JP4189644B2

JP4189644B2 - 生体分子相互作用測定方法

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Publication number: JP4189644B2
Application number: JP2003007469A
Authority: JP
Inventors: 雅之山本; ほづみ本橋; 基樹京; 川上　　文清; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2023-01-15
Also published as: JP2004264027A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固体表面上に生体分子を固定化して、固定化した生体分子と、生体分子又はその集合体との相互作用を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から生体分子の機能を調べる手段として、生体分子の相互作用が調べられてきた。相互作用を調べる手段としては、一方の分子を固体表面上に固定化し、対象物質を接触させて、対象物質が吸着するかどうかを検出する方法が一般的となってきている。相互作用を測定する際には、固定化した分子のモビリティを確保した上で、非特異的吸着を抑制されていることが好ましく、そのためには、固定化分子と表面のスペースを確保するスペーサーの存在が不可欠と考えられている。例えば、核酸分子を共有結合で固定化する方法において、核酸分子内にチミン１６塩基あるいはポリエチレングリコールのスペーサーを設ける方法が示されている（例えば特許文献１参照）。しかし、この方法では、架橋剤にスペーサーの効果がないために分子のモビリティが不十分で、相互作用解析の対象物質が限られる。
【０００３】
一方、スペーサーとしてポリマーを用いる方法も報告されている（例えば特許文献２参照）。しかし、この方法において使用されるポリマーはアミノ基を多く有する多官能型ポリマーで、表面からの距離を十分に取ることができず、効果が不十分である。また、両端が同じ官能基であると、両端とも反応してしまい、生体物質との反応効率が悪くなる。
【０００４】
米国特許においては、表面にハイドロゲルを形成し、ゲル内に官能基を設けることで固定化分子のモビリティを確保し、非特異的吸着を抑制する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。効果のある方法ではあるが、ゲルの内部と外部とで、対象物質の浸透、拡散速度が異なるため、リアルタイムに相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を厳密に測定する方法としては不適当である。
【０００５】
また、親水性高分子を有するスペーサーの末端に生体分子を固定化するための官能基を有し、もう一方の末端に固体表面に直接結合できる官能基をもつ分子が設計され、相互作用観察を行うことも、報告されている（非特許文献１、２参照）。しかし、この物質単独を表面に密に充填することは難しく、非特異的吸着を抑制するために、その他の親水性基末端物質を高い比率で混合する結果となり、表面に生体分子が固定化される密度が低く、測定感度が低いという問題が生じる。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第００／６７０２８号
【０００７】
【特許文献２】
特開２０００−１４６９７６号公報
【０００８】
【特許文献３】
米国特許５４３６１６１
【０００９】
【非特許文献１】
Ｓｉｇａｌｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８（１９９６）４９０−４９７
【００１０】
【非特許文献２】
Ｊｕｎｇｅｔ．ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ１６（２０００）９４２１−９４３２
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固定化した分子のモビリティを確保すると同時に、非特異的吸着を抑制し、厳密な相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）解析を可能とする方法を提供することを主な目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた。その結果、架橋剤としてヘテロ二官能型親水性高分子を用いて、固体表面上に生体分子を固定化した基板を用いて、生体分子間の相互作用を測定することにより、分子間相互作用を適切に測定し得ることを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本願発明は次の事項に係る。
【００１４】
１．架橋剤として分子量が１，０００以上２０，０００以下であり、かつ一般式Ｘ−Ｒ−Ｙで表されるヘテロ二官能型親水性高分子（ここでＸはアミノ基もしくはスクシンイミド基を表す。Ｙはカルボキシル基もしくはマレイミド基を表す。Ｒは高分子の繰り返し単位を表す。）を用いて金薄層を表面に有する基板である固体表面上に生体分子（Ａ）を固定化した基板を用いて、生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）又はその集合体との相互作用を表面プラズモン共鳴法又は表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する工程を有することを特徴とする生体分子相互作用測定方法。
２．ヘテロ二官能型親水性高分子のＲが、下記繰り返し単位
−（−Ｏ−Ｒ _１ −）ｎ−
（ここで、Ｒ _１は、炭素数が２−５のアルキレン基を表す。ｎは４〜４５０。）
で表される構造を有することを特徴とする項１に記載の方法。
３．ヘテロ二官能型親水性高分子の官能基Ｘがスクシンイミド基、及びＹがマレイミド基であることを特徴とする項１又は２に記載の方法。
４．固体表面が平面基板であることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．固体表面が、一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される化合物（ここでＸ’は金薄層と反応する官能基を表す。Ｙ’はアミノ基、カルボキシル基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド基から選ばれるヘテロ二官能型親水性高分子と結合する官能基を表す。Ｒ’は有機基を表す）を用いて金薄層表面に官能基を導入した固体表面であることを特徴とする項４に記載の方法。
６．一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される化合物が、８−アミノ−１−オクタンチオール（８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）又は７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ）であることを特徴とする項５に記載の方法。
７．生体分子（Ａ）を固定化した基板が、複数の種類の生体分子（Ａ）をアレイ状に固定化した基板であることを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の方法。
８．生体分子（Ａ）を固定化した基板が、１０種類以上の生体分子（Ａ）を固定化した基板であることを特徴とする項１〜７のいずれかに記載の方法。
９．生体分子（Ａ）が核酸であることを特徴とする項１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．生体分子（Ｂ）がタンパク質であることを特徴とする項１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．タンパク質が転写因子であることを特徴とする項１０に記載の方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
ヘテロ二官能型親水性高分子
本発明は、固定化した生体分子のモビリティを確保すると同時に、非特異的吸着を抑制し、厳密な相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）解析を可能とするために、生体分子を固体表面に固定化する方法において、架橋剤としてヘテロ二官能型親水性高分子を用いることを特徴とする。
【００３２】
この方法により、表面から一定のスペースを保った状態で生体分子を固定化することが可能となり、生体分子の相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）解析を、生体分子のモビリティを確保しつつ、リアルタイムで適切な観察を行うことができる。
【００３３】
架橋剤として用いるヘテロ二官能型親水性高分子は、一般式Ｘ−Ｒ−Ｙで表される。ここでＸは固体表面の官能基、もしくは固体表面に導入された官能基と結合する官能基を表す。Ｙは生体分子（Ａ）と結合する官能基を表す。また、Ｒは高分子の繰り返し単位を表す。ここで、高分子とは繰り返し単位の数が３以上のものをいう。
【００３４】
本発明の架橋剤となる高分子の末端となるヘテロな２つの官能基は、一方の末端の官能基Ｘが固体表面もしくは固体表面に導入された官能基と結合する官能基であり、他方の末端の官能基Ｙが生体分子（Ａ）と反応するものであって、互いに異なる官能基で構成される。即ち、Ｘ≠Ｙである。
【００３５】
官能基Ｙは固体表面と反応しない官能基であることが好ましい。官能基Ｙが表面と反応すると、表面にループが形成され、生体分子を固定化するための官能基が少なくなり、反応効率が悪くなるので好ましくない。
【００３６】
官能基Ｘ及びＹとしては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スクシンイミド基、スルホン化スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、イソシアネート基、エポキシ基、ヒドラジド基、アジド基などが挙げられる。このような官能基群の中からＸ及びＹとして異なる２つの官能基を選択し、組み合わせて構成する。
【００３７】
特に、Ｘ及びＹの組合せとしては、反応対象が異なるアミノ基とカルボキシル基の組合せ、スクシンイミド基とマレイミド基の組合せが好ましい。
【００３８】
生体分子（Ａ）がＤＮＡである場合、末端に導入する官能基Ｙはアミノ基、チオール基あるいはビオチンが好ましい。
【００３９】
ヘテロ二官能基型親水性高分子の分子量は２００以上、好ましくは１０００以上、更に好ましくは１５００以上であり、２００００以下、好ましくは１００００以下、更に好ましくは６０００以下である。
【００４０】
繰り返し単位で言うと、構成単位の繰り返し数が、４以上、好ましくは２０以上、更に好ましくは３０以上であり、４５０以下、好ましくは２２５以下、更に好ましくは１３０以下である。
【００４１】
本発明のヘテロ二官能型親水性高分子は、架橋剤となるだけでなく、スペーサーの役割も担う。分子量が小さすぎる場合には、十分なスペーサーとして機能しないため好ましくない。一方、分子量が大きすぎる場合には、一定のモル濃度が必要である固定化に要する架橋剤のグラム数が増大するため、好ましくない。
【００４２】
本発明において、架橋剤を構成する高分子は、非特異的吸着を抑制するために親水性である必要がある。ここで親水性とは架橋剤となる高分子が水溶性であることを意味する。
【００４３】
高分子の繰り返し単位Ｒは特に限定されるものではないが、下記繰り返し単位−（−Ｏ−Ｒ_１−）ｎ−
（ここで、Ｒ_１は、炭素数が２−５のアルキレン基を表す。ｎは４〜４５０。）で表される構造を有することが好ましい。
【００４４】
Ｒとしては、具体的には、-（-ＣＨ₂-ＣＨ₂-Ｏ-）-や-（-ＣＨ₂-ＣＨ₂-ＣＨ₂-Ｏ-）-等の直鎖状のアルキレン基や、-（-ＣＨ（ＣＨ₃）-ＣＨ₂-Ｏ-）-等の分岐状のアルキレン基などが挙げられる。また、-（-ＣＨ₂-ＣＨ₂-Ｏ-）ｐ-（-ＣＨ（ＣＨ₃）-ＣＨ₂-Ｏ-）ｑ-のようなブロック共重合体も含まれる。
【００４５】
このうち、親水性と鎖のフレキシビリティからみて、エチレングリコールの繰り返し単位-（-ＣＨ₂-ＣＨ₂-Ｏ-）-を有するものが好ましい。
【００４６】
生体分子の固定化方法
架橋剤を用いて生体分子を固定化する方法は特に限定されないが、例えば、架橋剤の一方の末端Ｘを表面に反応して固定化した後に、反対側の末端に存在する別の官能基Ｙを利用して、生体分子を固定化する方法が挙げられる。
【００４７】
具体的には、一方の末端にアミノ基を有し、他方の末端にカルボキシル基を有するヘテロ二官能基型高分子を架橋剤として用いる場合、カルボキシル基を導入した固体表面をカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化した後に、一方の末端であるアミノ基と反応させて、架橋剤を表面に固定化する。その次に架橋剤を介して表面に導入されたカルボキシル基を用いて生体分子（Ａ）を表面に固定化する。
【００４８】
また、一方の末端にスクシンイミド基を有し、他方の末端にマレイミド基を有するヘテロ二官能基型高分子を架橋剤として用いる場合、アミノ基を導入した固体表面に、架橋剤のスクシンイミド基を反応させる。次に架橋剤を介して表面に導入されたマレイミド基を用いて生体分子を表面に固定化する。
【００４９】
生体分子（Ａ）を架橋剤であるヘテロ二官能基型親水性高分子と結合する方法は特に限定されず、直接的に結合させても、また他の物質を介在させて間接的に結合させてもよい。結合の種類は特に限定されず、例えば、共有結合、イオン結合、キレート結合、水素結合などにより結合させることができる。
【００５０】
本発明のヘテロ二官能型架橋剤を用いた後に、生体分子に結合する官能基又は物質を導入することも、本発明に含まれる。例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基をヘテロ二官能型架橋剤で固定化した後に、ＮｉキレートによりＮＴＡ基とヒスチジンタグとをキレート結合させて、ヒスチジンタグ蛋白を表面に導入する方法や、ビオチン或いはストレプトアジビンを架橋剤の官能基Ｙと反応させて導入した後に、導入したビオチン或いはストレプトアビジンと生体分子（Ａ）を反応させる方法などが考えられる。
【００５１】
生体分子を固定化する固体表面としては、相互作用解析に適している点で平面基板が好ましい。
【００５２】
平面基板としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による相互作用解析に好適な金属基板が好ましい。金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、クロム等が挙げられる。このうち、表面に金薄層を有する透明基板が特に好ましい。
【００５３】
金薄層表面が好ましい理由として、金−硫黄結合を利用して、表面に官能基を導入できることが挙げられる。
【００５４】
金−硫黄結合を利用して、表面に官能基を導入する方法としては、例えば、一般式Ｘ'-Ｒ'-Ｙ'で表される化合物（ここでＸ'は金薄層と反応する、硫黄原子を有する官能基を表す。Ｙ'はヘテロ二官能型親水性高分子と結合する官能基を表す。Ｒ'は有機基を表す）を用いて、官能基を導入した金薄層の固体表面に、ヘテロ二官能型親水性高分子を用いて生体分子（Ａ）を固定化する方法などが挙げられる。
【００５５】
官能基Ｘ'としては、例えば、チオール基、スルフィド基またはジスルフィド基などが挙げられる。Ｙ'としては、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、エポキシ基、カルボニルジイミダゾール基、イソシアネート基などが挙げられる。またＲ’としては、アルキレン基などが挙げられる。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が5以上18以下であることが好ましい。炭素数が4未満であると、アルカン鎖同士の疎水結合が十分でなく、自己組織化表面の安定性に欠ける。また19以上であると、アルカン鎖の疎水性が強く、親水性物質の反応・固定化が困難となるだけでなく、センサー表面として疎水性が強いために測定中の非特異的吸着が懸念される。
【００５６】
一般式Ｘ'-Ｒ'-Ｙ'で表される化合物としては、具体的には、Ｙ'がアミノ基となる８−アミノ−１−オクタンチオール（8-Amino-1-Octanethiol）、Ｙ'がカルボキシル基となる７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（7-Carboxy-1-Heptanethiol）などが挙げられる。
【００５７】
生体分子（Ａ）としては、単独の物質を用いてもよく、複数の種類の物質を用いてもよい。複数の種類の物質を用いる場合には、ハイスループットな解析が可能になる。ハイスループットで解析を行うことにより、極めて多数の化合物を効率よくスクリーニングすることができる。特に8種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは12種類以上、さらに好ましくは24種類以上の生体分子を用いることが好ましい。上限は特に限定されないが、通常96種類程度である。複数の物質を固定化するためにはアレイ状に物質を固定化するのが好ましい。それにより、それぞれの固定化部位にて相互作用を解析することが可能となる。
【００５８】
生体分子（Ａ）の種類は特に限定されず、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖などを用いることができる。中でも安定であることと、多くの種類を容易に確保し得るという点で、核酸が好ましい。
【００５９】
本発明によって固定化された生体分子（Ａ）はモビリティに優れ、非特異的吸着を抑制する効果を有するため、生体分子（Ｂ）又はその集合体との相互作用を適切な状態で測定することができる。
【００６０】
生体分子（Ｂ）の種類も特に限定されず、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖など挙げられる。またタンパク質の二量体など、生体分子（Ｂ）の集合体も用いることができる。
【００６１】
本発明は、特に転写因子等の複雑な構造を有するタンパク質の測定に、特に適している。なぜならば、転写因子はｂ−ｚｉｐやｚｉｎｃフィンガーに見られるように立体的に特殊な構造を取るものが多く、結合する対象の核酸分子のモビリティが不十分だと、転写因子が容易に接近できない。また、転写因子は表面への非特異的吸着量が顕著に高いため、非特異的吸着を抑制しないと解析は不可能である。本発明においては固定化分子のモビリティを確保し、非特異的吸着を抑制できるため、転写因子等の特殊な構造をとる生体分子の相互作用評価の解析にも好適に用いることができる。
【００６２】
転写因子の種類も特に限定されず、例えば、NF1ファミリー、Mafファミリー、GATAファミリーなどが適用できる。特にMafファミリーは、ホモ二量体だけではなく、ヘテロ二量体を形成することが知られている。本発明においては、このような生体分子の集合体の相互作用も適切に解析することができ、本発明の方法を用いることによって、様々なヘテロ二量体の組み合わせによる結合挙動の違いを評価するなどの、非常に意義深い測定を行うことが可能になる。
【００６３】
本発明で測定可能な相互作用としては、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、核酸−タンパク質相互作用、核酸−核酸相互作用、タンパク質−ペプチド相互作用、タンパク質−糖鎖相互作用、抗原−抗体相互作用などが挙げられる。
【００６４】
測定方法
固定化された生体分子（Ａ）と、生体分子（Ｂ）又はその集合体との相互作用の測定方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いることが好ましい。さらに、ＳＰＲ法の中では、ＳＰＲイメージング法が特に好ましい。
【００６５】
ＳＰＲ法はラベルフリーかつリアルタイムな測定が可能な測定法である。従って、生体分子（Ａ）又は（Ｂ）の少なくとも一方がタンパク質である場合に、特に好適である。なぜなら、タンパク質はラベル操作によって、構造が変化したり、活性を失う可能性があるが、ＳＰＲ法は生体分子を標識化（ラベル）する必要のない相互作用解析方法であるため、生体分子の機能や活性を維持したまま適切な測定を行うことが可能である。また該方法により、リアルタイムな測定が可能であり、平衡状態だけではなく、結合と解離の速度を解析することが可能となるため、これらの結果から生体分子の機能を知るための貴重な情報を得ることができる。
【００６６】
また、ＳＰＲイメージング法はアレイ全体に偏光平行光を照射し、その反射光をＣＣＤカメラで撮影する方法であって、アレイのある地点における表面プラズモン共鳴角変位を反射光強度の変化によって知ることが可能である。よって、複数の配列を固定化した二本鎖オリゴヌクレオチドアレイと生体分子の相互作用解析をラベルフリーかつリアルタイムに測定することが可能であり、特に複数の生体分子を固定化したアレイを用いた生体分子相互作用の解析に好適に用いることができる。
【００６７】
【実施例】
以下に実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６８】
実施例１
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，ＳｈｅａｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００６９】
得られた表面にＧｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ社のＨａｎｄｓｐｏｔｔｅｒを用いて５’チオール末端のＤＮＡの二種類をハイブリダーゼーションさせてからスポッティングした。ＤＮＡの配列はＭａｆ認識配列（ＭＡＲＥ２５）と、Ｍａｆ非認識配列（ＭＡＲＥ２３）であり、詳細な配列は図１に示す。５’チオール末端からチミン１５塩基スペーサーを介した後、目的の配列が入るように設計されている。
【００７０】
Ｘ５ＳＳＣ溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に５’チオール末端ＤＮＡが２５μＭ、その相補的ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、沸騰浴中にて５分、０℃に急冷し１５分、その後３７℃で三時間インキュベートし、ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションした二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をスポッティングし、１５時間反応させてｄｓＤＮＡを表面に固定化した。
【００７１】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、３００ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、ｐＨ７．９の転写因子測定用緩衝液をフローセル内に流した。
【００７２】
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、転写因子ＭａｆＧのホモ二量体を１μｇ／ｍｌの濃度で上記転写因子測定用緩衝液に溶解してセル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、さらに転写因子を含まない緩衝液を流し、結合と解離のＳＰＲシグナルの変化を観察した。
【００７３】
観察はＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３の固定化部位と何もＤＮＡが固定化されていない部分（バックグラウンド部位）の三点で実施した。ＳＰＲシグナルの変化を示すグラフを図３に示す。ＭＡＲＥ２５配列のみにＭａｆＧホモ二量体が結合し、ＭＡＲＥ２３、バックグラウンド部位にはほとんど結合しないのが観察でき、結合速度定数２．２２×１０⁵（Ｍ^-1ｓ^-1）、解離速度定数８．８０×１０^-4（ｓ^-1）、結合平衡定数２．５２×１０⁸（Ｍ^-1）を得た。
【００７４】
ＭａｆＧホモ二量体をセル内に注入する前に撮影した画像と、注入して１０分後に撮影した画像を撮影し、両者の差を画像処理ソフトＮＩＨＩｍａｇｅで演算処理を行った。その結果を図４に示す。ＭＡＲＥ２５配列のみにＭａｆＧが結合していることが明らかである。
【００７５】
比較例１
実施例と同様に、金蒸着透明基板上に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を１ｍＭの濃度でリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、８−ＡＯＴに反応させた。Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは分子量４３６．３７の低分子物質であり、繰り返し単位を有さない。
【００７６】
実施例１と同様の方法で、５’末端にチオールを有するＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３配列をｄｓＤＮＡとした上で表面に固定化し、ＳＰＲイメージング測定を行った。
【００７７】
実施例１と同様にＭａｆＧホモ二量体の相互作用を観察したが、ＭＡＲＥ２５、ＭＡＲＥ２３、バックグラウンド部位のすべてに非特異的に吸着し、転写因子ＭａｆＧの特異性は観察できなかった（図５）。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、モビリティと活性・機能を保ったまま生体分子を固体表面に固定化することが可能になり、本発明の方法を用いることにより、生体分子もしくは生体分子集合体と生体分子との相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の厳密かつ適切な評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＲＥ２５の塩基配列を示す図面である。
【図２】図２は、ＭＡＲＥ２３の塩基配列を示す図面である。
【図３】図３は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（実施例）を示す図面である。
【図４】図４は、ＭａｆＧホモ二量体結合前後の画像の差（実施例）を示す図面である。
【図５】図５は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（比較例）を示す図面である。

Claims

架橋剤として分子量が１，０００以上２０，０００以下であり、かつ一般式Ｘ−Ｒ−Ｙで表されるヘテロ二官能型親水性高分子（ここでＸはアミノ基もしくはスクシンイミド基を表す。Ｙはカルボキシル基もしくはマレイミド基を表す。Ｒは高分子の繰り返し単位を表す。）を用いて金薄層を表面に有する基板である固体表面上に生体分子（Ａ）を固定化した基板を用いて、生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）又はその集合体との相互作用を表面プラズモン共鳴法又は表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する工程を有することを特徴とする生体分子相互作用測定方法。
ヘテロ二官能型親水性高分子のＲが、下記繰り返し単位
−（−Ｏ−Ｒ_１−）ｎ−
（ここで、Ｒ_１は、炭素数が２−５のアルキレン基を表す。ｎは４〜４５０。）
で表される構造を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
ヘテロ二官能型親水性高分子の官能基Ｘがスクシンイミド基、及びＹがマレイミド基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
固体表面が平面基板であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
固体表面が、一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される化合物（ここでＸ’は金薄層と反応する官能基を表す。Ｙ’はアミノ基、カルボキシル基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド基から選ばれるヘテロ二官能型親水性高分子と結合する官能基を表す。Ｒ’は有機基を表す）を用いて金薄層表面に官能基を導入した固体表面であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される化合物が、８−アミノ−１−オクタンチオール（８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）又は７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
生体分子（Ａ）を固定化した基板が、複数の種類の生体分子（Ａ）をアレイ状に固定化した基板であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
生体分子（Ａ）を固定化した基板が、１０種類以上の生体分子（Ａ）を固定化した基板であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
生体分子（Ａ）が核酸であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
生体分子（Ｂ）がタンパク質であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
タンパク質が転写因子であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。