JP4457107B2 - 固定化方法およびそのためのキット - Google Patents
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Description
標的分子と、標的分子と解離可能な複合体を形成することができる小胞構造との複合体を形成する工程、
形成された複合体と、固体支持体表面とを接触させ、標的分子を固体支持体表面に結合させ、複合体を解離させる工程、および、
固体支持体表面から小胞構造を除去し、固体支持体表面に固定された標的分子を切り離す工程。
図1は、ミセル/オリゴヌクレオチド複合体の図式的な説明である。
本発明を説明し、特許請求するにあたり、以下の用語を以下に記載の定義に従って用いるものとする。
上述したように、本発明は、一般的に、固体支持体表面への標的分子の固定化に関する。このような固定された標的分子を含む固体支持体は、分析および分離技術などの様々な分野で用いられる。固体支持体への標的分子の固定化は、場合によっては、分子を固体支持体表面に結合(例えば共有結合)させることを含む。通常、固体支持体は、標的分子と反応し得る反応性化学基を有する。場合によっては、標的分子は電荷を有し、固体支持体表面が対立する電荷を有する場合、標的分子は、固体支持体表面に引きつけられ、分子と固体支持体表面との相互作用を促進すると予想される。一方で、固体支持体表面が、標的分子の電荷と同種の電荷を有する場合、固定化が減じられるか、または実質的な妨害も容易に観察される。後者の例は、オリゴヌクレオチド(一般的に負電荷を有する)の負電荷を有する表面への固定化である。
5’TTT CCT CAG CAT CTT ATC CG3’(「BC1」と称する)
5’CGG ATA AGA TGC TGA GGA AA3’(「BC2」と称する)
ヌクレオチド配列BC1は、Persson,B.等(1997年)Anal.Biochem.246,34〜44で開示されている。
高い塩濃度でのアミノで修飾されたオリゴヌクレオチドBC1の固定化
センサーチップCM5を、0.2MのN−エチル−N−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド(EDC)、および、50mMのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)によって(7または20分間、流速5μl/mmで)活性化し(EDCおよびNHSは、ビアコアAB(ウプサラ,スウェーデン)製)、デキストラン上のカルボキシル基の分画を、反応性N−ヒドロキシスクシンイミドエステル基に変換した。次に、100μMのアミンで修飾されたオリゴヌクレオチドBC1(SGS DNA,コーピング,スウェーデン、または、DNAテクノロジー(DNA Technology),オールボー,デンマーク)のボレート(borate)8.5固定化緩衝液(ビアコアAB,ウプサラ,スウェーデン)溶液を、オリゴヌクレオチドBC1を表面に固定するために、13分間、5μl/分で注入した。エタノールアミンを3分間、5μl/分で注入することによって(それにより、ヒドロキシエチルアミドによって活性化された基を置き換える)、未反応のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活性化した。固定化の手順は、オリゴヌクレオチドの負電荷から遮蔽するために1〜3Mの高いNaCl濃度で、および、表面への迅速なカップリングを実現するために比較的高いpH値7.0〜8.5で行われた。
塩化テトラメチルアンモニウム存在下でのアミノで修飾されたオリゴヌクレオチドBC1の固定化
実施例1と同じ固定化プロトコールに従って、オリゴヌクレオチドBC1をCM5チップ表面に固定した[ただし、HBS−EP(ビアコアAB,ウプサラ,スウェーデン)を固定化緩衝液として用い、オリゴヌクレオチドの負電荷を遮蔽するために、NaClの代わりに、1M、0.75M、0.5Mまたは0.25Mの塩化テトラメチルアンモニウム(TMA−Cl)を用いたことを除く]。50mMのNaOH、1MのNaClで洗浄した後に、相補および非相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを、実施例1で説明したように行った。結果を以下の表2に示す。
臭化セチルトリメチルアンモニウムミセルとの複合体を形成することによる、アミノで修飾されたオリゴヌクレオチドBC1の固定化
センサーチップCM5を、上記の実施例1で説明したように活性化した。次に、様々な臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)濃度を含む、10〜50μMのアミンで修飾されたオリゴヌクレオチドBC1(SGS DNA,コーピング,スウェーデン、または、DNAテクノロジー,オールボー,デンマーク)の10mMのHEPES(pH7.4)(ビアコアAB,ウプサラ,スウェーデン)を、それらを表面に固定するために、10分間、5μl/分で注入した。未反応のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を、エタノールアミンを5μl/分で3分間注入することによって不活性化した。50mMのNaOH、1MのNaClで洗浄した後に、相補および非相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを、実施例1で説明したように行った。結果を以下の表3に示す。
臭化ドデシルトリメチルアンモニウムミセルとの複合体を形成することによる、アミノで修飾されたオリゴヌクレオチドBC1の固定化
実施例3で説明された手順に従った(ただし、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム(DTAB)を臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)の代わりに用いたことを除く)。非相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは起こらなかった。得られた結果を以下の表4に示す。
Claims (28)
- 標的分子を、標的分子と相互作用することができる固体支持体表面に固定する方法であって:
標的分子と、標的分子と解離可能な複合体を形成することができる小胞構造との複合体を形成する工程、
形成された複合体と、固体支持体表面とを接触させ、標的分子を固体支持体表面に結合させる工程、
複合体を解離する工程、および
固体支持体表面から小胞構造を除去し、固体支持体表面に固定された標的分子を切り離す工程、
を含み、標的分子と小胞構造とは、対立する電荷を有し、かつ標的分子と固体支持体表面とは、同種の電荷を有する、上記方法。 - 小胞構造は、リポソームまたはミセルである、請求項1に記載の方法。
- 標的分子は、負電荷を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 標的分子と固体支持体表面とはそれぞれ負電荷を有し、小胞構造は、正電荷を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子は、分析物を結合させることができるリガンドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子は、リガンドまたはリガンド結合物質を結合させることができるキャプチャー物質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子は、核酸または抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子は、人工核酸である、請求項7に記載の方法。
- 標的分子は、低分子量の有機化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 固体支持体表面は、標的分子の官能基と反応して共有結合を形成することができる反応性基を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 固体支持体表面は、特定の結合対の一方の要素を含み、その結合対の他方の要素は、標的分子またはその一部と共役している、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 表面に結合した要素は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、そして標的分子は、ビオチンタグを付されている、請求項11に記載の方法。
- 固体支持体表面は、ヒドロゲルを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- ヒドロゲルはデキストランベースのヒドロゲルであり、デキストランは、カルボキシメチル基を含む、請求項13に記載の方法。
- カルボキシメチル基が、活性化されて反応性基になる、請求項14に記載の方法。
- ミセルまたはリポソームに対する標的分子の割合は、約1:1である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 小胞構造は、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)を含むミセルである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- フローセルで行われる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 固体支持体は、センサー表面である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- センサー表面は、質量センシングによる、センサー表面における事象の検出が可能である、請求項19に記載の方法。
- 固体支持体は、クロマトグラフィー用の粒子である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法に従ってリガンドを結合させることができるキャプチャー物質を表面に固定すること、続いて、該表面と該リガンドとを接触させ、該リガンドを固定された該キャプチャー物質に結合させることを含む、固体支持体表面をリガンドでセンシタイズする方法。
- キャプチャー物質はオリゴヌクレオチドであり、リガンドは、キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドと共役している、請求項22に記載の方法。
- 一般的なキャプチャー物質を支持している固体支持体表面の異なる別々のエリアを、選択的に異なるリガンドと接触させ、異なるリガンドのアレイを固体支持体表面に提供する、請求項22または23に記載の方法。
- 異なるキャプチャー物質をそれぞれ支持している固体支持体表面の異なる別々のエリアを、異なるリガンドと接触させ、異なるリガンドのアレイを固体支持体表面に提供する、請求項22または23に記載の方法。
- 固体支持体表面は、センサー表面である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法で製造された固体支持体表面上で少なくとも1種のリガンドに結合することができる少なくとも1種の分析物に関してサンプルを分析するための、前記固体支持体表面の使用。
- 請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法で製造された固体支持体表面上での、少なくとも1種の分析物と少なくとも1種のリガンドとの相互作用を研究するための、前記固体支持体表面の使用。
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