JP2004037209A - アロマターゼ活性の測定方法、並びにアロマターゼの活性阻害の評価方法、およびそれらの方法のための組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、サイトクロームＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０）酵素ファミリーの一つであるアロマターゼの活性測定に関するものであり、また化学物質等のアロマターゼの阻害効果を評価するための方法に関するものである。また本発明はそれらの方法によって測定系を構築する際に使用する組成物に関する。
【解決手段】アロマターゼの活性を測定する方法であって、アロマターゼを作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により測定することを特徴とするアロマターゼ活性の測定方法。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイトクロームＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０）酵素ファミリーの一つであるアロマターゼの活性測定に関するものであり、また化学物質等のアロマターゼの阻害効果を評価するための方法に関するものである。また本発明はそれらの方法によって測定系を構築する際に使用する組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アロマターゼは主として生殖・性分化・成熟・成長・代謝・維持等に関わる性ホルモン量を調節する酵素であり、ステロイドホルモンの生合成系の最終段階において、アンドロジェンをエストロジェンに変換する。アロマターゼに関する研究はここ数１０年進められおり、現在もより新しい手法にて、各種起源のアロマターゼの発現機序・構造・機能・メカニズム・進化機構等が解明されつつある。
【０００３】
アロマターゼを活性が阻害されることにより、本来遺伝的に雌である生物が雌化する例が知られている。
例えば特開平０４−２１１３１５や特開平０５−１７６６５９などでは、ニワトリの雌の雄化が、トリブチルスズやトリフェニルスズによる貝類の雌化現象（いわゆるインポセックス：Ｉｍｐｏｓｅｘ）が、堀口ら（マル、エンバイロ、リサーチ　５０巻２２３−２２９頁（２０００年）：Ｍａｒ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｒｅｓ　Ｖｏｌ．　５０，　ｐｐ２２３−２２９（２０００））によって報告されている。人工化学物質による生命の性・生殖への影響はいわゆる内分泌撹乱物質問題として先世紀末より、緊急性のある課題として人類が直面している。
【０００４】
アロマターゼはまた乳癌・子宮癌等にも密接に関与する。エストロゲン依存性の癌の進行過程に伴ってアロマターゼは発現し、近年では北脇らが、子宮内膜症・子宮腺筋腫・子宮筋腫などに伴ってアロマターゼが発現することを報告している（北脇ら　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　　５７巻　５１４−５１９頁（１９９７年）：Ｋｉｔａｗａｋｉ，　Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．，　Ｖｏｌ．５７，５１４−５１９（１９９７））。彼らは健常者では子宮内膜にアロマターゼが認められないことを、アロマターゼ特異的抗体を用いた免疫染色法にて確認している。またアロマターゼの活性測定は、良性乳腺疾患・乳癌などの治療において、ホルモン感受性の有無の判断、治療方針の決定に有用であるとされている。さらにアロマターゼは胎盤・卵巣・セルトリ細胞・リーデッヒ細胞・脂肪組織・筋肉・毛髪の他、脳にもその存在が確認されており、脳の性分化・性行動にも関与する可能性が指摘されている。
【０００５】
アロマターゼはさらに毛髪の成長・脱毛にも関与している。多毛症、脱毛症は男性ホルモンに依存して生じており、アロマターゼの阻害剤を毛髪成長の制御に使用する試みが行なわれている（特表平１０−５０８８２８）。
【０００６】
乳癌・子宮癌等のエストロゲン依存性癌の治療薬あるいは毛髪成長制御剤として、種々のアロマターゼ阻害剤が研究開発されている。例えば現時点で販売・投与されている、アナストロゾールは非選択的非ステロイド性アロマターゼ阻害剤であり、閉経後女性のアロマターゼ阻害によって、副腎皮質から産生されるアンドロゲンがエストロゲンに変換することを抑制し、血漿中のエストロゲンを著明に低下させる。この薬剤は進行性再発乳癌等の治療薬として使用されている。
この様に性ホルモン調節酵素・薬物代謝酵素としての重要性からアロマターゼを標的とした薬物の開発が現在も進められており、より高性能な薬剤の需要が存在し、多くの大学研究機関・製薬メーカーにおいて新しいアロマターゼ阻害剤のスクリーニングが実施されている。
【０００７】
アロマターゼはヒト以外にも広く、哺乳類・鳥類・爬虫類・両生類・魚類、イボニシ等の貝類などの無脊椎動物にも広く分布し、根幹的な酵素の一つとして位置づけられている。このことは内分泌撹乱物質として、アロマターゼ阻害能あるいは促進能を有する人工化学物質の影響が、特定の貝類や鳥類のみに限定されるものではなく、ヒト自身にも影響を及ぼす可能性が高いことを意味する。このため、現在人類が大規模に使用している化学物質を全て、アロマターゼヘの影響という観点から見なおすことが急務となっているが、その試験法の煩雑さから、遅々として進んでいないのが現状である。
【０００８】
阻害試験法などに使用するために、アロマターゼは組換え技術等によって、昆虫細胞や哺乳動物細胞、酵母、大腸菌などを用いて生産されている（シグルら　ビー　ビー　アール　シー　２０１巻６９４−７００頁（１９９４年：　Ｓｉｇｌｅ　Ｒ．Ｏ．，　Ｂ．　Ｂ．　Ｒ．　Ｃ．　Ｖｏｌ．　２０１，　ｐｐ２０１−７００（１９９４）　等）。
【０００９】
アロマターゼ活性の測定法としては、シェンケルら（ジャーナル　ステロイドバイオケム　３３巻１２５−１３１頁（１９８９年）：Ｓｃｈｅｎｋｅｌ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｖｏｌ．３３，　ｐｐ１２５−１３１（１９８９））らの動物細胞を用いた方法、酵母細胞で発現させたアロマターゼによるスクリーニング方法（ポンポンら　モレキュラー　エンドクリノロジー　３巻１４７７−１４８７頁（１９８９年）：　Ｐｏｎｐｏｎ　Ｄ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　３，　ｐｐ１４７７−１４８７（１９８９））、組換え技術によりアロマターゼを発現する哺乳動物細胞を用いる方法（特表平４−５０２２６１）等の細胞を用いた方法がある。これらはインビトロ試験で実施しうるものであるが、細胞全体を使用するため、アロマターゼ蛋白質と試験対象の化学物質の直接の反応性を評価するものではない。　アロマターゼ活性測定法として、アロマターゼ蛋白質そのものの活性を検出する方法としては、ラジオアイソトープラベルされた基質を使用する、トリチウム水遊離アッセイ法（ベリノら　ジャーナル　クリニ　エンドクリノロジー　メタボ　４４巻６９９頁（１９７７年）：　Ｂｅｌｌｉｎｏ，　Ｆ．　Ｌ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．，　Ｖｏｌ．　４４，　ｐｐ６９９（１９７７））やストレッサーら（アナル　バイオケム　２８４巻４２７−４３０頁（２０００）：Ｓｔｒｅｓｓｅｒ，　Ｄ．Ｍ．，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２８４，　ｐｐ４２７−４３０（２０００））による、アロマターゼによって代謝された後、蛍光性を有する基質を使用する蛍光法がある。　さらに谷口ら（アナル　バイオケム　１８１巻１６７−１７１頁（１９８９年）：　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，　Ｈ．，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．１８１，　ｐｐ１６７−１７１（１９８９））による液体クロマトグラフィーによる方法等がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
アロマターゼ活性を測定において、哺乳動物細胞、組換え酵母細胞、組換え昆虫細胞など細胞を用いた場合には、細胞が含む他の代謝酵素の影響を受けることが最も大きな障害となる。アロマターゼ以外に多くのＰ４５０酵素は多数の種類細胞内に存在しているが、試験対象の化学物質が、それらの酵素によって代謝される可能性は高く、影響は大きい。また種々の化学物質の、細胞膜透過性は、動物細胞・酵母・大腸菌でそれぞれ異なるため、それぞれの細胞を用いて得た結果で差が認められるため、細胞を用いることによるバイアス込みの実験結果が得られることとなる。
【００１１】
トリチウム水遊離アッセイ法においては、比較的取扱い易く、危険性の少ない、トリチウムラベルを使用するものの、放射性化合物を取扱うための、特別の隔離空間・設備を必要とする他、アッセイ廃棄物も放射性化合物を含むため、特別の留意が必要であり、実験の操作性にも制限がある。
【００１２】
ストレッサーらによる方法はアロマターゼ活性を測定する場合には、放射性化合物を使用することもなく、多くの問題を生じないが、アロマターゼ阻害剤のスクリーニングにおいては、試験対象の化学物質の非常に多くが自ら蛍光を有するため、化学物質の阻害用量曲線を得る場合に、自己蛍光が測定の妨害となる。多くの化学物質が蛍光を有するためこの方法はスクリーニングとして限界を有する。
【００１３】
谷口らによる液体クロマトグラフィーによる方法は、放射性化合物を使用することもなく、阻害剤スクリーニングの場合においても、液体クロマトグラフィーにより分離分析のため、試験対象物質の自己蛍光の影響も、原理的にありえない。しかしながらクロマトグラフィーによる分析の前に、除蛋白操作・分離操作を必要とするため煩雑であり、さらに一度に多くのサンプルを分析することができないという難点を有する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、放射性化合物を使用することなく、試験対象の化学物質の自己蛍光の影響を受けることがなく、煩雑な操作を必要としない、ハイスループットに適したアロマターゼ活性の測定方法、アロマターゼ活性の阻害剤のスクリーニング方法につき鋭意努力検討した結果、アロマターゼによって変換されて生じた生成物を、免疫化学的に測定することで諸問題が解決されることに想到し、本願発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、
（１）　アロマターゼの活性を測定する方法であって、アロマターゼを作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により測定することを特徴とするアロマターゼ活性の測定方法。
（２）　アロマターゼ活性を測定する際に、評価すべき化学物質を同時に共存させ、生じる生成物の量の変化を免疫化学的手法により測定し、評価すべき化学物質の効果を評価することを特徴とする測定方法。
（３）　免疫学的手法が、生成物を特異的に認識する抗体を利用することを特徴とする（１）、（２）の測定方法。
（４）　生成物を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法から少なくとも一つの手法を利用することを特徴とする、（１）〜（３）の測定方法。
（５）　　基質が、アンドロジェンに類別されるものであることを特徴とする請求項１〜４の測定方法。
（６）　アロマターゼ活性測定に使用する基質がテストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、７−エトキシ−３−シアノクマリン、７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ベンジロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、ジベンジルフルオレセイン、７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリンであることを特徴とする（１）〜（５）の測定方法。
（７）　アロマターゼ反応の間あるいはアロマターゼ反応後、アロマターゼが固定化されることを特徴とする、（１）〜（６）の方法。
（８）　アロマターゼ反応終了後、アロマターゼとその他のアロマターゼ反応組成物とが分離されることを特徴とする（１）〜（７）の方法。
（９）　　アロマターゼ反応後、アロマターゼの活性を抑制するために、加熱処理あるいは阻害剤を添加することを特徴とする（１）〜（８）の方法。
（１０）　抗体が魚類・両性類・鳥類・爬虫類、哺乳類由来のポリクローナル抗体あるいは、モノクローナル抗体であることを特徴とする（３）〜（９）の方法。
（１１）　アロマターゼが貝類・軟体動物・魚類・両性類・鳥類・爬虫類・哺乳類由来であることを特徴とする（１）〜（１０）の方法。
（１２）　アロマターゼが遺伝子組換えで生産されていることを特徴とする（１）〜（１１）の方法。
（１３）　抗体が固定化されていることを特徴とする（１）〜（１２）の方法。
（１４）　アロマターゼ反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系をアロマターゼ反応時に共存させることを特徴とする、（１）〜（１３）の方法。
（１５）　アロマターゼ反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系が、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素を含むことを特徴とする、（１）〜（１４）の方法。
（１６）　アロマターゼ反応の基質が、抗体による免疫反応に実質的に影響を及ぼさない濃度に調節されていることを特徴とする、（１）〜（１５）の方法。
（１７）次に示す（１）〜（３）を含む試薬組成物であって、アロマターゼが、ある物質が意図している作用効果に及ぼす影響の度合いを測定する為の試薬組成物。
（１）アロマターゼ
（２）ある物質が、アロマターゼによって作用を受け、生じた生成物を、特異的に認識する抗体
（３）（２）に記載の抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法のいずれか１つの方法による測定を可能にする試薬組成物。
（１８）　特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化プレートあるいは特異抗体固定化（生成物架橋結合蛋白質）金薄膜チップ、特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化水晶振動子チップ、反応用緩衝液、特異抗体液、抗体試料希釈液、標準品、標識量を定量するための酵素基質液などから適宜選択される組成物を構成パーツとするキットであって、アロマターゼが、ある物質が意図している作用効果に及ぼす影響の度合いを測定する為のキット。
（１９）　非ステロイド性化学物質を評価対象とする（２）〜（１７）の方法。
（２０）　アロマターゼ反応時のアンドロジェン性の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることを特徴とする（２）〜（１９）の方法。
に関するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明で対象とするアロマターゼの形態としては、純化され活性のある蛋白以外に、動物組織・植物組織・微生物から部分精製、粗精製あるいは未精製抽出物が使用可能である。
【００１７】
本発明のアロマターゼ阻害剤のスクリーニングに使用する、アロマターゼの給源としては、ヒト・ラット・マウスなどの哺乳類由来のもの、ニワトリなど鳥類由来のもの、ワニなどの爬虫類由来のもの、カエルなどの両性類由来のもの、マス・メダカなど魚類由来のもの、貝類・軟体動物等の無脊椎動物由来のものを使用することができる。また本発明での測定対象としてのアロマターゼは、ヒト・ラット・マウスなどの哺乳類、ニワトリなど鳥類、ワニなどの爬虫類、カエルなどの両性類、マス・メダカなど魚類、貝類等の無脊椎動物から採取した生体試料中及びそれらを部分精製・高度精製したものに含まれる。
【００１８】
本発明における免疫化学的測定方法としては、アロマターゼによって変換された生成物を特異的な抗体を利用した、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法などを選択することができる。酵素免疫測定法として、生成物をハプテンとして酵素と結合させた、酵素標識体と固相化された生成物特異的抗体とを組み合わせた競合法か、生成物を牛血清アルブミン等と架橋結合させたものを固相化し、酵素標識された生成物特異的抗体を組合せた競合法を使用することができる。またこれらの方法を適宜変更して応用することが可能である。これらの酵素免疫測定競合法においては、アロマターゼによって変換されて生じた生成物が多いほど、最終的に検出する酵素標識体は少なくなり、結果として得られるシグナルは小さくなる。表面プラズモン共鳴法を利用する場合は、使用する金薄膜表面に、生成物特異的抗体または生成物を牛血清アルブミン等と架橋結合したものを、固定化して使用することができる。微量示差熱測定法の場合は、生成物と抗体との反応時に生じる微量熱量を直接測定することができる。水晶振動共鳴法の場合は水晶振動子上に生成物特異的抗体または生成物を牛血清アルブミン等と架橋結合したものを、固定化して使用することができる。
【００１９】
本発明の免疫化学的測定において使用する抗体とは、免疫グロブリンの各クラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのことを言い、各抗体は魚類・両性類・爬虫類・哺乳類のものを使用することができる。また抗体はこれら各種動物の生体液から得られたポリクローナルなものであっても、ハイブリドーマより産生されたモノクローナルものでも、遺伝子工学的に製造されたものであってもよい。さらには抗体は全体の分子であっても、結合部分の活性を保持しえれば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ，ｓｃＦｖあるいはミニボデイなどいかなる形態のフラグメントであってもよい。それらの抗体は生成物に対して、測定時においてアロマターゼによる生成物に対して十分に高い特異性を有することが必要である。　多数の化学物質と交差反応性を有する抗体を用いる場合も、本発明は包含するが、その場合アロマターゼ阻害活性の評価対象化学物質の種類は限定される可能性が高いであろう。
【００２０】
本発明でいう競合法とは、特異的抗体の結合対象である生成物Ａの標識体（Ａ−Ｌ）を、Ａ特異的抗体（Ｉｇ）が固定化された担体上で、アロマターゼによって生成された（Ａ）と（Ａ−Ｌ）の競合反応を行なわせた後、遊離の（Ａ−Ｌ）もしくは固相に結合した（Ａ−Ｌ）の標識（Ｌ）の量を計測する、測定系のことをいう。図１に標識として酵素（ペルオキシダーゼ）を用いた競合法測定系の例を示す。あるいは図２の様に、シグナルを生じない蛋白質（Ｂ）とＡを架橋結合した複合体（Ａ−Ｂ）を固定化した担体を用いて、標識抗体（Ｉｇ−Ｌ）とアロマターゼによって生成された（Ａ）を競合反応させる系も可能である。この場合遊離の（Ｉｇ−Ｌ）もしくは担体と結合した（Ｉｇ−Ｌ）の標識（Ｌ）の量を計測する。特異的抗体を固相化したものと酵素標識生成物を用いた測定系において得られる、アロマターゼ阻害のドーズレスポンスカーブ（用量曲線）を図３に模式的に示す。
【００２１】
本発明において表面プラズモン共鳴法、水晶振動共鳴法を用いた場合の測定原理を図４および図８に示す。これらの方法の場合、特異的抗体を金薄膜表面あるいは水晶振動子上に固定化するか、シグナルを生じない蛋白質（Ｂ）とＡを架橋結合した複合体（Ａ−Ｂ）を金薄膜表面あるいは水晶振動子上に固定化するかいずれかである。
【００２２】
本発明における生成物特異抗体あるいは生成物−蛋白質架橋複合体を固定化するための不溶性担体としては、ポリスチレン・ナイロン・ポリカーボネートなどプラスチック、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、セファロース、ニトロセルロース、ガラス、濾紙などが使用可能である。各担体には各種の官能基（ヒドラジド基、アルキルアミノ基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基など）が導入されていてもよい。担体の形状としては、マイクロタイタープレート、膜、シート、チップ、ビーズなど操作性のよいものを使用することができる。各不溶性担体の吸着可能力・結合能力はあらかじめ確認できている方が好ましいが、それらの情報は必ずしも必須ではない。本発明では、固相担体作製時に、共有結合によるカップリングも実施可能である。カップリング試薬としては、グルタルアルデヒド、カルボジイミドなどが用いられる。
【００２３】
本発明における抗体固相あるいは生成物−蛋白質架橋複合体を固定化する際に使用する吸着液のベース緩衝液としては、１０ｍＭ　りん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ含有：ｐＨ７．２）、５０ｍＭ　炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ含有：ｐＨ８．５）など、一般的に用いられているものを、抗体あるいは生成物−蛋白質架橋複合体の安定性が保持されるｐＨ範囲内（ｐＨ３．０〜１０．０：好ましくはｐＨ５．０〜９．０）で使用することができる。塩の種類、緩衝液の濃度は示した例に限定されるものではなく、適宜変更することができ、レセプターの種類によっては、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、あるいは微量の重金属塩等を０．０１ｍＭ〜３００ｍＭの範囲で添加することが可能である。吸着・結合反応後、牛血清アルブミンやカゼイン・ゼラチンなどを、非特異的反応防止の為にブロッキング剤として０．０１％〜１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で使用することができる。このブロック剤のベース緩衝液としては吸着液に使用したりん酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液の他に、マレイン酸、乳酸などの有機酸緩衝液を１０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲で使用することができる。ｐＨは測定系に関連するレセプター（抗体を含む）の安定化に最もふさわしい範囲を選択できるが、一般的にはｐＨ５．０〜ｐＨ８．５で使用することが多い。また固定化後の安定化のためにサッカロース・グルコース・デキストランなどの糖類を安定化剤として０．０１％〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で適宜添加することができる。
【００２４】
測定系に関与する抗体あるいは生成物−蛋白質架橋複合体を固定化させる時の濃度としては、０．１ｐｇ（ピコグラム）／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲を使用することができる。より好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌを、さらに好ましくは０．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬを選択することができる。
【００２５】
吸着・結合時に必要な時間としては、５分〜７２時間が選択可能であるが、より好ましくは１時間〜３６時間が選択できる。　インキュベートする温度としては、１℃〜４５℃が選択可能であるが、より好ましくは２℃〜３７℃が選択できる。
【００２６】
本発明で不溶性担体に抗体または生成物−蛋白質架橋複合体を吸着させた後、適宜１０ｍＭ　りん酸緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ含むｐＨ７．２）などの洗浄液で洗浄することができる。洗浄剤にはツイーン２０やトリトンＸ−１００など、温和な非イオン界面活性剤等などを適宜加えることもできる。
【００２７】
アロマターゼ活性測定に使用する基質としては、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、７−エトキシ−３−シアノクマリン、７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ベンジロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、ジベンジルフルオレセイン、７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリンなどを使用することができる。
【００２８】
アロマターゼ活性測定に使用する抗体としては、抗１７β−エストラジオール抗体、抗エストロン抗体など、基質が代謝された生成物を特異的に認識する抗体であれば、使用に制限はない。本発明の免疫化学的測定において使用する抗体は、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、水晶振動共鳴法の場合、不溶性担体に固定化して使用しても良いし、固定化せず溶液状態で使用しても良い。微量示差熱測定法での抗体の使用は、固定化する必要性はない。酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、水晶振動共鳴法で、抗体を不溶性担体に固定化することなく、溶液状態で使用する場合は、生成物を架橋結合した蛋白質（生成物―ＢＳＡコンジュゲート等）を不溶性担体に固定化することが必要となる。
【００２９】
アロマターゼ活性阻害効果を評価する際に、反応後、アロマターゼ反応時、アロマターゼは固定化されていても良い。またアロマターゼ反応後、不溶性担体に固定化されたアロマターゼ特異的抗体により補足・固定化し、反応系外に除去しても良い。また予めアロマターゼをビオチン化しておき、アロマターゼ反応後、不溶性担体に固定化されたストレプトアビジンにて反応系外に除去しても良い。あるいはアロマターゼ活性阻害効果を評価する際に、反応後、アロマターゼの活性を抑制するために、加熱処理をすることができる。あるいは反応後、既知のアロマターゼの阻害剤を添加することができる。
【００３０】
アロマターゼ反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系としては、ＮＡＤＰＨを産生することができる酵素系であれば限定されることはないが、アロマターゼ反応及びアロマターゼ反応後の免疫反応に影響を与えないことが望ましい。この様な酵素系としては、グルコース６リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）（以下ＮＡＤＰ^＋とも記載）とグルコース６リン酸脱水素酵素の組合せ、イソクエン酸、ＮＡＤＰ^＋とイソクエン酸脱水素酵素の組合せなどがある。
【００３１】
アロマターゼ反応の基質は、極めて多量に存在する場合、アロマターゼ反応後の免疫化学反応に影響を与える場合がある。このため実質的に影響が出ないレベルにまで、基質の量を調節することが好ましい。
具体例として、アロマターゼの基質としてテストステロンを、特異抗体として抗１７βエストラジオール抗体を選択した場合、抗１７βエストラジオールの特異性が非常に高く、テストステロンに対する交差反応性が極めて低い場合においても、一般に酵素反応として使用する際の基質濃度（１ｍＭ〜１００ｍＭ）では、特異的抗体にとって量的に極めて過剰であり、抗１７β−エストラジオール抗体と１７β−エストラジオールの免疫反応に影響を及ぼす場合がある。この場合基質濃度としてテストステロン濃度を減じることで、実質的に免疫反応に影響が出ないようにすることができる。他のアンドロジェン基質も、生成物特異的抗体の性能にもよるが、アロマターゼ反応時の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることが好ましい場合がある。
【００３２】
アロマターゼ反応のもう一つの電子伝達体としての基質は、ＮＡＤＰＨとして直接反応系に、一般に使用される０．１ｍＭ〜１０．０ｍＭの範囲で添加することが可能である。あるいはＮＡＤＰ^＋として添加し、上述の再生系の組合せを添加しても良い。グルコース６リン酸、ＮＡＤＰ^＋、グルコース６リン酸脱水素酵素の組合せの場合、それぞれ　０．２ｍＭ〜２０ｍＭ、０．１ｍＭ〜５．０ｍＭ、０．１ユニット／ｍｌ〜２０ユニット／ｍｌの範囲で使用可能である。より好ましくはそれぞれ　０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜３．０ｍＭ、０．５ユニット／ｍｌ〜１０ユニット／ｍｌの範囲で使用可能である。なおグルコース６リン酸、ＮＡＤＰ^＋、ＮＡＤＰＨはナトリウム塩、カリウム塩等の形で使用することができ、酵素類は高純度精製品・部分精製品・硫安懸濁品等を使用することができる。
【００３３】
免疫化学的測定として酵素免疫測定法を用いる場合、標識用酵素として、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、リゾチーム等、一般の酵素免疫測定法に使用されているものを制限なく利用できる。また適宜それら選択した酵素に応じて、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン、２，２−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム（ＡＢＴＳ）、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等の各種酵素に対応した基質が使用できる。
【００３４】
アロマターゼ反応及び免疫化学的反応においては、評価対象とする化学物質の溶解性を高めるため、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒を含むことができる。それらの有機溶媒はアロマターゼ反応及び免疫化学反応に影響しない範囲か、影響を無視できる範囲で使用することができる。ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドは、およそ０．１〜２０％、好ましくは０．２％〜１０％、より好ましくは　０．２％〜５％で使用することができる。
【００３５】
本発明でいう測定用キットとは、上述の生成物を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法などによる測定を可能にする各種の試薬群（固相化された担体を含む）のことである。具体的には特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化プレートあるいは特異抗体固定化（生成物架橋結合蛋白質）金薄膜チップ、特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化水晶振動子チップ、反応用緩衝液、特異抗体液、抗体試料希釈液、標準品、標識量を定量するための酵素基質液などから適宜選択される組成物を組合せたセットをいう。
【００３６】
本発明でいう非ステロイド性化学物質とは、いわゆるステロイド骨格を有しない、アミノグルテチミド、ナフトフラボンなどをいう。ステロイド骨格を有する化学物質のうちあるものは、アロマターゼの生成物質と構造的に類似するため、生成物特異的抗体に対して若干交差反応性を有する場合がある。これらの場合得られる阻害効果は、低く見積られ、偽陰性の結果を生じる可能性がある。こうした化学物質を評価する場合、特にアロマターゼのみを除いた測定系にて評価した結果と合わせて、化学物質の阻害効果を論じなければならない。しかしながらアロマターゼ阻害剤のうち、薬剤として開発されるものは、種々の理由からステロイド骨格を有しないものも多く、本発明は特に非ステロイド性アロマターゼ阻害剤のスクリーニングに有用である。また内分泌撹乱物質として問題になっている物質の多くは芳香環を有するが、非ステロイド性のものが多く、本発明は特に内分泌撹乱物質のスクリーニングにも有用である。
【実施例】
本発明の実施における望ましい態様を実施例として以下に述べる。
【００３７】
［実施例１］
【００３８】
（抗エストラジオール抗体固定化プレートの作製）
エストラジオールの３位の位置を利用して架橋された蛋白質を抗原として得た、精製抗エストラジオール抗体を、１μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈し（抗体吸着液）、コーニングコースター社製のマクロタイタープレート（９６ウエルタイプ：材質はポリスチレン）に１ウエルあたり１００μＬづつ分注した。分注後プレート表面をシールし、４℃にて終夜静置した。翌日抗体吸着液を除去し、１ウエルあたり１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２；１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）　２００μＬにて３回洗浄した。洗浄後１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２；１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む：りん酸緩衝液１）をベースとし、０．２％カゼイン、１０％サッカロースを含むブロッキング溶液　２００μＬを１ウエルづつ満たした。ブロッキング液を満たした後プレートを４℃にて終夜静置し、翌日ブロッキング液除去後１６時間の真空乾燥を実施した。真空乾燥したプレートは減圧化にて保管袋に密封し、以下の測定に供するまで４℃にて保存した。
（アロマターゼの測定）
ジェンテスト（ＧＥＮＴＥＳＴ）社製の組換えヒトアロマターゼを、１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２　；０．１％ＢＳＡを含む：りん酸緩衝液２）にて希釈し、各濃度系列を作製した。この各濃度系列　２５μＬと、りん酸緩衝液２をベースとした、グリセロール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下Ｇ６ＰＤＨとも記載）（０．５ユニット／ｍｌ）、ＭｇＣｌ_２　４．１３ｍＭ、ＮＡＤＰ・２Ｎａ１．６３ｍＭ、Ｇ６Ｐ・Ｎａ　４．１３ｍＭ、テストステロン６２．５μＭの反応混合液　１００μＬ　及び　りん酸緩衝液２　２５μＬをポリプロピレン製アッセイプレート（９６ウエル）中にて混合し、３７℃にて２０分間反応させた。この反応液を５０μＬとり、１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２　；０．１％ＢＳＡを含む：りん酸緩衝液３）をベースとしたペルオキシダーゼ標識エストラジオール（Ｅ２−ＨＲＰ）５０μＬと、抗エストラジオール抗体固定化プレート上にて混合し、４℃にて１時間反応させた。反応後ツイン２０　０．１％を含むりん酸緩衝液１　２００μＬにてプレートを３回洗浄後、テトラメチルベンチジンを含む酵素反応溶液１００μＬを加え、３７℃にて２０分間インキュベートした。この後１Ｎ　硫酸１００μＬにて酵素反応をとめ、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測光し、データ処理を実施した。ヒトアロマターゼの各濃度系列と得られる吸光度の関係を図５に示す。アロマターゼの濃度と吸光度は非常に高い相関性をもっており、本実施例の方法により吸光度のデータより試料中のアロマターゼ活性が測定できることが示されている。
【００３９】
［実施例２］
（化学物質のアロマターゼへの阻害効果の評価　▲１▼）
ジェンテスト（ＧＥＮＴＥＳＴ）社製の組換えヒトアロマターゼ溶液を、りん酸緩衝液２にて約１６００倍に希釈し、このアロマターゼ溶液　２５μＬと、りん酸緩衝液２をベースとした、Ｇ６ＰＤＨ（０．５ユニット／ｍｌ）、ＭｇＣｌ_２　４．１３ｍＭ、ＮＡＤＰ・２Ｎａ　１．６３ｍＭ、Ｇ６Ｐ・Ｎａ　４．１３ｍＭ、テストステロン６２．５μＭの反応混合液　１００μＬ　及び　りん酸緩衝液２をベースとした２５μＬのαナフトフラボン０μＭ〜３．２μＭ溶液を、ポリプロピレン製アッセイプレート（９６ウエル）中にて混合し、３７℃にて２０分間反応させた。この反応液を５０μＬとり、以後実施例１と同様の操作を実施し、各αナフトフラボン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。図６にその対応関係を示す。αナフトフラボンの量の増加に伴って、アロマターゼの阻害が強くなり、生成するエストラジオール量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【００４０】
［実施例３］
（化学物質のアロマターゼへの阻害効果の評価　▲２▼）
実施例２のαナフトフラボンにかえて、０〜９μＭのアミノグルテチミド溶液を用いて同様の操作を実施し、各アミノグルテチミド溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を求めた。図６にその対応関係を示す。アミノグルテチミドの量の増加に伴って、実施例２同様にアロマターゼの阻害が強くなり、生成するエストラジオール量が少なくなり、酵素免疫測定法でのシグナル量が増加していることが判る。
【発明の効果】
本発明により、放射性化合物を用いることなく、簡便・迅速に効率よくアロマターゼ活性を測定することができる。また本発明により、放射性化学物質を用いることなく、簡便・迅速にかつ効率的に多数の化学物質のアロマターゼ阻害活性の評価を実施することができる。本発明はこれらの簡便・迅速性より、特にアロマターゼを標的とする薬剤および撹乱化学物質の評価に好適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で包含する競合法（抗体を固定化）の酵素免疫測定法での測定原理を模式的に示す。
【図２】本発明で包含する競合法（生成物−蛋白質架橋複合体）の酵素免疫測定法での測定原理を模式的に示す。
【図３】本発明で阻害剤をスクリーニングする際に得られるドーズレスポンスカーブのモデルを模式的に示す。
【図４】本発明で包含する表面プラズモン共鳴法、水晶振動法での測定原理（生成物特異的抗体を固定化する場合）を模式的に示す。
【図５】実施例１での、ヒトアロマターゼの各濃度系列と得られる吸光度の関係を示す。
【図６】実施例２での、各αナフトフラボン溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係をを示す。
【図７】実施例３での、各アミノグルテチミド溶液濃度と４５０ｎｍでの吸光度の関係を示す。
【図８】本発明で包含する表面プラズモン共鳴法、水晶振動法での測定原理（生成物−蛋白質を固定化する場合）を模式的に示す。

Claims (20)

1. アロマターゼの活性を測定する方法であって、アロマターゼを作用させた後、生じた生成物を免疫化学的手法により測定することを特徴とするアロマターゼ活性の測定方法。
2. アロマターゼ活性を測定する際に、評価すべき化学物質を同時に共存させ、生じる生成物量の変化を免疫化学的手法により測定し、評価すべき化学物質の効果を評価することを特徴とする測定方法。
3. 免疫学的手法が、生成物を特異的に認識する抗体を利用することを特徴とする請求項１、２の測定方法。
4. 生成物を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法から少なくとも一つの手法を利用することを特徴とする、請求項１〜３の測定方法。
5. 基質が、アンドロジェンに類別されるものであることを特徴とする請求項１〜４の測定方法。
6. アロマターゼ活性測定に使用する基質がテストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオン、７−エトキシ−３−シアノクマリン、７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ベンジロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、ジベンジルフルオレセイン、７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリンであることを特徴とする請求項１〜５の測定方法。
7. アロマターゼ反応の間あるいはアロマターゼ反応後、アロマターゼが固定化されることを特徴とする、請求項１〜６の方法。
8. アロマターゼ反応終了後、アロマターゼとその他のアロマターゼ反応組成物とが分離されることを特徴とする請求項１〜７の方法。
9. アロマターゼ反応後、アロマターゼの活性を抑制するために、加熱処理あるいは阻害剤を添加することを特徴とする請求項１〜８の方法。
10. 抗体が魚類・両性類・鳥類・爬虫類、哺乳類由来のポリクローナル抗体あるいは、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３〜９の方法。
11. アロマターゼが貝類・軟体動物・魚類・両性類・鳥類・爬虫類・哺乳類由来であることを特徴とする請求項１〜１０の方法。
12. アロマターゼが遺伝子組換えで生産されていることを特徴とする請求項１〜１１の方法。
13. 抗体が固定化されていることを特徴とする請求項１〜１２の方法。
14. アロマターゼ反応に必要なニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（以下ＮＡＤＰＨとも記載）を補完する再生系をアロマターゼ反応時に共存させることを特徴とする、請求項１〜１３の方法。
15. アロマターゼ反応に必要なＮＡＤＰＨを補完する再生系が、グルコース６リン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素を含むことを特徴とする、請求項１〜１４の方法。
16. アロマターゼ反応の基質が、抗体による免疫反応に実質的に影響を及ぼさない濃度に調節されていることを特徴とする、請求項１〜１５の方法。
17. 次に示す（１）〜（３）を含む試薬組成物であって、アロマターゼが、ある物質が意図している作用効果に及ぼす影響の度合いを測定する為の試薬組成物。
    （１）アロマターゼ
    （２）ある物質が、アロマターゼによって作用を受け、生じた生成物を、特異的に認識する抗体
    （３）（２）に記載の抗体を用いて、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、微量示差熱測定法、水晶振動共鳴法のいずれか１つの方法による測定を可能にする試薬組成物。
18. 特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化プレートあるいは特異抗体固定化（生成物架橋結合蛋白質）金薄膜チップ、特異抗体（生成物架橋結合蛋白質）固定化水晶振動子チップ、反応用緩衝液、特異抗体液、抗体試料希釈液、標準品、標識量を定量するための酵素基質液などから適宜選択される組成物を構成パーツとするキットであって、アロマターゼが、ある物質が意図している作用効果に及ぼす影響の度合いを測定する為のキット。
19. 非ステロイド性化学物質を評価対象とする請求項２〜１７の方法。
20. アロマターゼ反応時のアンドロジェン性の基質濃度が０．０５ｎＭ〜５００μＭであることを特徴とする請求項２〜１９の方法。

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