JP4732837B2 - 測定器、マイクロリアクター、及びマイクロリアクターシステム、及び測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、圧電材料を利用した測定器、マイクロリアクター、マイクロリアクターシステム、及び測定方法に関し、特に異常蛋白質と結合する化合物の探索に用いるものに関する。

近年、ヒトゲノム（ヒトの遺伝子情報）の解析が終了し、異常な遺伝子構造が生成する異常蛋白質と病気との関係解明が進められつつある。この関係の解明により、新薬の開発手法が、開発者の薬剤や化合物に対する経験と勘を頼りに行う既存手法から、異常蛋白質に直接作用する化合物を探索して新薬とする手法へと変化している。この手法の採用により、２０年近く必要としていた新薬開発の期間が、今後５年程度に短縮すると見込まれている。

新薬候補の化合物の探索には、異常蛋白質と新薬候補の化合物との物理的な結合量を指標として用いるのが一般的である。結合量の測定方法としては、以前は、酵素、発光物質、放射性同位元素などの標識物質を結合させた化合物を用い、この化合物と異常蛋白を結合させた後、標識物質の量を測定することで、結合した化合物を定量していたが、現在では、標識物質を用いずに測定を行う方法が注目されている。

そこで、従来例として反応器を用いた測定方法を示す。反応器とは、半導体やガラス、樹脂などで構成されたチップの中に導入路と廃液路を形成し、その間に反応槽を設けたデバイスである。反応槽には、予め異常蛋白質を固定したセンサが設置される。このように構成された反応器において、導入路から化合物を含む被測定試料液を流し込むと、被測定試料液中の化合物が反応槽に予め設置された異常蛋白質と反応し、反応後の廃液が廃液路から排出される。なお、反応槽で予め固定されている物質はリガンドと呼ばれ、溶液として供給される物質はアナライトと呼ばれるため、以下ではこの用語を用いる。

反応槽においては、被測定試料液中のアナライトのうちあるものはリガンドと結合してセンサに固定される。アナライトとリガンドの反応が平衡状態に達すると（即ち、センサに固定されるアナライトの量と、センサから離れるアナライトの量が等しくなると）、リガンドに固定されているアナライトの量が一定量となる。この量が新薬開発に必要なデータとなる。このような反応器に関する技術としては、次のようなものがある。センサに圧電振動子（特に水晶振動子）の振動を利用し、圧電振動子表面に接する試料の粘性や振動子に付着した微少な質量を測定する技術である。詳細に説明すると、圧電振動子の両面に形成した電極に交流電圧を印加すると、圧電振動子の材料特性および形状から決定される特定の周波数で共振する。そこで、圧電振動子の電極に物質が付着すると、付着した質量に応じて振動子全体の共振周波数が変化する。この変化を検出することで、電極に付着した物質の質量を測定するという技術である。

しかし、このような質量計測手段では、特定の物質の検出はできないため、特定の物質のみを吸着もしくは捕獲する手段を所定位置に固定し、特定の物質のみを検出する構成が用いられている。一例を挙げると、蛋白質の検出に抗原抗体反応を用いる技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このような構成をセンサに利用すると、ある特定の測定対象物質の微小な質量を測定することが可能となる。また、従来例で示した反応器と同時に、ひとつのチップ基板内にバルブ、送液流路、液体の導入口、排出口を作りこんだものが、マイクロリアクターと呼ばれている。
特開２０００−３３８０２２号公報

従来は、アナライトとリガンドの結合反応を測定する場合、リガンドを反応槽内のセンサに固定する必要があった。これは、反応の検知に圧電振動子の振動を利用して、その周波数変化から微少な質量変化を測定するセンサを用いるため、アナライトを反応槽に供給したときに、その流れによりアナライトと共にリガンドが反応槽から流れ出てしまっては、リガンドとアナライトの結合量を測定することができないためである。

しかし、リガンドを反応槽内部に固定すると、リガンドの三次元的な自由な動きが阻害される。従来例では、リガンドとアナライトが反応するときに、リガンドの自由な変形を可能にするために、リガンドに標識物質を修飾しない方法がとられたが、従来の方法では、未だ、固定によるリガンドの自由度拘束が発生するので、新薬開発を目的とした測定には、満足のいく結果が得られないという課題があった。

そこで、本発明の目的は、反応槽内でリガンドを固定することなくアナライトとの結合量が測定できるようにすることである。

本発明は、ゲル物質が充填された反応槽内に、まず、リガントを流し、リガントを流している間の周波数変化を前記反応槽内に設けた水晶振動子の発振周波数測定により測定し、次いでリガントを流した後に引き続きアナライトを含有する試料溶液を前記反応槽内に流して同様の発振周波数の周波数変化を測定することによって、リガントとアナライトの移動速度の違いから生じる前記発振周波数の変化分（差分値）から、アナライトがリガントに捕獲される捕獲量を測定することを特徴とする測定器、マイクロリアクター、マイクロリアクターシステム、及び測定方法を提供することによって上記課題を解決するものである。

本発明によると、反応槽内でリガンドを固定することなくアナライトとの結合量が測定することができる。

(実施の形態の概要)
センサが形成された反応槽内５００にゲル５０１が充填されており、このゲル５０１内を流れるリガンド５０２とアナライト５０３の移動速度の違いを利用してリガンド５０２の反応質量を特定する。
(実施の形態の詳細)
以下、本発明について図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。
（実施の形態１）
図１は、本発明の反応器１０００の構成を説明する図であり、図１（ａ）は反応器１０００の模式的平面図、図１（ｂ）は反応器１０００の断面図（図１（ａ）中Ａ−Ａ’断面）、図１（ｃ）は反応器１０００内に試料を送液する構成を示す説明図である。反応器１０００は、蛋白質等の生体分子の相互作用を分析すること、具体的にはリガンド５０２にアナライト５０３を結合させてその結合反応状態を検知するためのものである。

反応器１０００は、圧電材料基板１００と流路底面基板１０１と流路基板２００を接合して構成している。まず、圧電材料基板１００について述べる。圧電材料基板１００は水晶振動子からなり、その両面には、検出電極６０１と対向電極６０２が設けられている。次に、流路基板２００には、溝が形成され、溝内に設けられた貫通穴である液導入口２０２と液排出口２０３が設けられている。これら圧電材料基板１００と流路底面基板１０１と流路基板２００とが一体化し、反応器１０００となり、溝部分が反応槽５００を形成する。この反応槽部にゲル５０１が充填されている。

圧電材料基板１００上に形成された検出電極６０１は液排出口２０３近傍にあり、反応槽５００は液導入口２０２から検出電極６０１に至る長手形状を有している。なお、図では電極に繋がる配線などは図示していない。

反応槽５００のサイズは長手方向に３０〜５０ｍｍ程度、幅が１０ｍｍ程度である。検出電極６０１のサイズは直径６ｍｍ程度である。

ここで、液導入口２０２に接続したポンプ９０２により、液導入口２０２にリガンド５０２やアナライト５０３を流入すると、反応槽５００を経て、液排出口２０３を経由して廃液タンク８００に液を流すことができる。すなわち、リガンド５０２やアナライト５０３は反応槽５００内のゲル５０１を通過して液排出口２０３にたどり着くことになる。

ここで、圧電材料基板１００に設けられた検出電極６０１は、圧電材料基板１００の発振周波数の変化からゲル５０１内に存在する物質の物理量として質量を計測している。本実施の形態では、圧電材料基板１００に水晶振動子を用いたため、検出方式としてＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）センサが形成されており、より詳しくは上記水晶振動子とこの水晶振動子の電極を介して接続され、前記水晶振動子の発振周波数を検出する周波数測定部（図示せず。）からなっている。

以上、説明したように、本発明に係わる測定器は、上記に述べた反応器とＱＣＭセンサと後述する捕獲量演算部からなるものである。

次に、本実施の形態の反応器１０００を用いた分析方法について図４のフローチャートに基づいて説明する。図２は分析時の反応器内の模式図である。図３は分析時に測定される圧電材料基板１００の発振周波数の時間変化を表すグラフである。本発明の分析においては、リガンド５０２がアナライト５０３よりも小さい必要がある。この理由は後に説明する。被測定試料にはリガンド５０２とアナライト５０３の区別はないので、分析時において、分子相互作用を調べたい分子の小さい方をリガンド５０２、大きい分子をアナライト５０３として、分析操作を行えばよい。以下に分析に係わる測定方法を説明する。

先ず本実施の形態の反応器１０００にリガンド５０２を液導入口２０２より送液する（図４、ステップＳ１）。図２（ａ）に示すようにリガンド５０２は検出電極６０１に向かって、ゲル５０１内を進む。この時点では図３（ａ）に示すように周波数ｆには変化が見られない。このまま継続してリガンド５０２を流し続けるとリガンド５０２がゲル５０１内を流れて検出電極６０１に達する。この時点で圧電材料基板１００の発振周波数が減少し始め、図２（ｂ）に示すように、リガンド５０２が液排出口２０３にまで到達すると、発振周波数は一定状態となり変化しなくなる（図３（ｂ））。

この状態で、リガンド５０２の送液を停止し、アナライト５０３を液導入口２０２より送液する（図４、ステップＳ２）。すると、図２（ｃ）に示すように、アナライト５０３はリガンド５０２が導入されたゲル５０１内を流れ始める。この時点では、圧電材料基板１００の発振周波数ｆは変化しない（図３（ｃ））。

ここで、反応槽５００内において、リガンド５０２とアナライト５０３の流れ方に違いが生じるので、以下にそれを説明する。本実施の形態に用いるリガンド５０２はアナライト５０３よりも分子サイズが小さいものを用いている。ゲル５０１内を蛋白等の分子が進むときに、小さい分子ほどブラウン運動の影響を受けやすく、ゲル５０１のポリマーの網にトラップされやすい。すなわち、本実施の形態では、小さい分子であるリガンド５０２がゲル５０１内を流れる速度よりも、大きい分子であるアナライト５０３が流れる速度の方が大きいので、後から送液したアナライト５０３がゲル５０１内部でリガンド５０２を追い越す流れが発生する。

そこで、図２（ｄ）に示すように、アナライト５０３が検出電極６０１に達するときには、リガンド５０２と混合した状態となる。このとき図３（ｄ）に示すように、周波数ｆはアナライト５０３に反応して大きく減少する。また、リガンド５０２とアナライト５０３が混合したときに、相互作用反応が生じ、お互いに結合する。

次に、アナライト５０３の送液を停止し、緩衝液５０４を液導入口２０２より送液する（図４、ステップＳ３）。すると、緩衝液５０４に押されることにより、アナライト５０３がリガンド５０２よりも先にゲル５０１内を流れ終わるため、図２（ｅ）に示すようにゲル５０１内のアナライト５０３量が減少していく。それに合わせて圧電材料基板１００の発振周波数ｆが上昇する（図３（ｅ））。ここで、リガンド５０２と結合しているアナライト５０３は、リガンド５０２を持って液排出口２０３より流れ出ていく。すなわち、図２（ｆ）に示すようにゲル５０１内に残るリガンド５０２の量は、アナライト５０３を導入する前の状態よりも、アナライト５０３と結合したリガンド５０２の分が、少なくなっている。この状態を図３（ｆ）に示す。最初にリガンド５０２を送液した時点の周波数ｆ１、アナライト５０３が全て反応槽５００内から排出された時点の周波数ｆ２とすると、ｆ２からｆ１を引いた値Δｆが、アナライト５０３と結合したリガンド５０２の量ということになる。そこで、Δｆの計算を行い、ＱＣＭに用いられるSauerbreyの式にΔｆを代入することによりアナライト５０３と結合したリガンド５０２の質量を求める（図４、ステップＳ４）。この質量は図示しない捕獲量演算部にて演算し算出される。

また、緩衝液５０４を流し続けると、図２（ｇ）に示すようにリガンド５０２も全て液排出口２０３に流れ出て、図３（ｇ）に示すように圧電材料基板１００の発振周波数は、リガンド５０２を送液する前の周波数に復帰する。この結果より、リガンド５０２が固定されること無くアナライト５０３と反応したことが把握できる。

本実施の形態においては、ゲル５０１に蛋白分子と非特異吸着が少ないポリアクリルアミドおよびその誘導体ゲルまたは、ポリビニル系ゲルを用いた。

また、本実施の形態では検出電極６０１が反応槽５００内にむき出しとなっており、リガンド５０２やアナライト５０３と直接接触する構造であった。実は、本実施の形態のように直接接触している場合、リガンドやアナライトの分子構造によっては、検出電極材と非特異吸着を起こすことがある。例えば、検出電極材に金を用いて、アナライトにエンドトキシンのようなＳ−Ｓ結合を含むものを用いると、金と硫黄でチオール結合する。このような現象を防ぐために、反応槽５００内でむき出しになっている検出電極６０１を含めた圧電基板材料１００の全面を、リガンドやアナライトと非特異吸着を起こさず、しかも絶縁材料である樹脂またはシリコン酸化膜で覆う方が望ましい。絶縁性の樹脂としてはＭＰＣポリマーが適す。

本実施の形態の反応器１０００を用いて、異常蛋白質と新薬候補の化合物との物理的な結合量の測定を行った結果、新薬開発時に指標となるための十分なデータを得ることができた。
（実施の形態２）
図５（ａ）に本実施の形態２のマイクロリアクター２０００の模式的平面図、図５（ｂ）にその断面図（図５（ａ）中Ｂ−Ｂ’断面）がそれぞれ示されている。なお、前述した実施の形態１と同様の記述は省略する。

マイクロリアクター２０００は、圧電材料基板２１００と流路基板２２２０ａ、流路底面基板２２２０ｂが積層された構成となっている。各々の部材について説明すると、圧電材料基板２１００は流路底面基板２２２０ｂに接続され、微細な凹部と貫通穴が形成された流路基板２２２０ａと積層して一体化することによって、反応が行われる反応槽２２２３と、リガンド５０２を供給するリガンド供給路２２２５ａと、緩衝液５０４を供給する緩衝液供給路２２２６と、アナライト５０３を供給するアナライト供給路２２２５ｂと、液排出口２２０３ａに至る廃液路２２２７とが設けられている。具体的には、緩衝液供給路２２２６が反応槽２２２３に接続される手前の部分で、リガンド供給路２２２５ａとアナライト供給路２２２５ｂが緩衝液供給路２２２６に接続されている。

なお、圧電材料基板２１００と流路基板２２２０ａと流路底面基板２２２０ｂを一体化して反応槽２２２３を形成する構成は、前述の実施の形態１とほぼ同様の構成である。そして、この反応槽２２２３内部にゲル２５０１が充填されている。

リガンド供給路２２２５ａの端部にはリガンド供給口２２０２ａが設けられている。同様に、緩衝液供給路２２２６の端部には緩衝液供給口２２０２ｃ、アナライト供給路２２２５ｂの端部にはアナライト供給口２２０２ｂが設けられている。各供給口は実施の形態１と同様に、それぞれ送液を行うポンプに接続されているが図示はしていない。また、液排出口２２０３ａに接続された廃液タンクも図示はしていない。

リガンド液供給路２２２５ａには、緩衝液供給路２２２６との接続部の上流側にバルブ２２１２ａが設けられている。また、アナライト液供給路２２２５ｂには、緩衝液供給路２２２６との接続部の上流側にバルブ２２１２ｂが設けられている。そして、緩衝液供給路２２２６には、リガンド液供給路２２２５ａとアナライト液供給路２２２５ｂの接続部の上流側にバルブ２２１２ｃが設けられている。

次にマイクロリアクター２０００を用いたマイクロリアクターシステム３５００の構成について、図６の構成図を利用して説明する。まず、マイクロリアクター２０００をステージ３５１０上に設置する。ステージ３５１０にはコンタクトピン３５１１が固定されており、マイクロリアクター２０００を設置すると、コンタクトピン３５１１は圧電材料基板２１００の検出電極２６０１および対向電極２６０２からの配線と一定圧力下で接触し、電気的導通を得る。

また、ステージ３５１０に設置されたマイクロリアクター２０００のリガンド供給口２２０２ａ、アナライト供給口２２０２ｂおよび緩衝液供給口２２０２ｃのそれぞれには、送液ポンプ３５０１が一機ずつ、計３機が接続されている。また、バルブ２２１２直上にはバルブの開閉を行うリニアアクチュエータ３５３０が配置されている。液排出口２２０３ａには廃液タンク３５０２が接続されている。

さらに、コンタクトピン３５１１、リニアアクチュエータ３５３０、送液ポンプ３５０１に、制御回路３５５０が接続された構成となっている。

マイクロリアクターシステム３５００の送液について説明する。まず、各供給口に接続された送液ポンプ３５０１により、リガンド、アナライトもしくは緩衝液を一定流量で供給する。リアクター内を流れる液はバルブ２２１２により送液制御される。バルブ２２１２の開閉動作を行うのは、バルブ２２１２直上に配置されたリニアアクチュエータ３５３０である。バルブ２２１２は弾性変形する変形部を有し、これをリニアアクチュエータ３５３０で押圧すると、変形部が流路を遮断する。変形部は弾性変形するため、押圧が解除されれば変形しなくなり、流路が開通することになる（図７参照）。

このため、リアクター外部からの圧力（変位）を与えるだけで、バルブの開閉を行うことができる。リアクター内の液は液排出口２２０３ａから排出され、液排出口２２０３ａに接続された廃液タンク３５０２に蓄積される。このような送液制御と、所定のタイミングでのセンサによる検出動作を制御回路３５５０が全て行う。

このマイクロリアクターシステム３５００を用いた本発明の分析方法について、図８フローチャートを参照して具体的に説明する。

まず、バルブ２２１２ｃを開き、緩衝液供給口２２０２ｃに接続されたポンプを駆動させて、緩衝液５０４を流路に送液する（図８、ステップＳ１）。そして、マイクロリアクター２０００の流路と反応槽５００内を緩衝液５０４で満たす。（図８、ステップＳ２）。次に、バルブ２２１２ｃを閉じて、バルブ２２１２ａを開き、リガンド供給口２２０２ａに接続されたポンプを駆動させて、リガンド５０２を流路に送液する（図８、ステップＳ３）。そして、リガンド５０２が反応槽５００内のゲル２５０１を通過して廃液路２２２７に出てきたことを確認する（図８、ステップＳ４）。この確認方法は圧電材料基板の発振周波数の変化（減少）が収まったことで確認する。そして、このときの周波数ｆ１を記録する（図８、ステップＳ５）。

次に、バルブ２２１２ａを閉じて、バルブ２２１２ｂを開き、アナライト供給口２２０２ｂに接続されたポンプを駆動させて、アナライト５０３を流路に送液する（図８、ステップＳ６）。そして、圧電材料基板の発振周波数をモニタして、アナライト５０３が検出電極２６０１に達して、周波数の減少が始まった時点でバルブ２２１２ｂを閉じて、バルブ２２１２ｃを開き、緩衝液供給口２２０２ｃに接続されたポンプを駆動させて、緩衝液５０４を送液する（図８、ステップＳ７）。次に、圧電材料基板の発振周波数の変化のモニタを続けて、発振周波数の上昇が止まった時点の周波数ｆ２を記録する（図８、ステップＳ８）。発振周波数ｆ１とｆ２の差Δｆを求めて、Sauerbreyの式に代入してリガンド５０２の結合重量を求める（図８、ステップＳ９）。

なお、分析条件の一例としては、反応に用いられるリガンド５０２の量が約１００μｌ、アナライト５０３の量も約１００μｌである。

本実施の形態においても、ゲル５０１に蛋白分子と非特異吸着が少ないポリアクリルアミドおよびその誘導体ゲルまたは、ポリビニル系ゲルを用いている。

上記の本実施形態のマイクロリアクター２０００およびマイクロリアクターシステム３５００を用いると、リガンドを固定することなくアナライトと自由に反応させることができるため、自然な状態での反応を評価することが可能となる。そして、新薬開発時に指標となるための十分なデータを得ることができる。

本発明の一実施形態に係る反応器の構造を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係わる分析時の反応器内の模式図である。 本発明の一実施形態に係る分析時に測定される圧電材料基板の発振周波数の時間変化を表すグラフである。 本発明の一実施形態に係る分析方法を示すフローチャートである。 本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターの構造を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターシステムの構成図である。 本発明に係るマイクロリアクタチップのバルブ動作を示す断面図である。 本発明の一実施形態に係るマイクロリアクターシステムを用いた分析方法を示すフローチャートである。

符号の説明

１０００ 反応器
５０２ リガンド
５０３ アナライト
１００ 圧電材料基板
１０１ 流路底面基板
２００ 流路基板
６０１ 検出電極
６０２ 対向電極
２０２ 液導入口
２０３ 液排出口
５００ 反応槽
５０１ ゲル
９０２ ポンプ
８００ 廃液タンク
２０００ マイクロリアクター
２１００ 圧電材料基板
２２２０ａ 流路基板
２２２０ｂ 流路底面基板
２２２３ 反応槽
２２２５ａ リガンド供給路
５０４ 緩衝液
２２２６ 緩衝液供給路
２２２５ｂ アナライト供給路
２２０３ａ 液排出口
２２２７ 廃液路
２５０１ ゲル
２２０２ａ リガンド供給口
２２０２ｃ 緩衝液供給口
２２０２ｂ アナライト供給口
２２１２ａ バルブ
２２１２ｂ バルブ
２２１２ｃ バルブ
３５００ マイクロリアクターシステム
３５１０ ステージ
３５１１ コンタクトピン
２１００ 圧電材料基板
２６０１ 検出電極
２６０２ 対向電極
３５０１ 送液ポンプ
２２１２ バルブ
３５３０ リニアアクチュエータ
３５０２ 廃液タンク
３５５０ 制御回路

Claims (10)

1. 試料溶液中に含有される第２の物質が特定の第１の物質に吸着して捕獲される捕獲量を測定する測定器において、
   前記測定試料が流入する流入口と流入した前記測定試料を流出する流出口とが設けられ、ゲル状の物質が充填された反応槽と、
   前記反応槽内部に設けられた圧電振動子と該圧電振動子に接続されて前記圧電振動子の発振周波数を測定する周波数測定部とからなるセンサと、
   前記第１の物質を、前記反応槽の前記ゲル状の物質内に流して前記ゲル状の物質に浮遊させたときに前記センサにより得られる第１の前記発振周波数と、前記第１の物質を流した後に前記第２の物質を、前記第１の物質が浮遊する前記反応槽の前記ゲル状の物質内に流して前記センサにより得られる第２の前記発振周波数との差分値を測定し、測定した前記差分値を用いて前記捕獲量を算出する捕獲量演算部とからなることを特徴とする測定器。
2. 前記ゲル状の物質は、ポリアクリルアミドゲルおよびポリアクリルアミド誘導体ゲル、または、ポリビニル系ゲルであることを特徴とする特徴とする請求項１に記載の測定器。
3. 前記圧電振動子は、水晶振動子であることを特徴とする請求項１に記載の測定器。
4. 前記圧電振動子は、樹脂またはシリコン酸化膜で覆われていることを特徴とする、請求項１または３に記載の測定器。
5. 前記第１の物質がリガンドであり、前記第２の物質がアナライトであることを特徴とする請求項１に記載の測定器。
6. 前記捕獲量は、質量であることを特徴とする請求項１に記載の測定器。
7. 前記反応槽は、溝を形成した第１の平面状基板と前記溝を覆う第２の平面状基板との貼り合わせによりなることを特徴とする請求項１に記載の測定器。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定器と、前記流入口と前記流出口のうちの少なくともいずれかに連通する流路と、流路中に設けられて前記試料溶液の流れを開閉するバルブとからなることを特徴とするマイクロリアクター。
9. 請求項８に記載のマイクロリアクターと、前記流路を介して前記反応槽に送液するポンプ手段と、前記バルブの開閉を行うアクチュエータと、前記センサと前記捕獲量演算部と前記ポンプ手段と前記アクチュエータとをそれぞれ制御する制御手段と、からなることを特徴とするマイクロリアクターシステム。
10. ゲル状の物質が充填された反応槽を流れる試料溶液中に含有される第２の物質が特定の第１の物質に吸着して捕獲される捕獲量を前記反応槽内に設置した水晶振動子の発振周波数測定により測定する測定方法において、
    前記第１の物質を前記反応槽内に流して前記ゲル状の物質に浮遊させ、前記センサにより第１の前記発振周波数を測定するステップと、
    前記第１の物質を流して前記ゲル状の物質に浮遊させた後に引き続き、前記第２の物質を前記反応槽内に流して前記センサにより第２の前記発振周波数を測定するステップと、
    得られた前記第１の発振周波数と前記第２の発振周波数との差分値に基づいて、前記捕獲量を算出するステップとからなることを特徴とする測定方法。

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