JP4171982B2

JP4171982B2 - バイオチップ

Info

Publication number: JP4171982B2
Application number: JP2003333072A
Authority: JP
Inventors: 基樹京; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-09-25
Filing date: 2003-09-25
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2023-09-25
Also published as: JP2005098843A

Description

本発明は、生体分子の非特異的吸着を抑制したバイオチップに関する。

近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。

チップ基板には生体分子だけではなく、親水性物質が固定化される方法が発明されている。たとえば特許文献１には区画された部位にＤＮＡが、その他の部分にポリエチレングリコールが固定化されたバイオチップアレイが示されている（例えば、特許文献１参照）。ＤＮＡが固定化されていない部位への非特異的吸着を抑制し、ＤＮＡハイブリダイゼーション、さらには蛋白との相互作用の解析に成功している。しかし、この方法では一旦保護基を全面に固定化した後に紫外線照射により区画化、ＤＮＡを固定化した後に周囲部の保護基を外し、反応性官能基であるスクシンイミド基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を固定化する。よってチップ作製は非常に煩雑であり、多くのステップが必要である。

文献ではチオール末端であるポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール）の単分子層が蛋白吸着を抑制することを報告している（例えば、非特許文献１参照）。この発明に用いられたポリエチレングリコールは３〜４の繰り返し単位を有し、炭素数１１のアルキル鎖、末端に金属結合性官能基であるチオール基が設けられている。しかし、このような化合物は疎水性部のアルキル鎖と親水性部のＰＥＧ鎖を有するため、合成は困難である。場合によってはミセルを形成し、バイオチップ表面への結合を制御するのが難しい場合がある

また、先行特許では分子量１，０００以上のＰＥＧとアルキル鎖を有する化合物をバイオセンサーに用いる方法が提供されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、アルキル鎖が６以上の場合は非特許文献１と同様に合成が困難となる問題点を有する。また、アルキル鎖が７以下の場合は、アルキル鎖間の疎水性相互作用による自己組織化単分子層（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｍｏｎｏｌａｙｅｒ）の形成が不十分であり、分子が容易に脱離する問題点を有する。
よって、容易にかつ安価に非特異的吸着を抑制されたバイオチップが求められている。

米国特許６１２７１２９号明細書国際公開第０１／８６３０１号パンフレットＰｒｉｍｅらＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５巻、１０７１４−１０７２１頁、１９９３年

本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを得ることにある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、バックグランドとのコントラストが高く、吸着・結合等の測定が容易に行えるバイオチップを得ることにある。

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．チップ上が生体分子を固定化する部分（固定化部）と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されているバイオチップであって、
該バックグラウンド部に、複数の枝分かれした末端に金属結合性官能基を有する親水性高分子が、該金属結合性官能基により金表面に結合していることを特徴とするバイオチップ。
２．親水性高分子の分子量が１，０００以上２０，０００以下であることを特徴とする１に記載のバイオチップ。
３．親水性高分子の分子量が１，０００以上１０，０００以下であることを特徴とする１又は２に記載のバイオチップ。
４．親水性高分子の分子量が５，０００より大きく１０，０００以下であることを特徴とする１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
５．金属結合性官能基が２個以上１６以下であることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
６．親水性高分子がポリエチレングリコールを含んでいる高分子であることを特徴とする１〜５のいずれかに記載のバイオチップ。
７．属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基であることを特徴とする１〜６のいずれかに記載のバイオチップ。
８．枝分かれの部分の長さが同等であり、中心部から複数の同じ長さの分子が広がっている親水性高分子が金表面に結合していることを特徴とする１〜７のいずれかに記載のバイオチップ。
９．チップの基板が透明基板であることを特徴とする１〜８のいずれかに記載のバイオチップ。
１０．バイオチップが、表面プラズモン共鳴測定用のバイオチップであることを特徴とする１〜９のいずれかに記載のバイオチップ。
１１．バイオチップが、表面プラズモン共鳴イメージング測定用のバイオチップであることを特徴とする１〜９のいずれかに記載のバイオチップ。

本発明により、１ステップで親水性高分子をバイオチップ表面に結合させることができるだけでなく、親水性高分子は複数の金属結合性官能基を有するためにチップ表面から脱離しにくく、非特異的吸着を大きく低減させることができる。

本発明のバイオチップは、複数の金属結合性官能基を有する親水性高分子が表面に結合している。一分子あたりの金属結合性官能基が複数であるため、該親水性高分子を金属表面に結合させた場合、すべての結合が同時に破壊されない限り、親水性高分子が金属表面から脱離することはない。従って、本発明で用いる親水性高分子は安定性に優れるため好ましい。

特許文献１にみられるような、区画化されたバイオチップを作製する場合、複数の金属結合性分子の溶液に、段階的に浸漬させる手段を取る。金属に結合している分子と溶液中の分子の交換反応が起こることが知られており、金属に結合する分子が容易に解離すると、区画化する意味がないため好ましくない。本発明で用いる親水性高分子は、区画化されたバイオチップで特に効果を発揮する。

本発明で使用する親水性高分子の一分子あたりの金属官能基は複数であることから２個以上であるが。好ましくは３個以上であり、上限は好ましくは１６個以下より好ましくは１０個以下である。３個以上であると、金属表面から解離する確率が減少するため好ましい。しかし、１７個以上であると、金属表面に結合していないフリーの金属結合性官能基が増加するため好ましくない。例えば、金属結合性官能基としてチオール基を選択する場合、フリーのチオール基が多数存在すると、マレイミド基を有する架橋剤を用いてチオール基を有する生体分子を固定化する手段には応用し難くなり、好ましくない。

親水性高分子と金属結合性官能基の間の結合、アルキル鎖の長さは特に限定されるものではないが、本発明の場合、金属表面での安定性が高いため、アルキル鎖を長くする必要はない。

親水性高分子の分子量は数平均で１，０００以上であることが好ましい。１，０００未満である場合、バイオチップ表面が十分に親水性でなく、非特異吸着を抑制することができない場合があるからである。親水性高分子の分子量の上限は特に定めるものではないが、分子量が２０，０００を越えると、溶液の粘性が上昇し、高分子が絡み合ったまま表面に固定化されることがある。共有結合で固定化されていない高分子が徐々に脱離するために、センサーのベースラインが変化することがあり、好ましくない。なお、数平均分子量は、ＧＰＣにより測定したもので、標準資料としてポリエチレングリコールを用いる。

親水性高分子は枝分かれしたものが好ましく、枝分かれした末端に金属結合性官能基がある場合が特に好ましい。高分子の主鎖に金属結合性高分子が複数含まれている場合、親水性高分子は表面に横たわり、非特異的吸着を抑制する能力が劣るため好ましくない。
枝分かれの部分の長さはほぼ同等であることが好ましく、中心部から複数の同じ長さの分子が広がっている親水性高分子がさらに好ましい。枝分かれした末端に金属結合性官能基がある場合、枝分かれ部の長さがまちまちであると、多数の金属結合性官能基がフリーのまま残る可能性があり、好ましくない。例えば、マルチアームタイプの分子、１〜４世代の比較的若い世代のデンドリマーなども挙げられる。

親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。

これらの中でも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはＰＥＧである。ＰＥＧは親水性が高く、反応性の有する官能基がないため非特異吸着を抑制する効果が高い。なお、これら親水性高分子は本発明で使用される分子の一部として含まれている。

金属結合性官能基はイオウを含む官能基が好ましく、特にはチオール基もしくはジスルフィド基であることが好ましい。これらの官能基は金属、特に金基板への吸着結合に最適であるためである。従って、バイオチップ基板は金であることが好ましい。

バイオチップとしては表面プラズモン共鳴測定用もしくは水晶発振子測定用が好ましい。いずれも生体分子を放射線同位体や蛍光分子でラベルする必要がなく、物質間の相互作用をリアルタイムに評価することができる。

表面プラズモン共鳴法による分析に供されるためには、本発明のバイオチップは金で被覆された透明基板であることが好ましい。
特に表面プラズモン共鳴イメージング法は、バイオチップ表面に複数の物質を固定化したアレイを作製し、同時に複数の物質の相互作用を観察することができるため好ましい。

バイオチップは生体分子を固定化する部分（固定化部）と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、複数の金属結合性官能基を有する親水性高分子が固定化されていることが好ましい。バックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する親水性高分子を固定化することで、固定化部とバックグラウンド部のシグナルの変化が明確となり、バイオチップとして非常に好ましい。

基板上に親水性化合物を固定化する方法としては特に限定されるものではないが、溶液中に金属表面を浸漬する公知の自己組織化表面作製方法や、公知のコート法であるスプレーコート、ディッピング、ローラーコート、ナイフコート（ブレードコート）等を用いることができる。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

［実施例］
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１０，０００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が四つ存在する分子であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。

１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。

このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクには０．５ｍｍ四方の穴が９６個あいており、穴があいている部分でＵＶ光が透過してスライドに照射される。

次に７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを２時間浸漬し、ＵＶ照射部にアミノ基を導入するとともに、４ａｒｍＰＥＧが７−ＣＨＴへと交換されるかどうかを確認した。

交換反応が起こったかどうかを確認する手段として、表面プラズモン共鳴イメージング機器（東洋紡績製）にチップをセットし、チップ表面へのポリＬリジンの吸着を観察した。測定は１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３０℃で実施した。１０μｇ／ｍｌの濃度で分子量４０００−１５０００のポリＬリジン（シグマ社製）を溶解させた上記のリン酸緩衝液を５分間接触させた。ポリＬリジンは正電荷を有するポリマーであり、７−ＣＨＴが結合されてカルボキシル基が導入された部分に静電的に結合する特性を有する。

図２にＳＰＲシグナルの変化を示す。ポリＬリジンによるシグナル量を、ポリＬリジンを流す３分前とポリＬリジンを流し終わってから５分後のシグナル値の変化を測定した。７−ＣＨＴ導入部のシグナルは、９６箇所の７−ＣＨＴ導入部のシグナル平均値とした。4ａｒｍＰＥＧ部のシグナルは列方向の間隔の部分で１１箇所の縦に長い長方形を取ってシグナル平均値とした。７−ＣＨＴ導入部（ＵＶ照射部）のポリＬリジンによるシグナルは１３．９であった。それに対し、４ａｒｍＰＥＧ結合部におけるポリＬリジンによるシグナルは１．５であり、シグナル比は９．１であった。これは、４ａｒｍＰＥＧ結合部に対する７−ＣＨＴの交換反応がほとんど起こらなかったことを意味する。４ａｒｍＰＥＧは長いアルキル鎖は有さないものの、複数点で金に結合しているため、金表面からの脱離がほとんどおこらなかったと考えることができる。

このように安定で、脱離しにくい親水性高分子が固定化されたバイオチップを容易に得ることができた。本実施例のバイオチップはＵＶ照射部のみに導入された７−ＣＨＴのカルボキシル基を起点として生体分子を結合することができる。４ａｒｍＰＥＧ固定化部には官能基がほとんど存在せず、非特異的吸着が抑制することができる。

［比較例］
一つの分子にチオール基を一つだけ有するＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥＳＨ−５０Ｈ）を1ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。ＰＥＧチオールの分子量は５０００であり、親水性が非常に高い。上述のようにＰＥＧチオールの一方の末端は金属結合性を有するチオール基であり、もう一方の末端はメトキシ基である。ＰＥＧチオールのアルキル鎖部分は炭素数２であり、分子間の疎水性結合は強くない。

１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。

このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。
次に７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを２時間浸漬し、ＵＶ照射部にアミノ基を導入した。

次に実施例と同様に７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを２時間浸漬し、ＵＶ照射部にアミノ基を導入するとともに、４ａｒｍＰＥＧが７−ＣＨＴへと交換されるかどうかを確認した。

交換反応が起こったかどうかを確認する手段として、実施例と同様に１０μｇ／ｍｌのポリＬリジンをリン酸緩衝液に溶解した溶液がバイオチップに結合するのを観察した。

図３にＳＰＲシグナルの変化を示す。７−ＣＨＴ導入部（ＵＶ照射部）のシグナルは１６．９であったのに対し、ＰＥＧチオール結合部におけるＰＥＩによるシグナルは１１．９であり、シグナル比は１．４であった。これは、ＰＥＧチオール結合部に対する７−ＣＨＴの交換反応が起こり、ＰＥＧ部分にもカルボキシル基が存在していることを意味する。ＰＥＧチオールは長いアルキル鎖は有さないだけでなく、金結合性官能基は一つだけなので、容易に金表面からの脱離したと考えることができる。従って、ＰＥＧチオール部分は不安定であり、ＰＥＧ結合部分にも生体分子が結合できる。また、静電的な非特異結合は多いと推察される。

本発明により、１ステップで親水性高分子をバイオチップ表面に結合させることができるだけでなく、親水性高分子は複数の金属結合性官能基を有するためにチップ表面から脱離しにくく、非特異的吸着を大きく低減させることができ、産業界に寄与すること大である。

実施例、比較例で使用したフォトマスク実施例においてポリＬリジンを流したときのＳＰＲシグナル変化比較例においてポリＬリジンを流したときのＳＰＲシグナル変化

Claims

チップ上が生体分子を固定化する部分（固定化部）と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されているバイオチップであって、
該バックグラウンド部に、複数の枝分かれした末端に金属結合性官能基を有する親水性高分子が、該金属結合性官能基により金表面に結合していることを特徴とするバイオチップ。
親水性高分子の分子量が１，０００以上２０，０００以下であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
親水性高分子の分子量が１，０００以上１０，０００以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。
親水性高分子の分子量が５，０００より大きく、かつ１０，０００以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
金属結合性官能基が２個以上１６以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
親水性高分子がポリエチレングリコールを含んでいる高分子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオチップ。
金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のバイオチップ。
枝分かれの部分の長さが同等であり、中心部から複数の同じ長さの分子が広がっている親水性高分子が金表面に結合していることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のバイオチップ。
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のバイオチップ。
バイオチップが、表面プラズモン共鳴測定用のバイオチップであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のバイオチップ。
バイオチップが、表面プラズモン共鳴イメージング測定用のバイオチップであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のバイオチップ。