JP2007178305A - 圧電素子及び固定化層の安定化方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 蛋白質により構成された固定化層の安定性を高めること(活性の維持)を目的とする。
【解決手段】 圧電板の両面に電極を備える圧電素子であって、前記電極上に、蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を親水性分子材料により被覆したことを特徴とする。
【選択図】 図1
【解決手段】 圧電板の両面に電極を備える圧電素子であって、前記電極上に、蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を親水性分子材料により被覆したことを特徴とする。
【選択図】 図1
Description
本発明は、生化学、医療及び食品分野等における化学反応の追跡や状態分析等に使用される圧電素子及び圧電素子の電極表面に形成された固定化膜の安定化方法に関するものである。
DNA・タンパク質など生体物質の相互作用を測定する方法として、また、抗原抗体反応を応用した測定などにQCM(Quartz Crystal Microbalance )の原理が使われている(例えば、特許文献1)。
一般に使用されるものは、透明基板(例えば、ガラス)、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する固定化層からなり、その官能基を介し、金属表面に抗体や抗原等の生理活性物質を固定化する。そして、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
しかしながら、電極表面に蛋白質等の生理活性物質を固定化するためには、時間がかかるため、測定を始めるまでに時間がかかるという問題があった。また、生理活性物質を予め固定化して乾燥状態で市場へ供給した場合には、測定開始までに固定化された蛋白質が変性等して測定できないという問題があった。
一般に使用されるものは、透明基板(例えば、ガラス)、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する固定化層からなり、その官能基を介し、金属表面に抗体や抗原等の生理活性物質を固定化する。そして、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
しかしながら、電極表面に蛋白質等の生理活性物質を固定化するためには、時間がかかるため、測定を始めるまでに時間がかかるという問題があった。また、生理活性物質を予め固定化して乾燥状態で市場へ供給した場合には、測定開始までに固定化された蛋白質が変性等して測定できないという問題があった。
そこで、本発明は、蛋白質により構成された固定化層の安定性を高めること(活性の維持)を目的とする。
上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討の結果、次の通り解決手段を見いだした。
即ち、本発明の圧電素子は、請求項1に記載の通り、圧電板の両面に電極を備える圧電素子であって、前記電極上に、蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を親水性分子材料により被覆したことを特徴とする。
また、請求項2に記載の本発明は、請求項1に記載の圧電素子において、前記蛋白質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインA及びプロテインGのうちの何れかであることを特徴とする。
また、請求項3に記載の本発明は、請求項1又は2に記載の圧電素子において、前記親水性分子材料は、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料であることを特徴とする。
また、本発明の固定化層の安定化方法は、請求項4に記載の通り、圧電板の両面に電極を設け、前記電極に蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を、親水性分子材料の溶液中に浸漬又は洗浄することにより、前記固定化層を前記親水性分子材料により被覆することを特徴とする。
また、請求項5に記載の本発明は、請求項4に記載の固定化層の安定化方法において、前記溶液は、水溶液であることを特徴とする。
また、請求項6に記載の本発明は、請求項4又は5に記載の固定化層の安定化方法において、前記固定化層を、前記親水性分子材料の溶液に浸漬後、乾燥させることを特徴とする。
また、請求項7に記載の本発明は、請求項4乃至6の何れかに記載の固定化層の安定化方法において、前記親水性分子材料は、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料であり、前記溶液濃度を1〜40重量%としたことを特徴とする。
即ち、本発明の圧電素子は、請求項1に記載の通り、圧電板の両面に電極を備える圧電素子であって、前記電極上に、蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を親水性分子材料により被覆したことを特徴とする。
また、請求項2に記載の本発明は、請求項1に記載の圧電素子において、前記蛋白質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインA及びプロテインGのうちの何れかであることを特徴とする。
また、請求項3に記載の本発明は、請求項1又は2に記載の圧電素子において、前記親水性分子材料は、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料であることを特徴とする。
また、本発明の固定化層の安定化方法は、請求項4に記載の通り、圧電板の両面に電極を設け、前記電極に蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を、親水性分子材料の溶液中に浸漬又は洗浄することにより、前記固定化層を前記親水性分子材料により被覆することを特徴とする。
また、請求項5に記載の本発明は、請求項4に記載の固定化層の安定化方法において、前記溶液は、水溶液であることを特徴とする。
また、請求項6に記載の本発明は、請求項4又は5に記載の固定化層の安定化方法において、前記固定化層を、前記親水性分子材料の溶液に浸漬後、乾燥させることを特徴とする。
また、請求項7に記載の本発明は、請求項4乃至6の何れかに記載の固定化層の安定化方法において、前記親水性分子材料は、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料であり、前記溶液濃度を1〜40重量%としたことを特徴とする。
本発明によれば、圧電素子の電極上に蛋白質を固定化層として形成し、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料により被覆することにより、固定化層の蛋白質の変性等を防ぐことができる。また、乾燥後も蛋白質により構成された固定化層の活性を失うことなく、長期保存が可能となる。更に、測定を行う度に固定化層を形成する必要がなくなり、測定開始までの時間を大幅に削減することができる。
以下、図面を参照し、本発明の一実施の形態について説明する。尚、本発明は、この実施の形態に制限されるものではない。
本実施の形態の圧電素子は、図1(a)に平面図に示すように、円形状に形成された圧電板3とその両面の内側(略中央部)に同じく円形状に形成された電極4,5とを備えている。同図(b)に側面図を示すように、各電極4,5からは、互いに反対方向となるように、圧電板3の外周方向に向かってリード線6,7が設けられており、リード線6,7の外縁部には円弧状に形成された接続端子8,9が形成されている。尚、圧電板3の表側のリード線6は、同図(b)に示すように、裏側に回り込み、接続端子8は圧電板3の裏側に配置されている。
本実施の形態の圧電素子は、図1(a)に平面図に示すように、円形状に形成された圧電板3とその両面の内側(略中央部)に同じく円形状に形成された電極4,5とを備えている。同図(b)に側面図を示すように、各電極4,5からは、互いに反対方向となるように、圧電板3の外周方向に向かってリード線6,7が設けられており、リード線6,7の外縁部には円弧状に形成された接続端子8,9が形成されている。尚、圧電板3の表側のリード線6は、同図(b)に示すように、裏側に回り込み、接続端子8は圧電板3の裏側に配置されている。
前記圧電素子の電極4の上には、蛋白質により構成された固定化層18が形成される。固定化層18が形成された圧電素子は、図2に示すように、湿潤雰囲気に満たされたシャーレ20内に配置され、固定化層18上に、親水性分子材料の水溶液を滴下して、親水性分子材料19により被覆する。
このようにして、固定化層18は、親水性分子材料19により被覆されるので、活性を失うことなく、安定化することができる。従って、電極4に固定化層18を形成した状態で長期間の保存が可能となる。
前記固定化層を構成する材料としては、QCMにより測定する際に必要な蛋白質等を固定化できるものであれば特に制限するものではないが、好ましくは、アビジン、ストレプトアビジンやニュートラアビジンを使用することができる。
また、親水性分子材料としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、ケトン基、エーテル基等をもつ化合物のように親水性を有するものであれば制限されるものではない。
その中でも糖類を含む親水性分子材料又は親水性高分子材料であることが好ましい。
糖類の例としては、単糖類(フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース)、二糖類(マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース)、オリゴ糖類(フルクオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖。三糖類及び四糖類を含む。)及び多糖類(アミロース、アミロペクチン、セルロース、ペクチン、グリコーゲン)、糖誘導体(前記した糖類の還元糖(例えば、糖アルコール、デオキシ糖)、酸化糖(アルドン酸、ウロン酸)、脱水糖誘導体(グリコセエン)、アミノ糖、チオ糖)等が挙げられ、これらの中でも好ましくは、マルトース等が挙げられる。ここで、多糖類とは、広義の糖を意味し、α−シクロデキストリン、セルロースなど自然界に広く存在する物質を含むものとする。
その中でも糖類を含む親水性分子材料又は親水性高分子材料であることが好ましい。
糖類の例としては、単糖類(フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース)、二糖類(マルトース、スクロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース)、オリゴ糖類(フルクオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖。三糖類及び四糖類を含む。)及び多糖類(アミロース、アミロペクチン、セルロース、ペクチン、グリコーゲン)、糖誘導体(前記した糖類の還元糖(例えば、糖アルコール、デオキシ糖)、酸化糖(アルドン酸、ウロン酸)、脱水糖誘導体(グリコセエン)、アミノ糖、チオ糖)等が挙げられ、これらの中でも好ましくは、マルトース等が挙げられる。ここで、多糖類とは、広義の糖を意味し、α−シクロデキストリン、セルロースなど自然界に広く存在する物質を含むものとする。
また、親水性高分子材料とは、分子構造中にカルボキシル基、スルホン基、第4アミノ基などの解離基や、水酸基、アミド基、エーテル基のような非イオン性の親水基を持つ高分子が含まれ、具体的には、ポリグリセリン、デキストラン、デキストリン等が挙げられる。
上記実施の形態では、親水性分子材料19の溶液を湿潤雰囲気下において、電極4上に滴下して、固定化層18を被覆するようにしたが、親水性分子材料の溶液中に電極4を浸漬することが好ましく、溶液としては水溶液が好ましい。
また、溶液は、室温下において、親水性分子材料を均一に分散させ、非コロイド状であることが好ましい。マルトース等の親水性高分子材料を水等の溶液に溶かした際の濃度については、好ましくは1〜40重量%である。1重量%未満であると、固定化層18の保存が安定せず、40重量%を超えると、親水性高分子材料により形成された被膜にひびが入り易くなり、このひびから固定化層の水分が蒸発してしまうおそれがある。更に、前記濃度は、1〜20重量%とすることが好ましい。形成された被膜を短時間で乾燥させることができ、被膜中に未乾燥の部位が生じて腐敗等を生じるおそれがなくなるからである。
また、溶液は、室温下において、親水性分子材料を均一に分散させ、非コロイド状であることが好ましい。マルトース等の親水性高分子材料を水等の溶液に溶かした際の濃度については、好ましくは1〜40重量%である。1重量%未満であると、固定化層18の保存が安定せず、40重量%を超えると、親水性高分子材料により形成された被膜にひびが入り易くなり、このひびから固定化層の水分が蒸発してしまうおそれがある。更に、前記濃度は、1〜20重量%とすることが好ましい。形成された被膜を短時間で乾燥させることができ、被膜中に未乾燥の部位が生じて腐敗等を生じるおそれがなくなるからである。
また、親水性分子材料19により被覆した後に、乾燥するようにすることが好ましい。カビや細菌等の発生を防ぐことができるからである。乾燥する方法については、室温下で自然乾燥させる等特に制限するものではないが、室温下で15分以上自然乾燥させることが好ましい。そして、その後に、密閉容器内にシリカゲル等の乾燥剤とともに窒素を封入して保存することが好ましい
また、防腐のために水溶性分子水溶液に浸漬する際、パラベン類等の防腐剤、望ましくはメチルパラベン・エチルパラベンを0.001〜20%含む水溶液に浸漬することが望ましい。
尚、上記固定化層18が形成される電極4は、この種の圧電素子に使用される公知の材料により構成することができるが、例えば、金や白金等を蒸着等して形成することができる。
また、圧電板3についても、公知のものを使用することができ、例えば、チタン酸バリウム、PZT(登録商標)等を使用することができる。また、その形状についても特に制限はなく、上記説明した円板形状の他に、矩形状等のものも使用することができる。
また、圧電板3についても、公知のものを使用することができ、例えば、チタン酸バリウム、PZT(登録商標)等を使用することができる。また、その形状についても特に制限はなく、上記説明した円板形状の他に、矩形状等のものも使用することができる。
前記圧電素子2は、ガラス等の絶縁材料から構成される基板1に固定して使用することができる。
具体的な取り付け構造の例については、図3(平面図)及び図4(断面図)に示すように、圧電板3の裏側の電極5を、所定の空間10を有するようにして、基板1に固定する。基板1には、圧電板3をはめ込むことができる程度の円形状の凹部11が設けられており、この凹部11の内周面は階段状に形成されて、圧電板3の裏側の電極5が基板1に接触しないようになっている。
前記凹部11の内周面の階段の平坦部12にも接続端子13,14が設けられ、これらと、圧電板3に設けられた接続端子8,9は、導電性接着剤15を介して接着されることになる。
尚、基板1に設けられた接続端子8,9は、図3に示すように、基板1内部に設けられた配線16を介して、圧電板3とは反対側の端部において、外部電源に接続されることになる。
具体的な取り付け構造の例については、図3(平面図)及び図4(断面図)に示すように、圧電板3の裏側の電極5を、所定の空間10を有するようにして、基板1に固定する。基板1には、圧電板3をはめ込むことができる程度の円形状の凹部11が設けられており、この凹部11の内周面は階段状に形成されて、圧電板3の裏側の電極5が基板1に接触しないようになっている。
前記凹部11の内周面の階段の平坦部12にも接続端子13,14が設けられ、これらと、圧電板3に設けられた接続端子8,9は、導電性接着剤15を介して接着されることになる。
尚、基板1に設けられた接続端子8,9は、図3に示すように、基板1内部に設けられた配線16を介して、圧電板3とは反対側の端部において、外部電源に接続されることになる。
次に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、本実施例により制限されるものではない。
(実施例1)
水晶板(厚さ0.1475mm、半径4.35mmのATカット27MHz)の両面の中央部に、対向するようにして、円形状の金電極(厚さ0.5μm、半径2.5mm)を形成することにより得られる水晶振動子を、ガラス基板上に固定した。
前記金電極に、ピランハ溶液(30%過酸化水素水:濃硫酸=1:3)を適量塗布し、5分間常温にて放置してから、水により洗浄する作業を2回行った。次に、前記金電極全面に、界面活性剤を塗布して、綿棒により洗浄後、更に水により洗浄した。
洗浄された金電極に対して、DTDP(Dithiodipropionic acid)処理を行い共有結合法により、Neutravidinを固定化し、更に、20%のマルトース水溶液に浸漬してから、室温で30分間自然乾燥させ、本実施例の圧電素子とした。
(実施例1)
水晶板(厚さ0.1475mm、半径4.35mmのATカット27MHz)の両面の中央部に、対向するようにして、円形状の金電極(厚さ0.5μm、半径2.5mm)を形成することにより得られる水晶振動子を、ガラス基板上に固定した。
前記金電極に、ピランハ溶液(30%過酸化水素水:濃硫酸=1:3)を適量塗布し、5分間常温にて放置してから、水により洗浄する作業を2回行った。次に、前記金電極全面に、界面活性剤を塗布して、綿棒により洗浄後、更に水により洗浄した。
洗浄された金電極に対して、DTDP(Dithiodipropionic acid)処理を行い共有結合法により、Neutravidinを固定化し、更に、20%のマルトース水溶液に浸漬してから、室温で30分間自然乾燥させ、本実施例の圧電素子とした。
(実施例2)
洗浄された金電極に対して、DTDP処理を行を行わずに物理吸着法により、Neutravidinを固定化し、更に、20%のマルトース水溶液に浸漬してから、室温で30分間自然乾燥させた以外は、実施例1と同様にして圧電素子とした。
洗浄された金電極に対して、DTDP処理を行を行わずに物理吸着法により、Neutravidinを固定化し、更に、20%のマルトース水溶液に浸漬してから、室温で30分間自然乾燥させた以外は、実施例1と同様にして圧電素子とした。
次に、本発明の固定化層の安定性乃至保存性を評価するために、下記比較例の圧電素子を作製した。
(比較例1)
実施例1と同様にして、金電極にNeutravidinを固定化し、乾燥させて比較例1の圧電素子とした。
実施例1と同様にして、金電極にNeutravidinを固定化し、乾燥させて比較例1の圧電素子とした。
(比較例2)
比較例1と同様にして、金電極にNeutravidinを固定化し、乾燥させず比較例2の圧電素子とした。
比較例1と同様にして、金電極にNeutravidinを固定化し、乾燥させず比較例2の圧電素子とした。
上記実施例1,2及び比較例1,2に対して下記内容の評価試験を実施した。
Neutravidinが固定化された圧電素子を、500μlのTBS(Tris Buffered Saline)が注入された測定槽(ガラスセル)に浸漬し、振動数を安定させる。
次に、ビオチン化オリゴDNAを終濃度25nMとなるように添加し、振動数変化をモニタリングし、Neutravidinへのビオチン化オリゴDNAの結合量の差を測定し、その結果を図5に示す。
Neutravidinが固定化された圧電素子を、500μlのTBS(Tris Buffered Saline)が注入された測定槽(ガラスセル)に浸漬し、振動数を安定させる。
次に、ビオチン化オリゴDNAを終濃度25nMとなるように添加し、振動数変化をモニタリングし、Neutravidinへのビオチン化オリゴDNAの結合量の差を測定し、その結果を図5に示す。
図5から、比較例1は、Neutravidinが乾燥していたために、比較例2に比べて半分の振動数の変化しか観測できなかった。
これに対して、実施例1及び2では、固定化されたばかりのNeutravidinと同等の振動数変化が観測され、これらの中でも共有結合法を使用してNeutravidinを固定化させた実施例1は、固定化直後のNeutravidinと同じ振動数の変化を観測することができた。
これに対して、実施例1及び2では、固定化されたばかりのNeutravidinと同等の振動数変化が観測され、これらの中でも共有結合法を使用してNeutravidinを固定化させた実施例1は、固定化直後のNeutravidinと同じ振動数の変化を観測することができた。
1 基板
2 圧電素子
3 圧電板
4 電極
5 電極
6 リード線
7 リード線
8 接続端子
9 接続端子
10 空間
11 凹部
12 平坦部
13 接続端子
14 接続端子
15 導電性接着剤
16 配線
17 シール剤
18 固定化層
19 親水性高分子材料
2 圧電素子
3 圧電板
4 電極
5 電極
6 リード線
7 リード線
8 接続端子
9 接続端子
10 空間
11 凹部
12 平坦部
13 接続端子
14 接続端子
15 導電性接着剤
16 配線
17 シール剤
18 固定化層
19 親水性高分子材料
Claims (7)
- 圧電板の両面に電極を備える圧電素子であって、前記電極上に、蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を親水性分子材料により被覆したことを特徴とする圧電素子。
- 前記蛋白質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインA及びプロテインGのうちの何れかであることを特徴とする請求項1に記載の圧電素子。
- 前記親水性分子材料は、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料であることを特徴とする請求項1又は2に記載の圧電素子。
- 圧電板の両面に電極を設け、前記電極に蛋白質により構成された固定化層を形成し、前記固定化層を、親水性分子材料の溶液中に浸漬又は洗浄することにより、前記固定化層を前記親水性分子材料により被覆することを特徴とする固定化層の安定化方法。
- 前記溶液は、水溶液であることを特徴とする請求項4に記載の固定化層の安定化方法。
- 前記固定化層を、前記親水性分子材料の溶液に浸漬後、乾燥させることを特徴とする請求項4又は5に記載の固定化層の安定化方法。
- 前記親水性分子材料は、糖類を含む親水性分子又は親水性高分子からなる材料であり、前記溶液濃度を1〜40重量%としたことを特徴とする請求項4乃至6の何れかに記載の固定化層の安定化方法。
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