JPH06109727A - １，２５−ジヒドロキシビタミンｄの検定法 - Google Patents
１，２５−ジヒドロキシビタミンｄの検定法Info
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- JPH06109727A JPH06109727A JP21688293A JP21688293A JPH06109727A JP H06109727 A JPH06109727 A JP H06109727A JP 21688293 A JP21688293 A JP 21688293A JP 21688293 A JP21688293 A JP 21688293A JP H06109727 A JPH06109727 A JP H06109727A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 １，２５−ジヒドロキシビタミンＤの免疫検
定法及びそれに使用するキットを提供する。 【構成】 試料を有機溶媒を用いて抽出し、レセプター
蛋白質、標識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ及
びレセプターに結合することができる抗体を添加し、標
識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのレセプター
蛋白質との相対的結合度を測定する工程を含んでなる試
料中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの競争結合検
定法、及びそれに用いられるキット。
定法及びそれに使用するキットを提供する。 【構成】 試料を有機溶媒を用いて抽出し、レセプター
蛋白質、標識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ及
びレセプターに結合することができる抗体を添加し、標
識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのレセプター
蛋白質との相対的結合度を測定する工程を含んでなる試
料中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの競争結合検
定法、及びそれに用いられるキット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血液または血液成分試料
中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3 のレベルを試
験する検定法に関する。より詳しくは抽出及び免疫検定
両方の使用に関する。本発明はアメリカ合衆国ナショナ
ル・インスチチュート・オブ・ヘルス(National Instit
utes Of Health) （ＮＩＨ）助成金ＤＫ１４８８１によ
り授与された政府支援によりなされた。合衆国政府はこ
の発明に一定の権利を有している。
中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3 のレベルを試
験する検定法に関する。より詳しくは抽出及び免疫検定
両方の使用に関する。本発明はアメリカ合衆国ナショナ
ル・インスチチュート・オブ・ヘルス(National Instit
utes Of Health) （ＮＩＨ）助成金ＤＫ１４８８１によ
り授与された政府支援によりなされた。合衆国政府はこ
の発明に一定の権利を有している。
【０００２】
【従来の技術】ビタミンＤは哺乳動物での多くの有用な
機能を有する周知のビタミンである。ビタミンＤは肝臓
中における２５−ヒドロキシ化及びそれに続く腎臓中に
おける１−ヒドロキシル化によって活性化される。この
ことは腸内カルシウム輸送、骨からのカルシウム移動及
び腎臓中でのカルシウムの再吸収の増加を刺激する。ビ
タミンＤの活性形態、１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ（ａ／ｋ／ａＤ3 ）、はカルシウム及びリンに対する
必要性によって調節される。低血清カルシウム濃度は上
皮小体腺を刺激して、腎臓における“１，２５−（Ｏ
Ｈ）2 Ｄ”の製造のひきがねとなる上皮小体ホルモンを
分泌する。次いで１，２５−（ＯＨ）2 Ｄは腸にカルシ
ウム及びリンを吸収させ、骨にカルシウムを移動させ、
カルシウムの腎臓吸収を刺激する。これらの効果は血液
カルシウムを正規のレベルまで高め、ひいては蛋白上皮
小体分泌を停止させ、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄの製造を
停止させる。この代謝生成物はまた鉱物質及び骨格のホ
メオスタシス（恒常性）に主要な役割を演じると考えら
れる。
機能を有する周知のビタミンである。ビタミンＤは肝臓
中における２５−ヒドロキシ化及びそれに続く腎臓中に
おける１−ヒドロキシル化によって活性化される。この
ことは腸内カルシウム輸送、骨からのカルシウム移動及
び腎臓中でのカルシウムの再吸収の増加を刺激する。ビ
タミンＤの活性形態、１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ（ａ／ｋ／ａＤ3 ）、はカルシウム及びリンに対する
必要性によって調節される。低血清カルシウム濃度は上
皮小体腺を刺激して、腎臓における“１，２５−（Ｏ
Ｈ）2 Ｄ”の製造のひきがねとなる上皮小体ホルモンを
分泌する。次いで１，２５−（ＯＨ）2 Ｄは腸にカルシ
ウム及びリンを吸収させ、骨にカルシウムを移動させ、
カルシウムの腎臓吸収を刺激する。これらの効果は血液
カルシウムを正規のレベルまで高め、ひいては蛋白上皮
小体分泌を停止させ、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄの製造を
停止させる。この代謝生成物はまた鉱物質及び骨格のホ
メオスタシス（恒常性）に主要な役割を演じると考えら
れる。
【０００３】それゆえ、血液中の１，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤのレベルの測定はある種の疾病（例えば、
腎臓衰弱、骨そしょう症）についての重要な診断手段で
ある。またそれは将来において有用な研究情報を提供す
ることが期待される。この代謝生成物の競争検定法はす
でにいくつか存在する。エス．ドコウらアナリ・バイオ
ケミ(S. Dokoh et al., Anal. Biochem.) 、１１６、２
１１−２２２（１９８１）、ジェー．アイスマンらアー
キ・バイオケミ・バイオフィジ(J. Eisman et al., Arc
h. Biochem. Biophys.) 、１７６、２３５−２４３（１
９７９）、エイチ．ペリーらバイオケミ・バイオフィジ
・リサ・コミニュ( H. Perry et al., Biochem. Biophy
s. Res. Commun.)、１１２、４３１−４３６（１９８
３）、アール．ビューロンらアン・エンドクリン(R. Bo
uillon et al., Ann. Endocrin.)、４１、４３５−３６
（１９８０）、アール．ビューロン、クリニ・ケミ(R.
Bouillon, Clin. Chem.)、２６、５６２−５６７（１９
８０）、アール．ビューロン、ユーロ・ジェー・バイオ
ケミ(R. Bouillon, Eur. J. Biochem.) 、６６、２８５
−２９１（１９７６）、イー．メイワーらクリニ・チム
・アクタ(E.Mawer, et al., Clin. Chim. Acta.) 、１
９０、１９９−２０９（１９９０）、エス．マノラガス
らジェー・クリニ・エンドクリノル・メタボ(S. Manola
gas, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.) 、５６、
７５１−７６９（１９８３）、ピー．ブランボーグらバ
イオケミストリー(P. Brumbaugh, et al., Biochemistr
y)、１３、４０９１−４０９７（１９７４）、ティー．
レインハードら(T. Reinhardt, et al.)、５８、ジェー
・クリニ・エンドクリノル・メタボ９１−９８（１９８
４）、アール．ホルストらキドニー・インタ(R. Horst,
et al., KindneyInt.)、３８、Ｓ２８−Ｓ３５（１９
９０）参照。これら文献及びここに参照するその他すべ
ての刊行物の開示はここに完全に述べられたものとして
本発明の説明に用いられる。
シビタミンＤのレベルの測定はある種の疾病（例えば、
腎臓衰弱、骨そしょう症）についての重要な診断手段で
ある。またそれは将来において有用な研究情報を提供す
ることが期待される。この代謝生成物の競争検定法はす
でにいくつか存在する。エス．ドコウらアナリ・バイオ
ケミ(S. Dokoh et al., Anal. Biochem.) 、１１６、２
１１−２２２（１９８１）、ジェー．アイスマンらアー
キ・バイオケミ・バイオフィジ(J. Eisman et al., Arc
h. Biochem. Biophys.) 、１７６、２３５−２４３（１
９７９）、エイチ．ペリーらバイオケミ・バイオフィジ
・リサ・コミニュ( H. Perry et al., Biochem. Biophy
s. Res. Commun.)、１１２、４３１−４３６（１９８
３）、アール．ビューロンらアン・エンドクリン(R. Bo
uillon et al., Ann. Endocrin.)、４１、４３５−３６
（１９８０）、アール．ビューロン、クリニ・ケミ(R.
Bouillon, Clin. Chem.)、２６、５６２−５６７（１９
８０）、アール．ビューロン、ユーロ・ジェー・バイオ
ケミ(R. Bouillon, Eur. J. Biochem.) 、６６、２８５
−２９１（１９７６）、イー．メイワーらクリニ・チム
・アクタ(E.Mawer, et al., Clin. Chim. Acta.) 、１
９０、１９９−２０９（１９９０）、エス．マノラガス
らジェー・クリニ・エンドクリノル・メタボ(S. Manola
gas, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.) 、５６、
７５１−７６９（１９８３）、ピー．ブランボーグらバ
イオケミストリー(P. Brumbaugh, et al., Biochemistr
y)、１３、４０９１−４０９７（１９７４）、ティー．
レインハードら(T. Reinhardt, et al.)、５８、ジェー
・クリニ・エンドクリノル・メタボ９１−９８（１９８
４）、アール．ホルストらキドニー・インタ(R. Horst,
et al., KindneyInt.)、３８、Ｓ２８−Ｓ３５（１９
９０）参照。これら文献及びここに参照するその他すべ
ての刊行物の開示はここに完全に述べられたものとして
本発明の説明に用いられる。
【０００４】これら従来技術の検定法は哺乳動物の血清
または血漿を典型的にはビタミンＤとその代謝生成物を
抽出し大部分の阻害脂質類をあとに残す有機溶媒によっ
て処理される。次にこれら抽出物はカラム上で精製され
る。半精製された１，２５−（ＯＨ）2 Ｄは次に高性能
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でさらに精製され
て精製１，２５−（ＯＨ）2 Ｄが得られる。ＨＰＬＣ精
製は好ましい腸内源ビタミンＤレセプター蛋白質を用い
る場合には臨界的な段階であることが発見されている。
例えば、前記ジェー．アイスマンら参照。あいにくこの
ＨＰＬＣ段階は時間がかかり、比較的コスト高の装置を
必要とする。ＨＰＬＣ後、血清から単離された１，２５
−（ＯＨ）2 Ｄは次いで標識した１，２５−（ＯＨ）2
Ｄ及び１，２５−（ＯＨ）2 Ｄと特異的に結合する蛋白
質である１，２５−（ＯＨ）2 Ｄレセプターまたはビタ
ミンＤ代謝物に対する抗体のいずれかとの混合物に添加
される。血清中の標識しない１，２５−（ＯＨ）2 Ｄは
放射線標識した１，２５−（ＯＨ）2 Ｄと競争する。標
識した１，２５−（ＯＨ）2 Ｄが標識しない１，２５−
（ＯＨ）2 Ｄによって減らされた程度を試料中に存在す
る１，２５−（ＯＨ）2 Ｄを定量する標準曲線を作り上
げるのに用いられる。標識した１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ
の結合のレベルは典型的には遊離ないし未結合の標識し
た１，２５−（ＯＨ）2 Ｄをデキストラン塗工木炭上に
吸収させて定量される。例えば、ジェー．ハッダッドら
ジェー・クリニク・エンドクル(J. Haddad, et al., J.
Clin. Endocr.) 、３３、９９２−９９５（１９７１）
参照。
または血漿を典型的にはビタミンＤとその代謝生成物を
抽出し大部分の阻害脂質類をあとに残す有機溶媒によっ
て処理される。次にこれら抽出物はカラム上で精製され
る。半精製された１，２５−（ＯＨ）2 Ｄは次に高性能
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でさらに精製され
て精製１，２５−（ＯＨ）2 Ｄが得られる。ＨＰＬＣ精
製は好ましい腸内源ビタミンＤレセプター蛋白質を用い
る場合には臨界的な段階であることが発見されている。
例えば、前記ジェー．アイスマンら参照。あいにくこの
ＨＰＬＣ段階は時間がかかり、比較的コスト高の装置を
必要とする。ＨＰＬＣ後、血清から単離された１，２５
−（ＯＨ）2 Ｄは次いで標識した１，２５−（ＯＨ）2
Ｄ及び１，２５−（ＯＨ）2 Ｄと特異的に結合する蛋白
質である１，２５−（ＯＨ）2 Ｄレセプターまたはビタ
ミンＤ代謝物に対する抗体のいずれかとの混合物に添加
される。血清中の標識しない１，２５−（ＯＨ）2 Ｄは
放射線標識した１，２５−（ＯＨ）2 Ｄと競争する。標
識した１，２５−（ＯＨ）2 Ｄが標識しない１，２５−
（ＯＨ）2 Ｄによって減らされた程度を試料中に存在す
る１，２５−（ＯＨ）2 Ｄを定量する標準曲線を作り上
げるのに用いられる。標識した１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ
の結合のレベルは典型的には遊離ないし未結合の標識し
た１，２５−（ＯＨ）2 Ｄをデキストラン塗工木炭上に
吸収させて定量される。例えば、ジェー．ハッダッドら
ジェー・クリニク・エンドクル(J. Haddad, et al., J.
Clin. Endocr.) 、３３、９９２−９９５（１９７１）
参照。
【０００５】近年、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に
対するモノクロナール抗体（ｍＡｂ）が数種開発さた。
米国特許第４，８１６，４１７号にはわれわれの研究所
が新しい検定法を報告している。この方法は血清１，２
５ビタミンＤと標識した１，２５ビタミンＤの間の競争
結合検定においてレセプターを「仕上げライン」として
使用した後の溶液からの薬剤レセプターへのこれら抗体
の使用を含んでいる。この検定法は直接（中間体の精製
なしに）血清を検定する。しかしながら、他のビタミン
Ｄ代謝生成物類からの妨害を少なくするためにスクリー
ニング物質としてビタミンＤ輸送蛋白質が必要である。
この免疫検定法は利点があるけれども、現在ある種の疾
病及び他の状態の血液試料は必要とされるビタミンＤ輸
送蛋白質のレベルを大幅に変動させることがあることが
発見された。これはいくつかの変動（この変動を補正す
るためにある種の追加の段階の使用は存在しない）の原
因となる。このように１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ3 の免疫検定法に改善要望が存在することは理解でき
よう。
対するモノクロナール抗体（ｍＡｂ）が数種開発さた。
米国特許第４，８１６，４１７号にはわれわれの研究所
が新しい検定法を報告している。この方法は血清１，２
５ビタミンＤと標識した１，２５ビタミンＤの間の競争
結合検定においてレセプターを「仕上げライン」として
使用した後の溶液からの薬剤レセプターへのこれら抗体
の使用を含んでいる。この検定法は直接（中間体の精製
なしに）血清を検定する。しかしながら、他のビタミン
Ｄ代謝生成物類からの妨害を少なくするためにスクリー
ニング物質としてビタミンＤ輸送蛋白質が必要である。
この免疫検定法は利点があるけれども、現在ある種の疾
病及び他の状態の血液試料は必要とされるビタミンＤ輸
送蛋白質のレベルを大幅に変動させることがあることが
発見された。これはいくつかの変動（この変動を補正す
るためにある種の追加の段階の使用は存在しない）の原
因となる。このように１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ3 の免疫検定法に改善要望が存在することは理解でき
よう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、本発明の目
的は上記のような１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを
検定することができる免疫検定法を提供することを含
む。もう１つの目的は迅速かつ比較的低費用で、高価な
装置を使用することなく容易に行うことができる上記の
種類の検定法を提供することである。さらにもう１つの
目的は上記種類の検定を行うためのキットを提供するこ
とである。本発明のなおその他の目的及び利点は下記の
説明から明らかになるであろう。以下に好ましい態様に
ついて説明するが、これらは単なる本発明の例である。
的は上記のような１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを
検定することができる免疫検定法を提供することを含
む。もう１つの目的は迅速かつ比較的低費用で、高価な
装置を使用することなく容易に行うことができる上記の
種類の検定法を提供することである。さらにもう１つの
目的は上記種類の検定を行うためのキットを提供するこ
とである。本発明のなおその他の目的及び利点は下記の
説明から明らかになるであろう。以下に好ましい態様に
ついて説明するが、これらは単なる本発明の例である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、１つの様相に
おいて、動物の血液、動物の血漿、動物の血清または動
物の組織の試料中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
の存在を定量する競争結合検定法を提供する。試料を
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが抽出できるよう
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを溶解する有機溶媒
と接触させる。次に抽出された１，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤへ、（ａ）１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄと結合することができるレセプター蛋白質、（ｂ）標
識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、及び（ｃ）
レセプター蛋白質と結合することができる抗体を添加す
る。次に、レセプター蛋白質に結合した標識した１，２
５−ジヒドロヒドロキシビタミンＤの相対的結合度を測
定する。
おいて、動物の血液、動物の血漿、動物の血清または動
物の組織の試料中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
の存在を定量する競争結合検定法を提供する。試料を
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが抽出できるよう
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを溶解する有機溶媒
と接触させる。次に抽出された１，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤへ、（ａ）１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄと結合することができるレセプター蛋白質、（ｂ）標
識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、及び（ｃ）
レセプター蛋白質と結合することができる抗体を添加す
る。次に、レセプター蛋白質に結合した標識した１，２
５−ジヒドロヒドロキシビタミンＤの相対的結合度を測
定する。
【０００８】好ましい形態において、添加段階前に、抽
出された部分をシリカカラム上で精製して妨害性のビタ
ミンＤ代謝生成物類を除去する。次に、添加段階中、
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤに特異的に結合しな
い、脂肪酸を含まない蛋白質もまた添加される。現在ま
で、最上の結果は添加蛋白質がウシの血清アルブミンま
たはサイトゾル肝臓抽出物である場合に達成された。オ
ボアルブミン、シトクロムＣ、細菌抽出物、酵母抽出物
または大豆蛋白質などのその他の蛋白質もまた使用され
る。
出された部分をシリカカラム上で精製して妨害性のビタ
ミンＤ代謝生成物類を除去する。次に、添加段階中、
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤに特異的に結合しな
い、脂肪酸を含まない蛋白質もまた添加される。現在ま
で、最上の結果は添加蛋白質がウシの血清アルブミンま
たはサイトゾル肝臓抽出物である場合に達成された。オ
ボアルブミン、シトクロムＣ、細菌抽出物、酵母抽出物
または大豆蛋白質などのその他の蛋白質もまた使用され
る。
【０００９】もう１つの様相においては、本発明者は標
識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、１，２５−
ジヒドロキシビタミンに結合することができるレセプタ
ー蛋白質、該レセプター蛋白質に結合することができる
抗体、及びＢＳＡなどの促進剤蛋白質を含む競争検定キ
ットを提供する。
識した１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、１，２５−
ジヒドロキシビタミンに結合することができるレセプタ
ー蛋白質、該レセプター蛋白質に結合することができる
抗体、及びＢＳＡなどの促進剤蛋白質を含む競争検定キ
ットを提供する。
【００１０】本発明は結合を含まない分離段階はＶＤＲ
に対するｍＡｂを用いることによってなされるが、血清
ビタミンＤ輸送蛋白質レベルの相違による変化性に影響
をうけない新しい検定法を提供することが理解されよ
う。これに関して、潜在的に妨害性の脂質類とともに輸
送蛋白質及び多くの他の蛋白質類が抽出段階によって除
去される。
に対するｍＡｂを用いることによってなされるが、血清
ビタミンＤ輸送蛋白質レベルの相違による変化性に影響
をうけない新しい検定法を提供することが理解されよ
う。これに関して、潜在的に妨害性の脂質類とともに輸
送蛋白質及び多くの他の蛋白質類が抽出段階によって除
去される。
【００１１】セプ−パク(Sep-Pak) シリカゲルカラム精
製は潜在的に妨害性のビタミンＤ代謝生成物類を除去す
ることを好ましく達成することを述べるべきである。Ｈ
ＰＬＣとは異なり、この型のクロマトグラフィーは迅速
かつ高価な装置なしで行うことができる。セプ−パクの
代わりに、セファデックス(Sephadex)ＬＨ２０またはリ
ピデックス(Lipidex) ５０００などの他のカラムも２５
−ヒドロキシビタミンＤ及び２４，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤから１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを分
離するのに用いることができる。
製は潜在的に妨害性のビタミンＤ代謝生成物類を除去す
ることを好ましく達成することを述べるべきである。Ｈ
ＰＬＣとは異なり、この型のクロマトグラフィーは迅速
かつ高価な装置なしで行うことができる。セプ−パクの
代わりに、セファデックス(Sephadex)ＬＨ２０またはリ
ピデックス(Lipidex) ５０００などの他のカラムも２５
−ヒドロキシビタミンＤ及び２４，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤから１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを分
離するのに用いることができる。
【００１２】最も驚くべきことに、促進剤蛋白質は加え
戻さ(added back)なければならず、さもないとｍＡｂが
作用しないことが発見された。好ましい促進剤はウシ血
清アルブミン及びサイトゾル肝臓抽出製剤類である。し
かしながら、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと特異
結合しない、脂肪酸を含まない多くの蛋白質類を作用さ
せられる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと特異結
合しない輸送蛋白質を加え戻すことは１，２５−（Ｏ
Ｈ）2 Ｄ3 との競争の原因となり、それゆえ検定を妨害
することを注意すべきである。また、この新しい検定法
は非常に高感度であることが注目される。血清からの抽
出及び精製後の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の全回収率が
高いことと組み合わせて、この感度はヒトの血清の１，
２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 レベルが僅か０．５ｍｌの血清試
料で２倍ないし３倍に検定できることを示す。
戻さ(added back)なければならず、さもないとｍＡｂが
作用しないことが発見された。好ましい促進剤はウシ血
清アルブミン及びサイトゾル肝臓抽出製剤類である。し
かしながら、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと特異
結合しない、脂肪酸を含まない多くの蛋白質類を作用さ
せられる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと特異結
合しない輸送蛋白質を加え戻すことは１，２５−（Ｏ
Ｈ）2 Ｄ3 との競争の原因となり、それゆえ検定を妨害
することを注意すべきである。また、この新しい検定法
は非常に高感度であることが注目される。血清からの抽
出及び精製後の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の全回収率が
高いことと組み合わせて、この感度はヒトの血清の１，
２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 レベルが僅か０．５ｍｌの血清試
料で２倍ないし３倍に検定できることを示す。
【００１３】要約すると、発明者らは血清のＨＰＬＣ精
製を要することなく、ＶＤＲに対するｍＡｂを用い１，
２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 を検出する改良された検定法を開
発した。この検定法は正常または病気の人からの血清の
１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 レベルの迅速かつ正確な定量
に有用であり、またビタミンＤ代謝生成物類投与後の患
者にさえも有用である。
製を要することなく、ＶＤＲに対するｍＡｂを用い１，
２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 を検出する改良された検定法を開
発した。この検定法は正常または病気の人からの血清の
１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 レベルの迅速かつ正確な定量
に有用であり、またビタミンＤ代謝生成物類投与後の患
者にさえも有用である。
【００１４】
【実施例】以下に本発明の好ましい態様について説明す
るが、これらは単に本発明の例であって本発明はこれら
に限定されるものではない。原材料 ビタミンＤ化合物類（１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 ，２５
−ＯＨ−Ｄ3 ，２４，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 ）はホフマ
ン−ラロツシェ社(Hoffman-La Roche Company)（Ｎｕｔ
ｌｅｙ，ＮＪ）または中外製薬（株）（東京、日本）か
らの寄贈であった。１，２５−（ＯＨ）2 ［２６，２７
− 3Ｈ］Ｄ3 （１６６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を既に発表され
たジェー．ナポリら(J. Napoli et al.)バイオケミスト
リー、１９、２５１５−２５２１（１９８０）によりジ
ュポン／ニューイングランドヌクレア(Dup0nt/New Engl
and Nuclear)（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって合成し、
またはアメルシャム・インターナショナル(Amersham In
ternational)ｐｌｃ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒ
ｅ，英国）から購入した。ＮＳＨ−ＬＣ−ビオチンはピ
アース(Pierce)（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入し
た。卵白アビジンはカルザイム・ラボラトリー社(Calzy
me Laboratory, Inc.)（Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐ
ｏ，ＣＡ）からのものであった。セファロース(Sepharo
se) ＣＬ−４Ｂはファルマシア(Pharmacia) （Ｕｐｐｓ
ａｌａ，スエーデン）からのものであった。ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ；本質的に遊離の脂肪酸含有せず）は
シグマ(Sigma) （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのもの
であった。セプ−パプ(Sep-Pak)シリカカートリッジは
ウォータース(Waters)（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購
入した。使用した緩衝剤は次の通りである： ＴＥＤＫ300 ：５０ｍＭ・トリス／ＨＣｌ、１．５ｍＭ
・ＥＤＴＡ、５ｍＭ・ジチオトレイトール、３００ｍＭ
・ＫＣｌ、ｐＨ７．４、 ＴＥ−トライトン：ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ・トリス／Ｈ
Ｃｌ、１．５ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の０．５
％トライトン(Triton)Ｘ−１００、 ＰＢＳ：１．５ｍＭ・ＫＨ2 ＰＯ4 、８．１ｍＭ・Ｎａ
2 ＨＰＯ4 、１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２．７ｍＭ・ＫＣ
ｌ、ｐＨ８．０。 すべての有機溶媒は液体クロマトグラフィー級精製品で
あった。
るが、これらは単に本発明の例であって本発明はこれら
に限定されるものではない。原材料 ビタミンＤ化合物類（１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 ，２５
−ＯＨ−Ｄ3 ，２４，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 ）はホフマ
ン−ラロツシェ社(Hoffman-La Roche Company)（Ｎｕｔ
ｌｅｙ，ＮＪ）または中外製薬（株）（東京、日本）か
らの寄贈であった。１，２５−（ＯＨ）2 ［２６，２７
− 3Ｈ］Ｄ3 （１６６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を既に発表され
たジェー．ナポリら(J. Napoli et al.)バイオケミスト
リー、１９、２５１５−２５２１（１９８０）によりジ
ュポン／ニューイングランドヌクレア(Dup0nt/New Engl
and Nuclear)（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって合成し、
またはアメルシャム・インターナショナル(Amersham In
ternational)ｐｌｃ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒ
ｅ，英国）から購入した。ＮＳＨ−ＬＣ−ビオチンはピ
アース(Pierce)（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入し
た。卵白アビジンはカルザイム・ラボラトリー社(Calzy
me Laboratory, Inc.)（Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐ
ｏ，ＣＡ）からのものであった。セファロース(Sepharo
se) ＣＬ−４Ｂはファルマシア(Pharmacia) （Ｕｐｐｓ
ａｌａ，スエーデン）からのものであった。ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ；本質的に遊離の脂肪酸含有せず）は
シグマ(Sigma) （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのもの
であった。セプ−パプ(Sep-Pak)シリカカートリッジは
ウォータース(Waters)（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購
入した。使用した緩衝剤は次の通りである： ＴＥＤＫ300 ：５０ｍＭ・トリス／ＨＣｌ、１．５ｍＭ
・ＥＤＴＡ、５ｍＭ・ジチオトレイトール、３００ｍＭ
・ＫＣｌ、ｐＨ７．４、 ＴＥ−トライトン：ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ・トリス／Ｈ
Ｃｌ、１．５ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の０．５
％トライトン(Triton)Ｘ−１００、 ＰＢＳ：１．５ｍＭ・ＫＨ2 ＰＯ4 、８．１ｍＭ・Ｎａ
2 ＨＰＯ4 、１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２．７ｍＭ・ＫＣ
ｌ、ｐＨ８．０。 すべての有機溶媒は液体クロマトグラフィー級精製品で
あった。
【００１５】豊富なＶＤＲ及びｍＡｂＸＶＩＥ６または
ＸＶＩＥ１０を含有し、ブタＶＤＲを特異的に検出する
ブタ腸核抽出物を既に発表された方法に従って調製し
た。エム．ダーメら(M. Dame et al.)バイオケミストリ
ー、２５、４５２３−４５３４（１９８６）。ＶＤＲに
対する抗体を生成することができるハイブリドーマもま
たアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(Ame
rican Type Culture Collection)（Ｒｕｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍｄ．）にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．＃ＨＢ９４９６で寄託
されており、米国特許第４，８１６，４１７号に関連し
て既に入手可能とされていることに注目されたい。その
寄託の入手は認可を意図するものではない。
ＸＶＩＥ１０を含有し、ブタＶＤＲを特異的に検出する
ブタ腸核抽出物を既に発表された方法に従って調製し
た。エム．ダーメら(M. Dame et al.)バイオケミストリ
ー、２５、４５２３−４５３４（１９８６）。ＶＤＲに
対する抗体を生成することができるハイブリドーマもま
たアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(Ame
rican Type Culture Collection)（Ｒｕｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍｄ．）にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．＃ＨＢ９４９６で寄託
されており、米国特許第４，８１６，４１７号に関連し
て既に入手可能とされていることに注目されたい。その
寄託の入手は認可を意図するものではない。
【００１６】０．１モルの炭酸水素ナトリウム緩衝液、
ｐＨ８．３に対して透析したモノクロナール抗体類を１
ｍｇ／ｍｌの抗体溶液と６０μｇのＮＨＳ−ＬＣビオチ
ンとともに室温で４時間温置することによってビオチニ
ル化した。遊離のビオチンをＰＢＳに対する広範な透析
により除去した。アビジン−セファロース(avidin-Seph
arose)をジェー．コームら(J. Kohm et al.)バイオケミ
・バイオフィジ・リサ(Biochem. Biophys. Res.)、１０
７、８７８−８８４（１９８２）報告の方法、アビジン
を臭化シアン活性化法を用いてセファロースＣＬ−４Ｂ
とカップリングさせることにより合成した。腸核抽出物
のＶＤＲ含有率はヒドロキシルアパタイト検定法変法
（エム．イナバら(M. Inaba et al.) バイオケミ・バイ
オフィジ・アクタ、１０１０、２０−２７（１９８
９））により定量した。ダブリュー．ウエックスラーら
(W. Wecksler et al.)アナリ・バイオケミ(Anal. Bioch
em.)、９２、３１４−３２３（１９７９）参照。蛋白質
濃度はブラッドフォード(Bradford)検定法により定量し
た。エム．ブラッドフォード、アナリ・バイオケミ、７
２、２４８−２５４（１９７６）。
ｐＨ８．３に対して透析したモノクロナール抗体類を１
ｍｇ／ｍｌの抗体溶液と６０μｇのＮＨＳ−ＬＣビオチ
ンとともに室温で４時間温置することによってビオチニ
ル化した。遊離のビオチンをＰＢＳに対する広範な透析
により除去した。アビジン−セファロース(avidin-Seph
arose)をジェー．コームら(J. Kohm et al.)バイオケミ
・バイオフィジ・リサ(Biochem. Biophys. Res.)、１０
７、８７８−８８４（１９８２）報告の方法、アビジン
を臭化シアン活性化法を用いてセファロースＣＬ−４Ｂ
とカップリングさせることにより合成した。腸核抽出物
のＶＤＲ含有率はヒドロキシルアパタイト検定法変法
（エム．イナバら(M. Inaba et al.) バイオケミ・バイ
オフィジ・アクタ、１０１０、２０−２７（１９８
９））により定量した。ダブリュー．ウエックスラーら
(W. Wecksler et al.)アナリ・バイオケミ(Anal. Bioch
em.)、９２、３１４−３２３（１９７９）参照。蛋白質
濃度はブラッドフォード(Bradford)検定法により定量し
た。エム．ブラッドフォード、アナリ・バイオケミ、７
２、２４８−２５４（１９７６）。
【００１７】試料抽出及びクロマトグラフィー ０．５ｍｌの血清へ１０μｌのエタノール中の８００カ
ウント／分の１，２５−（ＯＨ）2 −［ 3Ｈ］Ｄ3 を回
収率監視のため添加した。試料を室温で１時間温置して
脂質類を加水分解し、その後０．５ｍｌのＰＢＳと３倍
容量のジクロロメタンを添加した。混合物を３振動／秒
で３分間振とうした。低部の有機相（エタノール）を集
め、一方上部の相を３倍容量のジクロロメタンで２回再
抽出した。統合したジクロロメタン溶液を窒素気流下で
蒸発させ、残留物を５００μｌの４％イソプロパノール
／ｎ−ヘキサンに溶解した。セプ−パクシリカゲルクロ
マトグラフィーをティー．レインハードら(T. Reinhard
t et al.) ジェー・クリニ・エンドクリノル・メタボ
(J. Endocrinol. Metab.) 、５８、９１−９８（１９８
４）の方法に準じて行った。
ウント／分の１，２５−（ＯＨ）2 −［ 3Ｈ］Ｄ3 を回
収率監視のため添加した。試料を室温で１時間温置して
脂質類を加水分解し、その後０．５ｍｌのＰＢＳと３倍
容量のジクロロメタンを添加した。混合物を３振動／秒
で３分間振とうした。低部の有機相（エタノール）を集
め、一方上部の相を３倍容量のジクロロメタンで２回再
抽出した。統合したジクロロメタン溶液を窒素気流下で
蒸発させ、残留物を５００μｌの４％イソプロパノール
／ｎ−ヘキサンに溶解した。セプ−パクシリカゲルクロ
マトグラフィーをティー．レインハードら(T. Reinhard
t et al.) ジェー・クリニ・エンドクリノル・メタボ
(J. Endocrinol. Metab.) 、５８、９１−９８（１９８
４）の方法に準じて行った。
【００１８】要するに、試料をメタノール、クロロホル
ム、ｎ−ヘキサン及び４％イソプロパノール／ヘキサン
での連続処理により予め活性化したセプーパクシリカカ
ラムに塗布した。カラムを１０ｍｌの４％イソプロパノ
ール／ヘキサン及び８ｍｌの６％イソプロパノール／ヘ
キサンでの連続洗浄後、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 を１
０ｍｌの１５％イソプロパノール／ヘキサンで溶離し
た。集めた溶媒を窒素気流下で蒸発させ、残留物を７０
μｌの無水エタノールに溶解し、そのうちの２０μｌを
トレーサーの回収率測定に使用し、２０μｌ試料２種を
ラジオレセプター検定に用いた。
ム、ｎ−ヘキサン及び４％イソプロパノール／ヘキサン
での連続処理により予め活性化したセプーパクシリカカ
ラムに塗布した。カラムを１０ｍｌの４％イソプロパノ
ール／ヘキサン及び８ｍｌの６％イソプロパノール／ヘ
キサンでの連続洗浄後、１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 を１
０ｍｌの１５％イソプロパノール／ヘキサンで溶離し
た。集めた溶媒を窒素気流下で蒸発させ、残留物を７０
μｌの無水エタノールに溶解し、そのうちの２０μｌを
トレーサーの回収率測定に使用し、２０μｌ試料２種を
ラジオレセプター検定に用いた。
【００１９】別法による抽出 便宜上抽出溶媒を最上層にする別の抽出法は次の通りで
ある。血清試料（２５０μｌ）を５００μｌの酢酸エチ
ルで３回抽出した。回収率を測定するため、追加の３つ
の試料の各々に１，２５−（ＯＨ）2 ［ 3Ｈ］−Ｄ3 を
添加し、室温で３０分間温置し、他の試料とともに処理
した。有機層を小試験管に移し、窒素下３７℃湯浴中で
乾燥した。次に試料を２００μｌのヘキサン中２％酢酸
エチルに室温で３０分間かけ溶解した。
ある。血清試料（２５０μｌ）を５００μｌの酢酸エチ
ルで３回抽出した。回収率を測定するため、追加の３つ
の試料の各々に１，２５−（ＯＨ）2 ［ 3Ｈ］−Ｄ3 を
添加し、室温で３０分間温置し、他の試料とともに処理
した。有機層を小試験管に移し、窒素下３７℃湯浴中で
乾燥した。次に試料を２００μｌのヘキサン中２％酢酸
エチルに室温で３０分間かけ溶解した。
【００２０】その間に、セプ−パクカラムを各試料ごと
１カラムをヘキサンですすぐことにより調製した。試料
をカラム上におき、試験管及びカラム受器を数ｍｌのヘ
キサン中１０％の酢酸エチルで３回すすいだ。次にカラ
ムを２０ｍｌのヘキサン中１０％酢酸エチル及び２０ｍ
ｌのヘキサン中２０％酢酸エチルで順次洗浄した。カラ
ムから１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 をヘキサン中５０％酢
酸エチル溶液を用いて溶離し、大型のホウケイ酸ガラス
管（１８×１５０ｍｍ）に集めた。実施したすべての検
定においてトリチウム化化合物が９０％より多くが５０
％酢酸エチル画分中に回収された。試料は窒素下３７℃
湯浴中で乾燥し、５０ｍｌのエタノール中に溶解した。
次にこの溶液を免疫検定による分析に付した。
１カラムをヘキサンですすぐことにより調製した。試料
をカラム上におき、試験管及びカラム受器を数ｍｌのヘ
キサン中１０％の酢酸エチルで３回すすいだ。次にカラ
ムを２０ｍｌのヘキサン中１０％酢酸エチル及び２０ｍ
ｌのヘキサン中２０％酢酸エチルで順次洗浄した。カラ
ムから１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 をヘキサン中５０％酢
酸エチル溶液を用いて溶離し、大型のホウケイ酸ガラス
管（１８×１５０ｍｍ）に集めた。実施したすべての検
定においてトリチウム化化合物が９０％より多くが５０
％酢酸エチル画分中に回収された。試料は窒素下３７℃
湯浴中で乾燥し、５０ｍｌのエタノール中に溶解した。
次にこの溶液を免疫検定による分析に付した。
【００２１】１，２５ビタミンＤ3 を抽出する（他方大
部分の脂質類、蛋白質類、及び水溶性化合物類を後に残
す）ことができるその他の有機溶媒類が同様に使用でき
ると理解されるべきである。抽出溶媒のその他の例はジ
エチルエーテル、クロロホルム、アセトニトリル、ブチ
ルアルコール、ベンゼン、及びトルエンである。
部分の脂質類、蛋白質類、及び水溶性化合物類を後に残
す）ことができるその他の有機溶媒類が同様に使用でき
ると理解されるべきである。抽出溶媒のその他の例はジ
エチルエーテル、クロロホルム、アセトニトリル、ブチ
ルアルコール、ベンゼン、及びトルエンである。
【００２２】モノクロナール抗体及びアビジン−セファ
ロースの滴定曲線 次に、３０または５０ｆｍｏｌのブタの腸ＶＤＲを１０
０倍過剰の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の添加もしくはな
しで１．０ｎＭの［ 3Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3
とともに４時間氷上で予備温置した。指定量のビオチニ
ル化ｍＡｂを添加した後０℃で一晩温置した。その後１
００μｌのアビジン−セファロース（５０％スラリー）
を添加し、混合物を０℃で連続振とうしながら１時間温
置した。免疫沈降の効率は既に発表の方法で評価した。
ワイ．リーら(Y. Lee et al.) ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、２６４、１３７０１−１３７０５
（１９８９）参照。アビジン−セファロースの滴定は２
０ｆｍｏｌのＶＤＲと１μｇのビオチニル化ｍＡｂを用
い上記のようにして行った。
ロースの滴定曲線 次に、３０または５０ｆｍｏｌのブタの腸ＶＤＲを１０
０倍過剰の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の添加もしくはな
しで１．０ｎＭの［ 3Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3
とともに４時間氷上で予備温置した。指定量のビオチニ
ル化ｍＡｂを添加した後０℃で一晩温置した。その後１
００μｌのアビジン−セファロース（５０％スラリー）
を添加し、混合物を０℃で連続振とうしながら１時間温
置した。免疫沈降の効率は既に発表の方法で評価した。
ワイ．リーら(Y. Lee et al.) ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、２６４、１３７０１−１３７０５
（１９８９）参照。アビジン−セファロースの滴定は２
０ｆｍｏｌのＶＤＲと１μｇのビオチニル化ｍＡｂを用
い上記のようにして行った。
【００２３】非平衡ラジオレセプター検定 ２０μｌのエタノール中の標準１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ
3 （０．３−４０ｐｇ）または試料を、２０ｆｍｏｌの
ブタの腸ＶＤＲ、１μｇのビオチニル化ｍＡｂ及び０．
７５ｍｇのＢＳＡを含有する２７０μｌのＴＥＤＫ300
溶液とともに室温で１時間温置した。混合物を１０μｌ
のエタノール中の５０００ｃｐｍの［ 3Ｈ］−１，２５
−（ＯＨ）2 Ｄ3 とともにさらに室温で１時間温置し、
次いで氷上に一晩保持した。免疫沈降は飽和量のアビジ
ン−セファロースを用いて行った。セファロースは７５
０μｌのＴＥ−トライトンで３回洗浄し、シンチレーシ
ョンびんに移し、それに４ｍｌのＡＣＳ−ＩＩ（アメー
シャム・インターナショナルｐｌｃ）を添加し、シンチ
レーション計数により放射能を計数した。１，２５−
（ＯＨ）2 Ｄ3 濃度（ｍｌ当たりピコグラム）は標準曲
線から１００％回収値に補正して決定した。
3 （０．３−４０ｐｇ）または試料を、２０ｆｍｏｌの
ブタの腸ＶＤＲ、１μｇのビオチニル化ｍＡｂ及び０．
７５ｍｇのＢＳＡを含有する２７０μｌのＴＥＤＫ300
溶液とともに室温で１時間温置した。混合物を１０μｌ
のエタノール中の５０００ｃｐｍの［ 3Ｈ］−１，２５
−（ＯＨ）2 Ｄ3 とともにさらに室温で１時間温置し、
次いで氷上に一晩保持した。免疫沈降は飽和量のアビジ
ン−セファロースを用いて行った。セファロースは７５
０μｌのＴＥ−トライトンで３回洗浄し、シンチレーシ
ョンびんに移し、それに４ｍｌのＡＣＳ−ＩＩ（アメー
シャム・インターナショナルｐｌｃ）を添加し、シンチ
レーション計数により放射能を計数した。１，２５−
（ＯＨ）2 Ｄ3 濃度（ｍｌ当たりピコグラム）は標準曲
線から１００％回収値に補正して決定した。
【００２４】研究 １４人の正常な成人、１６人の初期上皮小体機能亢進症
患者、及び１２人の慢性腎不全患者から一晩断食後に血
清を得た。また、４人の正常なボランティアに７日間１
日２．０μｇの１α−ＯＨ−Ｄ3 を経口投与し、事前、
投与１日後及び７日後に採血した。
患者、及び１２人の慢性腎不全患者から一晩断食後に血
清を得た。また、４人の正常なボランティアに７日間１
日２．０μｇの１α−ＯＨ−Ｄ3 を経口投与し、事前、
投与１日後及び７日後に採血した。
【００２５】この検定法はまた対照ラット及び慢性腎不
全症ラットからの血清についても適用された。オスのウ
イスターラット（生後６週間）の５／６腎切除あるなし
について１６週間普通の給飼を続けた。その後、体重１
００ｇ当たり０．１５μｇの１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3
を腹腔内に投与した。処置後指定の時間にエーテル麻酔
下で腹部大動脈から採血した。
全症ラットからの血清についても適用された。オスのウ
イスターラット（生後６週間）の５／６腎切除あるなし
について１６週間普通の給飼を続けた。その後、体重１
００ｇ当たり０．１５μｇの１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3
を腹腔内に投与した。処置後指定の時間にエーテル麻酔
下で腹部大動脈から採血した。
【００２６】結果 ジクロロメタン抽出及び酢酸エチル抽出はともに動物血
清からの１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の抽出に上首尾に用
いられた。ジクロロメタン抽出とアルカリ加水分解を用
いて妨害性極性脂質類は除去された。０．２５−０．５
％のＢＳＡを放射レセプター面に用いた場合、この抽出
あるなし試料の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の標準曲線は
よく平行しており、検定を妨害する因子の存在しないこ
とを暗示した。ジクロロメタン抽出物中の検定において
競争妨害する可能性のある多量の２５−ＯＨ−Ｄ3 はセ
プ−パクシリカカートリッジを用いて容易かつ迅速に除
去された。
清からの１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の抽出に上首尾に用
いられた。ジクロロメタン抽出とアルカリ加水分解を用
いて妨害性極性脂質類は除去された。０．２５−０．５
％のＢＳＡを放射レセプター面に用いた場合、この抽出
あるなし試料の１，２５−（ＯＨ）2 Ｄ3 の標準曲線は
よく平行しており、検定を妨害する因子の存在しないこ
とを暗示した。ジクロロメタン抽出物中の検定において
競争妨害する可能性のある多量の２５−ＯＨ−Ｄ3 はセ
プ−パクシリカカートリッジを用いて容易かつ迅速に除
去された。
【００２７】抽出段階は潜在的に妨害性の脂質類及びあ
る種の潜在的に妨害性の蛋白質類を除去するけれども、
本発明者はそれはまた腸レセプター／ｍＡｂ検定を用い
る場合に必要とされる血液中に存在するある種の蛋白質
類も除去することを発見したことが理解されよう。
る種の潜在的に妨害性の蛋白質類を除去するけれども、
本発明者はそれはまた腸レセプター／ｍＡｂ検定を用い
る場合に必要とされる血液中に存在するある種の蛋白質
類も除去することを発見したことが理解されよう。
【００２８】現在のところ、ＢＳＡ及びサイトゾル肝臓
調製剤が最上の結果を示したが、下記の特性を有する他
の蛋白質類もまた使用され得る：脂肪酸を含まず、１，
２５−（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に特異結合することな
く、好ましくは１０００をこえた分子量で、かつ好まし
くは水溶性もしくは塩の希溶液に可溶性であること。促
進の正確な機構は現時点では不明であるが、現在の結果
に基くと、その効果は１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄが検定管壁に粘着するのを防止し、レセプターを安定
化し、アビジン−セファロース複合体の形成を助けるこ
との組み合わせであると信じられる。
調製剤が最上の結果を示したが、下記の特性を有する他
の蛋白質類もまた使用され得る：脂肪酸を含まず、１，
２５−（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に特異結合することな
く、好ましくは１０００をこえた分子量で、かつ好まし
くは水溶性もしくは塩の希溶液に可溶性であること。促
進の正確な機構は現時点では不明であるが、現在の結果
に基くと、その効果は１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄが検定管壁に粘着するのを防止し、レセプターを安定
化し、アビジン−セファロース複合体の形成を助けるこ
との組み合わせであると信じられる。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、試料中の１，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤの正確なレベルを比較的低経費
で、高価な装置を使用することなく、迅速かつ容易に定
量することができる。
ヒドロキシビタミンＤの正確なレベルを比較的低経費
で、高価な装置を使用することなく、迅速かつ容易に定
量することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小山 英則 日本国大阪府堺市田出井町５−２−506 (72)発明者 ジーン エム． プラール アメリカ合衆国 53719 ウイスコンシン マデイソン ジヨージタウン コート ７ (72)発明者 アン ウーランド−スミス アメリカ合衆国 53711 ウイスコンシン マデイソン シヤレー ガーデン ＃２ 2437
Claims (9)
- 【請求項１】 動物の血液、動物の血漿、動物の血清、
または動物の組織の試料中の１，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤの存在を定量する競争結合検定法であって、 試料をその中へ１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを抽
出するよう１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを溶解す
る有機溶媒と接触させ、 抽出された１，２５−ジヒドロキシビタミンＤへ（ａ）
その１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと結合すること
ができるレセプター蛋白質、（ｂ）標識した１，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ、及び（ｃ）レセプター蛋白質
に結合することとができる抗体を添加し、そして標識し
た１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのレセプター蛋白
質との相対的結合度を測定する各段階を含んでなる検定
法。 - 【請求項２】 測定段階前に、抽出された１，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤへ１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤと特異的に結合せず、脂肪酸を含まない蛋白質を添
加する追加段階がある請求項１の検定法。 - 【請求項３】 脂肪酸を含まない蛋白質がアルブミンと
サイトゾル肝臓抽出物からなる群から選ばれる請求項２
の検定法。 - 【請求項４】 標識した１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤが放射線標識した１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄである請求項２の検定法。 - 【請求項５】 前記測定段階前に、前記抗体に結合した
レセプター蛋白質が免疫沈降される請求項２の検定法。 - 【請求項６】 有機溶媒が酢酸エチルである請求項１の
検定法。 - 【請求項７】 有機溶媒がジクロロメタンである請求項
１の検定法。 - 【請求項８】 標識した１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと結合するこ
とができるレセプター蛋白質、該レセプター蛋白質と結
合することができる抗体、及び請求項２の蛋白質を含ん
でなる競争検定キット。 - 【請求項９】 標識した１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤが放射線標識されている請求項８のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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