められる。末端の官能基としては低反応性かつ非イオン性の点でヒドロキシ基あるいはメトキシ基が好ましい。
【0010】
親水性高分子の分子量は1000以上であることが好ましい。1000未満である場合、バイオチップ表面が十分に親水性でなく、非特異吸着を抑制することができない場合があるからである。親水性高分子の分子量の上限は特に定めるものではないが、分子量が20000を越えると、溶液の粘性が上昇し、高分子が絡み合ったまま表面に固定化されることがある。共有結合で固定化されていない高分子が徐々に脱離するために、センサーのベースラインが変化することがあり、好ましくない場合がある。
【0011】
親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(メタ)アクリル酸塩、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。
これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のOH基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは親水性が高く、反応性の有する官能基がないため非特異吸着を抑制する効果が高い。なお、これら親水性高分子は高分子とR1とが結合する部分を含んでいても良い。
【0012】
バイオチップ表面に結合される化合物X−R1−R2もしくはR2−R1−X−R1−R2において、表面の金属に結合するための官能基Xはチオール基もしくはジスルフィド基であることが好ましい。Xがチオール基の場合はX−R1−R2の形をとり、Xがジスルフィド基の場合はR2−R1−X−R1−R2の形をとる。これらの官能基は金属、特に金基板への吸着結合に最適であり、バイオチップ基板は金であることが好ましい。
【0013】
バイオチップの検出方法としては表面プラズモン共鳴法もしくは水晶発振子法が好ましい。いずれも生体分子を放射線同位体や蛍光分子でラベルする必要がなく、物質間の相互作用をリアルタイムに評価することができる。
【0014】
表面プラズモン共鳴法による分析に供されるためには、本発明のバイオチップは金で被覆された透明基板であることが好ましい。
特に表面プラズモン共鳴イメージング法は、バイオチップ表面に複数の物質を固定化したアレイを作製し、同時に複数の物質の相互作用を観察することができるため好ましい。
【0015】
バイオチップは生体分子を固定化する部分(固定化部)と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、金属結合性官能基と、炭素数8以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が固定化されていることが好ましい。バックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する親水性高分子を固定化することで、固定化部とバックグラウンド部のシグナルの変化が明確となり、バイオチップとして非常に好ましい。
【0016】
基板上に親水性化合物を固定化する方法としては、コート法が好ましく、スプレーコート、ディッピング、ローラーコート、ナイフコート(ブレードコート)等、公知のコート法を用いることができる。
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0017】
[実施例]
(ステップ1)
アルキル鎖の炭素数が2であり、末端の官能基がチオール基であるPEGチオール(日本油脂製SUNBRIGHT MESH−50H)を1mMの濃度で7mlのエタノール:水=6:1の混合溶液に溶解させた。PEGチオールの分子量は5000であり、親水性が非常に高い。また、PEGの末端はメトキシ基であり、反応性をほとんど有さない。
【0018】
18mm四方、1mm厚のLak10ガラススライドにクロムを3nm蒸着し、金を45nm蒸着した金蒸着スライドを、上記PEGチオール溶液に3時間浸漬させ、金基板全体にPEGチオールを結合させた。
【0019】
(ステップ2)
このスライドの上に図1に示すフォトマスクを載せ、500W超高圧水銀ランプ(ウシオ電機製)で2時間照射し、固定化部のPEGチオールを除去した。
【0020】
(ステップ3)
次に11−アミノ−1−ウンデカンチオール・ハイドロクロライド(11−AUT:同仁化学研究所)の1mM溶液中にスライドを2時間浸漬し、固定化部にアミノ基を導入した。
【0021】
(ステップ4)
N−ヒドロキシスクシンイミド基とマレイミド基を有する分子量3400のPEG(NHS−PEG−MAL:Shearwater社製)を10mg/mlの濃度で固定化部に1時間反応させ、マレイミド基を導入した。
【0022】
(ステップ5)
ここに4種類の5’チオール末端DNA(A,B,C,D)を1mMの濃度(リン酸緩衝液)に調製し、15時間反応させて固定化した。4種類のチオール末端DNAのシーケンスを下に示す。5’末端にチオール基を有し、Tが15塩基スペーサーとして入っている配列になっている。
【0023】
4種類のチオール末端DNAのシーケンス
A:5’HS−(T)15−ATCTGATAAGACTTATCTGCT 3’
B:5’HS−(T)15−CGGCAACTGATAAGGATTCCC 3’
C:5’HS−(T)15−TGCTGACTCAGCA 3’
D:5’HS−(T)15−CAATGAGTCATTG 3’
【0024】
このように5つのステップで簡易にDNAアレイを作製することができた。こうして得られたDNAアレイを表面プラズモン共鳴イメージング装置(GWC Instruments社製)にセットし、リン酸緩衝液(10mMリン酸、150mM NaCl)を注入した。そして、4種類のDNA(A,B,C,D)のTが15塩基続くスペーサー部を除いた相補的DNAを1μMでリン酸緩衝液に溶解した液を順に流し、それぞれをハイブリダイゼーションさせた。そのSPRシグナルを図3に示す。それぞれの部位のシグナルが増大し、ハイブリダイゼーションがおこったことを示している。このときのバックグラウンド部にはほとんど吸着しておらず、非特異的吸着がないことを示している。
このように非特異的吸着が抑制されたバイオチップを容易に得ることができた。
【0025】
[比較例]
(ステップ1)
11−AUTの1mM溶液に金蒸着ガラススライドを3時間浸漬し、表面にアミノ基を導入した。
【0026】
(ステップ2)
Fmoc−OSu(NovaBiochem社製)0.5mgをDMSO200μlに溶解させ、リン酸緩衝液300μlを加え、ガラススライドに2時間反応させた。
【0027】
(ステップ3)
このスライドの上に図1に示すフォトマスクを載せ、500W超高圧水銀ランプ(ウシオ電機製)で2時間照射し、固定化部のPEGチオールを除去した。
【0028】
(ステップ4)
次に11−AUTの1mM溶液中にスライドを2時間浸漬し、固定化部にアミノ基を導入した。
【0029】
(ステップ5)
N−ヒドロキシスクシンイミド基とマレイミド基を有する分子量3400のPEG(NHS−PEG−MAL:Shearwater社製)を10mg/mlの濃度で固定化部に1時間反応させ、マレイミド基を導入した。
【0030】
(ステップ6)
ここに三種類の5’チオール末端DNAを1mMの濃度(リン酸緩衝液)に調製し、15時間反応させて固定化した。
【0031】
(ステップ7)
Tris(2−aminoethyl)amine 0.09ml、ジメチルホルムアミド0.51mlの混合溶液に5分浸漬する工程を二回繰り返し、Fmocを除去した
【0032】
(ステップ8)
片末端にスクシンイミド基を有する分子量2000のPEG(mPEG−SPA)を反応させ、バックグラウンド部にPEGを固定化する
こうしてバックグラウンド部にPEGを有するDNAアレイを得るのに8ステップが必要であり、アレイの作製は煩雑である。
【0033】
【発明の効果】
本発明により、非特異的吸着が抑制されたバイオチップを簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例、比較例で使用したフォトマスク
【図2】ハイブリダイゼーションによるSPRシグナルの変化
Claims (11)
- 金属結合性官能基と、炭素数8以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が表面に結合していることを特徴とするバイオチップ
- 親水性高分子部の末端がヒドロキシ基あるいはメトキシ基であることを特徴とする請求項1に記載のバイオチップ
- 親水性高分子部の分子量が1,000以上であることを特徴とする請求項1又は2に記載のバイオチップ
- 親水性高分子部がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載のバイオチップ
- 金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基であることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載のバイオチップ
- チップ表面が金であることを特徴とする請求項1〜5いずれか記載のバイオチップ
- チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項1〜6いずれか記載のバイオチップ
- チップが表面プラズモン共鳴で測定されるものであることを特徴とする請求項1〜7いずれか記載のバイオチップ
- チップが表面プラズモン共鳴イメージングで測定されるものであることを特徴とする請求項1〜8いずれか記載のバイオチップ
- チップ上が生体分子を固定化する部分(固定化部)と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、金属結合性官能基と、炭素数8以下のヘテロ原子を含まないアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が固定化されていることを特徴とする請求項1〜9いずれか記載のバイオチップ
- チップが金で被覆された水晶発振子である請求項1〜6いずれか記載のバイオチップ
Priority Applications (1)
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JP2003070736A JP2004279204A (ja) | 2003-03-14 | 2003-03-14 | バイオチップ |
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WO2006043461A1 (ja) * | 2004-10-20 | 2006-04-27 | Riken | 相互作用観察方法 |
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-
2003
- 2003-03-14 JP JP2003070736A patent/JP2004279204A/ja active Pending
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