JP2004125461A - 表面プラズモン共鳴測定用バイオチップ - Google Patents
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Abstract
【課題】バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得る。
【解決手段】生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と接触させたのちに、分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、該緩衝液で３分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するニッケルとヒスチジンタグ付蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップ
【解決手段】生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と接触させたのちに、分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、該緩衝液で３分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するニッケルとヒスチジンタグ付蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップ
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
表面プラズモン共鳴によって物質間の相互作用を評価できるバイオチップに関する。特には、ヒスチジンタグを有する生体分子もしくは生物分子集合体を効率よく吸着させることにより、表面プラズモン共鳴を測定した際にバックグランドとの差が明白になるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡや蛋白質などの生体分子の機能を調べるあるいは、発現遺伝子、蛋白質を明らかにする手段として、生体分子間の相互作用を評価する試みがなされている。その一つとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による相互作用解析法が挙げられる。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を共鳴角の変化で測定する方法である。
【０００３】
ＳＰＲの利点は、相互作用分析に蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質が不要な点とリアルタイムでの測定が可能な点である。ラベル物質を物質に導入するのは非常に煩雑かつ困難な場合があり、ラベル操作により物質の本来の機能、活性が失われる場合がある。
【０００４】
ＳＰＲで相互作用を観察するには分子を金属薄膜表面に固定化する必要がある。固相に生体分子を固定化する方法として、表面に導入した官能基を起点とし、共有結合、イオン結合によって固定化する手段などが挙げられる。
【０００５】
従来の技術では基板上の一点を測定するものがほとんどであるが、文献等にあるようにＳＰＲ技術を応用したＳＰＲイメージング法によって基板表面の局在部位におけるＳＰＲ変化を検出することが可能である（例えば、非特許文献１）。すなわち、基板上の異なる場所に複数の物質を固定化すれば、複数の物質の相互作用解析が同時に可能である。
【０００６】
ＳＰＲに用いられるチップも、基板全体に官能基を導入するものがほとんどであり、生体分子を固定化していない状態では固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。そのため、ＳＰＲイメージング法に適用すると、バックグラウンド部に存在する官能基へサンプルが非特異的吸着するのを無視できない場合がある。また、微少量だけ特定の位置に生体分子溶液をスポットする技術も必須であり、高価なスポッティング装置が必要となる。
【０００７】
米国特許では、固定化部位に生体分子を固定化し、バックグラウンド部に起点となる官能基あるいは結合分子が存在しない親水性高分子を固定化したアレイを作製する手段が開示されている例えば、特許文献１）。この発明では、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化する際にはバックグラウンド部は可逆性疎水性保護基が固定化されており、スポッティングが容易である。しかし、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化したのちに塩基性有機溶媒を用いて疎水性保護基を除去し、親水性高分子を固定化する操作が必要であり、非常に煩雑かつ、塩基性有機溶媒が生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。また、親水性高分子を固定化する際に固定化した生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。具体的には親水性高分子が固定化生体分子に結合し、生体分子の機能が損なわれる点である。
【０００８】
そこで、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるバイオチップが望まれている。
【０００９】
生体分子を活性・機能を保ったまま固定化する方法としてヒスチジンタグを有する蛋白質・ペプチドをニッケルキレートによって固定化し、ＳＰＲで解析する方法が特表平１０−５０５９１０に提案されている。この方法は金属キレートによって（ポリ）ペプチドを表面に固定化しＳＰＲで相互作用を研究する方法が開示しており、蛋白・ペプチドの活性、機能を保ったまま表面に固定化し、解析することが可能である。しかし、ここでは（ポリ）ペプチドは一検体ずつ、チップを再生して使用する方法が用いられており、複数の蛋白質・ペプチドを同一表面上に固定化して相互作用を解析する概念は示されていない。
【００１０】
本発明はバックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する物質が固定化され、固定化部位にはヒスチジンタグを有する物質を固定化させるための起点となるＮＴＡ基をもつ官能基導入されているバイオチップを得ることを可能とする。
【００１１】
【非特許文献１】
Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７年，６９巻，１４４９−１４５６
【特許文献１】
米国特許６１２７１２９号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体、特には、ヒスチジンタグを有する生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得ることにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
【００１４】
１．生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と接触させたのちに、分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、該緩衝液で３分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するニッケルとヒスチジンタグ付蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップ
【００１５】
２．固定化部位に導入されている官能基がニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基であることを特徴とする１に記載のバイオチップ
【００１６】
３．バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されていることを特徴とする１もしくは２記載のバイオチップ
【００１７】
４．固定化部位にポリマーが固定化されており、該ポリマーにＮＴＡ基が結合していることを特徴とする１〜３いずれかに記載のバイオチップ
【００１８】
５．金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１９】
６．表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングであることを特徴とする１〜５のいずれかに記載のバイオチップ
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明はＳＰＲ測定用のバイオチップであり、生体分子を表面に固定化し、相互作用解析や発現遺伝子、蛋白質などのスクリーニングに有効である。本発明では生体分子の固定化部位と、固定化部位以外のバックグラウンド部は明確に区別されており、固定化部位には好ましくは固定化させるための起点となるＮＴＡ基を有する物質が固定化されている。ヒスチジンタグを有する生体分子は例えばニッケル−ＮＴＡ基を介して、キレート結合によって表面に固定化することができる。
【００２１】
本発明のバイオチップはＳＰＲイメージングなどの基板表面を解析する方法に適しており、複数の固定化部位に複数の物質を固定化し、同時に相互作用解析することが可能である。ＳＰＲで解析できるよう、基板は透明プラスチックあるいはガラスが好ましく、その表面には金属薄膜が形成されている。金属薄膜は金を蒸着した表面が特に好ましい。
【００２２】
ＮＴＡ基を導入する方法は特に限定されるものではないが、ＮＴＡ基を有するアルカンチオールを直接的に金表面に導入する方法や、カルボキシル基を有するアルカンチオールを金表面に導入しておき、アミンカップリング法によってアミノ基末端のＮＴＡ化合物を導入する方法や、官能基を有する物質（好ましくはポリマー）を表面に導入しておき、官能基を有する物質にＮＴＡ基を有する化合物を結合させる方法などが挙げられる。金−硫黄結合を利用した上記方法だけでなく、官能基をもつ物質（好ましくはポリマー）を表面にコーティングして、ＮＴＡ基を導入する手法なども可能である。
【００２３】
中でも、官能基を有するポリマーを表面に固定化しておき、ＮＴＡ基を有する化合物を導入する方法はポリマーがスペーサーとして働き、非特異的結合を抑制するため好ましい。
【００２４】
バックグラウンド部は非特異的吸着を抑制するため非イオン性物質が固定化されることが好ましい。例えば末端に水酸基あるいはポリエチレングリコールなどの親水性高分子をもつアルカンチオールを直接金表面に固定化する方法が挙げられる。また、官能基を末端にもつアルカンチオールを導入しておき、該官能基を利用して間接的に非イオン性物質を表面に固定化する方法も挙げられる。
【００２５】
固定化部位とバックグラウンド部を分ける手段としては光照射によるパターン化技術や、スタンプ技術などが挙げられる。例えば、光を照射してパターン化する手法では、紫外線により金−硫黄結合を酸化して洗浄除去し、新たにアルカンチオールを金表面に結合させることができる。
【００２６】
以下に例を挙げる。
バイオチップはＳＰＲ装置にセットされ、緩衝液中にて観察される。緩衝液の屈折率によってＳＰＲ共鳴角が変化するため、測定は同一の緩衝液で実施される。緩衝液を導入した段階で、撮影する角度が設定される。バイオチップがＳＰＲ共鳴を起こし、反射光強度が極小となる入射角（ＳＰＲ共鳴角）から０．５度から１度小さい角度にて測定は実施されることが好ましい。測定対象は固定化部位であるため、固定化部位の共鳴角を対象として角度は設定する。本発明のバイオチップに対して、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と１分前後接触させて、ＮＴＡ−ニッケルキレートを形成させる。次に分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に接触させると、ヒスチジンタグ−ニッケル−ＮＴＡ錯体形成により、蛋白質が固定化部位に結合し、ＳＰＲ共鳴角が広角側にシフトするため、反射光強度が増大する。ヒスチジンタグを有する蛋白質を接触させる時間は３分以上１０分以内程度が好ましい。その後３分から１０分間緩衝液で洗浄したときに、ヒスチジンタグ蛋白が固定化部位に多く吸着される。バックグラウンド部には非イオン性物質が固定化されているため、蛋白の吸着量が少ない。このように固定化部位のみに蛋白が吸着され、その周囲にはできるだけ吸着されないようなチップが測定上好ましい。
【００２７】
ＳＰＲ装置にはスライド表面の解析が可能である白色光源を用いたＳＰＲイメージング装置を使用する。スライドからの反射像はＣＣＤカメラによって撮影するＳＰＲイメージングにより、経時的に画像が取り込まれる。取り込まれた画像から高分子を接触させる前の画像の差を演算処理によって得ることができる。
【００２８】
分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液を３０℃にてチップ表面に５分間接触させて、蛋白質が固定化部位に結合させ、その後該緩衝液にて３分間洗った場合に、その結合によって得られるＳＰＲによるシグナル増加と、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナル増加を比較する。比較対照は塩化ニッケル（ＩＩ）を接触させる前の画像となる。この操作によって、塩化ニッケルと蛋白質を接触させる前後のシグナル変化を知ることができる。固定化部位に結合するニッケルと蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であると、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を導入するのが容易となるため好ましい。なお、シグナル比を得る場合、比較される固定化部位とバックグラウンド部は基板上１ｍｍ以上離れないように設定する。画像をコンピュータで解析する方法として、例えば画像処理ソフトＶ＋＋（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｐｔｉｃｓ社）を用いてリアルタイムでシグナル変化を捉えることができる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［実施例］
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）１ｍｇを３００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ナカライテスク社製）に溶解し、２００μｌの２００ｍＭトリエタノールアミン（アルドリッチ社製）水溶液ｐＨ７．０を加え、混合してから８−ＡＯＴの自己組織化表面に反応させ、Ｆｍｏｃを表面全体に固定化した。次に水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、ウシオ電機製１０００Ｗ高圧水銀ランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が１００個並んだものである。
【００３１】
照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、光を照射した部分に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。１ｍｇ／ｍｌポリグルタミン酸３０００−１５０００（シグマ社製）、０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液に溶解させて、光を照射して８−ＡＯＴを固定化した部分に一時間反応させ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基を活性化して表面へ固定化した。水で洗浄後すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡ（同仁化学研究所製）を１６時間反応させ、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基をポリグルタミン酸に導入した。これで固定化部位にはＮＴＡ基が存在し、バックグラウンド部にはＦｍｏｃが固定化されたチップとなる。
【００３２】
ポリグルタミン酸はＦｍｏｃに非特異的に吸着するため、Ｆｍｏｃを化学的に除去しバックグラウンドにはポリエチレングリコールを固定化する。Ｔｒｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ（アルドリッチ製）０．９ｍｌとジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）５．１ｍｌの混合液を３回繰り返して１０分ずつ反応させ、Ｆｍｏｃを表面から除去し、水とエタノールで洗浄する。こうしてＦｍｏｃを除去したバックグラウンドは８−ＡＯＴが存在しており、分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解して２時間反応させ、ＰＥＧをバックグラウンドに固定化した。
【００３３】
こうして作製したバイオチップは固定化部位にポリグルタミン酸を介してＮＴＡ基をもち、バックグラウンド部に非イオン性のＰＥＧが固定化されている。
このバイオチップをＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、固定化部位のＳＰＲ共鳴角から１度入射角が小さい角度で観察した。
【００３４】
観察は１０ｍＭＨｅｐｅｓ（同仁化学研究所社製）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、３０℃で実施した。２．５ｍＭの塩化ニッケル（ＩＩ）と２３ｋＤａのヒスチジンタグ付き蛋白質０．１μｇ／ｍｌを接触させる過程の写真を５秒おきに撮影し、固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果を図１に示す。図１において、０−１５０秒は緩衝液を流し、１５０−３００秒は塩化ニッケル（ＩＩ）を流して３００−４００秒は緩衝液を流してＮＴＡ基をニッケルキレートとし、さらに４００−７５０秒はヒスチジンタグ付き蛋白を流し固定化した後、７５０−９００秒では緩衝液を流した。９００秒の時点での固定化部位とバックグランドの６点の反射光強度の経時変化を求め、３点でシグナル比を得た。結果は４．２１、３．７８、３．６４で、平均は３．８８であり、２を上回っていた。
【００３５】
なお、バイオチップとの接触・洗浄はフローセルを用い、フローセルはＰＯＭ製で図４で示したものを用いた。具体的にはフローセルの溝部に線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのシリコンゴム製Ｏリングをセットし、さらにこの上にバイオチップを金蒸着面がフローセルと向き合うようにして重ね、フーローセル−バイオチップの間隔が２００μ程度になるようにして固定した。フローセルの注入部および排出部にチューブを接続し、緩衝液ポンプにてポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液および緩衝液を導入した。導入流量はいずれも２００μｌ／ｍｉｎで行った。
測定温度は２５℃で行った。
【００３６】
ここで用いたヒスチジンタグ付き蛋白質はＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９９，１７，１０３０−１０３２に記載されたＴＡＰであり、ＴＡＰにヒスチジンタグを導入した。この蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。右ラインのマーカーからわかるようにこの蛋白質の分子量は２３ｋＤａである。
【００３７】
また、塩化ニッケルとヒスチジンタグ付き蛋白が接触する前後の画像の差をとった結果を図３に示す。色が濃くなっている部分は反射光強度が上がっていることを示す。
【００３８】
この画像の差の濃淡を、点線で観察したグラフを図４に示す。この図からもバックグラウンド部のシグナルと固定化部位のシグナルのシグナル比が２以上であることを察することができる。
【００３９】
［比較例］
実施例と同様の金蒸着基板を８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、全面に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、基板全体にアミノ基を導入した。この表面に１ｍｇ／ｍｌポリグルタミン酸３０００−１５０００、０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをリン酸緩衝液に溶解させて、表面の８−ＡＯＴに一時間反応させ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基を活性化して表面へ固定化した。水で洗浄後すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡを１６時間反応させ、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基をポリグルタミン酸に導入した。
この場合のバイオチップは固定化部位とバックグラウンド部の区別がなく、ニッケルとヒスチジンタグ付き蛋白を接触させると、全面に一様に吸着する。どこをとってもシグナル比は限りなく１．００に近い数値をとった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のＳＰＲ用バイオチップはヒスチジンタグを有する生体分子もしくは生物分子集合体がバックグラウンド部には非特異的吸着することががほとんどなく、効率よく活性を保ったまま結合部位には吸着し、ＳＰＲを測定した際にバックグランドとの差が明白になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られた、ＳＰＲにて固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果の図
【図２】実施例で用いたヒスチジンタグ付き蛋白質（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９９，１７，１０３０−１０３２に記載されたＴＡＰにヒスチジンタグを導入したもの）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果図
【図３】実施例でのヒスチジンタグ付き蛋白質接触前と緩衝液流入後の画像の差をとった結果の概略図
【図４】図２の画像の差の濃淡を点線部で観察したグラフ
【図５】実施例で用いたフローセルの上面および断面（上面図の点線部分の断面）図
【発明の属する技術分野】
表面プラズモン共鳴によって物質間の相互作用を評価できるバイオチップに関する。特には、ヒスチジンタグを有する生体分子もしくは生物分子集合体を効率よく吸着させることにより、表面プラズモン共鳴を測定した際にバックグランドとの差が明白になるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡや蛋白質などの生体分子の機能を調べるあるいは、発現遺伝子、蛋白質を明らかにする手段として、生体分子間の相互作用を評価する試みがなされている。その一つとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による相互作用解析法が挙げられる。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を共鳴角の変化で測定する方法である。
【０００３】
ＳＰＲの利点は、相互作用分析に蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質が不要な点とリアルタイムでの測定が可能な点である。ラベル物質を物質に導入するのは非常に煩雑かつ困難な場合があり、ラベル操作により物質の本来の機能、活性が失われる場合がある。
【０００４】
ＳＰＲで相互作用を観察するには分子を金属薄膜表面に固定化する必要がある。固相に生体分子を固定化する方法として、表面に導入した官能基を起点とし、共有結合、イオン結合によって固定化する手段などが挙げられる。
【０００５】
従来の技術では基板上の一点を測定するものがほとんどであるが、文献等にあるようにＳＰＲ技術を応用したＳＰＲイメージング法によって基板表面の局在部位におけるＳＰＲ変化を検出することが可能である（例えば、非特許文献１）。すなわち、基板上の異なる場所に複数の物質を固定化すれば、複数の物質の相互作用解析が同時に可能である。
【０００６】
ＳＰＲに用いられるチップも、基板全体に官能基を導入するものがほとんどであり、生体分子を固定化していない状態では固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。そのため、ＳＰＲイメージング法に適用すると、バックグラウンド部に存在する官能基へサンプルが非特異的吸着するのを無視できない場合がある。また、微少量だけ特定の位置に生体分子溶液をスポットする技術も必須であり、高価なスポッティング装置が必要となる。
【０００７】
米国特許では、固定化部位に生体分子を固定化し、バックグラウンド部に起点となる官能基あるいは結合分子が存在しない親水性高分子を固定化したアレイを作製する手段が開示されている例えば、特許文献１）。この発明では、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化する際にはバックグラウンド部は可逆性疎水性保護基が固定化されており、スポッティングが容易である。しかし、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化したのちに塩基性有機溶媒を用いて疎水性保護基を除去し、親水性高分子を固定化する操作が必要であり、非常に煩雑かつ、塩基性有機溶媒が生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。また、親水性高分子を固定化する際に固定化した生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。具体的には親水性高分子が固定化生体分子に結合し、生体分子の機能が損なわれる点である。
【０００８】
そこで、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるバイオチップが望まれている。
【０００９】
生体分子を活性・機能を保ったまま固定化する方法としてヒスチジンタグを有する蛋白質・ペプチドをニッケルキレートによって固定化し、ＳＰＲで解析する方法が特表平１０−５０５９１０に提案されている。この方法は金属キレートによって（ポリ）ペプチドを表面に固定化しＳＰＲで相互作用を研究する方法が開示しており、蛋白・ペプチドの活性、機能を保ったまま表面に固定化し、解析することが可能である。しかし、ここでは（ポリ）ペプチドは一検体ずつ、チップを再生して使用する方法が用いられており、複数の蛋白質・ペプチドを同一表面上に固定化して相互作用を解析する概念は示されていない。
【００１０】
本発明はバックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する物質が固定化され、固定化部位にはヒスチジンタグを有する物質を固定化させるための起点となるＮＴＡ基をもつ官能基導入されているバイオチップを得ることを可能とする。
【００１１】
【非特許文献１】
Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７年，６９巻，１４４９−１４５６
【特許文献１】
米国特許６１２７１２９号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体、特には、ヒスチジンタグを有する生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得ることにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
【００１４】
１．生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と接触させたのちに、分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、該緩衝液で３分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するニッケルとヒスチジンタグ付蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップ
【００１５】
２．固定化部位に導入されている官能基がニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基であることを特徴とする１に記載のバイオチップ
【００１６】
３．バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されていることを特徴とする１もしくは２記載のバイオチップ
【００１７】
４．固定化部位にポリマーが固定化されており、該ポリマーにＮＴＡ基が結合していることを特徴とする１〜３いずれかに記載のバイオチップ
【００１８】
５．金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１９】
６．表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングであることを特徴とする１〜５のいずれかに記載のバイオチップ
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明はＳＰＲ測定用のバイオチップであり、生体分子を表面に固定化し、相互作用解析や発現遺伝子、蛋白質などのスクリーニングに有効である。本発明では生体分子の固定化部位と、固定化部位以外のバックグラウンド部は明確に区別されており、固定化部位には好ましくは固定化させるための起点となるＮＴＡ基を有する物質が固定化されている。ヒスチジンタグを有する生体分子は例えばニッケル−ＮＴＡ基を介して、キレート結合によって表面に固定化することができる。
【００２１】
本発明のバイオチップはＳＰＲイメージングなどの基板表面を解析する方法に適しており、複数の固定化部位に複数の物質を固定化し、同時に相互作用解析することが可能である。ＳＰＲで解析できるよう、基板は透明プラスチックあるいはガラスが好ましく、その表面には金属薄膜が形成されている。金属薄膜は金を蒸着した表面が特に好ましい。
【００２２】
ＮＴＡ基を導入する方法は特に限定されるものではないが、ＮＴＡ基を有するアルカンチオールを直接的に金表面に導入する方法や、カルボキシル基を有するアルカンチオールを金表面に導入しておき、アミンカップリング法によってアミノ基末端のＮＴＡ化合物を導入する方法や、官能基を有する物質（好ましくはポリマー）を表面に導入しておき、官能基を有する物質にＮＴＡ基を有する化合物を結合させる方法などが挙げられる。金−硫黄結合を利用した上記方法だけでなく、官能基をもつ物質（好ましくはポリマー）を表面にコーティングして、ＮＴＡ基を導入する手法なども可能である。
【００２３】
中でも、官能基を有するポリマーを表面に固定化しておき、ＮＴＡ基を有する化合物を導入する方法はポリマーがスペーサーとして働き、非特異的結合を抑制するため好ましい。
【００２４】
バックグラウンド部は非特異的吸着を抑制するため非イオン性物質が固定化されることが好ましい。例えば末端に水酸基あるいはポリエチレングリコールなどの親水性高分子をもつアルカンチオールを直接金表面に固定化する方法が挙げられる。また、官能基を末端にもつアルカンチオールを導入しておき、該官能基を利用して間接的に非イオン性物質を表面に固定化する方法も挙げられる。
【００２５】
固定化部位とバックグラウンド部を分ける手段としては光照射によるパターン化技術や、スタンプ技術などが挙げられる。例えば、光を照射してパターン化する手法では、紫外線により金−硫黄結合を酸化して洗浄除去し、新たにアルカンチオールを金表面に結合させることができる。
【００２６】
以下に例を挙げる。
バイオチップはＳＰＲ装置にセットされ、緩衝液中にて観察される。緩衝液の屈折率によってＳＰＲ共鳴角が変化するため、測定は同一の緩衝液で実施される。緩衝液を導入した段階で、撮影する角度が設定される。バイオチップがＳＰＲ共鳴を起こし、反射光強度が極小となる入射角（ＳＰＲ共鳴角）から０．５度から１度小さい角度にて測定は実施されることが好ましい。測定対象は固定化部位であるため、固定化部位の共鳴角を対象として角度は設定する。本発明のバイオチップに対して、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と１分前後接触させて、ＮＴＡ−ニッケルキレートを形成させる。次に分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に接触させると、ヒスチジンタグ−ニッケル−ＮＴＡ錯体形成により、蛋白質が固定化部位に結合し、ＳＰＲ共鳴角が広角側にシフトするため、反射光強度が増大する。ヒスチジンタグを有する蛋白質を接触させる時間は３分以上１０分以内程度が好ましい。その後３分から１０分間緩衝液で洗浄したときに、ヒスチジンタグ蛋白が固定化部位に多く吸着される。バックグラウンド部には非イオン性物質が固定化されているため、蛋白の吸着量が少ない。このように固定化部位のみに蛋白が吸着され、その周囲にはできるだけ吸着されないようなチップが測定上好ましい。
【００２７】
ＳＰＲ装置にはスライド表面の解析が可能である白色光源を用いたＳＰＲイメージング装置を使用する。スライドからの反射像はＣＣＤカメラによって撮影するＳＰＲイメージングにより、経時的に画像が取り込まれる。取り込まれた画像から高分子を接触させる前の画像の差を演算処理によって得ることができる。
【００２８】
分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液を３０℃にてチップ表面に５分間接触させて、蛋白質が固定化部位に結合させ、その後該緩衝液にて３分間洗った場合に、その結合によって得られるＳＰＲによるシグナル増加と、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナル増加を比較する。比較対照は塩化ニッケル（ＩＩ）を接触させる前の画像となる。この操作によって、塩化ニッケルと蛋白質を接触させる前後のシグナル変化を知ることができる。固定化部位に結合するニッケルと蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であると、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を導入するのが容易となるため好ましい。なお、シグナル比を得る場合、比較される固定化部位とバックグラウンド部は基板上１ｍｍ以上離れないように設定する。画像をコンピュータで解析する方法として、例えば画像処理ソフトＶ＋＋（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｐｔｉｃｓ社）を用いてリアルタイムでシグナル変化を捉えることができる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［実施例］
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）１ｍｇを３００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ナカライテスク社製）に溶解し、２００μｌの２００ｍＭトリエタノールアミン（アルドリッチ社製）水溶液ｐＨ７．０を加え、混合してから８−ＡＯＴの自己組織化表面に反応させ、Ｆｍｏｃを表面全体に固定化した。次に水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、ウシオ電機製１０００Ｗ高圧水銀ランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が１００個並んだものである。
【００３１】
照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、光を照射した部分に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。１ｍｇ／ｍｌポリグルタミン酸３０００−１５０００（シグマ社製）、０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液に溶解させて、光を照射して８−ＡＯＴを固定化した部分に一時間反応させ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基を活性化して表面へ固定化した。水で洗浄後すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡ（同仁化学研究所製）を１６時間反応させ、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基をポリグルタミン酸に導入した。これで固定化部位にはＮＴＡ基が存在し、バックグラウンド部にはＦｍｏｃが固定化されたチップとなる。
【００３２】
ポリグルタミン酸はＦｍｏｃに非特異的に吸着するため、Ｆｍｏｃを化学的に除去しバックグラウンドにはポリエチレングリコールを固定化する。Ｔｒｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ（アルドリッチ製）０．９ｍｌとジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）５．１ｍｌの混合液を３回繰り返して１０分ずつ反応させ、Ｆｍｏｃを表面から除去し、水とエタノールで洗浄する。こうしてＦｍｏｃを除去したバックグラウンドは８−ＡＯＴが存在しており、分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解して２時間反応させ、ＰＥＧをバックグラウンドに固定化した。
【００３３】
こうして作製したバイオチップは固定化部位にポリグルタミン酸を介してＮＴＡ基をもち、バックグラウンド部に非イオン性のＰＥＧが固定化されている。
このバイオチップをＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、固定化部位のＳＰＲ共鳴角から１度入射角が小さい角度で観察した。
【００３４】
観察は１０ｍＭＨｅｐｅｓ（同仁化学研究所社製）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、３０℃で実施した。２．５ｍＭの塩化ニッケル（ＩＩ）と２３ｋＤａのヒスチジンタグ付き蛋白質０．１μｇ／ｍｌを接触させる過程の写真を５秒おきに撮影し、固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果を図１に示す。図１において、０−１５０秒は緩衝液を流し、１５０−３００秒は塩化ニッケル（ＩＩ）を流して３００−４００秒は緩衝液を流してＮＴＡ基をニッケルキレートとし、さらに４００−７５０秒はヒスチジンタグ付き蛋白を流し固定化した後、７５０−９００秒では緩衝液を流した。９００秒の時点での固定化部位とバックグランドの６点の反射光強度の経時変化を求め、３点でシグナル比を得た。結果は４．２１、３．７８、３．６４で、平均は３．８８であり、２を上回っていた。
【００３５】
なお、バイオチップとの接触・洗浄はフローセルを用い、フローセルはＰＯＭ製で図４で示したものを用いた。具体的にはフローセルの溝部に線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのシリコンゴム製Ｏリングをセットし、さらにこの上にバイオチップを金蒸着面がフローセルと向き合うようにして重ね、フーローセル−バイオチップの間隔が２００μ程度になるようにして固定した。フローセルの注入部および排出部にチューブを接続し、緩衝液ポンプにてポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液および緩衝液を導入した。導入流量はいずれも２００μｌ／ｍｉｎで行った。
測定温度は２５℃で行った。
【００３６】
ここで用いたヒスチジンタグ付き蛋白質はＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９９，１７，１０３０−１０３２に記載されたＴＡＰであり、ＴＡＰにヒスチジンタグを導入した。この蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。右ラインのマーカーからわかるようにこの蛋白質の分子量は２３ｋＤａである。
【００３７】
また、塩化ニッケルとヒスチジンタグ付き蛋白が接触する前後の画像の差をとった結果を図３に示す。色が濃くなっている部分は反射光強度が上がっていることを示す。
【００３８】
この画像の差の濃淡を、点線で観察したグラフを図４に示す。この図からもバックグラウンド部のシグナルと固定化部位のシグナルのシグナル比が２以上であることを察することができる。
【００３９】
［比較例］
実施例と同様の金蒸着基板を８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、全面に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、基板全体にアミノ基を導入した。この表面に１ｍｇ／ｍｌポリグルタミン酸３０００−１５０００、０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをリン酸緩衝液に溶解させて、表面の８−ＡＯＴに一時間反応させ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基を活性化して表面へ固定化した。水で洗浄後すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡを１６時間反応させ、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基をポリグルタミン酸に導入した。
この場合のバイオチップは固定化部位とバックグラウンド部の区別がなく、ニッケルとヒスチジンタグ付き蛋白を接触させると、全面に一様に吸着する。どこをとってもシグナル比は限りなく１．００に近い数値をとった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のＳＰＲ用バイオチップはヒスチジンタグを有する生体分子もしくは生物分子集合体がバックグラウンド部には非特異的吸着することががほとんどなく、効率よく活性を保ったまま結合部位には吸着し、ＳＰＲを測定した際にバックグランドとの差が明白になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られた、ＳＰＲにて固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果の図
【図２】実施例で用いたヒスチジンタグ付き蛋白質（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９９，１７，１０３０−１０３２に記載されたＴＡＰにヒスチジンタグを導入したもの）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果図
【図３】実施例でのヒスチジンタグ付き蛋白質接触前と緩衝液流入後の画像の差をとった結果の概略図
【図４】図２の画像の差の濃淡を点線部で観察したグラフ
【図５】実施例で用いたフローセルの上面および断面（上面図の点線部分の断面）図
Claims (6)
- 生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液と接触させたのちに、分子量が２０ｋＤａ以上５０ｋＤａ以下のヒスチジンタグを有する蛋白質が濃度０．１μｇ／ｍｌで溶解しているｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、該緩衝液で３分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するニッケルとヒスチジンタグ付蛋白質によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップ
- 固定化部位に導入されている官能基がニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ
- バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されていることを特徴とする請求項１もしくは２記載のバイオチップ
- 固定化部位にポリマーが固定化されており、該ポリマーにＮＴＡ基が結合していることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のバイオチップ
- 金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
- 表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオチップ
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