CN105164532B - 用于确定同分异构分析物的方法和试剂 - Google Patents

用于确定同分异构分析物的方法和试剂 Download PDF

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Abstract

方法包括确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的量。确定第一测量值和第二测量值。所述第一测量值代表所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的总量。所述第二测量值仅代表所述第二同分异构分析物的量。从所述第一测量值减去所述第二测量值，以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中第一同分异构体分析物的量。

Description

用于确定同分异构分析物的方法和试剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月28日提交的非临时性申请美国序列号13/780,305在35U.S.C. 119(e)下的权益，在此将其全部内容通过引用明确并入本文。
背景技术
本发明涉及用于在怀疑含有同分异构分析物的样品中确定两种或更多种同分异构分析物的每种的存在和/或量的组合物、方法和试剂盒。
许多小分子化合物或半抗原，例如药物和维生素，以同分异构形式存在，其中只有一种形式是活性的。为了获得分析物的活性形式的准确测量，必须解决该分析物的非活性同分异构体的存在。取决于该分析物的活性形式的功能，测量分析物的两种同分异构形式(即活性形式和非活性形式)可导致可能对个体不利的不准确性。准确地评估生物样品中一对同分异构分析物的每种的水平是重要的，尤其当仅一种同分异构体是活性的，并且包含非活性同分异构体的量的测量扭曲了样品中分析物的水平。例如，测量生物样品中的维生素D水平是重要的，因为维生素D缺乏与哺乳动物中许多病症有关。在婴儿中，例如，包含3-差向异构体的量的维生素D测量可导致婴儿中维生素D水平的不准确评估，这进而可导致缺乏合适的补充。测量维生素D的活性形式是重要的，以使婴儿可以接受合适的维生素D治疗(如有必要)。
术语“维生素D”表示一类脂溶性开环甾类化合物。在人体中，维生素D是独特的，因为它可作为胆钙化甾醇(维生素D3)或麦角钙化甾醇(维生素D2)被摄取，以及因为人体也可以在日照充足时(由胆甾醇)合成维生素D。由于此后一性能，一些人认为维生素D是非必要膳食维生素，但大多数人认为它是必要营养素。维生素D在钙离子体内平衡的正调节中具有重要的生理作用。维生素D3是由动物合成的维生素形式。维生素D2也是乳制品和某些食品中添加的常见补充剂。
膳食和体内合成的维生素D3二者都必须经历代谢活化来产生生物活性代谢物。在人体中，维生素D3活化的初始步骤主要在肝脏中发生并涉及羟基化以形成中间代谢物25-羟基胆钙化甾醇(也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟基胆钙化甾醇或25-羟基维生素D3)。钙二醇是维生素D3在循环系统中的主要形式。维生素D2也经历类似的代谢活化，成为25-羟基维生素D2。这些化合物共同地被称作25-羟基维生素D(缩写为25(OH)D)，并且它们是在血清中测量以确定维生素D状态的主要代谢物；25(OH)D及其差向异构体二者都为需要被转化成1,25(OH)D以发挥生物作用的预激素。1,25(OH)D的生物活性与3-差向-1,25(OH)D的生物活性的比较是复杂的。
维生素D化合物25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2在3-位是差向异构的，所述差向异构体分别被命名为25-羟基维生素D3和3-差向-25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2和3-差向-25-羟基维生素D2。只有这些差向异构化合物的每种的一种差向异构体，即分别是25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2是活性的。25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的差向异构体的结构在图1中阐述。
存在用于准确和灵敏地确定怀疑含有这样的分析物的样品中的同分异构分析物的浓度的试剂和方法的需要。例如，存在用于准确和灵敏地确定维生素D的差向异构形式的浓度的试剂和方法的需要。
概述
根据本文描述的原理的一些实例涉及确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的量的方法。在所述方法中，确定第一测量值和第二测量值。为了确定所述第一测量值，通过使用第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的总量，所述第一抗体对所述第一同分异构分析物与所述第二同分异构分析物的每种展示出足够的测定结合亲合力。为了确定所述第二测量值，通过使用所述第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第二同分异构分析物的量，其中过量使用结合至所述第一同分异构分析物但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力且对所述第二同分异构分析物基本无测定结合亲合力的第二抗体，以阻挡所述第一同分异构分析物结合至所述第一抗体。使所述第二测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构分析物的量。从所述第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
根据本文描述的原理的一些实例涉及确定样品中第一同分异构体分析物和第二同分异构分析物的量的方法。在所述方法中，确定第一测量值和第二测量值。为了确定所述第一测量值，通过使用第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的总量，所述第一抗体对所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的每种具有至少约107升/摩尔(liters/mole)的结合亲合力。为了确定所述第二测量值，通过使用所述第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第二同分异构分析物的量，以获得第二测量值，其中过量使用对所述第一同分异构分析物具有约106至约1012升/摩尔的结合亲合力以及对所述第二同分异构分析物具有小于约104升/摩尔的结合亲合力的第二抗体，以阻挡所述第一同分异构分析物结合至所述第一抗体。使所述第二测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构分析物的量，并且从所述第一测量值减去所述第二测量值以得到所得值，使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
附图说明
图1是25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的差向异构形式的化学式的描述。
图2是描述按照根据本文描述的原理的实例，加入和不加入第二抗体的3-差向-25-羟基维生素D3的维生素D测量的曲线图。
图3是描述按照根据本文描述的原理的实例，加入和不加入第二抗体的3-差向-25-羟基维生素D3的维生素D测量的曲线图。
具体实施方案的详细说明
常规讨论
根据本文描述的原理的方法使分析物的两种同分异构体的一种的交叉反应性(cross-reactivity)最小化并测量其量，其中一种同分异构体或它的代谢产物是有效的，而另一种同分异构体或它的代谢产物是无效的。术语“有效的”表示分析物关于具体功能的活性的程度，所述具体功能可以是例如生物功能，例如骨骼代谢。例如，物质的生物活性与所述物质增强或抑制例如保持受试者中的矿物质和盐的适当水平、细胞功能的生物功能的能力有关。通过说明而非限制的方式，维生素D保持受试者中与钙稳态和骨骼代谢有关的钙与磷酸盐的适当水平。
方法包括确定样品中第一同分异构分析物与第二同分异构分析物的量。确定第一测量值和第二测量值。所述第一测量值代表所述第一同分异构分析物与所述第二同分异构分析物的总量。所述第二测量值仅代表所述第二同分异构分析物的量。从所述第一测量值减去所述第二测量值，以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
在根据本文描述的原理的方法中，使用至少两部分待分析的样品。使用结合至所述分析物的两种同分异构形式的抗体(第一抗体)在怀疑含有分析物的至少两种同分异构形式的样品的第一部分上进行测定。所述第一抗体对所述第一同分异构分析物与所述第二同分异构分析物的每种展示足够的测定结合亲合力。
短语“测定结合亲合力”表示抗体结合至相应的分析物以产生结合至分析物的抗体的复合物的强度。
短语“足够的测定结合亲合力”表示抗体对分析物的结合亲合力是产生足以获得导致准确和灵敏测定分析物的测定信号的量的可检测复合物的结合亲合力。所述第一抗体的结合亲合力足够强以形成所述第一抗体与第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的每种的可检测复合物，一旦测定系统和仪器已经经过合适的校准且已采用了任何对所述同分异构分析物之一或二者的抗体识别的校正因子，则可检测复合物准确地代表样品中所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的量。在所述样品的第一部分上的该测定测量样品中分析物的两种同分异构形式的量或浓度。
使用结合至所述分析物的两种同分异构形式的第一抗体和结合至所述同分异构形式之一(第一同分异构形式​​)但对另一种同分异构形式(第二同分异构形式)基本不展示结合亲合力，使得所述第二同分异构形式在所述第二部分上进行的测定中免于被所述第一抗体检测的第二抗体二者在相同样品的第二部分上进行相同的测定。所述结合至所述第一同分异构形式​​但不结合至所述第二同分异构形式的第二抗体对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力。在一些实例中，所述结合至同分异构形式之一但不结合至另一种同分异构形式的第二抗体结合至活性同分异构形式但不结合至非活性同分异构形式。在所述样品的第二部分上的所述测定仅测量所述分析物的同分异构形式的一种，即上述中的第二同分异构分析物的浓度。可以使用获得的信号值确定总的分析物浓度和所述分析物的两种同分异构形式的每种的浓度。
短语“不足的测定结合亲合力”表示所述第二抗体对同分异构分析物的结合亲合力小于所述第一抗体对同分异构分析物的结合亲合力。在一些实例中，短语“不足的测定结合亲合力”表示所述第二抗体对同分异构分析物的结合亲合力不大至足够在所述第二抗体与所述第一同分异构分析物之间形成可检测复合物，从而任何可检测复合物都不会准确地代表所述第一同分异构分析物的量。当过量使用时，所述第二抗体展示出对所述第一同分异构分析物的足够的结合亲合力，以阻挡在所述样品的第二部分上的测定中所述第一抗体结合至所述第一同分异构分析物。所述第二抗体对所述分析物的第一同分异构形式的结合亲合力太低，以至不会产生第二抗体和第一同分异构分析物的复合物，使得在采用的测定中产生用于准确检测所述第一同分异构分析物的足够的信号。
对于所述第二同分异构形式的短语“基本不展示结合亲合力”表示在所述第二抗体与所述分析物的第二同分异构形式之间基本不形成可检测复合物。
应该注意的是，如果来自所述样品的第二部分上的测定的结果基本等于零，则从所述样品的第一部分上的测定获得的结果代表所述分析物的两种同分异构形式的仅一种的浓度，因为未在所述样品的第二部分上的测定中检测到所述分析物的另一种同分异构形式。在这样的情况下，无需在考虑中的所述样品的两个部分上进行测定，因为来自根据本文描述的原理的方法的结果表明只有一种所述分析物的同分异构形式对在所述样品的第一部分上的测定中获得的信号作出贡献。另一方面，如果来自所述样品的第二部分上的测定的结果基本不等于零，则从所述样品的第一部分上的测定获得的结果代表所述分析物的两种同分异构形式的浓度，因为在所述样品的第二部分上的测定中检测到所述分析物的另一种同分异构形式。在这样的情况下，需要在考虑中的所述样品的两个部分上进行测定，因为来自根据本文描述的原理的方法的结果表明所述分析物的两种同分异构形式对在所述样品的第一部分上的测定中获得的信号都作出贡献。
抗体的制备
通过说明而非限制的方式描述根据本文描述的原理制备抗体的方法的实例。需要至少两种不同的抗体，所述抗体具有根据本文描述的原理的性能。一种抗体对所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物二者都展示出足够的测定结合亲合力。另一种抗体结合至所述第一同分异构分析物，但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力，且对所述第二同分异构分析物基本不展示出测定结合亲合力。
在根据本文描述的原理的一些实例中，足够的测定结合亲合力为例如至少约107升/摩尔，或者至少约108升/摩尔，或者至少约109升/摩尔，或者至少约1010升/摩尔，或者至少约1011升/摩尔，或者至少约1012升/摩尔，或者至少约1013升/摩尔，或者至少约1014升/摩尔，并且可检测复合物的量足以获得导致准确和灵敏测定所述分析物的测定信号。在根据本文描述的原理的一些实例中，足够的测定结合亲合力为例如约107至约1014升/摩尔，或约107至约1011升/摩尔，或约107至约1012升/摩尔，或约108至约1014升/摩尔，或约108至约1011升/摩尔，或约108至约1012升/摩尔。
在一些实例中，不足的测定结合亲合力表示所述第二抗体对第一同分异构分析物的结合亲合力小于所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力。在一些实例中，取决于所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力，所述第二抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力比所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力小例如约10、或约102、或约103、或约104、或约105倍。例如，如果所述第一种抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力是约109升/摩尔，则所述第二抗体的结合亲合力可以小于约107升/摩尔，或小于约106升/摩尔。在根据本文描述的原理的一些实例中，不足的测定结合亲合力表示抗体对分析物的结合亲合力为例如约106至约108升/摩尔，或约106至约107升/摩尔，取决于所述抗体的性质和所述分析物的性质。
在一些实例中，基本无结合亲合力表示抗体对同分异构分析物具有例如小于约104升/摩尔，或小于约103升/摩尔，或小于约102升/摩尔，或小于约10升/摩尔的结合亲合力。
在以上讨论中，结合亲合力是特异性结合亲合力，这涉及与基本较不识别其它分子相比，相对于另一个，特异性识别两种不同分子之一。另一方面，非特异性结合涉及分子之间的非共价结合，其相对来说与特异性表面结构无关。非特异性结合可以由若干因素，包括分子间的疏水相互作用产生。
所述抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各种分类和同型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可以包括Fab、Fv和F(ab')2、Fab'等。此外，可以在适当时使用免疫球蛋白或它们的片段的聚集物、聚合物和共轭物，只要保持对特定分子的结合亲合力。
可以通过本领域中公知的技术，例如制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白(体细胞杂交技术)来制备单克隆抗体。可以根据Köhler和Milstein，Nature 265:495-497,1975的标准技术来生产单克隆抗体。单克隆抗体技术的综述记载在LymphocyteHybridomas，Melchers 等人编辑，Springer-Verlag (New York 1978)，Nature 266: 495(1977)，Science 208: 692 (1980)和Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46(1981)中。
在用于制备抗体的另一方法中，可以从染色体DNA切除对抗体结合位点的序列编码，并插入到克隆载体中，其可以在细菌中表达，以产生具有相应的抗体结合位点的重组蛋白。该方法包括克隆和表达核苷酸序列或至少编码特异性结合天然抗体所需的氨基酸序列的其诱变处理形式。
在用于生产单克隆抗体的一个方法中，第一步骤包括用抗原(例如用免疫原)使产生抗体的动物，例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊或牛免疫。免疫可在使用或不使用佐剂下进行，所述佐剂例如完全弗氏佐剂或其它佐剂，例如单磷酰脂质A和合成的海藻糖dicorynomycolate佐剂。下一步骤包括将脾细胞与产生抗体的动物分离，并例如通过使用聚乙二醇或其它技术使所述产生抗体的脾细胞与适当的融合配偶体，通常是骨髓瘤细胞融合。通常，所用的骨髓瘤细胞是通常在次黄嘌呤-胸苷(HT)培养基中生长但不能在次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基中生长，用于选择融合细胞的那些。下一步骤包括选择融合细胞，通常通过在HAT培养基中选择。下一步骤包括使用免疫测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或其它适于筛选的免疫测定来筛选用于产生适当的抗体的克隆杂交体。
术语“免疫原性载体”表示当共轭至半抗原和被注射到哺乳动物中或另外用作免疫原时，引起免疫反应和导致产生结合至所述半抗原的抗体的基团或部分。免疫原性载体有时也被称为抗原载体。在根据本文描述的原理的一些实例中，合成了包含免疫原性载体，其包括聚(氨基酸)和非聚(氨基酸)免疫原性载体，在特定的位置连接至免疫抑制剂化合物的免疫原并用于制备抗体。半抗原是能够特异性地结合至相应抗体，但它们本身不充当用于制备所述抗体的免疫原(或抗原)的化合物。因此，将半抗原连接至用于产生抗体的免疫原性载体。
免疫原性载体的聚(氨基酸)的分子量范围(以道尔顿计)为例如约5,000至约10,000,000或约20,000至约600,000或约25,000至约250,000的分子量。聚(氨基酸)免疫原性载体包括蛋白质，例如，白蛋白、血清蛋白，如球蛋白、眼晶状体蛋白和脂蛋白。说明性的蛋白质包括但不限于例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵卵清蛋白和牛γ球蛋白(BGG)。非聚(氨基酸)免疫原性载体包括多糖、核酸和颗粒物(生物材料和合成材料)。各种免疫原性载体公开在Davalian等人的美国专利号5,089,390，第4栏第57行至第5栏第5行中，其通过引用并入本文中。
如上所述，所述免疫原性载体可以是多糖，所述多糖是单糖的高分子量聚合物，其可以被天然或合成制备并通常包括单糖的重复冷凝。多糖的实例是淀粉、糖原、纤维素、糖胶，如阿拉伯树胶、琼脂等。所述多糖还可含有聚(氨基酸)残基和/或脂质残基。
如上所述，在根据本文描述的原理的一些实例中，所述免疫原性载体可以通过连接基团在分析物的预定位置上被连接至分析物类似物。在一些实例中，所述连接基团可以包含约2至约50个原子或4至约30个原子(不计氢)，并且可以包含2至约30个原子、或3至约20个原子的链，每种独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷组成的组。部分或全部的所述连接基团可以是被连接至所述免疫抑制剂化合物的分子的一部分，例如但不限于，例如聚(氨基酸)上的氨基酸残基。在一些实例中，所述连接基团包含肟官能团。
连接基团中的杂原子的数目可以为0至约20、或1至约15、或约2至约10。所述连接基团可以是脂族或芳族的。当存在杂原子时，氧通常作为被连接至碳、硫、氮或磷的氧代或氧化存在，氮通常作为通常被连接至碳、氧、硫或磷的硝基、亚硝基或氨基存在；硫与氧相似；而磷通常作为膦酸单或二酯和磷酸单或二酯被连接至碳、硫、氧或氮。在连接基团和待共轭的分子之间形成共价键的常见官能团为烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮、硫醚和羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。包含杂原子的连接基团的一个具体实施方案是如上所述的肟官能团。
在大多数情况下，当连接基团具有连接官能团(用于与基团反应的官能团)，例如，包含氮和硫类似物的非氧代羰基基团、磷酸酯基团、氨基基团，烷基化剂例如卤化烷基或甲苯磺酰基烷基，氧化(羟基或硫类似物、巯基)氧代羰基(例如，醛或酮)，或活性烯烃例如乙烯基砜或α-、β-不饱和酯时，这些官能团被连接至胺基基团、羧基基团、活性烯烃、烷基化剂，例如溴乙酰基。当连接胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸时，形成酰胺、脒和磷酰胺。当连接硫醇和活性烯烃时，形成硫醚。当连接硫醇和烷基化剂时，形成硫醚。当在还原条件下连接醛和胺时，形成烷基胺。当连接酮或醛和羟胺(包括其衍生物，其中取代基取代羟基基团的氢)时，形成肟官能团(=N-O-)。当连接羧酸或磷酸和醇时，形成酯。各种连接基团是本领域公知的；参见，例如J. Biol. Chem. (1970) 245:3059。
每种不同的抗体由于对如上所述的两种同分异构分析物的一种或二者的它的结合亲合力被选择。因此，制备并通过适当的筛选方法来选择第一抗体，使得所述第一抗体对所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的每种展示出足够的测定结合亲合力。制备并通过适当的筛选方法来选择第二抗体，使得所述第二抗体连接至所述第一同分异构分析物，但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力，并进一步对所述第二同分异构分析物基本不展示出测定结合亲合力。可以通过公知的筛选方法选择对如上所述的分析物具有必要的结合亲合力的抗体，所述方法包括，通过说明而非限制的方式，例如ELISA、斑点杂交、Western分析和表面等离子体共振。
测定的一般描述
以下讨论通过说明而非限制的方式。可以在根据本文描述的原理的确定中涉及的所述样品的部分上使用任何使用抗体的合适的测定。所述测定可以在不分离(均质)或分离(非均质)任何测定组分或产物下进行。非均质测定通常包括一个或多个分离步骤，并且可以是竞争性的或非竞争性的。所述测定可以是手动的或自动的。
所述待分析的样品是怀疑含有分析物的样品。所述样品可以是生物样品或非生物样品。生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是，例如，人类或其它动物物种。生物样品包括生物体液，例如全血、血清、血浆(plasma)、痰、淋巴液、精液、阴道粘液、排泄物、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊液、泪液、粘液等；生物组织，例如头发、皮肤、来自器官或其它躯体部分的切片或切除组织；等等。在许多情况下，所述样品是全血、血浆或血清。非生物样品包括但不限于，例如废物流，其也可以使用根据本文所述的原理的化合物进行分析。
可以在任何适宜的培养基中制备样品，所述培养基可以是例如，测定培养基，其在下文中更充分地讨论。在一些情况下，可以对样品例如溶解血细胞施加预处理。在一些实例中，这样的预处理在不干扰随后的测定的培养基中进行。
在许多实施方案中，免疫测定涉及标记试剂。涉及标记试剂的免疫测定包括例如化学发光免疫测定、酶免疫测定、荧光偏振免疫测定、放射免疫测定、抑制测定、诱导发光测定和荧光氧通道测定。
一种常用的免疫测定组包括使用有限浓度的测定试剂之一的免疫测定。另一免疫测定组包括使用过量的一种或多种主要试剂。另一免疫测定组是无分离均质测定，其中当根据本文描述的原理的一种抗体结合至所述样品中两种同分异构分析物之一或二者时，标记试剂调节标记物信号。
如上所述，所述测定可以在不分离(均质)或分离(非均质)任何测定组分或产物下进行。均质免疫测定由以下示例：公开在Rubenstein等人的美国专利号3,817,837，第3栏，第6行至第6栏，第64行中的EMIT®测定(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,Deerfield, IL)；在美国专利号5,340,716(Ullman等人)中公开的诱导发光免疫测定(“LOCI®技术”)；例如在Ullman等人的美国专利号3,996,345，第17栏，第59行至第 23栏，第25行中公开的那些免疫荧光方法；例如在Maggio等人的美国专利号4,233,402，第6栏，第25行至第9栏，第63行中公开的那些酶通道免疫测定(“ECIA”)；例如尤其如美国专利号5,354,693中公开的荧光偏振免疫测定(“FPIA”)；酶免疫测定例如酶联免疫吸附测定(“ELISA”)。非均质测定的示例是放射免疫测定，其公开在Yalow等人的J. Clin. Invest.39:1157 (1960)中。以上公开内容全部通过引用并入本文中。
其它的酶免疫测定例如是由Ngo和Lenhoff，FEBS Lett. (1980)116：285-288)讨论的酶调节介导免疫测定(“EMMIA”)；由Oellerich，J(Clin. Chem. Clin. Biochem.(1984) 22:895-904)公开的底物标记荧光免疫测定(“SLFIA”)；由Khanna等人的Clin.Chem. Acta (1989) 185:231-240)公开的联合酶给体免疫测定(combined enzyme donorimmunoassay)(“CEDIA”)；均质颗粒标记免疫测定，例如颗粒增强的比浊抑制免疫测定(“PETINIA”)和颗粒增强的比浊免疫测定(“PETIA”)等。
其它测定包括溶胶颗粒免疫测定(“SPIA”)、分散染料免疫测定(“DIA”)；金属免疫测定(“MIA”)；酶膜免疫测定(“EMIA”)； 发光免疫测定(“LIA”)​​；等等。其它测定类型包括涉及当结合分析物时监测试剂在光学、声学和电学性能的变化的免疫传感器测定。这样的测定包括，例如，光学免疫传感器测定、声学免疫传感器测定、半导体免疫传感器测定、电化学换能器免疫传感器测定、电位型免疫传感器测定和电流型电极测定。
非均质测定通常包括一个或多个分离步骤，并且可以是竞争性的或非竞争性的。各种竞争性和非竞争性非均质测定形式公开在Davalian等人的美国专利号5,089,390，第14栏，第25行至第15栏，第9行中，其通过引用并入本文。在竞争性非均质测定的实例中，具有与之结合的分析物抗体的载体与含有怀疑含有所述分析物的样品和包含标记物的分析物类似物的培养基接触。样品中的分析物与标记分析物类似物竞争，以结合至分析物抗体。将所述载体和所述培养基分离后，通过常规技术确定所述载体或所述培养基的标记物活性并且所述标记物活性与样品中的分析物的量有关。在上述竞争性非均质测定的变体中，所述载体包含分析物类似物，其与所述样品的分析物竞争以结合至根据本文描述的原理的抗体试剂。
在一些实例中，待分析的样品经过预处理以从内源性结合物质，例如结合所述分析物的血浆或血清蛋白中释放分析物。从内源性结合物质中释放所述分析物可以例如通过加入消化剂或释放剂或按顺序使用的消化剂和释放剂的组合进行。所述消化剂是分解所述内源性结合物质使它们不再能结合所述分析物的消化剂。这样的试剂包括但不限于蛋白酶K，和蛋白酶K及蛋白变性剂，例如洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠)。通过说明而不是限制的方式，用于从内源性结合物质释放所述分析物的释放剂包括酸性变性剂，例如水杨酸、杀鼠灵、磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、苯胺萘磺酸(ANS)(包括，例如1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)和8-苯胺基萘-1-磺酸(8-ANS))、水杨酸和上述的衍生物。
用于进行所述消化或释放作用的条件，例如持续时间、温度、pH和培养基中释放剂的浓度取决于例如所述分析物的性质、所述内源性结合物质的性质、所述样品的性质以及所述释放剂的性质。通常，条件足以实现所需的效果或功能。在根据本文描述的原理的一些实例中，释放剂的有效浓度为约0.01至约20 mg/mL，或约0.01至约10 mg/mL，或约0.01至约5 mg/mL，或约0.1至约20 mg/mL，或约0.1至约10 mg/mL，或约0.1至约5 mg/mL，或约0.1至约1 mg/mL。预处理样品以从内源性结合物质释放所述分析物可以在进行测定之前作为单独的步骤或在测定中作为第一步骤进行。在这两者任一种的情况下，可能需要一种或多种试剂来停止消化剂和/或释放剂的作用。
用于根据本文所述的原理在样品的部分上进行测定的条件包括在通常提供最佳的测定灵敏度的适度的pH下在水性缓冲培养基中进行所述测定。水性培养基可以仅仅为水，或可以包含0.1至约40体积%的助溶剂。所述培养基的pH将为例如约4至约11，或约5至约10，或约6.5至约9.5。所述pH将通常是任何特异性结合对的结合成员的最佳结合，所述测定的其它试剂，例如信号产生系统成员的最佳pH等之间的折衷。各种缓冲剂可以用于获得所需的pH和在所述测定期间维持pH。通过说明而非限制的方式，说明性的缓冲剂包括例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、TRIS、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。所使用的具体缓冲剂并非关键，但在单独的测定中可以优选一种或另一种缓冲剂。
可以在所述测定方法中使用各种辅助材料。例如，除了缓冲剂之外，所述培养基还可以包含所用培养基和试剂的稳定剂。在一些实施方案中，除了这些添加剂之外，还可以包含蛋白质，例如白蛋白；有机溶剂，例如，甲酰胺；季铵盐；聚阴离子，例如硫酸葡聚糖；结合增强剂，例如聚亚烷基二醇；多糖，例如葡聚糖或海藻糖。所述培养基还可以包含用于防止形成血块的试剂。这样的试剂是本领域中公知的，并且包括但不限于例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐、肝磷脂。所述培养基还可以包含一种或多种防腐剂，例如，但不限于例如叠氮化钠、硫酸新霉素、PROCLIN®300、链霉素。所述培养基还可以包含一种或多种表面活性剂。如果使用，任何上述材料以足以获得所需的效果或功能的浓度或量存在。
可以以一个或多个时间间隔(包括在包含上述的那些试剂的测定中加入使用的各种试剂之间的任何时间间隔)将一个或多个培养周期施加于所述培养基。通常在足以发生所述试剂的各种组分的结合以及所述样品中分析物的结合的温度和时间下培养所述培养基。通常使用适度的温度进行所述方法，并且测量期间通常为恒温，优选室温。在一些实例中，培养温度例如为约5℃至约99℃，或约15℃至约70℃，或约20℃至约45℃。在一些实例中，所述培养的时间周期例如为约0.2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1分钟至约15分钟。所述时间周期取决于所述培养基的温度和各种试剂的结合速率，所述结合速率由缔合速率常数、浓度、结合常数和离解速率常数决定。
本文所讨论的许多测定使用信号产生系统，所述系统可具有一种或多种组分，至少一种组分是标记物。所述信号产生系统产生与样品中分析物的存在有关的信号。所述信号产生系统包含产生可测量的信号所需的所有试剂。所述信号产生系统的其它组分可以包含在显影液中，并且可以包括但不限于例如底物、增强剂、活化剂、化学发光化合物、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子以及结合信号产生物质所需的特异性结合物质。所述信号产生系统的其它组分可以是例如辅酶、与酶产物反应的物质、其它酶和催化剂。所述信号产生系统提供可通过外部手段，通过使用电磁辐射，理想地通过目测检测的信号。示例性的信号产生系统在美国专利号5,508,178中描述，其相关公开内容通过引用并入本文中。
术语“标记物”包括聚(氨基酸)标记物和非聚(氨基酸)标记物。术语“聚(氨基酸)标记物部分”包括属于蛋白质的标记物，例如但不限于例如酶、抗体、肽和免疫原。对于标记物蛋白质，例如酶，分子量范围将为约10,000至约600,000，或约10,000至约300,000分子量。例如，每约200,000分子量的蛋白质通常存在至少一种根据本文描述的原理的化合物(类似物基团)，或每约150,000分子量至少约1种化合物，或每约100,000分子量至少约1种化合物，或每约50,000的分子量至少约1种化合物。在酶的情况下，类似物基团的数目通常为1至约20，约2至约15，约3至约12，或约6至约10。
通过说明而不是限制的方式，酶包括氧化还原酶，例如脱氢酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶；涉及过氧化氢的产生和过氧化氢的使用以将染料前体氧化为染料的酶，例如辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶；水解酶，例如碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶；萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；转移酶；酶的组合，例如但不限于糖氧化酶，例如葡萄糖和半乳糖氧化酶，或杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与使用过氧化氢氧化染料前体的酶，即例如辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶的过氧化物酶偶合。
术语“非-聚(氨基酸)标记物”包括非蛋白质的那些标记物。所述非聚(氨基酸)标记物能够直接被检测或可通过产生可检测信号的反应检测。所述非聚(氨基酸)标记物可以是同位素的或非同位素的，并且通过说明而非限制的方式，可以是例如放射性同位素、发光化合物(其包括但不限于例如荧光化合物和化学发光化合物)、催化剂、促进剂、染料、辅酶、酶底物、放射性基团和可扩增的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在一些实例中，所述信号产生系统的一个成员是有机小分子，其表示具有约200至约2,000，或约200至约1,500，或约200至约1,000，或约200至约500分子量的分子。这样的有机小分子包括但不限于例如生物素、荧光分子(例如荧光素和罗丹明)、化学发光分子和二硝基苯酚。有机小分子的结合配偶体是特异性地识别并结合至所述小分子的分子。小分子的结合配偶体由所述小分子的性质限定，并且包括但不限于，例如抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、有机小分子的抗体(其包括但不限于荧光分子的抗体(例如荧光素抗体和罗丹明抗体)、化学发光分子的抗体、二硝基苯酚的抗体)。
在一些测定的实例中，使用载体。所述载体可以由有机或无机的、固体或液体的水不溶性材料组成，并且其可以是透明的或部分透明的。所述载体可具有若干形状的任一种，例如但不限于颗粒(颗粒状载体)，其包括珠粒、薄膜、膜、管、井、条、棒、纤维或平坦表面，例如板或纸。所述载体可以或可以不在其中使用它的培养基中悬浮。可悬浮载体的实例是聚合物材料，例如胶乳、脂双层或脂质体、油滴、细胞和水凝胶以及磁性颗粒。其它载体组合物包括聚合物，通过说明而非限制的方式，例如硝化纤维素、醋酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)，例如每种可以单独使用或与其它材料结合使用。所述载体可以用或可以不用例如染料、催化剂或其它可检测基团进一步标记。
在一些实例中，所述载体可以是颗粒。所述颗粒具有至少约0.02微米且不大于约100微米的平均直径。在一些实例中，所述颗粒具有约0.05微米至约20微米，或约0.3微米至约10微米的平均直径。所述颗粒可以是有机的或无机的、可溶胀的或非溶胀的、多孔的或非多孔的，优选具有通常为约0.7 g/mL至约1.5 g/mL的接近于水的密度，并且可以由可以是透明的、部分透明的或不透明的材料组成。所述颗粒可以是生物材料，例如细胞和微生物，例如红血球，白血球，淋巴细胞，杂交瘤，链球菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，病毒。所述颗粒也可以是由有机和无机聚合物、脂质体、胶乳颗粒、磁性或非磁性颗粒、磷脂囊泡、乳糜微粒、脂蛋白等组成的颗粒。在一些实例中，所述颗粒是二氧化铬(chrome)颗粒或胶乳颗粒。
化学发光颗粒是已经与化学发光化合物缔合的颗粒。如本文所使用的，短语“与…缔合”表示化合物，例如化学发光化合物和颗粒可以通过例如直接或间接键合、吸附、吸收、并入或溶解来缔合。可以使用的化学发光化合物的实例是美国专利号5,340,716和6,251,581中阐述的那些，其相关的公开内容通过引用并入本文中。在根据本文描述的原理的一些实例中，化学发光化合物是可光活化物质，其直接或由光敏化激发时，或与单线态氧反应时，经过化学反应以形成能够在光(通常在250-1200 nm的波长范围内)发射的同时或随后分解的亚稳态反应产物。术语“可光活化的”包括“可光化学活化的”。在一些实例中，所述化学发光化合物是与单线态氧反应以形成二氧杂环丁烷或二氧杂环丁酮的那些。后者通常是富电子烯烃。这样的富电子烯烃的示例是烯醇醚、烯胺、9-亚烷基-N-烷基-9,10-二氢化吖啶(alkylacridan)、芳基乙烯基醚、二噁烯、芳基咪唑、9-亚烷基-苍耳烷和光泽精。其它化合物包括鲁米诺(luminol)和其它邻苯二甲酰肼，以及受到保护免于经历化学发光反应的化学发光化合物，其借助于通过光化学不稳定保护基团来保护，这样的化合物包括，例如，萤火虫萤光素、水通道蛋白(aquaphorin)和鲁米诺。可以使用的这样的化学发光化合物的实例是美国专利号5,709,994中阐述的那些，其相关公开内容通过引用并入本文中。
敏化剂颗粒是已经与敏化剂化合物缔合的颗粒，其包括但不限于光敏剂化合物。可以使用的敏化剂化合物的实例是美国专利号5,340,716和6,251,581中阐述的那些，其相关公开内容通过引用并入本文中。
光敏剂是通常通过用光激发产生单线态氧的敏化剂。在一些实例中，所述光敏剂比所述化学发光化合物吸收更长的波长且具有比所述化学发光化合物较低的能量三重态。所述光敏剂可以是可光活化的(例如染料和芳族化合物)。所述光敏剂通常是由共价键合的原子组成的化合物，通常具有多个共轭双键或三键。所述化合物应当吸收在200-1100 nm，通常300-1000 nm，优选450-950 nm的波长范围内的光。典型的光敏剂包括但不限于例如丙酮、二苯甲酮、9-噻吨酮、曙红、9,10-二溴蒽、亚甲基蓝、金属卟啉(例如血卟啉)、酞菁、叶绿素、玫瑰红、勃克明斯特富勒烯(buckminsterfullerene)，以及这些化合物的衍生物。其它光敏剂的实例列举在N.J. Turro，"Molecular Photochemistry"，第132页，W. A.Benjamin Inc.，N.Y. 1965中。所述光敏剂有助于其中通过单线态氧活化的光活化。通常，所述光敏剂吸收光并由此形成激发的光敏剂使氧活化以产生与化学发光化合物反应，产生亚稳定发光中间体的单线态氧。
一些已知的测定使用信号产生系统(sps)，其使用第一和第二sps成员。所述sps成员可以是关联的，因为一个sps成员的活化产生产物，例如光或活化产物，其导致另一个sps成员的活化。
在这样的测定的实例中，所述sps成员包括敏化剂，例如光敏剂，以及包括化学发光化合物的化学发光组合物，其中所述敏化剂的活化产生使所述化学发光组合物活化的产物。所述第二sps成员通常产生与结合和/或未结合的sps成员的量，即结合或未结合至正在检测的分析物的sps成员的量有关的可检测信号。在根据本文描述的原理的一些实例中，所述敏化剂试剂或所述化学发光试剂的一种包含根据本文描述的原理的抗体试剂。
根据本文描述的原理的方法的实例
如以上所讨论的，根据本文描述的原理的方法涉及确定样品中第一同分异构分析物与第二同分异构分析物的量。在所述方法中，确定第一测量值和第二测量值。为了确定所述第一测量值，通过使用第一抗体在所述样品的第一部分上进行测定来测量所述第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的总量，所述第一抗体对所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的每种都展示出足够的测定结合亲合力。在所述实例中，所述第一抗体是通过上述过程之一制备的单克隆抗体。
所述样品部分可以在不干扰测定的任何适宜的培养基中制备；通常使用水性培养基。所述样品部分的规模取决于例如同分异构分析物的性质、所述测定的性质、用于进行测定的各种试剂的性质和包含所述分析物的复合物的性质的一个或多个。对测定中所涉及的两种测量，所述样品部分的规模应该基本相同。在一些实例中，所述样品部分的体积为例如约1μL至约100μL，或约2μL至约100μL，或约5μL至约100μL，或约10μL至约100μL，或约1μL至约80μL，或约1μL至约60μL，或约1μL至约40μL，或约1μL至约20μL，或约5μL至约50μL，或约10μL至约50μL。
在第一样品部分上进行所选择的确定第一测量值的测定，可以如上文讨论的对所述第一样品部分进行预处理以从内源性结合物质中释放分析物。通过测量由复合物产生的信号水平来测量包含分析物的第一抗体和第一和第二同分异构分析物的复合物的量。观察到的信号与所述样品中结合的第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的总量有关。
为了确定第二测量值，通过使用第一抗体在所述样品的第二部分上进行所述测定来测量所述第二同分异构分析物的量，并且所述测定培养基还包含结合至所述第一同分异构分析物但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力且对所述第二同分异构分析物基本无测定结合亲合力的第二抗体。可以如上文讨论的对所述第二样品部分进行预处理以从内源性结合物质中释放分析物。或者，可以在将所述部分用于根据本文描述的原理的方法中之前对所述样品进行预处理。在所述实例中，所述第二抗体是通过上述过程之一制备的单克隆抗体。在包含所述样品的第二部分的测定培养基中相对于所述第一抗体过量地使用所述第二抗体，以阻挡所述第一同分异构分析物结合至所述第一抗体。过量是大于结合可能存在于所述样品中的所述第一同分异构分析物的大部分所需的所述第一抗体的量的量。使用的第二抗体的量取决于例如所述第二抗体的性质、所述第一抗体的性质、所述同分异构分析物的性质、所述测定培养基的性质和所述测定的性质。在根据本文描述的原理的一些实例中，所述第二抗体的过量是例如所述第一抗体的量的约5至约200倍，或约5至约150倍，或约5至约100倍，或约5至约50倍，或约10至约200倍，或约10至约150倍，或约10至约100倍，或约10至约50倍，或约20至约200倍，或约20至约150倍，或约20至约100倍，或约20至约50倍。通过测量由所述复合物产生的信号的水平来测量包含所述分析物的所述第一抗体和所述第二同分异构分析物的复合物的量。观察到的信号与所述样品中的所述第二同分异构分析物的量有关。从所述第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
如上文更充分讨论的，可以使用任何合适的测定。所述测定包括添加用于确定所述样品中的分析物的浓度的试剂。所述试剂至少包括第一抗体和第二抗体，并且因此所述测定是免疫测定。在所述样品部分上进行的测定可以在单独的反应容器中依次或同时进行或在对每个样品部分相同的反应容器中依次进行。术语“复合物”表示其中所述分析物的抗体结合至所述样品中的分析物的复合物。
如上所述，所述同分异构分析物的测量可以在已经用释放剂处理过的样品上进行。添加至所述样品中的释放剂的量是足以从内源性结合物质置换基本全部同分异构分析物的量。短语“置换基本全部由内源性结合物质结合的同分异构分析物”表示从内源性结合物质置换的同分异构分析物是至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少99%，或至少99.5%，或至少99.9%或100%，并且在测定期间可用于检测。
加入释放剂之后，在从内源性结合物质置换基本全部同分异构分析物的条件下将所述样品培养一段时间。所述培养的时间长度和条件取决于例如所述释放剂的性质、所述分析物的性质和所述分析物的疑似浓度的一个或多个。在一些实施方案中，该步骤的培养温度可以是例如约5℃至约99℃，或约15℃至约70℃，或约20℃至约45℃。所述培养的时间段为例如约0.2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1至约15分钟。所述培养可以在培养基，为方便起见，可以是如本文所讨论的测定培养基中进行，但不是必须的。
根据本文描述的原理的一个具体实例涉及在怀疑含有所述分析物的样品的第一和第二部分上使用以下测定试剂的方法：(i)根据本文描述的原理的抗体试剂，(ii)包含分析物类似物的化学发光颗粒试剂，和(iii) 包含小分子结合部分或小分子的结合配偶体的光敏剂颗粒试剂。
在下面的具体实例中，通过说明而非限制的方式，所述同分异构分析物是维生素D的非差向和差向形式。可以使用诱导发光免疫测定。所述诱导发光免疫测定在美国专利号5,340,716(Ullman)中提及，其公开内容通过应用并入本文中。在一种方法中，所述测定使用已经与光敏剂缔合的颗粒，其中维生素D类似物结合至所述颗粒(颗粒-类似物试剂)。对于在怀疑含有维生素D分析物的非差向和差向形式二者的样品的第一部分上的测定，化学发光试剂包含对所述维生素D分析物的非差向和差向形式的每种展示出足够的测定结合亲合力的第一抗体。对在所述样品的第二部分上的测定，所述包含第一抗体的化学发光试剂与第二抗体一起使用，所述第二抗体结合至所述维生素D分析物的非差向形式，但对所述维生素D分析物的非差向形式展示出不足的测定结合亲合力且对所述维生素D分析物的差向形式基本无测定结合亲合力。在上面的实例中，所述第一抗体连接至小分子，所述小分子结合至化学发光颗粒上的小分子的结合配偶体。所述化学发光试剂可以预先形成或原位形成。所述维生素D分析物(非差向和差向形式)与所述颗粒-类似物试剂竞争，以结合至根据本文描述的原理的维生素D的抗体。如果存在维生素D分析物，则与所述化学发光试剂紧密邻近的颗粒-类似物试剂的分子的数目较少。因此，将存在测定信号的减少。当所述两种标记物紧密邻近时，所述光敏剂产生单线态氧并活化所述化学发光试剂。经活化的化学发光试剂随后产生光，其中在分析物存在下观察到信号的减少。产生的光的量与形成的复合物的量有关，这进而对于第一样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的非差向和差向形式二者的量(第一测量值)有关，并且对于第二样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的差向形式的量(第二测量值)有关。从所述第一测量值减去所述第二测量值，得到所述样品中维生素D分析物的非差向形式的量。
在使用维生素D作为实例的诱导发光免疫的另一具体实例中，通过说明而非限制的方式，所述测定使用已经与化学发光化合物缔合的颗粒，其中维生素D类似物结合至所述颗粒(颗粒-类似物试剂)。对于第一样品部分，光敏剂试剂包含对所述维生素D分析物的非差向和差向形式的每种展示出足够的测定结合亲合力的第一抗体，所述第一抗体连接至小分子，所述小分子进而结合至化学发光颗粒上的小分子的结合配偶体。对于第二样品部分，使用所述光敏剂试剂和第二抗体。所述第二抗体结合至所述维生素D分析物的非差向形式，但对所述维生素D分析物的非差向形式展示出不足的测定结合亲合力且对所述维生素D分析物的差向形式基本无测定结合亲合力。对于所述第一样品部分，维生素D分析物的非差向形式和差向形式二者与所述颗粒-类似物试剂竞争，以结合至维生素D的所述第一抗体。如果存在维生素D分析物，则与所述光敏剂试剂紧密邻近的颗粒-类似物试剂的分子的数目较少。因此，将存在测定信号的减少。对于所述第二样品部分，所述维生素D分析物的差向形式与所述颗粒-类似物试剂竞争，以结合至维生素D的所述第一抗体，因为所述维生素D分析物的非差向形式由第二抗体结合。如果存在所述维生素D分析物的差向形式，则与所述光敏剂试剂紧密邻近的颗粒-类似物试剂的分子的数目较少。因此，将存在测定信号的减少。当所述两种标记物紧密邻近时，所述光敏剂产生单线态氧并活化所述颗粒-类似物试剂的化学发光化合物。经活化的化学发光化合物随后产生光，其中在分析物的存在下观察到信号的减少。产生的光的量与形成的复合物的量有关，这进而对于第一样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的非差向和差向形式二者的量(第一测量值)有关，并且对于第二样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的差向形式的量(第二测量值)有关。从所述第一测量值减去所述第二测量值，得到所述样品中的维生素D分析物的非差向形式的量。
在使用维生素D的诱导发光测定的另一具体实例中，通过说明而不是限制的方式，使用共轭至小分子的结合配偶体的光敏剂颗粒，例如，抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(其是生物素的结合配偶体)。使用根据本文描述的原理的包含连接至结合至维生素D分析物的非差向异构和差向异构形式二者的第一抗体的生物素的抗体试剂。化学发光试剂用作部分检测体系。培养所述第一样品部分或所述第二样品部分的反应培养基(视情况而定)，以允许光敏剂颗粒的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素凭借抗生物素蛋白和生物素之间的结合而结合至所述抗体试剂的生物素，并且还允许根据本文描述的原理的抗体试剂的第一抗体之间的特异性结合，其现在连接至所述光敏剂颗粒，以结合至所述样品的分析物以及是部分所述化学发光试剂的分析物。然后，用光照射所述培养基，以激发光敏剂，其在它的激发态能够将氧活化到单线态。因为现在由于存在分析物，较少的化学发光试剂与光敏剂紧密邻近，所以存在较少的通过单线态氧的化学发光试剂的活化和较少的发光。然后检查所述培养基以得到发光或发射光的存在和/或量，其存在与所述分析物的存在和/或量有关，其中在分析物的存在下观察到信号的减少。产生的光的量与形成的复合物的量有关，这进而对于第一样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的非差向和差向形式二者的量(第一测量值)有关，并且对于第二样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的差向形式的量(第二测量值)有关。从所述第一测量值减去所述第二测量值，得到所述样品中的维生素D分析物的非差向形式的量。
通过说明而非限制的方式，用于样品中的维生素D的检测的测定形式的另一实例是ACMIA测定形式。对于所述ACMIA测定形式，涂布有维生素D或维生素D类似物的二氧化铬颗粒(二氧化铬颗粒试剂)被用作第一组分。第二种组分是包含根据本文所述的原理的维生素D的抗体的抗体试剂。在所述抗体试剂中，所述抗体通过连接基团连接至报告酶(reporter enzyme) (例如，β-半乳糖苷酶)，以形成抗体-酶共轭物。以过量，即大于结合样品中可能存在的全部维生素D分析物所需的量的量将所述抗体试剂加入到反应容器中。对预先用释放剂进行处理的样品的第一部分用如上所述的第一抗体试剂进行处理，所述第一抗体试剂包含对维生素D分析物的非差向和差向形式的每种展示出足够的测定结合亲合力的抗体；所述抗体结合至所述样品中的维生素D。在所述培养基中将所述抗体-酶共轭物与样品混合，以允许维生素D分析物结合至所述抗体。然后，加入二氧化铬颗粒试剂以结合任何过量的抗体-酶共轭物。然后，施加磁体，所述磁体从悬浮液中吸出所有的二氧化铬颗粒和过量的抗体-酶，并且将上清液转移到最终反应容器。将所述报告酶的底物加入到所述最终反应容器，并且以吸收率随时间变化的形式，用分光光度法测量酶活性。该信号的量与样品中的维生素D的非差向和差向形式二者的量有关。用如上所述的第一抗体试剂和第二抗体处理预先用释放剂进行处理的样品的第二部分，其包含第二抗体，所述第二抗体结合至所述维生素D分析物的非差向形式，但对所述维生素D分析物的非差向形式展示出不足的测定结合亲合力且对所述维生素D的差向形式基本无测定结合亲合力。在所述培养基中将所述抗体-酶共轭物与样品混合，以允许所述维生素D分析物结合至所述抗体。然后，加入二氧化铬颗粒试剂以结合任何过量的抗体-酶共轭物。然后，施加磁体，所述磁体从所述悬浮液中吸出所有的二氧化铬颗粒和过量的抗体-酶，并且将上清液转移到最终反应容器。将所述报告酶的底物加入到所述最终反应容器，并且以吸收率随时间变化的形式，用分光光度法测量酶活性。该信号的量与样品中的维生素D的非差向和差向形式二者的量有关。
用于测定样品中的维生素D的同分异构形式的另一实例(通过说明而不是限制的方式)是使用顺磁性颗粒作为固相的吖啶酯标记物免疫测定(ADVIA免疫测定)。用于该维生素D测定实例的检测系统包括作为小分子共轭物或捕获共轭物的小分子标记的维生素D(捕获部分)，作为固相(SP)的涂布有所述小分子的结合配偶体的顺磁性胶乳颗粒和根据本文描述的原理的吖啶酯标记的维生素D抗体(检测抗体)。所述小分子可以是例如生物素或荧光素，并且各自的结合配偶体可以为抗生蛋白链菌素或荧光素抗体。所述维生素D可直接或通过连接基团连接至所述小分子，所述连接基团例如蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)。患者样品中的维生素D与捕获部分的维生素D竞争，以结合至所述吖啶酯标记的检测抗维生素D抗体。用1,8- ANS对怀疑含有维生素D的样品进行预处理。可以使用根据本文描述的原理的各自抗体和根据随之提供的制造商说明书的Centaur®、Centaur®XP或Centaur®CP设备(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE)在第一和第二样品部分上进行所述测定。
根据本文描述的原理的分析物的测定的另一实例是使用顺磁性颗粒作为固相的吖啶酯标记物免疫测定(ADVIA免疫测定)。用于该同分异构分析物测定实例的检测系统包括根据本文描述的原理的抗体试剂，其中小分子连接至所述分析物的抗体(捕获抗体)作为捕获共轭物、作为固相(SP)的涂布有抗体试剂的小分子的结合配偶体的顺磁性胶乳颗粒和吖啶酯标记的分析物类似物(检测半抗原)。所述吖啶酯标记物可以直接结合至所述分析物以形成所述检测半抗原或可以使用连接基团，其包括例如蛋白质，例如BSA。样品的分析物与吖啶酯标记的检测半抗原竞争，以与抗分析物抗体结合。可以用一种或多种释放剂和消化剂对怀疑含有所述分析物的样品进行预处理。可以使用根据随之提供的制造商说明书的Centaur®、Centaur®XP或Centaur®CP设备(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,Newark DE)在第一和第二样品部分上进行所述测定。在以上吖啶酯测定的变体中，所述小分子可以是例如生物素或荧光素，并且所述小分子的结合配偶体可以分别是例如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素或荧光素抗体。
可以测定的样品中的同分异构分析物的浓度通常为例如约10-5至约10-17 M，或约10-6至约10-14 M。例如所述测定是定性的、半定量的还是定量的(相对于存在于样品中的分析物的量)、具体的检测技术和分析物的预期浓度的考虑通常决定各种试剂的浓度。
测定培养基中各种试剂的浓度将通常由所考虑的分析物的浓度范围、所述测定的性质等决定。然而，每种试剂的最终浓度通常凭经验确定，以最优化考虑范围内测定的灵敏度。即，显著的分析物浓度变化将提供可精确测量的信号差异。例如信号产生系统的性质和所述分析物的性质的考虑通常决定各种试剂的浓度。
如上所述，在培养基中以组合提供所述样品和试剂。尽管加入至所述培养基的顺序可以改变，但对于本文描述的测定形式的一些实施方案将存在一定的优选。最简单的加入顺序当然是同时加入所有的材料，并确定所述测定培养基对信号的影响，如在均质测定中。或者，可以按顺序将每种试剂或试剂组组合。在一些实施方案中，在如上所讨论的各个加入步骤之后，可以包括培养步骤。在非均质测定中，在一个或多个培养步骤之后还可以使用洗涤步骤。
根据本文描述的原理的一些实例涉及确定怀疑含有维生素D的样品中维生素D的两种同分异构形式的一种或二者的存在和量的一种或二者并且可以在本文中被称为“维生素D的测定”的方法。如本文所使用的，关于测定的术语“维生素D”表示25-羟基胆钙化甾醇(也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟胆钙化甾醇或25-羟基维生素D(缩写为25(OH)D)；钙二醇；1,25-二羟基维生素D3(钙三醇；1,25(OH)2D3)；1,25-二羟基维生素D4；1,25-二羟基维生素D5；和1,25-二羟基维生素D6；包括以上所有的代谢物的一种或多种的一种或多种非差向和差向形式。
检验步骤
在测定方法的一个步骤中，检验培养基以验证根据本文描述的原理的含有分析物的一种或多种同分异构形式和分析物的抗体的复合物的存在。一种或两种复合物的存在和/或量指示样品中分析物的一种或多种同分异构形式的存在和/或量。
短语“测量分析物的量”表示定量、半定量和定性测定分析物的一种或多种同分异构形式。定量、半定量和定性的方法及所有其它用于确定分析物的方法被认为是测量所述分析物的量的方法。例如，仅检测怀疑含有所述分析物的样品中的分析物的存在或不存在的方法被认为包括在本发明的范围之内。术语“检测”和确定以及测量的其它常见同义词预期在本发明的范围内。
在许多实施方案中，检验培养基包括检测来自所述培养基的信号。该信号的存在和/或量与样品中的分析物的一种或多种同分异构形式的存在和/或量有关。检测的具体方式取决于信号产生系统的性质。如上所讨论的，存在许多方法，通过该方法产生信号的信号标记物可以产生通过外部装置可检测的信号。信号产生系统的活化取决于信号产生系统成员的性质。
测量期间的温度通常为例如约10℃至约70℃，或约20℃至约45℃，或约20℃至约25℃。在一种方法中，使用已知浓度的维生素D分析物形成标准曲线。也可以使用校准仪和其它对照物。
由任何标记物产生的冷光或光可以以目测、照相、光量测定、分光光度的形式测量，例如通过使用光电倍增管或光电二极管，或通过任何其他适宜的装置来确定其量，这与所述培养基中的分析物的量有关。信号的存在和/或量的检验还包括信号的检测，这通常仅为其中读取信号的步骤。通常使用仪器读取该信号，所述仪器的性质取决于所述信号的性质。所述仪器可以是，但不限于例如分光光度计、荧光计、吸收分光计、光度计和化学光度计(chemiluminometer)。
用于进行测定的包含试剂的试剂盒
可以制备用于在怀疑含有分析物的同分异构形式的样品部分上进行测定的试剂盒。所述试剂盒包含用于在所述样品的各个部分上待进行测定的抗体试剂。因此，一种抗体试剂包含对第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的每种展示出足够的测定结合亲合力的抗体。包含第二抗体，其结合至所述第一同分异构分析物，但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力且对所述第二同分异构分析物基本无测定结合亲合力。所述试剂盒还可以包含用于进行所述测定的其它试剂，其性质取决于具体的测定形式。
试剂可以各种在单独的容器中或各种试剂可以在一个或多个容器中混合，这取决于所述试剂的交叉反应性和稳定性。所述试剂盒还可以包含用于进行测定的其它单独包装的试剂，例如额外的特异性结合对成员、信号产生系统成员和辅助试剂。
试剂盒中各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供显著最优化本发明方法期间需要发生的反应和进一步显著最优化测定灵敏度的试剂浓度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种试剂可以作为干粉，通常是冻干的，包含赋形剂提供，其在溶解时将提供对使用根据本文描述的原理的化合物试剂进行方法或测定具有合适的浓度的试剂溶液。所述试剂盒还可以包括使用包含根据本文描述的原理的化合物试剂的试剂的方法的书面说明书。
如本文所用的名称“第一”和“第二”是完全任意的，并且不意图建议本发明方法中所提及的部分中的任何顺序或排名或加入部分的任何顺序。
如本文所用的短语“至少”表示指定项的数目可以等于或大于列举的数目。如本文所用的短语“约”表示列举的数目可以相差加上或减去10%；例如，“约5”表示4.5至5.5的范围。
通过说明而非限制的方式，下面的讨论涉及根据本文描述的原理的具体实施例；所述具体实施例并不意在限制本公开内容和所附权利要求书的范围。在不脱离本公开内容的精神和范围的基础上，可以设想多种修改和替代组合物、方法和系统。
实施例
除非另外指出，下面的实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich ChemicalCorporation (St. Louis MO)或Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI)。除非另有说明，本文公开的份数和百分数以重量比体积计。
定义：
mg=毫克
g =克(s)
ng =纳克(s)
mL =毫升(s)
μL=微升(s)
μmol =微摩尔
℃ =摄氏度
min=分钟(s)
sec=秒(s)
hr =小时(s)
w/v=重量比体积
v/v=体积比体积
TLC =薄层色谱法
HPLC =高效液相色谱法
EDTA =乙二胺四乙酸
PEG =聚乙二醇
的EtOAc =乙酸乙酯
DMF =二甲基甲酰胺
DMSO =二甲基亚砜
MEOP = 1-甲氧基-2-丙醇
MES = 2-(N-吗啉基)乙磺酸
DI =蒸馏
UPA =超微粒分析仪
LOCI =发光氧通道免疫测定
Ab =抗体。
制备对非差向-维生素D和差向-维生素D二者都展示出足够的测定结合亲合力的 生物素化的第一抗体
将维生素D抗体5H10(来自Bioventix，Farnham，Surrey，UK的羊单克隆抗体)在10mM PO4、300 mM NaCl中的pH 7.0的溶液(0.8毫升，2.63 mg/mL)与43.2μL的NHS-dPEG®4-生物素(Quanta Biodesign Ltd.，Powell OH，料号(part number) 10200)的水性溶液(2.0mg/mL)混合。加入的生物素化试剂的量代表所述生物素化试剂对所述抗体的10倍摩尔挑战。将反应混合物在室温下培养3小时，然后通过加入80μL的0.5M TRIS将反应淬灭。将反应混合物在Amicon® (YM10)设备中进行与pH 7.0的10 mM PO4、300 mM NaCl缓冲交换直至流出物在260 nm的吸光度≤0.03。将抗体溶液(1.04 mL，2.1 mg/mL蛋白质)与10μL的PROCLIN®300和10μL的使用0.2μm ACRODISC®注射器过滤器(Pall Corporation)过滤的新霉素硫酸盐水性溶液(10 mg/mL)混合，并在2-8℃贮存。
EPRM-EDA珠粒的制备
将EPRM珠粒(2000 mg，20.0 mL)加入到40 mL的小瓶。EPRM珠粒通过类似于在美国专利号7,179,660中描述的程序制备，并且化学发光化合物中为含有铕的2-(4-(N,N,二-十四烷基)-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩螯合物。将EDA(800 mg，890μL)与10 mL的MES pH 6缓冲剂(“缓冲剂”)和约4.2 mL的6N HCl混合。所述混合物的pH是，或被调节到约6.9。利用涡流将所述EDA溶液加入到EPRM珠粒并将混合物在室温下摇动15分钟。在15 mL的小瓶中将氰基硼氢化钠(400 mg)与10 mL去离子水混合并且将该组合物加入到来自上述的珠粒混合物。将所述混合物在37℃下摇振18-20小时。将珠粒转移至六个40 mL的离心管中。加入MES缓冲剂使体积达到35 mL，将所述混合物以19,000 rpm离心30分钟。滗析上清液，并用搅拌棒使珠粒再悬浮在2 mL的缓冲剂中，并且加入另外的缓冲剂到35 mL。将混合物在18瓦特的功率下超声处理30秒，使用冰将混合物保持冷却。洗涤/超声处理步骤进行4次，以除去所有活化化学物质。最后的MES缓冲剂离心后，将2mL的含有5% MEOP和0.1% Tween®20的缓冲剂(“第二缓冲剂”)加入到管中用于再悬浮步骤。在超声处理之前加入另外的第二缓冲剂到35mL。将珠粒悬浮液以19,000 rpm离心30分钟。弃去上清液。在各个管中最终超声处理使用12mL的第二缓冲剂，以产生25 mg/mL的稀释液。如在UPA仪器上确定的粒度为277 nm。
以类似于在美国专利号6,153,442和美国专利申请公开号20050118727A中描述的方法的方式制备EPRM发光珠粒(chemibead)，其相关公开内容通过引用并入本文中。所述EPRM发光珠粒包含氨基葡聚糖内层和具有游离醛官能团的葡聚糖醛外层。参见例如，美国专利号5,929,049、7,179,660和7,172,906，其相关公开内容通过引用并入本文。在使用合适的缓冲剂，例如MES的缓冲水性介质中，反应在约0℃至约40℃的温度，约5.5至约7.0，或约6的pH下进行约16至约64小时。通过加入合适的淬灭剂，例如羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)淬灭所述反应，然后洗涤所述颗粒。
在还原性胺化条件下，外部葡聚糖醛层上的醛基与乙二胺反应以形成具有包含亚乙基链和末端胺基的侧链部分的试剂EPRM-EDA。还原性胺化条件包括使用还原剂，例如金属氢化物。反应期间，所述反应在水性介质中在约20℃至约100℃的温度下进行约1小时至约48小时。
25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯(25-OH维生素D2 3-氨基甲酸酯)的合成
在氮气下在室温下在5mL烧瓶中(用箔片覆盖)将购自ChemReagents.com，Sugarland TX的22 mg(55μmol)25-OH维生素D3、100 mg(420μmol)二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1 mL无水乙腈中的100μL三乙胺的混合物搅拌18小时，以制备经活化的25-OH VD3。TLC(EtOAc：己烷= 2:1)显示没有起始材料残留。通过将150 mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)、0.3 mL三乙胺和1 mL DMF加入至10mL烧瓶中制备悬浮液。在搅拌下将含有经活化的25-OH VD3的溶液逐滴加入到CMO悬浮液中，所述搅拌持续另外18小时。施加真空以尽可能除去溶剂(加热浴温度应不超过50℃)。将EtOAc(25 mL)加入到残余物中，用2 mL盐水洗涤三次。将有机相用无水Na2SO4干燥并过滤；使用旋转蒸发仪除去溶剂。干燥后获得粗产物(42mg)并经HPLC纯化。在高真空下干​​燥后获得纯产物(24 mg)。将所述产物溶于1.2 mL的无水DMSO中。将等分试样转移到保持在-70℃的小瓶中。
EPRM-EDA和25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯偶合产生发光珠粒试剂
将25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯(10μL如上所述制备的DMSO 中的等分试样)(0.2mg)加入到2 mL的小瓶。将EDAC(6.8 mg)和SNHS(9.4 mg)以及2.27 mL无水DMSO(3 mg/mL)加入到5 mL的小瓶。将EDAC/SNHS溶液(190μL)与来自上述的2-mL小瓶的内容物(1 mg/mL)混合，以制备经活化的25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯。使混合物在室温下旋转18小时。用3.6 mL去离子水将16%的GAFAC®表面活性剂溶液(GAF Corporation, Wayne NJ)的0.4 mL等分试样(0.15%)稀释至1.6%。
将维生素D3(8.5 mg)和850μL DMSO(10 mg/mL)混合。将2.0 mL(200 mg)EPRM-EDA加入到装有搅拌棒的10 mL圆底烧瓶中(标记为3323-064B)，随后加入400μL(4 mg)的来自上述的维生素D3溶液。在室温下将该混合物搅拌过夜。
将2.0 mL(200 mg)EPRM-EDA(如上所述制备)加入到装有搅拌棒的10 mL圆底烧瓶中，随后在适度的搅拌下加入260μL 1.6%GAFAC®表面活性剂溶液(0.15%)。将504μL无水DMSO加入到小试管中，随后加入如上所述制备的60μL (0.06 mg)经活化的维生素D3-3氨基甲酸酯；并将该混合物加入到EPRM-EDA珠粒混合物。所述珠粒悬浮液的总DMSO含量为20%。将反应容器在室温下搅拌过夜。然后，通过渗滤来洗涤所述珠粒。
每批珠粒与10% MEOP/1% GAFAC®/MES pH6缓冲剂占据20 mL工作体积。用5体积的缓冲剂渗滤该混合物，然后在18-21瓦特下用探针超声波仪进行超声处理，使用冰使混合物保持冷却。所述渗滤/超声处理持续经过50体积，流出物样品以35、40、45和50体积取出。将缓冲剂改变为以10体积使用的LOCI半抗原洗涤缓冲剂(50 mM HEPES、300 mM NaCl、1 mMEDTA、0.01%新霉素硫酸盐、0.1% TRITON 405X和0.15% PROCLIN®300，pH 7.2)。将混合物减少至约7 mL并实施UPA。粒度为3323-064A = 289 nm和3323-064B = 298 nm。确定固体百分数，并用LOCI半抗原洗涤缓冲剂pH7.2使珠粒达到10 mg/mL。产量为160.4 mg。
非差向-维生素D和差向-维生素D的测定
在DIMENSION® Vista®分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Deerfield，IL)上，按照LOCI测定的规程并使用含有不同量的非差向-25-羟基维生素D3和/或3-差向- 25-羟基维生素D3的校准仪溶液进行测定。在本实施例中，所述测定使用如上所述制备的发光珠粒试剂作为化学发光试剂。样品部分与(i)如上所述制备的第一生物素化抗体试剂(第一样品部分)或(ii)第一生物素化抗体和第二抗体(第二样品部分)，然后与发光珠粒试剂反应。对于第二样品部分，所述第二抗体是维生素D抗体10H9(小鼠单克隆抗体，记载于CENTAUR®维生素D测定，Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE中)的溶液(0.8 mL，2.63 mg/mL)；所述第二抗体过量存在(75 μg/mL或5H10抗体的量的100倍)。使所述发光珠粒结合至未被来自样品的分析物占据的单克隆抗体结合位点的片段。随后，将抗生蛋白链菌素偶合的敏化剂珠粒加入到反应混合物中。这导致发光珠粒/敏化珠粒对的形成，其浓度与维生素D的两种形式(第一样品部分)或维生素D的差向形式(第二样品部分)的浓度负相关。当在680 nm发光时，敏化剂珠粒产生单线态氧，该单线态氧扩散进入到与敏化珠粒成对的发光珠粒中，与烯属染料反应，并触发在大约612 nm的化学发光信号，其与分析物浓度负相关。
使用与美国专利号6,153,442、7,022,529、7,229,842和美国专利申请公布号20050118727A中描述的方法类似的方法制备抗生蛋白链菌素-敏化剂珠粒(一种或多种“敏化珠粒”)。所述光敏剂是双(三己基)-硅-叔丁基-酞菁。敏化珠粒试剂的浓度在pH 8.0，含有150 mM NaCl的HEPES缓冲剂中为200 μg/mL。将如上所述制备的EPRM-EDA-25-OH维生素D3颗粒试剂在200 μg/mL的浓度下，在pH 7.2，含有150 mM NaCl和0.1%洗涤剂的HEPES缓冲剂中用作“发光珠粒试剂”。
对于各个样品部分，在时间t =零秒，将20 μL生物素化抗体试剂和20μL水加入到反应容器中。21.6秒后加入12 μL样品，随后加入8 μL水。在t =414.0秒，加入40 μL发光珠粒试剂，并随后加入20 mL水。然后在457.2秒分散敏化珠粒试剂。引发反应时序之后601.2秒进行测量。得到代表维生素D的差向和非差向形式二者的量的第一测量值和仅代表维生素D的差向形式的量的第二测量值。
使用上述测定形式在血清样品上进行测定，所述血清样品被掺入不同量的非差向25-羟基维生素D3(非差向-VD)，但不掺入3-差向-25-羟基维生素D3(3-差向-VD)。进行该组测定以校准仪器和含有或不含有10H9第二抗体的样品。结果总结在下表1中并绘制在图3所示的曲线图中。
结果显示，即使存在过量的10H9第二抗体，所述测定仍检测到一些非差向VD。因此，将必须调整在此仪器系统上在使用10H9第二抗体的其它测定中获得的结果来解释该校准的结果。
使用以上测定形式在血清样品上进行测定，所述血清样品被掺入不同量的非差向VD和3-差向-VD。在有10H9第二抗体(+10H9)和没有10H9第二抗体(-10H9)下都进行所述测定。参照图2和图3中的曲线图获得“预测1”和“预测2”值。所述值是ng/mL；差异= +10H9值与预测1值之间的差异。“掺入量”是掺入样品中的3-差向-VD的量。结果总结在下表2中。
使用表2中的以上数据，如下计算3-差向-VD的校正量；3-差向异构体的预测量列在第二到最后一列中。上表2的每列的解释如下：
第1列：-10H9是在不存在10H9 Ab下测量的25(OH)D(ng/mL)。这代表了25(OH)D的总量(D2 + D3 + 3差向体×交叉反应性)(ng/mL)
第2列：+10H9是在10H9 Ab的存在下测量的25(OH)D(ng/mL)。这代表了被抑制的总25(OH)D(部分D2 +部分D3 + 3差向体×交叉反应性)(ng/mL)
第3列：预测1是如果3-差向异构体不存在于样品中，在10H9 Ab的存在下的25(OH)D的量(部分D2 +部分D3)(ng/mL)
第4列：差异是第2列减第3列 = 3差向体×交叉反应性
第5列：预测2是第4列除以交叉反应性或(3差向体×交叉反应性)/交叉反应性= 3差向体(ng/mL)
第6列：掺入量是有多少3差向异构体被掺入样品中。此列应与第5列进行比较以显示第5列和第6列的结果有多接近。
结果总结于表3中。校正表示从在不存在10H9 Ab下测量的总的25(OH)D(ng/mL)减去测量的3-差向异构体(ng/mL)后计算的25(OH)D(ng/mL)。CXR表示除去3-差向异构体的干扰之后，2反应容器测定的3-差向异构体的交叉反应性。这与上面提到的交叉反应性不同。表2中的交叉反应性是具有3-差向异构体的5H10Ab的交叉反应性。表3中的交叉反应性是从最终的25(OH)D浓度(ng/mL)减去3-差向异构体的浓度后的测定的交叉反应性。
在表3中，第1、2、3、4和5列分别对应于表2中的第1、2、7、4和5列。第6列是校正的，其是没有3-差向异构体的 25(OH)D(ng/mL)。基本上，将校准仪L2-L5的 25(OH)D值(ng/mL)对存在和不存在10H9抗体的25(OH)D值之间的差异(ng/mL)绘图。由该图产生的系数用于通过差异预测非-3-差向异构体25(OH)D值。该结果是因为差异是代表非-3-差向异构体信号的抑制的信号，因为10H9抗体仅结合至非差向异构体。
在此将本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文中，如同每个单独的出版物或专利申请被特别和单独指明通过引用并入本文中一样。
应当理解的是，上述实施例仅举例说明代表本文描述的原理的许多具体实施例的一部分。显然，不脱离以下权利要求限定的范围的基础上，本领域的技术人员可以容易地设想出许多其它方案。
除非另外指出，下面实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich ChemicalCorporation (St. Louis MO)或Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI)。除非另有说明，本文公开的份数和百分数都以重量比体积计。

Claims (17)

1.确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的量的方法，其中所述两种同分异构分析物是差向异构体，所述方法包括：
(a) 通过使用第一抗体在一部分所述样品上进行测定来测量所述第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的总量，以获得第一测量值，所述第一抗体对所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的每种都展示出至少107升/摩尔的结合亲合力；
(b) 通过使用所述第一抗体在一部分所述样品上进行所述测定来测量所述第二同分异构分析物的量，其中使用第二抗体以获得第二测量值，所述第二抗体以106至108升/摩尔的结合亲合力结合所述第一同分异构分析物并且以小于104升/摩尔的结合亲合力结合所述第二同分异构分析物，所述第二抗体的使用量为所述第一抗体的使用量的5至200倍，其中所述第二抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力小于所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力的至少1/10，且其中所述第二抗体结合所述第一同分异构分析物，从而使得所述第一同分异构分析物不能结合至所述第一抗体；和
(c) 使所述第二测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构分析物的量，并从所述第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
2.根据权利要求1的方法，其中所述两种同分异构分析物是25-羟基维生素D3和3-差向-25-羟基维生素D3。
3.根据权利要求1的方法，其中所述测定是均质测定。
4.根据权利要求1的方法，其中所述测定是非均质测定。
5.根据权利要求1的方法，其中所述测定是竞争性测定。
6.根据权利要求1的方法，其中所述测定是非竞争性测定。
7.根据权利要求1的方法，其中所述测定使用包含颗粒的试剂。
8.根据权利要求1的方法，其中所述测定使用包含光敏剂试剂和化学发光颗粒的试剂。
9.根据权利要求8的方法，其中所述光敏剂试剂包含颗粒。
10.确定样品中非差向-25-羟基维生素D3和3-差向-25-羟基维生素D3的量的方法，所述方法包括：
(a) 通过使用第一抗体在一部分所述样品上进行测定来测量非差向-25-羟基维生素D3和3-差向-25-羟基维生素D3的总量，以获得第一测量值，所述第一抗体对非差向-25-羟基维生素D3和3-差向-25-羟基维生素D3的每种都具有 108-1014升/摩尔的结合亲合力；
(b) 通过使用所述第一抗体在一部分所述样品上进行所述测定来测量所述3-差向-25-羟基维生素D3的量，以获得第二测量值，其中以5至200倍于所述第一抗体的量使用第二抗体，所述第二抗体对非差向-25-羟基维生素D3具有106至108升/摩尔的结合亲合力和所述第二抗体对3-差向-25-羟基维生素D3具有小于104升/摩尔的结合亲合力，其中所述第二抗体对非差向-25-羟基维生素D3的结合亲合力小于所述第一抗体对非差向-25-羟基维生素D3的结合亲合力的至少1/10，且其中所述第二抗体结合至非差向-25-羟基维生素D3，从而使得所述非差向-25-羟基维生素D3不能结合至所述第一抗体；和
(c) 使所述第二测量值等同于所述样品中的3-差向-25-羟基维生素D3的量，并从所述第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述非差向-25-羟基维生素D3的量。
11.根据权利要求10的方法，其中所述第一抗体是维生素D单克隆抗体5H10。
12.根据权利要求10的方法，其中所述第二抗体是维生素D单克隆抗体10H9。
13.根据权利要求10的方法，其中所述测定是竞争性均质测定、竞争性非均质测定、非竞争性均质测定或非竞争性非均质测定。
14.根据权利要求10的方法，其中所述测定使用包含颗粒的试剂。
15.根据权利要求10的方法，其中所述测定使用包含光敏剂试剂和化学发光颗粒的试剂。
16.根据权利要求15的方法，其中所述光敏剂试剂包含颗粒。
17.根据权利要求10的方法，其中所述测定是发光氧通道免疫测定。
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