JP6352312B2 - 異性体検体を決定する方法および試薬 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本願は、２０１３年２月２８日に出願された米国特許非仮出願第１３／７８０,３０５号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、異性体検体を含有することが疑われるサンプルにおいて２つまたはそれ以上の異性体検体のそれぞれの存在および／または量を決定するための、組成物、方法およびキットに関する。

例えば、薬物およびビタミンといったような多くの小分子化合物またはハプテンは、異性体形態で存在し、そのうちの１つの形態のみが活性である。検体の活性形態の正確な測定を得るためには、検体の非活性異性体の存在に対処しなければならない。検体の両方の異性体形態、すなわち、活性および非活性形態の測定は、検体の活性形態の機能に応じて個々に有害となりうる不正確さを導く可能性がある。生体サンプル中の一対の異性体検体のそれぞれのレベルを正確に評価することは、特に異性体の１つのみが活性である場合、重要であり、そして非活性異性体の量を含む測定は、サンプル中の検体のレベルを歪める。例えば、ビタミンＤ欠乏は哺乳動物の多くの障害と関係があるため、生体サンプル中のビタミンＤレベルを測定することは重要である。乳児では、例えば、３−エピ異性体の量を含むビタミンＤの測定により乳児のビタミンＤレベルの不正確な評価が導かれることがあり、これにより次に適当な補充が不足することになりうる。必要に応じて、乳児が適当なビタミンＤ療法を受けることができるように、ビタミンＤの活性形態を測定することが重要である。

「ビタミンＤ」という用語は、脂溶性セコステロイドの一群をいう。ヒトでは、ビタミンＤは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ_３）またはエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ_２）として摂取することができるため、そして日光への曝露が十分であるときは、体内で（コレステロールから）それを合成することもできるため、ビタミンＤは独特である。この後者の性質のため、ビタミンＤは、ほとんど必須栄養素と考えられているにもかかわらず、食物中の非必須ビタミンであるとも考えられている。ビタミンＤは、カルシウムイオン恒常性の正の制御において重要な生理学的役割を有する。ビタミンＤ_３は、動物によって合成されるビタミンの形態である。また、それは、ビタミンＤ_２と同様に、乳製品および特定の食品に添加される一般的なサプリメントでもある。

食物中のおよび内因的に合成されたビタミンＤ_３は、代謝活性化を受けて生物活性代謝物を生成する。ヒトでは、ビタミンＤ_３活性化における最初のステップは、主として肝臓中で起こり、そして中間代謝物２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（カルシジオール、カルシフェジオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールまたは２５−ヒドロキシビタミンＤ_３とも呼ばれる、を形成するヒドロキシル化を含む。カルシジオールは、循環系中のビタミンＤ_３の主要形態である。ビタミンＤ_２も、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２に類似した代謝活性化を受ける。これらの化合物は、まとめて２５−ヒドロキシビタミンＤ（略して２５（ＯＨ）Ｄ）と呼ばれ、そしてそれらはビタミンＤの状態を決定するために血清中で測定される主要な代謝物である；２５（ＯＨ）Ｄおよびそのエピマーは、いずれも生物学的機能を発揮するために１，２５（ＯＨ）Ｄに変換される必要があるプレホルモンである。１，２５（ＯＨ）Ｄの生物活性を、３−エピ−１，２５（ＯＨ）Ｄのそれに対して比較することは、複雑である。

ビタミンＤ化合物２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および２５−ヒドロキシビタミンＤ_２は、３位のエピマーであり、それらのエピマーは、それぞれ２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_２と表わされる。これらのエピマー化合物のそれぞれのエピマーの一方のみ、すなわち、それぞれ２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および２５−ヒドロキシビタミンＤ_２が活性である。２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および２５−ヒドロキシビタミンＤ_２のエピマーに関する構造は、図１に記載されている。

このような検体を含有することが疑われるサンプルにおいて、異性体検体の濃度を正確に、かつ高感度で測定するための試薬および方法が必要とされている。例えば、ビタミンＤのエピマー形態の濃度を正確に、かつ高感度で測定するための試薬および方法が必要とされている。

本明細書に記載された原理によるいくつかの例は、サンプル中で第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を決定する方法に関する。本方法では、第１の測定値および第２の測定値が決定される。第１の測定値を決定するため、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す一次抗体を用いてサンプルの一部においてアッセイを実施することによって第１の異性体検体および第２の異性体検体の総量を測定する。第２の測定値を決定するため、一次抗体を用いてサンプルの一部においてアッセイを実施することによって第２の異性体検体の量を測定し、ここで、第１の異性体検体に結合するが、第１の異性体検体に対して不十分なアッセイ結合親和性を示し、かつ第２の異性体検体に対するアッセイ結合親和性を実質的に示さない二次抗体を過剰に用いて第１の異性体検体の一次抗体への結合を遮断する。第２の測定値は、サンプル中の第２の異性体検体の量に等しいとみなす。第１の測定値から第２の測定値を減算して結果値を得、そしてその結果値は、サンプル中の第１の異性体検体の量に等しいとみなす。

本明細書に記載された原理によるいくつかの例は、サンプルにおいて第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を決定する方法に関する。本方法では、第１の測定値および第２の測定値が決定される。第１の測定値を決定するため、少なくとも約１０^７リットル／モルの第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して結合親和性を有する一次抗体を用いてサンプルの一部においてアッセイを実施することによって第１の異性体検体および第２の異性体検体の総量を測定する。第２の測定値を決定するため、一次抗体を用いてサンプルの一部においてアッセイを実施することによって第２の異性体検体の量を測定して第２の測定値を得、ここで、約１０^６〜約１０^１２リットル／モルの第１の異性体検体に対する結合親和性および約１０^４リットル未満／モルの第２の異性体検体に対する結合親和性を有する二次抗体を過剰に用いて第１の異性体検体の一次抗体への結合を遮断する。第２の測定値は、サンプル中の第２の異性体検体の量に等しいとみなし、そして第１の測定値から第２の測定値を減算して結果値を得、それをサンプル中の第１の異性体検体の量に等しいとみなす。

２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および２５−ヒドロキシビタミンＤ_２のエピマー形態の化学式の図である。 本明細書に記載された原理による実施例に従って二次抗体を添加した、および添加なしの３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３のビタミンＤ測定を示すグラフである。 本明細書に記載された原理による実施例に従って二次抗体を添加した、および添加なしの３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３のビタミンＤ測定を示すグラフである。

特定の実施態様の詳述
一般的な議論
本明細書に記載された原理による方法は異性体またはその代謝産物の一方は効力があり、そしてもう一方またはその代謝産物はそうでない場合に、検体の２つの異性体の一方の交差反応性を最小限にし、そしてその量を測定する。「効力がある」という用語は、特定の機能に関する検体の活性の程度のことをいい、例えば、それは、例えば骨代謝のような生物学的機能であってもよい。例えば、物質の生物活性とは、細胞機能である、例えば、対象におけるミネラルおよび塩の適当なレベルの維持といったような生物学的機能を増強または抑制する物質の能力のことをいう。ビタミンＤは、例として、かつ限定されることなく、対象においてカルシウムおよびリン酸の適当なレベルを維持しており、これはカルシウム恒常性および骨代謝と関連がある。

方法は、サンプルにおいて第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を決定することを含む。第１の測定値および第２の測定値が決定される。第１の測定値は、第１の異性体検体および第２の異性体検体の総量を表す。第２の測定値は、第２の異性体検体のみの量を表す。第１の測定値から第２の測定値を減算して結果値を得、そしてその結果値をサンプル中の第１の異性体検体の量に等しいとみなす。

本明細書に記載された原理による方法では、分析すべきサンプルの少なくとも２つの部分が利用される。アッセイは、検体の両方の異性体形態に結合する抗体（一次抗体）を用いて、検体の少なくとも２つの異性体形態を含有することで疑われるサンプルの第１の部分において実施される。一次抗体は、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す。

「アッセイ結合親和性」という成句は、抗体が対応する検体に結合して検体に結合された抗体の複合体を産生する強度のことをいう。

「十分なアッセイ結合親和性」という成句は、検体に対する抗体の結合親和性が、検体の正確かつ高感度な測定結果となるアッセイシグナルを得るために十分な量で検出可能な複合体を産生するものであることを意味する。一次抗体の結合親和性は、一次抗体と、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれとの検出可能な複合体を形成するのに十分に強く、ここで、アッセイシステムおよび機器が適した較正にかけられており、そして異性体検体の一方または両方の抗体認識に関する任意の補正因子が適用されるならば、検出可能な複合体は、サンプル中の第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を正確に表している。サンプルの第１の部分におけるこのアッセイでは、サンプル中の検体の両異性体形態の量または濃度を測定する。

同じアッセイを、同じサンプルの第２の部分において、検体の両方の異性体形態に結合する一次抗体と、異性体形態の一方（第１の異性体形態）に結合するが、もう一方の異性体形態（第２の異性体形態）に対して実質的に結合親和性を示さず、第２の部分において実施されたアッセイにおける一次抗体による検出に関して第２の異性体形態を遊離したままにしておく二次抗体との両方を用いて実施する。第１の異性体形態に結合するが、第２の異性体形態に結合しない二次抗体は、第１の異性体検体に対して不十分なアッセイ結合親和性を示す。いくつかの例では、異性体形態の一方に結合するが、もう一方の異性体形態に結合しない二次抗体は、活性異性体形態に結合するが、非活性異性体形態に結合しない。サンプルの第２の部分におけるこのアッセイでは、検体の異性体形態の一方のみ、すなわち、上の説明の第２の異性体検体の濃度を測定する。得られたシグナル値を用いて総検体濃度および検体の２つの異性体形態のそれぞれの濃度を決定してもよい。

「不十分なアッセイ結合親和性」という成句は、異性体検体に対する二次抗体の結合親和性が、異性体検体に対する一次抗体の結合親和性よりも低いことを意味する。いくつかの例において、「不十分なアッセイ結合親和性」という成句は、異性体検体に対する二次抗体の結合親和性が、二次抗体と第１の異性体検体との間で検出可能な複合体を形成するのに十分に大きくなく、したがって、任意の検出可能な複合体が第１の異性体検体の量を正確に表していないことを意味する。二次抗体は、過剰に用いたとき、サンプルの第２の部分におけるアッセイにおいて一次抗体の第１の異性体検体への結合を遮断するのに十分な、第１の異性体検体に対する結合親和性を示す。使用したアッセイにおいて第１の異性体検体の正確な検出にとって十分なシグナルが生じるように、検体の第１の異性体形態に対する二次抗体の結合親和性は、二次抗体と第１の異性体検体との複合体を生成するには非常に低い。

第２の異性体形態に対して「実質的に結合親和性を示さない」という成句は、二次抗体と検体の第２の異性体形態との間で実質的に検出可能な複合体が形成されないことを意味する。

サンプルの第２の部分におけるアッセイから結果が実質的に０に相当する場合、サンプルの第２の部分におけるアッセイにおいて検体のもう一方の異性体形態が検出されないため、サンプルの第１の部分におけるアッセイから得られた結果が、検体の２つの異性体形態の一方のみの濃度を表すことに留意する必要がある。このような状況では、本明細書に記載された原理による方法からの結果が、検体の異性体形態の一方のみが、サンプルの第１の部分におけるアッセイで得られたシグナルに関与していることを示しているため、当該サンプルの２つの部分においてアッセイを実施する必要はないであろう。一方、サンプルの第２の部分におけるアッセイからの結果が実質的に０に相当しない場合、サンプルの第２の部分におけるアッセイにおいて検体のもう一方の異性体形態が検出されるため、サンプルの第１の部分におけるアッセイから得られた結果は、検体の２つの異性体形態の両方の濃度を表す。このような状況では、本明細書に記載された原理による方法からの結果は、検体の異性体形態の両方がサンプルの第１の部分におけるアッセイで得られたシグナルに関与していることを示しているため、当該サンプルの２つの部分においてアッセイを実施することが必要であろう。

抗体の調製
本明細書に記載された原理により抗体を調製する方法の例を、例として、かつ限定されることなく、記載する。少なくとも２つの異なる抗体が必要であり、それらは本明細書に記載された原理よる性質を有する。１つの抗体は、第１の異性体検体および第２の異性体検体の両方に対して十分なアッセイ結合親和性を示す。もう一方の抗体は、第１の異性体検体に結合するが、第１の異性体検体に対する不十分なアッセイ結合親和性を示し、そして第２の異性体検体に対してアッセイ結合親和性を実質的に示さない。

本明細書に記載された原理によるいくつかの例において、十分なアッセイ結合親和性は、例えば、少なくとも約１０^７リットル／モル、または少なくとも約１０^８リットル／モル、または少なくとも約１０^９リットル／モル、または少なくとも約１０^１０リットル／モル、または少なくとも約１０^１１リットル／モル、または少なくとも約１０^１２リットル／モル、または少なくとも約１０^１３リットル／モル、または少なくとも約１０^１４リットル／モルであり、そして検出可能な複合体の量は、検体の正確かつ高感度な測定結果となるアッセイシグナルを得るために十分である。本明細書に記載された原理によるいくつかの例では、十分なアッセイ結合親和性は、例えば、約１０^７〜約１０^１４リットル／モル、または約１０^７〜約１０^１１リットル／モル、または約１０^７〜約１０^１２リットル／モル、または約１０^８〜約１０^１４リットル／モル、または約１０^８〜約１０^１１リットル／モル、または約１０^８〜約１０^１２リットル／モルである。

いくつかの例では、不十分なアッセイ結合親和性は、第１の異性体検体に対する二次抗体の結合親和性が、第１の異性体検体に対する一次抗体の結合親和性より低いことを意味する。いくつかの例では、第１の異性体検体に対する一次抗体の結合親和性に応じて、第１の異性体検体に対する二次抗体の結合親和性は、第１の異性体検体に対する一次抗体の結合親和性よりも、例えば、約１０、または約１０^２、または約１０^３、または約１０^４、または約１０^５倍低い。例えば、第１の異性体検体に対する一次抗体の結合親和性が約１０^９リットル／モルである場合、二次抗体の結合親和性は、約１０^７リットル／モルより低い、または約１０^６リットル／モルより低い。本明細書に記載された原理によるいくつかの例では、不十分なアッセイ結合親和性は、検体に対する抗体の結合親和性が抗体の性質および検体の性質に応じて、例えば、約１０^６〜約１０^８リットル／モル、または約１０^６〜約１０^７リットル／モルであることを意味する。

いくつかの例では、結合親和性が実質的にないというのは、抗体が、例えば、約１０^４リットル／モルより低い、または約１０^３リットル／モルより低い、または約１０^２リットル／モルより低い、または約１０リットル／モルより低い、異性体検体に対する結合親和性を有することを意味する。

上の議論において、結合親和性は、特異的結合親和性であり、これは、他の分子の実質的により劣った認識と比較して２つの異なる分子の一方のもう一方に対する特異的認識を含む。一方、非特異的結合には、特異的表面構造と比較的無関係である分子間の非共有結合が含まれる。非特異的結合は、分子間に疎水的相互作用を含むいくつかの因子から生じてもよい。

抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含んでもよく、この免疫グロブリンには、さまざまな種類およびアイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭ、などが含まれる。
そのフラグメントは、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’などを含んでもよい。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、必要に応じて、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの集合体、多量体および複合体を用いることができる。

モノクローナル抗体は、連続的な雑種細胞系を調製し、そして分泌されたタンパク質を採取するような当分野でよく知られている技術（体細胞ハイブリダイゼーション技術）によって調製することができる。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 265:495-497, 1975の標準技術に従って産生してもよい。モノクローナル抗体技術の総説は、Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers, et al. Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), and Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981)に見いだされる。

抗体調製の別のアプローチでは、抗体結合部位のための配列コーディングを、染色体ＤＮＡから切り取り、そしてクローニングベクターに挿入することができ、これを細菌中で発現させて対応する抗体結合部位を有する組換えタンパク質を産生することができる。このアプローチは、少なくとも自然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその突然変異バージョンをクローニングし、そして発現させることを含む。

モノクローナル抗体を産生する１つのアプローチでは、第１のステップは、抗原、例えば、免疫原によるマウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたはウシといったような抗体産生動物の免疫化を含む。免疫化は、アジュバント、例えば完全フロイントアジュバントまたは他のアジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡおよび合成トレハロースジコリノミコラートアジュバントを用いて、または用いることなく実施することができる。次のステップは、抗体産生動物から脾臓細胞を単離し、そして、例えばポリエチレングリコールまたは他の技術を用いて抗体産生脾臓細胞を適当な融合パートナー、典型的に骨髄腫細胞と融合させることを含む。典型的に、使用する骨髄腫細胞は、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）培地で正常に増殖するが、融合細胞の選択に用いるヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地で増殖することができない。次のステップは、典型的にＨＡＴ培地中の選択による融合細胞の選択を含む。次のステップは、免疫測定法、例えば酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）またはスクリーニングに適した他の免疫測定法を用いて、適当な抗体産生のためのクローン化ハイブリッドをスクリーニングすることを含む。

「免疫原性キャリア」という用語は、ハプテンに結合され、そして哺乳動物に注射されるか、または別のやり方で免疫原として用いたときに、免疫応答を誘導し、そしてハプテンに結合した抗体の産生を誘発する群または部分を意味する。免疫原性キャリアは、しばしば抗原性キャリアとも呼ばれる。本明細書に記載された原理によるいくつかの例では、特定の位置で免疫抑制化合物に結合された、ポリ（アミノ酸）および非ポリ（アミノ酸）免疫原性キャリアを含む、免疫原性キャリアを含む免疫原を合成し、そして抗体の調製に用いる。ハプテンは、対応する抗体と特異的に結合可能な化合物であるが、しかし、それ自体では抗体を調製するための免疫原（または、抗原）として作用しない。従って、ハプテンを免疫原性キャリアに結合させ、それを用いて抗体を産生する。

免疫原性キャリアであるポリアミノ酸の分子量範囲（ダルトンで）は、例えば、約５，０００〜約１０，０００，０００、または約２０，０００〜約６００，０００、または約２５，０００〜約２５０，０００の分子量である。ポリ（アミノ酸）免疫原性キャリアには、例えば、アルブミン、血清タンパク質、例えば、グロブリン、接眼レンズレンズタンパク質およびリポタンパク質のようなタンパク質が含まれる。例示的なタンパク質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミンおよびウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。非ポリ（アミノ酸）免疫原性キャリアとしては、多糖類、核酸および粒子（生物学的および合成物質）が含まれる。多種多様な免疫原性キャリアは、Davalianら、米国特許第５,０８９,３９０号、第４段、第５７行〜第５段、第５行に開示されており、それは参照により本明細書に組み込まれている。

上記のように、免疫原性キャリアは多糖類であってもよく、これは、自然にまたは合成的に調製されうる単糖類の高分子量ポリマーであり、そして、通常、単糖類の繰り返された縮合を含む。多糖類の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、炭水化物ガム、例えばアラビアガム、寒天、などである。多糖類は、ポリ（アミノ酸）残基および／または脂質残基を含有することもできる。

上記のように、本明細書に記載された原理によるいくつかの例では、免疫原性キャリアを、検体上の予め決められた位置で連結基によって検体類似体に結合させてもよい。いくつかの例では、連結基は、水素を数に入れずに、約２〜約５０個の原子、または４〜約３０個の原子を含んでもよく、そしてそれぞれ、通常、炭素、酸素、硫黄、窒素、およびリンからなる群から独立して選択される、２から約３０個までの原子、または３〜約２０個の原子の鎖を含んでもよい。連結基の一部またはすべては、例えば、限定されるわけではないが、ポリ（アミノ酸）上のアミノ酸残基のような、免疫抑制化合物に結合された分子の一部であってもよい。いくつかの例において、連結基にはオキシム官能基が含まれる。

連結基中のヘテロ原子の数は、０から約２０個まで、または１〜約１５個、または約２〜約１０個の範囲であってもよい。連結基は、脂肪族または芳香族であってもよい。ヘテロ原子が存在するとき、酸素は、通常、オキソまたはオキシとして存在し、炭素、硫黄、窒素またはリンに結合されており、窒素は、通常、ニトロ、ニトロソまたはアミノとして存在し、通常、炭素、酸素、硫黄またはリンに結合されており；硫黄は、酸素と類似しており；その一方で、リンは、通常、ホスホン酸およびリン酸モノまたはジエステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合されている。連結基と結合されるべき分子との間の共有結合の形成における一般的な官能基は、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテルならびにカルボン酸、スルホン酸およびリン酸エステル、アミドおよびチオエステルである。ヘテロ原子を含む連結基の１つの具体的な実施態様は、上記のようなオキシム官能基である。

ほとんどの場合、連結基が、例えば、窒素および硫黄類似体を含む非オキソカルボニル基、リン酸基、アミノ基、アルキル化剤、例えばハロもしくはトシルアルキル、オキシ（ヒドロキシルまたは硫黄類似体、メルカプト）オキソカルボニル（例えば、アルデヒドまたはケトン）、または活性オレフィン、例えばビニルスルホンもしくはα−、β−不飽和エステルのような連結官能基（部分と反応するための官能基）を有するとき、これらの官能基は、アミン基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えば、ブロモアセチルに結合されている。アミンおよびカルボン酸もしくはその窒素誘導体またはリン酸が結合される場合、アミド、アミジンおよびリンアミドが形成される。メルカプタンおよび活性化オレフィンが結合される場合、チオエーテルが形成される。メルカプタンおよびアルキル化剤が結合される場合、チオエーテルが形成される。アルデヒドおよびアミンが還元条件下で結合される場合、アルキルアミンが形成される。ケトンまたはアルデヒドおよびヒドロキシルアミン（置換基がヒドロキシル基の水素の代わりである場合、その誘導体を含む）が結合される場合、オキシム官能基（＝Ｎ−Ｏ−）が形成される。カルボン酸またはリン酸およびアルコールが結合される場合、エステルが形成される。さまざまな連結基が当分野でよく知られており；例えば、Cautrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245:3059を参照のこと。

上記のように２つの異性体検体の一方または両方に対する結合親和性に関して、それぞれ異なる抗体を選択する。したがって、一次抗体を調製し、そして一次抗体が第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示すように、適当なスクリーニング法を用いて選択する。二次抗体を調製し、そして二次抗体が第１の異性体検体に結合するが、第１の異性体検体に対して不十分なアッセイ結合親和性を示し、そしてさらに第２の異性体検体に対してアッセイ結合親和性を実質的に示さないように、適当なスクリーニング法を用いて選択する。上記の検体に対して必要な結合親和性を有する抗体は、よく知られたスクリーニング方法論によって選択してもよく、それには、例として、限定されることなく、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウェスタン分析および表面プラスモン共鳴が含まれる。

アッセイの一般的な説明
以下の議論は、例であって、限定されるわけではない。本明細書に記載された原理により含まれる測定におけるサンプルの部分において、抗体を利用する任意の適当なアッセイを用いてもよい。アッセイは、アッセイ成分または産物のなんらかの分離なし（均一）または分離あり（不均一）のいずれかで実施することができる。不均一アッセイは、通常、１つまたはそれ以上の分離ステップを含み、そして競合的または非競合的であることができる。アッセイは手動でもよいし、または自動化してもよい。

分析すべきサンプルは、検体を含有することが疑われるものである。サンプルは、生物学的サンプルまたは非生物的サンプルであってもよい。生物学的サンプルは、哺乳動物対象または非哺乳動物対象からのものであってもよい。哺乳動物対象は、例えば、ヒトまたは他の動物の種であってもよい。生物学的サンプルとしては、生物学的液体、例えば全血、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、糞便、尿、髄液、唾液、大便、脳脊髄液、涙、粘液など；生物学的組織、例えば毛、皮膚、切片または器官もしくは他の身体部分から切り取られた組織；およびその他が含まれる。多くの場合、サンプルは、全血、血漿または血清である。また、本明細書に記載された原理に従って化合物を用いて、例えば廃棄物流を含むが、これに限定されるわけではない非生物学的サンプルを分析してもよい。

サンプルは、任意の都合のよい媒体中で調製することができ、それは、例えば、アッセイ媒体であってもよく、それについては、以下でより詳細に議論する。いくつかの場合、例えば血液細胞を溶解するなどのために、サンプルに前処理を適用してもよい。いくつかの例では、このような前処理は、その後でアッセイを妨げない媒体中で実施する。

多くの実施態様において、免疫測定法は標識試薬を含む。標識試薬を含む免疫測定法としては、例えば、化学発光免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、放射免疫測定法、阻害アッセイ、誘起発光アッセイ（induced luminescence assay）、および蛍光酸素チャネリングアッセイ（fluorescent oxygen channeling assays）が含まれる。

免疫測定法の１つの一般的な群には、アッセイ試薬の１つの限定された濃度を用いる免疫測定法が含まれる。免疫測定法の別の群には、主要な試薬の１つまたはそれ以上の過剰の使用が含まれる。免疫測定法の別の群は、本明細書に記載された原理による抗体の１つが、サンプル中の２つの異性体検体の一方または両方に結合すると、標識試薬が標識シグナルを調節する、分離を含まない均一アッセイである。

上記のように、アッセイは、アッセイ成分または産物のなんらかの分離なし（均一）または分離あり（不均一）のいずれかで実施することができる。均一免疫測定法は、Rubensteinら、米国特許第３,８１７,８３７号、第３欄、第６行〜第６欄、第６４行に開示されたＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ（Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL）；米国特許第５，３４０，７１６号（Ullmanら）に開示された誘起発光免疫測定法（「ＬＯＣＩ（登録商標）技術」）；Ullmanら、米国特許第３,９９６,３４５号、第１７欄、第５９行〜第２３欄、第２５行に開示されたもののような免疫蛍光法；Maggioら、米国特許第４,２３３,４０２号、第６欄、第２５行〜第９欄、第６３行に開示されたもののような酵素チャネリング免疫測定法（「ＥＣＩＡ」）；例えば、とりわけ、米国特許第５,３５４,６９３号に開示されたような蛍光偏光免疫測定法（「ＦＰＩＡ」）；酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）のような酵素免疫測定法によって例示される。不均一アッセイの例は、放射免疫測定法であり、Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39:1157 (1960)に開示されている。上の開示は、すべて参照により本明細書に組み込まれる。

他の酵素免疫測定法は、例えば、Ngo and Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288によって議論された酵素活性調節剤標識免疫測定法（enzyme modulate mediated immunoassay）（「ＥＭＭＩＡ」）；Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904によって開示された蛍光基質標識免疫測定法（substrate labeled fluorescence immunoassay）（「ＳＬＦＩＡ」）；Khanna, et al., Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240によって開示された複合酵素ドナー免疫測定法（combined enzyme donor immunoassay）（「ＣＥＤＩＡ」）；均一粒子標識免疫測定法（homogeneous particle labeled immunoassays）、例えば粒子増強比濁阻害免疫測定法（particle enhanced turbidimetric inhibition immunoassays）（「ＰＥＴＩＮＩＡ」）および粒子増強比濁免疫測定法（particle enhanced turbidimetric immunoassay）（「ＰＥＴＩＡ」）などである。

他のアッセイには、ゾル粒子イムノアッセイ（sol particle immunoassay）（「ＳＰＩＡ」）、分散染料免疫測定法（disperse dye immunoassay）（「ＤＩＡ」）；メタロイムノアッセイ（metalloimmunoassay）「（「ＭＩＡ」）；酵素膜免疫測定法（enzyme membrane immunoassays）（「ＥＭＩＡ」）；発光免疫測定法（luminoimmunoassays）（「ＬＩＡ」）；などが含まれる。他のタイプのアッセイには、検体の結合による試薬の光学的、音響的および電気的性質における変化のモニタリングを含む免疫センサーアッセイが含まれる。このようなアッセイには、例えば、光免疫センサーアッセイ（optical immunosensor assays）、音響免疫センサーアッセイ（acoustic immunosensor assays）、半導体免疫センサーアッセイ（semiconductor immunosensor assays）、電気化学トランスデューサー免疫センサーアッセイ（electrochemical transducer immunosensor assays）、電位差測定免疫センサーアッセイ（potentiometric immunosensor assays）、および電流測定電極アッセイ（amperometric electrode assays）が含まれる。

不均一アッセイは、通常、１つまたはそれ以上の分離ステップを含み、そして競合的または非競合的でありうる。さまざまな競合的および非競合的不均一アッセイフォーマットは、Davalianら、米国特許第５，０８９，３９０号、第１４欄、第２５行〜第１５欄、第９行に開示されており、参照により本明細書に組み込まれている。競合的不均一アッセイの例では、それに結合される検体に対する抗体を有する支持体を、標識を含む検体および検体類似体を含有することが疑われるサンプルを含有する媒体と接触させる。サンプル中の検体は、検体抗体に対する結合に関して、標識検体類似体と競合する。支持体および媒体を分離した後、支持体または媒体の標識活性は、従来の技術によって決定され、そしてサンプル中の検体の量と関連がある。上の競合的不均一アッセイの変法では、支持体は、検体類似体を含み、これは、本明細書に記載された原理による抗体試薬への結合に関してサンプルの検体と競合する。

いくつかの例では、分析すべきサンプルを前処理にかけて、例えば、検体を結合する血漿または血清蛋白のような内在性結合物質から検体を遊離させる。内在性結合物質から検体の遊離は、例えば、消化剤もしくは遊離剤（releasing agent）または経時的に用いられる消化剤と遊離剤との組合せの添加によって実施してもよい。消化剤は、内在性結合物質がもはや検体を結合することができないように内在性結合物質を分解するものである。このような物質としては、プロテイナーゼＫおよびプロテイナーゼＫおよび、例えば、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）のようなタンパク質変性剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。内在性結合物質から検体を遊離するための遊離剤としては、例として、かつ限定されることなく、酸性変性剤、例えば、サリチル酸、ワルファリンナトリウム、スルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）（例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）および８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸（８−ＡＮＳ）を含む）、サリチル酸および上記の誘導体が含まれる。

例えば、期間、温度、消化または遊離作用を実施する媒体中の遊離剤のｐＨおよび濃度のような条件は、例えば、検体の性質、内在性結合物質の性質、サンプルの性質、および遊離剤の性質によって左右される。一般に、条件は、所望の効果または機能を達成するために十分である。本明細書に記載された原理によるいくつかの例では、遊離剤の有効濃度は、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｍＬ、または約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．０１〜約５ｍｇ／ｍＬ、または約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．１〜約５ｍｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１ｍｇ／ｍＬである。アッセイを実施する前の独立したステップとして、またはアッセイの第１のステップとして、内在性結合物質から検体を遊離するサンプルの前処理を実施してもよい。いずれの場合においても、消化剤および／または遊離剤の作用を停止させるために１つまたはそれ以上の試薬が必要となりうる。

本明細書に記載された原理によるサンプルの一部においてアッセイを実施する条件は、一般に最適アッセイ感度を提供する、適度なｐＨで緩衝化された水性媒体中でアッセイを実施することを含む。水性媒体は、単に水だけでもよいし、または０．１から約４０体積パーセントまでの補助溶媒を含んでもよい。媒体のｐＨは、例えば、約４〜約１１の範囲、または約５〜約１０の範囲、または約６．５〜約９．５の範囲になるであろう。ｐＨは、通常、任意の特異的結合対の結合メンバーの最適結合、シグナル発生システムのメンバーのようなアッセイの他の試薬にとって最適なｐＨなどの妥協点（compromise）となるであろう。所望のｐＨを達成し、そしてアッセイ中にｐＨを維持するためにさまざまな緩衝液を用いてもよい。例となる緩衝液としては、例として、かつ限定されることなく、例えば、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＴＲＩＳ、バルビタール、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳおよびＢＩＣＩＮＥが含まれる。使用する特定の緩衝液は重要ではないが、しかし、個々のアッセイでは、１つまたはもう１つの緩衝液が好まれうる。

本アッセイ法では、さまざまな補助的物質を用いてもよい。例えば、緩衝液に加えて、媒体は、使用する媒体および試薬に関する安定剤を含んでもよい。いくつかの実施態様では、これらの添加剤に加えて、タンパク質、例えば、アルブミンなど；有機溶媒、例えば、ホルムアミドなど；第四級アンモニウム塩；ポリアニオン、例えば、硫酸デキストランなど；結合エンハンサー、例えば、ポリアルキレングリコール；多糖類、例えば、デキストランまたはトレハロースなどが含まれうる。また、媒体は、凝血塊の形成を防止する物質を含んでもよい。このような物質は当分野でよく知られており、そして、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸塩、ヘパリンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。媒体は、１つまたはそれ以上の保存剤、例えば、限定されるわけではないが、ナトリウムアジド、硫酸ネオマイシン、ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、ストレプトマイシンなどを含んでもよい。媒体は、１つまたはそれ以上の界面活性剤をさらに含んでもよい。上の物質はいずれも、使用する場合、所望の効果または機能を達成するために十分な濃度または量で存在する。

上記のものを含む、アッセイで用いるさまざまな試薬を添加する間の任意の間隔を含む１つまたはそれ以上の間隔で、１つまたはそれ以上のインキュベーション期間を媒体に適用してもよい。通常、試薬のさまざまな成分の結合およびサンプル中の検体の結合が起こるのに十分な温度および時間で媒体をインキュベートする。本方法を実施するには、通常、穏やかな温度を用い、そして測定期間中、通常、一定の温度、好ましくは、室温である。いくつかの例において、インキュベーション温度は、例えば、約５°から約９９℃まで、または約１５℃から約７０℃まで、または約２０℃から約４５℃までの範囲である。インキュベーションの期間は、いくつかの例において、例えば、約０．２秒〜約２４時間、または約１秒〜約６時間、または約２秒〜約１時間、または約１分〜約１５分である。期間は、媒体の温度およびさまざまな試薬の結合速度に左右され、それは、結合速度定数、濃度、結合定数および解離速度定数によって決まる。

本明細書において議論する多くのアッセイは、シグナル発生システムを用い、それは１つまたはそれ以上の成分を有してもよく、少なくとも１つの成分が標識である。シグナル発生システムは、サンプル中の検体の存在に関連するシグナルを生成する。シグナル発生システムは、測定可能なシグナルの発生に必要な試薬のすべてを含む。シグナル発生システムの他の成分は、現像液中に含まれてもよく、そして、例えば、基質、エンハンサー、活性化物質、化学発光化合物、補因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に必要な特異的結合物質が含まれうるが、それらに限定されるわけではない。シグナル発生システムの他の成分は、例えば、補酵素、酵素的産物と反応する物質、他の酵素および触媒であってもよい。シグナル発生システムは、外部手段によって、電磁放射線の使用によって、望ましくは目視検査によって検出可能なシグナルを提供する。例示的なシグナル発生システムは、米国特許第５,５０８,１７８号に記載されており、その関連した開示は、参照により本明細書に組み込まれている。

「標識」という用語は、ポリ（アミノ酸）標識および非ポリ（アミノ酸）標識を含む。「ポリ（アミノ酸）標識部分」という用語は、限定されるわけではないが、例えば、酵素、抗体、ペプチドおよび免疫原のようなタンパク質である標識が含まれる。例えば、酵素のような標識タンパク質では、分子量範囲は、約１０，０００から約６００，０００まで、または約１０，０００から約３００，０００までの分子量になるであろう。通常、タンパク質の、例えば、約２００，０００の分子量当たり少なくとも１個、または約１５０，０００の分子量当たり少なくとも約１個、または約１００，０００の分子量当たり少なくとも約１個、または約５０，０００の分子量当たり少なくとも約１個の本明細書に記載された原理による化合物（類似体群）がある。酵素の場合、類似体群の数は、通常、１から約２０個まで、約２〜約１５個、約３〜約１２個、または約６〜約１０個である。

酵素には、例として、かつ限定されることなく、例えば、酸化還元酵素、例えば、脱水素酵素、例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび乳酸脱水素酵素など；過酸化水素の産生および色素前駆体を色素に酸化する過酸化水素の使用に関与する酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼおよびミクロペルオキシダーゼなど；ヒドロラーゼ、例えば、アルカリホスファターゼおよび−ガラクトシダーゼなど；ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、および細菌ルシフェラーゼなど；トランスフェラーゼ；酵素の組合せ、例えば、限定されるわけではないが、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースおよびガラクトースオキシダーゼ、または色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素とカップリングされた、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのような複素環式オキシダーゼ、すなわち、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼもしくはミクロペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼが含まれる。

「非ポリ（アミノ酸）標識」という用語は、タンパク質でないそれらの標識を含む。非ポリ（アミノ酸）標識は、直接検出可能であるか、または検出可能なシグナルを発生する反応を通して検出可能である。非ポリ（アミノ酸）標識は、同位体または非同位体であることができ、そして、例として、かつ限定されることなく、例えば、放射性同位体、発光性化合物（それには、例えば、蛍光化合物および化学発光化合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない）、触媒、プロモーター、色素、補酵素、酵素基質、放射性基および増幅性ポリヌクレオチド配列に関してコードするポリヌクレオチドであることができる。

いくつかの例において、シグナル発生システムの１つのメンバーは、分子量約２００〜約２，０００、または約２００〜約１，５００、または約２００〜約１，０００、または約２００〜約５００の分子に相当する有機小分子である。このような有機小分子には、例えば、ビオチン、蛍光分子（例えば、フルオレセインおよびローダミンなど）、化学発光分子およびジニトロフェノールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。有機小分子に対する結合パートナーは、小分子を特異的に認識し、かつそれに結合する分子である。小分子に対する結合パートナーは、小分子の性質によって定められ、そして、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、有機小分子に対する抗体（これには、蛍光分子に対する抗体（例えばフルオレセインに対する抗体およびローダミンに対する抗体など）、化学発光分子に対する抗体、ジニトロフェノールに対する抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない）、を含むが、それらに限定されるわけではない。

アッセイのいくつかの例では、支持体を利用する。支持体は、有機または無機の、固体または液体の水不溶性物質で構成されてもよく、そしてそれは透明または部分的に透明であってもよい。支持体は、例えば、限定されるわけではないが、ビーズを含む粒子（微粒子支持体）、フィルム、膜、チューブ、ウェル、細片、ロッド、繊維、または平らな表面、例えば、プレートまたは紙などのような多くの形状のいずれかを有することができる。支持体は、それが用いられる媒体中に懸濁可能であってもよいし、またはそうでなくてもよい。懸濁可能な支持体の例は、例えば、ラテックス、脂質二重層またはリポソームのようなポリマー物質、油滴、セルおよびヒドロゲル、ならびに磁性粒子である。他の支持体組成物としては、例えば、ポリマー、例として、かつ限定されることなく、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ブチル）などが含まれ、それ自体で、または他の物質と共に用いられる。支持体は、例えば、色素、触媒または他の検出可能な基でさらに標識してもよいし、または標識しなくてもよい。

いくつかの例において、支持体は粒子であってもよい。粒子は、少なくとも約０．０２ミクロン、そして約１００ミクロンを超えない平均直径を有する。いくつかの例において、粒子は、約０．０５ミクロンから約２０ミクロンまで、または約０．３ミクロンから約１０ミクロンまでの平均直径を有する。粒子は、有機または無機、膨潤性または非膨潤性、多孔性または非多孔性、好ましくは、水に近い密度、一般に約０．７ｇ／ｍＬから約１．５ｇ／ｍＬまで、そして透明、部分的に透明、または不透明でありうる物質で構成される。粒子は、例えば、細胞および微生物のような生物学的物質、例えば、赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および大腸菌（E.coli）、ウイルスであることができる。また、粒子は、有機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、磁性または非磁性粒子、リン脂質ベシクル、カイロミクロン、リポタンパク質などで構成される粒子であることもできる。いくつかの例において、粒子は、二酸化クロム（クロム）粒子またはラテックス粒子である。

化学発光粒子は、それとともに化学発光化合物と会合した粒子である。本明細書に用いるとき、「それとともに会合する」という成句は、例えば、化学発光化合物および粒子のような化合物が、例えば、直接的もしくは間接的な結合、吸着、吸収、取り込みまたは溶液によって会合しうることを意味する。利用しうる化学発光化合物の例は、米国特許第５，３４０，７１６号および同第６，２５１，５８１号に記載されたものであり、その関連した開示は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に記載された原理によるいくつかの例において、化学発光化合物は、光による直接もしくは増感された励起により、または一重項酸素との反応により、化学反応を受けて、通常、２５０〜１２００ｎｍの波長範囲内で、同時にまたはその後で光の放出を伴って分解可能である準安定反応生成物を形成する、光励起性物質である。「光励起性」という用語は、「光化学的に活性化可能」を含む。いくつかの例において、化学発光化合物は、一重項酸素と反応してジオキセタンまたはジオキセタノンを形成するものである。後者は、通常、電子リッチなオレフィンである。このような電子リッチなオレフィンの例は、エノールエーテル、エナミン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、９−アルキリデン−キサントゲン酸エステルおよびルシゲニンである。他の化合物としては、ルミノールおよび他のフタルヒドラジドおよび光化学的に不安定保護基によって保護されることによって化学発光反応を受けることから保護される化学発光化合物、例えば、ホタルルシフェリン、アクアホリン（aquaphorin）およびルミノールを含むこのような化合物が含まれる。利用しうるこのような化学発光化合物の例は、米国特許第５,７０９,９９４号に記載されたものであり、その関連した開示は、参照により本明細書に組み込まれている。

増感剤粒子は、それとともに増感剤化合物と会合された粒子であり、それには光増感剤化合物が含まれるが、それに限定されるわけではない。使用しうる増感剤化合物の例は、米国特許第５，３４０，７１６号および同第６，２５１，５８１号に記載されたものであり、その関連した開示は、参照により本明細書に組み込まれている。

光増感剤は、通常、光による励起によって一重項酸素を生成するための増感剤である。いくつかの例において、光増感剤は、化学発光化合物より長い波長で吸収し、そして化学発光化合物より低いエネルギー三重項を有する。光増感剤は、光励起性（例えば、色素および芳香族化合物）であることができる。光増感剤は、通常、複数の共役した二重または三重結合を有する、通常、共有結合した原子で構成される化合物である。この化合物は、２００〜１１００ｎｍ、通常、３００〜１０００ｎｍ、好ましくは４５０〜９５０ｎｍの波長範囲で光を吸収するはずである。典型的な光増感剤としては、例えば、アセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、９，１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、金属ポルフィリン（例えば、ヘマトポルフィリン）、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフラーレン、およびこれらの化合物の誘導体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。他の光増感剤の例は、N.J. Turro, “Molecular Photochemistry”, page 132, W. A. Benjamin Inc., N.Y. 1965に列挙されている。光増感剤は、活性化が一重項酸素による場合、光活性化を助ける。通常、光増感剤は光を吸収し、こうして形成された励起光増感剤が酸素を活性化して一重項酸素を生成し、これが化学発光化合物と反応して準安定発光性中間体が得られる。

いくつかの知られているアッセイでは、第１および第２のｓｐｓメンバーを用いるシグナル発生システム（ｓｐｓ）を利用する。ｓｐｓメンバーは、ｓｐｓの１つのメンバーの活性化により、例えば、光または活性化生成物のような生成物を産生することに関与してもよく、それによりｓｐｓの別のメンバーが活性化されることになる。

このようなアッセイの例では、ｓｐｓメンバーは、例えば、光増感剤のような増感剤、および化学発光化合物を含む化学発光組成物を含み、ここでは、増感剤の活性化により化学発光組成物を活性化する生成物を生じる。第２のｓｐｓメンバーは、通常、結合および／または非結合ｓｐｓメンバーの量、すなわち、検出される検体に結合したまたは結合していないｓｐｓメンバーの量に関連する検出可能なシグナルを発生させる。本明細書に記載された原理によるいくつかの例において、増感剤試薬または化学発光試薬のいずれか１つは、本明細書に記載された原理による抗体試薬を含む。

本明細書に記載される原理による方法の例
上に議論したように、本明細書に記載された原理による方法は、サンプルにおいて第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を決定することに関する。この方法では、第１の測定値および第２の測定値が決定される。第１の測定値を決定するため、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す一次抗体を用いてサンプルの第１の部分においてアッセイを実施することによって第１の異性体検体および第２の異性体検体の総量を測定する。この例において、一次抗体は、上記の手順の１つによって調製されたモノクローナル抗体である。

サンプル部分は、アッセイを妨げないなんらかの都合のよい媒体中で調製することができる。水性媒体が一般に用いられる。サンプル部分のサイズは、例えば、異性体検体の性質、アッセイの性質、アッセイを実施するためのさまざまな試薬の性質、および検体を含む複合体の性質の１つまたはそれ以上に左右される。サンプル部分のサイズは、決定に関与する両測定と本質的に同一とすべきである。いくつかの例では、サンプル部分の体積は、例えば、約１μＬ〜約１００μＬ、または約２μＬ〜約１００μＬ、または約５μＬ〜約１００μＬ、または約１０μＬ〜約１００μＬ、または約１μＬ〜約８０μＬ、または約１μＬ〜約６０μＬ、または約１μＬ〜約４０μＬ、または約１μＬ〜約２０μＬ、または約５μＬ〜約５０μＬ、または約１０μＬ〜約５０μＬである。

第１の測定値を決定するために選択されたアッセイは、第１のサンプル部分において実施され、これは、上で議論したように前処理して内在性結合物質から検体を遊離させてもよい。検体に対する一次抗体ならびに第１および第２の異性体検体を含む複合体の量は、複合体によって生成されるシグナルのレベルを測定することによって測定する。観察されたシグナルは、サンプル中の第１の異性体検体および第２の異性体検体を合わせた総量に相当する。

第２の測定値を決定するため、一次抗体を用いてサンプルの第２の部分においてアッセイを実施することによって第２の異性体検体の量を測定し、そしてアッセイ媒体は、第１の異性体検体に結合するが、第１の異性体検体に対する不十分なアッセイ結合親和性を示し、そして第２の異性体に対するアッセイ結合親和性を実質的に示さない二次抗体を更に含む。第２のサンプル部分は、上で議論したように前処理して内在性結合物質から検体を遊離してもよい。別法として、本明細書に記載された原理による方法で用いるべき部分を使用する前に、サンプルを前処理してもよい。この例では、二次抗体は、上記の手順の１つによって調製されたモノクローナル抗体である。一次抗体への第１の異性体検体の結合を遮断するため、サンプルの第２の部分を含むアッセイ媒体中で、一次抗体と比較して二次抗体を過剰に用いる。過剰量とは、サンプル中に存在するであろう第１の異性体検体の大多数を結合するのに必要な一次抗体の量を超える量である。使用する二次抗体の量は、例えば、二次抗体の性質、一次抗体の性質、異性体検体の性質、アッセイ媒体の性質、およびアッセイの性質に左右される。本明細書に記載された原理によるいくつかの例では、二次抗体の過剰量は、例えば、一次抗体の量の約５〜約２００倍、または約５〜約１５０倍、または約５〜約１００倍、または約５〜約５０倍、または約１０〜約２００倍、または約１０〜約１５０倍、または約１０〜約１００倍、または約１０〜約５０倍、または約２０〜約２００倍、または約２０〜約１５０倍、または約２０〜約１００倍、または約２０〜約５０倍である。検体に対する一次抗体および第２の異性体検体を含む複合体の量は、複合体によって生成されるシグナルのレベルを測定することによって測定される。観察されるシグナルは、サンプル中の第２の異性体検体の量に関連がある。第１の測定値から第２の測定値を減算して結果値を得、そしてその結果値は、サンプル中の第１の異性体検体の量に等しいとみなす。

上でより詳細に議論したように、任意の適したアッセイを用いてもよい。アッセイは、サンプル中の検体の濃度を決定するための試薬を加えることを含む。この試薬は、少なくとも一次抗体および二次抗体を含み、したがって、アッセイは免疫測定法である。サンプル部分において実施されるアッセイは、各サンプル部分に関して、別々の反応容器中で順次に、もしくは同時に、または同じ反応容器中で順次に実施してもよい。「複合体」という用語は、検体に対する抗体がサンプル中の検体に結合した複合体のことをいう。

上記のように、異性体検体の測定は、遊離剤で処理したサンプルにおいて実施してもよい。サンプルに加える遊離剤の量は、内在性結合物質から異性体検体の実質的にすべてを置換するのに十分である量である。「内在性結合物質によって結合された異性体検体の実質的にすべてを置換する」という成句は、内在性結合物質から異性体検体が、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％、または１００％置換され、かつアッセイ中の検出に利用可能であることを意味する。

遊離剤を加えた後、内在性結合物質から異性体検体の実質的にすべてを置換する条件下で、サンプルを、しばらくの間、インキュベートする。インキュベーションの長さおよび条件は、例えば、遊離剤の性質、検体の性質、および検体の疑われる濃度の１つまたはそれ以上に左右される。いくつかの実施態様において、このステップのインキュベーション温度は、例えば、約５℃〜約９９℃、または約１５℃〜約７０℃、または約２０℃〜約４５℃であってもよい。インキュベーションの期間は、例えば、約０．２秒〜約２４時間、または約１秒〜約６時間、または約２秒〜約１時間、または約１〜約１５分である。インキュベーションは、便宜上、本明細書で議論したようなアッセイ媒体であってもよい媒体中で実施してもよいが、しかし、必要なわけではない。

本明細書に記載された原理による特定の一例は、検体を含有することが疑われるサンプルの第１および第２の部分において以下のアッセイ試薬を用いる方法に関する：（ｉ）本明細書に記載された原理による抗体試薬、（ｉｉ）検体類似体を含む化学発光粒子試薬、および（ｉｉｉ）小分子に対する小分子−結合部分または結合パートナーを含む光増感剤粒子試薬。

以下の特定の例では、異性体検体は、例として、かつ限定されることなく、ビタミンＤの非エピおよびエピ形態である。誘起発光免疫測定法を用いてもよい。誘起発光免疫測定法は、米国特許第５，３４０，７１６号（Ullman）を参照し、この開示は参照により本明細書に組み込まれている。１つのアプローチにおいて、アッセイでは、それとともに光増感剤を会合している粒子を用い、ここで、ビタミンＤ類似体は、粒子に結合されている（粒子−類似体試薬）。ビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態を含有することが疑われるサンプルの第１の部分におけるアッセイでは、化学発光試薬は、ビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す一次抗体を含む。サンプルの第２の部分におけるアッセイでは、ビタミンＤ検体の非エピ形態に結合するが、ビタミンＤ検体の非エピ形態に対する不十分なアッセイ結合親和性を示し、そしてビタミンＤ検体のエピ形態に対するアッセイ結合親和性を実質的に示さない二次抗体と共に、一次抗体を含む化学発光試薬を用いる。上の例において、一次抗体は小分子に結合されており、それは化学発光粒子上の小分子に対する結合パートナーに結合する。この化学発光試薬は、予め形成してもよいし、またはその場で形成してもよい。ビタミンＤ検体（非エピおよびエピ形態）は、本明細書に記載された原理によるビタミンＤに対する抗体への結合に関して粒子−類似体試薬と競合する。ビタミンＤ検体が存在する場合、化学発光試薬に接近してくる粒子−類似体試薬の分子数は、より少なくなる。したがって、アッセイシグナルは減少することになる。２つの標識がごく接近しているとき、光増感剤は一重項酸素を生成し、そして化学発光試薬を活性化する。活性化化学発光試薬は、その後、光を生じ、ここで、シグナルの減少が検体の存在下で観察される。発生する光量は、形成される複合体の量に関連しており、それは次に第１のサンプル部分におけるアッセイでは、サンプル中に存在するビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態の両方の量に関連し（第１の測定値）、そして第２のサンプル部分におけるアッセイでは、サンプル中に存在するビタミンＤ検体のエピ形態の量に関連する（第２の測定値）。第１の測定値から第２の測定値を減算すると、サンプル中のビタミンＤ検体の非エピ形態の量が得られる。

例としてビタミンＤを用いる誘起発光免疫測定法の別の特定の例において、例として、かつ限定されることなく、アッセイでは、それとともに化学発光化合物を会合する粒子を使用し、ここで、ビタミンＤ類似体は、粒子に結合される（粒子−類似体試薬）。第１のサンプル部分に関して、光増感剤試薬は、ビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す一次抗体を含み、それは、次に化学発光粒子上の小分子に対する結合パートナーに結合される小分子に結合されている。第２のサンプル部分に関して、光増感剤試薬および二次抗体を用いる。二次抗体は、ビタミンＤ検体の非エピ形態に結合するが、ビタミンＤ検体の非エピ形態に対して不十分なアッセイ結合親和性を示し、そしてビタミンＤ検体のエピ形態に対してアッセイ結合親和性を実質的に示さない。第１のサンプル部分に関して、ビタミンＤ検体の非エピ形態およびエピ形態はいずれも、ビタミンＤの一次抗体への結合に関して粒子−類似体試薬と競合する。ビタミンＤ検体が存在する場合、光増感剤試薬に接近してくる粒子−類似体試薬の分子数は、より少なくなる。したがって、アッセイシグナルが減少することになる。第２のサンプル部分に関して、ビタミンＤ検体の非エピ形態は二次抗体によって結合されるため、ビタミンＤ検体のエピ形態は、ビタミンＤの一次抗体への結合に関して、粒子−類似体試薬と競合する。ビタミンＤ検体のエピ形態が存在する場合、光増感剤試薬に接近してくる粒子−類似体試薬の分子数は、より少なくなる。したがって、アッセイシグナルが減少することになる。２つの標識がごく接近したときに、光増感剤は一重項酸素を生成し、そして粒子−類似体試薬の化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は、その後、光を生じ、ここで、シグナルの減少が検体の存在下で観察される。生じた光の量は、形成された複合体の量に関連しており、それは、次に、第１のサンプル部分におけるアッセイでは、サンプル中に存在するビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態の両方の量に関連しており（第１の測定値）、そして第２のサンプル部分におけるアッセイでは、サンプル中に存在するビタミンＤ検体のエピ形態の量に関連している（第２の測定値）。第１の測定値から第２の測定値を減算すると、サンプル中のビタミンＤ検体の非エピ形態の量が得られる。

ビタミンＤを用いる誘起発光アッセイの別の特定の例では、例として、かつ限定されることなく、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン（それらはビオチンに対する結合パートナーである）のような小分子に対する結合パートナーに結合される光増感剤粒子が用いられる。ビタミンＤ検体の非エピマーおよびエピマー形態の両方に結合する一次抗体に結合されたビオチンを含む、本明細書に記載された原理による抗体試薬を用いる。化学発光試薬は、検出システムの部分として用いられる。第１のサンプル部分または第２のサンプル部分のための反応媒体を、場合によっては、インキュベートしてアビジンとビオチンとの間の結合によって光増感剤粒子のアビジンまたはストレプトアビジンを抗体試薬のビオチンと結合させ、そしてまた、本明細書に記載された原理による抗体試薬の一次抗体間の特異的結合を可能にし、それは、ここで光増感剤粒子に結びついて、サンプルの検体および化学発光試薬の部分である検体に結合する。次いで、媒体に光照射して光増感剤を刺激し、それにより酸素を一重線状態に活性化するその励起状態が可能となる。検体の存在のため、ここで、光増感剤にごく接近している化学発光試薬がより少ないので、一重項酸素による化学発光試薬の活性化がより少なくなり、そして発光がより少なくなる。次いで、発光または放出された光の存在および／または量に関して媒体を試験し、その存在は、検体の存在および／または量に関連しており、ここで、シグナルの減少が検体の存在下で観察される。発生した光の量は、形成された複合体に関連しており、それは次に、第１のサンプル部分におけるアッセイでは、サンプル中に存在するビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態の両方の量に関連し（第１の測定値）、そして第２のサンプル部分におけるアッセイでは、サンプル中に存在するビタミンＤ検体のエピ形態の量に関連する（第２の測定値）。第１の測定値から第２の測定値を減算すると、サンプル中のビタミンＤ検体の非エピ形態の量が得られる。

サンプル中で、ビタミンＤを検出するためのアッセイフォーマットの別の例は、例として、かつ限定されることなく、ＡＣＭＩＡアッセイフォーマットである。ＡＣＭＩＡアッセイフォーマットでは、第１の成分としてクロム粒子を用い、それはビタミンＤまたはビタミンＤ類似体（クロム粒子試薬）でコーティングされている。第２の成分は、本明細書に記載された原理によるビタミンＤに対する抗体を含む抗体試薬である。抗体試薬中、抗体は、連結基によってレポーター酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）に結合されて抗体−酵素複合体（conjugate）を形成している。抗体試薬を、過剰量、すなわち、サンプルに存在するであろうビタミンＤ検体のすべてを結合するために必要となる量を超える量で反応容器に加える。遊離剤による処理に予めかけたサンプルの第１の部分を、ビタミンＤ検体の非エピおよびエピ形態のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す抗体を含む、上記のような一次抗体試薬で処理する；抗体は、サンプル中のビタミンＤに結合する。抗体−酵素複合体を媒体中のサンプルと混合してビタミンＤ検体を抗体に結合させる。次に、クロム粒子試薬を加えて、あらゆる過剰な抗体−酵素複合体を結合する。次いで、磁石を適用し、それにより懸濁液からクロム粒子および過剰の抗体−酵素のすべてを引き寄せ、そして上清を最終的な反応容器に移す。レポーター酵素の基質を最終的な反応容器に加え、そして酵素活性を、分光測光法により経時的な吸光度の変化として測定する。このシグナルの量は、サンプル中のビタミンＤの非エピおよびエピ形態の両方の量に関連する。遊離剤による処理に予めかけたサンプルの第２の部分を、上記のような一次抗体試薬および二次抗体で処理し、それは、ビタミンＤ検体の非エピ形態に結合するが、ビタミンＤ検体の非エピ形態に対して不十分なアッセイ結合親和性を示し、そしてビタミンＤのエピ形態に対して結合親和性を実質的に示さない二次抗体を含む。抗体−酵素複合体を媒体中のサンプルと混合してビタミンＤ検体を抗体に結合させる。次に、クロム粒子試薬を加えてあらゆる過剰な抗体−酵素複合体を結合する。次いで、磁石を適用し、これにより懸濁液からクロム粒子および過剰の抗体−酵素のすべてを引き寄せ、そして上清を最終的な反応容器に移す。レポーター酵素の基質を最終的な反応容器に加え、そして酵素活性を、経時的な吸光度の変化として分光測光法で測定する。このシグナルの量は、サンプル中のビタミンＤの非エピおよびエピ形態に関連する。

サンプル中のビタミンＤの異性体形態に関するアッセイの別の例（例として、かつ限定されない）は、固相として常磁性体粒子を用いるアクリジニウムエステル標識免疫測定法（ＡＤＶＩＡ免疫測定法）である。ビタミンＤアッセイのこの例に用いられる検出システムは、小分子複合体または捕捉複合体として小分子標識ビタミンＤ（捕捉部分）、固相（ＳＰ）として小分子コーティングされた常磁性体ラテックス粒子に対する結合パートナー、および本明細書に記載された原理によるビタミンＤ（検出抗体）に対するアクリジニウムエステル標識抗体を含む。小分子は、例えば、ビオチンまたはフルオレセインであってもよく、そしてそれぞれの結合パートナーは、ストレプトアビジンまたはフルオレセインに対する抗体であってもよい。ビタミンＤは、直接または、例えばタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような連結基を通して小分子に結合してもよい。患者サンプル中のビタミンＤは、アクリジニウムエステル標識検出抗ビタミンＤ抗体への結合に関して捕捉部分のビタミンＤと競合する。ビタミンＤを含有することが疑われるサンプルを１，８−ＡＮＳによる前処理にかける。アッセイは、第１および第２のサンプル部分において、本明細書に記載された原理によるそれぞれの抗体およびCentaur（登録商標）、Centaur（登録商標） XPまたはCentaur（登録商標）CP装置（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.、デラウエア州ニューアーク）用い、それとともに供給される製造元の説明書に従って実施してもよい。

本明細書に記載された原理による検体に関するアッセイの別の例は、固相として常磁性粒子を用いるアクリジニウムエステル標識免疫測定法（ＡＤＶＩＡ免疫測定法）である。このアッセイの例で異性体検体に対して用いる検出システムは、本明細書に記載された原理による抗体試薬を含み、ここでは、小分子は、捕捉複合体として検体に対する抗体（捕捉抗体）、抗体試薬の小分子のための結合パートナーでコーティングされた固相（ＳＰ）として常磁性ラテックス粒子、およびアクリジニウムエステル標識検体類似体（検出ハプテン）に連結される。アクリジニウムエステル標識を、検体に直接結合して検出ハプテンを形成してもよいし、または、例えばＢＳＡのようなタンパク質を含む連結基を用いてもよい。サンプルの検体は、抗検体抗体との結合に関してアクリジニウムエステル標識検出ハプテンと競合する。検体を含有することが疑われるサンプルを、遊離剤および消化剤の１つまたはそれ以上による前処理にかけてもよい。アッセイは、第１および第２のサンプル部分において、Centaur（登録商標）、Centaur（登録商標） XPまたはCentaur（登録商標） CP装置（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.、デラウエア州ニューアーク）を用い、それとともに供給される製造元の説明書に従って実施してもよい。上のアクリジニウムエステルアッセイの変法において、小分子は、例えば、ビオチンまたはフルオレセインであってもよく、そして小分子に対する結合パートナーは、それぞれ、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンまたはフルオレセインに対する抗体であってもよい。

試験されうるサンプル中の異性体検体の濃度は、一般に、例えば、約１０−５から約１０−１７Ｍまで、または約１０−６から約１０−１４Ｍまでの間で変化する。アッセイが定性的、半定量的または定量的かどうか（サンプル中に存在する検体の量に対して）、特定の検出技術および検体の期待される濃度といったような要件によって、通常、さまざまな試薬の濃度が決定される。

アッセイ媒体のさまざまな試薬の濃度は、一般に、興味の検体の濃度範囲、アッセイの性質などによって決定される。しかし、興味の範囲にわたってアッセイの感度を最適化するため、試薬のそれぞれの最終濃度は、通常、経験的に決定される。すなわち、検体の濃度における変化は重要であり、これにより正確に測定可能なシグナルの差異が得られるはずである。通常、シグナル発生システムの性質および検体の性質といった要件により、さまざまな試薬の濃度が決定される。

上記のように、サンプルおよび試薬は、媒体中で組み合せて提供される。媒体に添加する順序は変えてもよいが、本明細書に記載されたアッセイフォーマットのいくつかの実施態様に関して、特定の好ましいものがあるであろう。添加で最も単純な順序は、もちろん、同時にすべての物質を加えることであり、そして均一アッセイなどではアッセイ媒体がシグナルを有する効果を決定する。別法として、試薬のそれぞれ、または試薬のグループを、順次、合わせることができる。いくつかの実施態様では、上で議論したようにそれぞれの添加後にインキュベーションステップを含んでもよい。不均一アッセイでは、１つまたはそれ以上のインキュベーションステップの後に洗浄ステップを用いてもよい。

本明細書に記載された原理によるいくつかの例は、ビタミンＤを含有することが疑われるサンプル中のビタミンＤの２つの異性体形態の一方または両方の存在および量の一方または両方を決定する方法に関し、そして本明細書では「ビタミンＤに関するアッセイ」と称してもよい。アッセイに関して本明細書に用いるとき、「ビタミンＤ」という用語は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（また、カルシジオール、カルシフェジオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールまたは２５−ヒドロキシビタミンＤ（略して２５（ＯＨ）Ｄ）ともよばれる；カルシジオール；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（カルシトリオール；１，２５（ＯＨ）２Ｄ_３）；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_４；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_５；および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_６の１つまたはそれ以上の非エピおよびエピ形態の１つまたはそれ以上のことであり、上記のすべての代謝物を含む。

試験ステップ
アッセイ方法の１つのステップでは、本明細書に記載された原理による検体の１つまたはそれ以上の異性体形態および検体に対する抗体を含む複合体の存在に関して媒体を試験する。複合体の一方または両方の存在および／または量は、サンプル中の検体の異性体形態の１つまたはそれ以上の存在および／または量を示している。

「検体の量を測定する」という成句は、検体の異性体形態の１つまたはそれ以上の定量的、半定量的および定性的決定のことをいう。定量的、半定量的および定性的である方法、ならびに検体を決定するためのすべての他の方法は、検体の量を測定する方法であると考えられる。例えば、検体を含有することが疑われるサンプルにおいて単に検体の存在または非存在のみを検出する方法は、本発明の範囲内に含まれると考えられる。「検出すること」および「決定すること」という用語、ならびに測定に関する他の一般的な同義語は、本発明の範囲内にあると企図される。

多くの実施態様において、媒体の試験は、媒体からシグナルの検出を含む。シグナルの存在および／または量は、サンプル中の検体の異性体形態の１つまたはそれ以上の存在および／または量に関連する。特定の検出方式は、シグナル発生システムの性質に左右される。上に議論したように、それによってシグナル生成シグナルの標識が外部手段によって検出可能なシグナルを生成することができる多くの方法がある。シグナル発生システムの活性化は、シグナル発生システムメンバーの性質に左右される。

測定中の温度は、一般に、例えば約１０℃から約７０℃まで、または約２０℃から約４５℃まで、または約２０℃〜約２５℃である。１つのアプローチでは、ビタミンＤ検体の既知の濃度を用いて標準曲線を形成する。標準物質および他の対照を用いてもよい。

発光または任意の標識から生成される光は、目視により、写真によって、光量計で、分光測光法で、例えば光電子増倍管もしくはフォトダイオードの使用によって、またはその量を決定するために都合のよい他のいずれかの手段によって測定することができ、それは媒体中の検体の量に関連する。また、シグナルの存在および／または量に関する試験は、シグナルの検出を含み、それは一般に、単にシグナルを読み取るステップである。シグナルは、通常、機器を用いて読み取り、その性質はシグナルの性質に左右される。機器は、例えば、分光光度計、蛍光計、吸収分光計、照度計、および化学照度計であってもよいが、それらに限定されるわけではない。

アッセイを実施するための試薬を含むキット
検体の異性体形態を含有することが疑われるサンプルの部分においてアッセイを実施するためのキットが調製されうる。キットは、サンプルの各部において実施されるアッセイのための抗体試薬を含む。したがって、１つの抗体試薬は、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す抗体を含む。第１の異性体検体に結合するが、第１の異性体検体に対して不十分なアッセイ結合親和性を示し、そして第２の異性体検体に対してアッセイ結合親和性を実質的に示さない二次抗体が含まれる。キットは、アッセイを実施するための他の試薬をさらに含んでもよく、その性質は、特定のアッセイフォーマットに左右される。

試薬は、それぞれ、個々の容器中にあってもよく、または試薬の交差反応性および安定性に応じて、さまざまな試薬を１つまたはそれ以上の容器中で合わせることができる。キットは、例えば、さらなる特異的結合対メンバー、シグナル発生システムメンバー、および補助的試薬といったような、アッセイを実施するための他の個別に包装された試薬をさらに含むことができる。

キットのさまざまな試薬の相対量は、本方法中に起こる必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するため、そしてさらに実質的にアッセイの感度を最適化するために広範に変化することができる。適当な状況下で、キットの試薬の１つまたはそれ以上は、賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができ、それを溶解すると、本明細書に記載された原理による化合物試薬を用いて方法またはアッセイを実施するための適当な濃度を有する試薬溶液が提供されることになる。キットは、本明細書に記載された原理による化合物試薬を含む試薬を利用する方法の明細書をさらに含むことができる。

本明細書に用いるような「第１の」および「第２の」という表示は、完全に任意であり、そして部分間のなんらかの順序または序列を示唆する意味ではなく、あるいは本方法における部分の添加のなんらかの順序に相当するものでもない。

本明細書に用いられる「少なくとも」という成句は、指定された項目の数が、列挙される数と等しいか、またはそれを超えてもよいことを意味する。本明細書に用いられる「約」という成句は、列挙された数がプラスまたはマイナス１０％異なってもよいことを意味し、例えば、「約５」は、４．５〜５．５の範囲を意味する。

以下の議論は、例として、かつ限定されることなく、本明細書に記載される原理による具体的な実施例に関する。具体的な実施例は、本開示および添付の特許請求の範囲を限定しようとするものではない。多くの改変および代替の組成物、方法およびシステムは、本開示の精神と範囲から逸脱することなく考案されうる。

実施例
特に明記しない限り、下の実験の物質は、シグマアルドリッチケミカル社（Sigma-Aldrich Chemical Corporation）（ミズーリ州セントルイス）またはフルカケミカル社（Fluka Chemical Corporation）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入してもよい。本明細書に開示された部分およびパーセンテージは、特に明記しない限り、体積に対する質量による。

定義：
ｍｇ＝ミリグラム
ｇ＝グラム
ｎｇ＝ナノグラム
ｍＬ＝ミリリットル
μＬ＝マイクロリットル
μｍｏｌ＝マイクロモル
℃＝摂氏温度
ｍｉｎ＝分
ｓｅｃ＝秒
ｈｒ＝時間
ｗ／ｖ＝体積に対する質量
ｖ／ｖ＝体積に対する体積
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィー
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＭｅＯＰ＝１−メトキシ−２−プロパノール
ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＤＩ＝蒸留した
ＵＰＡ＝超粒子分析器（Ultra Particle Analyzer）
ＬＯＣＩ＝発光酸素チャネリング免疫測定法（luminescent oxygen channeling immunoassay）
Ａｂ＝抗体

非エピ−ビタミンＤおよびエピ−ビタミンＤの両方に対して十分なアッセイ結合親和性を示すビオチン化一次抗体の調製
１０ｍＭのＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中のビタミンＤ抗体５Ｈ１０の溶液（２．６３ｍｇ／ｍＬで０．８ｍＬ）（Bioventix、Farnham、Surrey、英国からのヒツジモノクローナル）をＮＨＳ−ｄＰＥＧ（登録商標）４−ビオチン（Quanta Biodesign Ltd.、Powell OH、パート番号１０２００）の水溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）４３．２μＬと混合した。加えたビオチン化試薬の量は、抗体を有するビオチン化剤の１０倍モル挑戦を表す。反応混合物を室温で３時間インキュベートし、次いで、０．５ＭのＴＲＩＳ８０μＬを添加して反応をクエンチした。溶出液の２６０ｎｍでの吸収が≦０．０３になるまで、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）デバイス（ＹＭ１０）中１０ｍＭのＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて反応混合物を緩衝液交換にかけた。抗体溶液（２．１ｍｇ／ｍＬタンパク質で１．０４ｍＬ）を１０μＬのＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００と混合し、そして０．２μｍのＡＣＲＯＤＩＳＣ（登録商標）シリンジフィルタ（Pall Corporation）を用いて硫酸ネオマイシンの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを濾過し、そして２〜８℃で保存した。

ＥＰＲＭ−ＥＤＡビーズの調製
ＥＰＲＭビーズ（２０００ｍｇ、２０．０ｍＬ）を４０ｍＬバイアルに加える。ＥＰＲＭビーズは、米国特許第７,１７９,６６０号に記載されたものと類似の方法によって調製し、そして化学発光化合物は、ユーロピウムキレートを有する２−（４−（Ｎ，Ｎ，ジ−テトラデシル）−アニリノ−３−フェニルチオキセンである。ＥＤＡ（８００ｍｇ、８９０μＬ）をＭＥＳ ｐＨ６緩衝液（「緩衝液」）１０ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ約４．２ｍＬと合わせた。混合物のｐＨは、約６．９であるか、またはそうなるように調整する。ＥＤＡ溶液をＥＰＲＭビーズに加えてボルテックスし、そして混合物を室温で１５分間揺動させる。１５ｍＬバイアル中でナトリウムシアノボロヒドリド（４００ｍｇ）を脱イオン水１０ｍＬと合わせ、そして合わせたものを上のビーズ混合物に加える。混合物を３７℃で１８〜２０時間振盪する。ビーズを６本の４０ｍＬ遠心管に移す。ＭＥＳ緩衝液を加えて体積を３５ｍＬにし、そして混合物を１９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清をデカントし、そして撹拌ロッドを用いてビーズを緩衝液２ｍＬ中で再懸濁し、そしてさらなる緩衝液を３５ｍＬに加える。混合物を冷たく保つために氷を用いて、混合物を出力１８ワットで３０秒間超音波処理する。洗浄／超音波処理ステップを４回実施してすべての活性化化学物質を除去する。最後のＭＥＳ緩衝液の遠心分離後、５％のＭｅＯＰおよび０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する緩衝液（「第２の緩衝液」）２ｍＬを、再懸濁ステップのため、管に加える。超音波処理前に、さらなる第２の緩衝液を３５ｍＬまで加える。ビーズ懸濁液を１９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清を捨てる。最後の超音波処理では、各管中に第２の緩衝液１２ｍＬを用いて２５ｍｇ／ｍＬ希釈溶液を得る。粒径は、ＵＰＡ機器で測定して２７７ｎｍである。

ＥＰＲＭケミビーズ（chemibead）は、米国特許第６,１５３,４４２号および米国特許出願公開第２００５０１１８７２７Ａ号に記載された方法と類似のやり方で調製し、それらの関連した開示は、参照により本明細書に組み込まれている。ＥＰＲＭケミビーズは、アミノデキストラン内層および遊離アルデヒド官能基を有するデキストランアルデヒド外層を含む。例えば、米国特許第５，９２９，０４９号、同第７，１７９，６６０号および同第７，１７２，９０６号を参照し、それらの関連した開示は、参照により本明細書に組み込まれている。反応は、例えば、ＭＥＳのような適した緩衝液を用いて緩衝化された水性媒体中、ｐＨ約５．５〜約７．０、または約６で、約０〜約４０℃の温度で、約１６〜約６４時間の間実施する。例えば、カルボキシメトキシアミンヘミ塩酸塩（ＣＭＯ）のような適したクエンチング剤の添加によって反応をクエンチし、そしてその後、粒子を洗浄する。

外側のデキストランアルデヒド層上のアルデヒド基は、還元的アミノ化条件下でエチレンジアミンと反応してエチレン鎖および末端アミン基を含むペンダント部分を有する試薬ＥＰＲＭＥＤＡを形成する。還元的アミノ化条件は、例えば、金属水素化物のような還元剤の使用を含む。反応は、水性媒体中、約２０℃〜約１００℃の反応中の温度で約１時間〜約４８時間の間実施する。

２５−ＯＨビタミンＤ_３ ３−カルバメート（２５−ＯＨビタミンＤ_２ ３−カルバメート）の合成
５ｍｌのフラスコ（ホイルで覆う）中、無水アセトニトリル１ｍＬ中のChemReagents.com、テキサス州シュガーランドから購入した２５−ＯＨ ＶＤ_３２２ｍｇ（５５μｍｏｌ）、炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）１００ｍｇ（４２０μｍｏｌ）、トリエチルアミン１００μＬの混合物を窒素下、室温で１８時間撹拌して活性化２５−ＯＨ ＶＤ_３を調製した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝２：１）は、出発物質が残っていることを示さなかった。１０ｍｌのフラスコにカルボキシメトキシルアミンヘミ塩酸塩（ＣＭＯ）１５０ｍｇ、トリエチルアミン０．３ｍｌおよびＤＭＦ１ｍｌを加えることによって懸濁液を調製した。活性化２５−ＯＨ ＶＤ_３を含有する溶液を、ＣＭＯ懸濁液に撹拌しながら滴加し、これをさらに１８時間続けた。真空を適用して可能な限り溶媒を除去した（加熱浴温度は、５０℃を超えてはならない）。残留物にＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）を加え、それをブライン２ｍｌで３回洗浄した。有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、そして濾過した；ロータリエバポレーターを用いて溶媒を除去した。乾燥後、粗生成物（４２ｍｇ）を得、そしてＨＰＬＣによって精製した。高真空下で乾燥した後、純粋な生成物（２４ｍｇ）を得た。生成物を無水ＤＭＳＯ１．２ｍｌに溶解した。アリコートをバイアルに移し、それを−７０℃に保った。

ケミビーズ試薬を得るためのＥＰＲＭＥＤＡと２５−ＯＨビタミンＤ_３ ３−カルバメートとのカップリング
２５−ＯＨビタミンＤ_３ ３−カルバメート（上記のように調製したＤＭＳＯ中のアリコート１０μＬ）（０．２ｍｇ）を２ｍＬバイアルに加えた。ＥＤＡＣ（６．８ｍｇ）およびＳＮＨＳ（９．４ｍｇ）ならびに乾燥ＤＭＳＯ（３ｍｇ／ｍＬ）２．２７ｍＬを５ｍＬバイアルに加えた。ＥＤＡＣ／ＳＮＨＳ溶液（１９０μＬ）を上の２ｍＬバイアルの内容物（１ｍｇ／ｍＬ）と合わせて活性化２５−ＯＨビタミンＤ_３ ３−カルバメートを調製した。混合物を室温で１８時間回転させた。１６％ＧＡＦＡＣ（登録商標）界面活性剤溶液のアリコート（GAF Corporation、ニュージャージー州ウェイン）（０．１５％）０．４ｍＬを脱イオン水３．６ｍＬで１．６％まで希釈した。

ビタミンＤ_３（８．５ｍｇ）およびＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ）８５０μＬを合わせた。撹拌棒を備えた１０ｍＬ丸底フラスコ（標識３３２３−０６４Ｂ）にＥＰＲＭＥＤＡ２．０ｍＬ（２００ＭＧ）、続いて上のビタミンＤ_３溶液４００μＬ（４ｍｇ）を加えた。混合物を室温で一夜撹拌した。

撹拌棒を備えた１０ｍＬ丸底フラスコに、ＥＰＲＭＥＤＡ（上記のように調製した）２．０ｍＬ（２００ｍｇ）、続いて１．６％のＧＡＦＡＣ（登録商標）界面活性剤溶液（０．１５％）２６０μＬを、穏やかに撹拌しながら加えた。小さな試験管に無水ＤＭＳＯ ５０４μＬ、を加えた。続いて上記のように調製した活性化ビタミンＤ_３−３−カルバメート６０μＬ（０．０６のｍｇ）を加え；そして混合物をＥＰＲＭ−ＥＤＡビーズ混合物に加えた。ビーズ懸濁液の総ＤＭＳＯ含量は２０％であった。反応容器を室温で一夜撹拌するにまかせた。次いで、ビーズをダイアフィルトレーションによって洗浄した。

１０％のＭｅＯＰ／１％のＧＡＦＡＣ（登録商標）／ＭＥＳ ｐＨ６緩衝液を用いて各ビーズロットを最大２０ｍＬの作業体積にした。混合物を緩衝液５体積で限外濾過し、次いで、混合物を冷たく保つため氷を用いて、プローブソニケーターを用いて１８〜２１ワットで超音波処理した。ダイアフィルトレーション／超音波処理を５０体積まで継続し、溶出液サンプルを３５、４０、４５および５０体積で採取した。緩衝液をＬＯＣＩハプテン洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％の硫酸ネオマイシン、０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）４０５Ｘおよび０．１５％のＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００（ｐＨ７．２）に変更し、その際、１０体積を用いた。混合物を約７ｍＬまで減らし、そしてＵＰＡを実施した。粒子サイズは、３３２３−０６４Ａ＝２８９ｎｍおよび３３２３−０６４Ｂ＝２９８ｎｍであった。固形物パーセントを決定し、そしてビーズロットをＬＯＣＩハプテン洗浄緩衝液ｐＨ７．２で１０ｍｇ／ｍＬにした。収量は１６０．４ｍｇであった。

非エピ−ビタミンＤおよびエピ−ビタミンＤに関するアッセイ
アッセイは、ＤＩＭＥＮＴＩＯＮ（登録商標）ＶＩＳＴＡ（登録商標）分析器（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.、イリノイ州ディアフィールド）においてＬＯＣＩアッセイのプロトコールに従い、そして様々な量の非エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３および／または３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３を含有する標準物質溶液を用いて実施した。本実施例において、アッセイでは、化学発光試薬として、上記のように調製したケミビーズ試薬を用いる。サンプル部分を、（ｉ）上記のように調製した一次ビオチン化抗体試薬（第１のサンプル部分）または（ｉｉ）一次ビオチン化抗体および二次抗体（第２のサンプル部分）いずれかと、次いでケミビーズ試薬と反応させる。第２のサンプル部分では、二次抗体は、ビタミンＤ抗体１０Ｈ９（ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ビタミンＤアッセイに見いだされるマウスモノクローナル、Siemens Healthcare Diagnostics Inc.、デラウエア州ニューアーク）の溶液（２．６３ｍｇ／ｍＬで０．８ｍＬ）である；二次抗体は、過剰量で存在した（７５μｇ／ｍＬまたは５Ｈ１０抗体の量の１００倍）。ケミビーズは、サンプルからの検体によって占有されないモノクローナル抗体結合部位の分画に結合する。その後、ストレプトアビジン結合増感剤ビーズを反応混合物に加える。これにより、ケミビーズ／センシビーズ対が形成され、その濃度は、ビタミンＤの両方の形態（第１のサンプル部分）またはビタミンＤのエピ形態（第２のサンプル部分）いずれかの濃度に反比例する。６８０ｎｍで照射すると、増感剤ビーズは、一重項酸素を生成し、それはセンシビーズと対になるケミビーズ中に拡散し、オレフィン色素と反応し、そして約６１２ｎｍで化学発光シグナルを誘発し、それは検体濃度に反比例する。

ストレプトアビジン−増感剤ビーズ（「センシビーズ」）は、米国特許第６，１５３，４４２号、同第７. ０２２，５２９号、同第７，２２９，８４２号および米国特許出願公開第２００５０１１８７２７Ａ号に記載されたものと類似の方法を用いて調製する。光増感剤は、ビス−（トリヘキシル）−ケイ素−ｔ−ブチル−フタロシアニンであった。センシビーズ試薬の濃度は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０中、２００μｇ／ｍＬであった。上記のように調製したＥＰＲＭ−ＥＤＡ−２５−ＯＨビタミンＤ_３粒子試薬を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％の洗浄剤を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．２中、２００μｇ／ｍＬの濃度で「ケミビーズ試薬」として用いた。

それぞれのサンプル部分について、時間ｔ＝０秒で、ビオチン化抗体試薬２０μＬおよび水２０μＬを反応容器に加えた。２１．６秒後、サンプル１２μＬ、続いて水８μＬを加えた。ｔ＝４１４．０秒で、ケミビーズ試薬４０μＬ、続いて水２０ｍＬを加えた。次いで、４５７．２秒で、センシビーズ試薬を投入した。反応順序を開始後、測定には６０１．２秒かかった。ビタミンＤのエピおよび非エピ形態の両方の量を表す第１の測定値およびビタミンＤのエピ形態のみの量を表す第２の測定値が得られた。

上のアッセイフォーマットを用いて、様々な量の非エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（非−エピ−ＶＤ）を添加したが、３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤ_３（３−エピ−ＶＤ）を添加してない血清サンプルにおいてアッセイを実施した。このアッセイのセットは、機器および１０Ｈ９二次抗体を含有した、または含有しなかったサンプルを較正するために実施した。結果を下の表１にまとめ、そして図３に示したグラフ中にプロットする。

結果は、アッセイでは、存在する過剰量の１０Ｈ９二次抗体を用いても、いくらかの非エピ−ＶＤがなお検出されることを示す。したがって、この機器システムにおいて１０Ｈ９二次抗体を用いる他のアッセイで得られた結果を調整して、この較正の結果を説明しなければならないであろう。

上のアッセイフォーマットを用いて、様々な量の非エピ−ＶＤおよび３−エピ−ＶＤを添加した血清サンプルにおいてアッセイを実施した。１０Ｈ９二次抗体あり（＋１０Ｈ９）およびなし（−１０Ｈ９）の両方でアッセイを実施した。図２および３のグラフに関して「予測１」および「予測２」の値が得られる。値はｎｇ／ｍＬである；差＝＋１０Ｈ９値と予測１の値との間の差。「添加量」は、サンプルに添加した３−エピ−ＶＤの量である。それらの結果を下の表２にまとめる。

表２の上のデータを用いて、３−エピ−ＶＤの補正した量を以下のように算出する；３−エピマーの予測された量を第２〜最後の欄に記載する。上の表２の各欄の説明
欄１：−１０Ｈ９は、１０Ｈ９ Ａｂの非存在下で測定されたｎｇ／ｍＬの２５（ＯＨ）Ｄである。これは、２５（ＯＨ）Ｄのｎｇ／ｍＬの総量を表す（Ｄ_２＋Ｄ_３＋３エピ×交差反応性）。
欄２：＋１０Ｈ９は、１０Ｈ９ Ａｂの存在下で測定されたｎｇ／ｍＬの２５（ＯＨ）Ｄである。これは、抑制された総２５（ＯＨ）Ｄのｎｇ／ｍＬを表す（部分的Ｄ_２＋部分的Ｄ_３＋３エピ×交差反応性）。
欄３：予測１は、サンプル中に存在する３−エピマーがない場合、１０Ｈ９の存在下でのｎｇ／ｍＬの２５（ＯＨ）Ｄの量である（部分的Ｄ_２＋部分的Ｄ_３）。
欄４：差は、欄２マイナス欄３である＝３エピ×交差反応性。
欄５：予測２は、交差反応性で割った欄４、すなわち（３エピ×交差反応性）／交差反応性＝３エピｎｇ／ｍＬ）である。
欄６：添加量は、３−エピマーをサンプル中にどれくらい添加したかである。欄５および欄６の結果がどれだけ近いかを示すには、この欄をカラム５と比較しなければならない。それらの結果を表３にまとめる。補正平均２５（ＯＨ）Ｄのｎｇ／ｍＬは、１０Ｈ９ Ａｂの非存在下で測定された総ｎｇ／ｍＬの２５（ＯＨ）Ｄから、測定された３−エピマーｎｇ／ｍＬを減算した後に算出された。ＣＸＲは、３−エピマー干渉が除去された後の２つの反応容器アッセイの３−エピマー交差反応性を意味する。これは、上で言及した交差反応性と同じでない。表２の交差反応性は、５Ｈ１０ Ａｂの３−エピマーとの交差反応性である。表３の交差反応性は、３−エピマーの濃度を最終的な２５（ＯＨ）Ｄのｎｇ／ｍＬ濃度から減算した後のアッセイの交差反応性である。

表３中、欄１、２、３、４および５は、それぞれ表２中の欄１、２、７、４および５に対応する。欄６は補正されており、それは３−エピマーなしのｎｇ／ｍＬの２５（ＯＨ）Ｄである。基本的に、標準物質Ｌ２−Ｌ５に対するｎｇ／ｍＬの２５（ＯＨ）Ｄ値は、１０Ｈ９抗体の存在下および非存在下での２５（ＯＨ）Ｄ値の間のｎｇ／ｍＬの差に対してプロットした。このプロットから生じた係数を用いて、その差によって非３−エピマー２５（ＯＨ）Ｄの値を予測した。これは、１０Ｈ９抗体が非エピマーにしか結合しないので、その差が非３−エピマーシグナルを表す抑制されたシグナルであるためである。

本明細書に引用されたすべての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれたことが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。

上記の実施例は、本明細書に記載された原理を表す多くの具体的実施例のいくつかの例示でしかないことを理解すべきである。当業者が、以下の特許請求の範囲によって定義された範囲を逸脱することなく、多くの他の変法を容易に考案することができることは明らかである。

特に明記しない限り、下の実験の物質は、シグマアルドリッチケミカル社（Sigma-Aldrich Chemical Corporation）（ミズーリ州セントルイス）またはフルカケミカル社（Fluka Chemical Corporation）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入してもよい。本明細書に開示された部およびパーセンテージは、特に明記しない限り、体積に対する質量による。

Claims (16)

1. サンプル中の第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を決定する方法であって、
   （ａ）サンプルの一部において、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対して十分なアッセイ結合親和性を示す一次抗体を用いてアッセイを実施して第１の測定値を得ることによって第１の異性体検体および第２の異性体検体の総量測定すること；
   （ｂ）サンプルの一部において、一次抗体を用いてアッセイを実施して第２の測定値を得ることによって第２の異性体検体の量を測定すること、ここで、第１の異性体検体に結合するが、第１の異性体検体に対して不十分なアッセイ結合親和性を示し、そして第２の異性体検体に対してアッセイ結合親和性を実質的に示さない二次抗体を過剰に用いて第１の異性体検体の一次抗体への結合を遮断する；および
   （ｃ）第２の測定値をサンプル中の第２の異性体検体の量に等しいとみなし、そして第１の測定値から第２の測定値を減算して結果値を得、そして該結果値をサンプル中の第１の異性体検体の量に等しいとみなすこと、
   を含む方法であって、
   前記２つの異性体検体が２５−ヒドロキシビタミンＤ３および３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤ３である前記方法。
2. 前記アッセイが均一アッセイである、請求項１に記載の方法。
3. 前記アッセイが不均一アッセイである、請求項１に記載の方法。
4. 前記アッセイが競合的アッセイである、請求項１に記載の方法。
5. 前記アッセイが非競合的アッセイである、請求項１に記載の方法。
6. 前記アッセイが前記検体の類似体を含む試薬を用い、該類似体が標識を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記アッセイが粒子を含む試薬を用いる、請求項１に記載の方法。
8. 前記アッセイが光増感剤試薬および化学発光粒子を含む試薬を用いる、請求項１に記載の方法。
9. 前記光増感剤試薬が粒子を含む、請求項８に記載の方法。
10. サンプル中の第１の異性体検体および第２の異性体検体の量を決定する方法であって、
    （ａ）サンプルの一部において、少なくとも約１０ ⁷ リットル／モルの、第１の異性体検体および第２の異性体検体のそれぞれに対する結合親和性を有する一次抗体を用いてアッセイを実施して第１の測定値を得ることによって第１の異性体検体および第２の異性体検体の総量を測定すること；
    （ｂ）一次抗体を用いてサンプルの一部においてアッセイを実施して第２の測定値を得ることによって第２の異性体検体の量を測定すること、ここで、約１０⁶〜約１０⁸リットル／モルの第１の異性体検体に対する結合親和性および約１０⁴リットル／モルより低い第２の異性体検体に対する結合親和性を有する二次抗体を過剰に用いて第１の異性体検体の一次抗体への結合を遮断する；および
    （ｃ）サンプルで第２の測定値を第２の異性体検体の量に等しいとみなし、そして第１の測定値から第２の測定値を減算して結果値を得、そしてその結果値をサンプル中の第１の異性体検体の量に等しいとみなすこと、
    を含む方法であって、
    前記２つの異性体検体が２５−ヒドロキシビタミンＤ ₃ および３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤ ₃ である前記方法。
11. 前記アッセイが、競合的均一アッセイ、競合的不均一アッセイ、非競合的均一アッセイまたは非競合的不均一アッセイである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記アッセイが、前記検体の類似体を含む試薬を用い、該類似体が標識を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記アッセイが粒子を含む試薬を用いる、請求項１０に記載の方法。
14. 前記アッセイが光増感剤試薬および化学発光粒子を含む試薬を用いる、請求項１０に記載の方法。
15. 前記光増感剤試薬が粒子を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記アッセイが発光酸素チャネリング免疫測定法である、請求項１０に記載の方法。

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