BR112014009500B1 - Método in vitro para a liberação de um composto de vitamina d, método in vitro para medição de um composto de vitamina d e uso de uma composição reagente - Google Patents

Abstract

MÉTODO IN VITRO PARA A LIBERAÇÃO DE UM COMPOSTO DE VITAMINA D, MÉTODO IN VITRO PARA MEDIÇÃO DE UM COMPOSTO DE VITAMINA DE USO DE UMA COMPOSIÇÃO REAGENTE. A presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação dos compostos de vitamina D ligados à proteína de ligação da vitamina D, a um método in vitro para a detecção de um composto de vitamina D em que o composto de vitamina D é liberado a partir da proteína de ligação da vitamina D através da utilização desta composição reagente e da mistura do reagente obtidos desta,maneira A presente invenção também se refere à utilização da composição reagente descrita para a liberação dos compostos de vitamina D, bem como a um estojo para a detecção de um composto de vitamina D que contém a composição reagente para a liberação dos compostos de vitamina D juntamente com os reagentes comuns de detecção.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação dos compostos de vitamina D ligados à proteína de ligação da vitamina D, a um método in vitro para a detecção de um composto de vitamina D em que o composto de vitamina D é liberado a partir da proteína de ligação da vitamina D através da utilização desta composição reagente e da mistura do reagente obtidos desta maneira. A presente invenção também se refere à utilização da composição reagente descrita para a liberação dos compostos de vitamina D, bem como a um estojo para a detecção de um composto de vitamina D que contém a composição reagente para a liberação dos compostos de vitamina D juntamente com os reagentes comuns de detecção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Um suprimento adequado de vitamina D é vital como o termo “vitamina” já sugere. A deficiência de vitamina D ocasiona doenças graves: tais como o raquitismo ou osteoporose. Embora a vitamina D ainda seja considerada como uma única substância no início do século passado, o sistema de vitamina D mudou ao longo das últimas décadas para uma rede complexa e multiforme de metabólitos de vitamina D. Nos dias atuais, mais de 40 produtos diferentes metabólicas de vitamina D são conhecidos (Zerwekh, JE, Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281).

[003] Os seres humanos somente podem produzir as vitaminas D3 ou calciferóis através da ação dos raios ultravioletas da luz solar sobre a pele. A vitamina D3 no sangue está ligada à denominada proteína de ligação da vitamina D e é transportada para o fígado em que é convertida na 25-hidroxivitamina D3 através da 25-hidroxilação. Sabe-se nos dias atuais, que uma diversidade de outros tecidos está envolvida no metabolismo da vitamina D, além de pele e fígado, os dois órgãos que já foram mencionados (Schmidt-GayK, H. et al., (Eds.), “Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP”, Springer Verlag, Heidelberg (1990) páginas 24-47). A 25-hidroxivitamina D e mais especificamente a 25-hidroxivitamina D2 e 25-hidroxivitamina D3 são as formas de armazenamento principais da vitamina D no organismo humano em relação às suas quantidades. Quando necessário, estes precursores podem ser convertidos nos rins para a formação da 1α,25-dihidroxivitamina D biologicamente ativa, a denominada hormona D. A vitamina D biologicamente ativa regula, entre outras, a absorção do cálcio a partir do intestino, a mineralização óssea e influencia um grande número de outras vias metabólicas: tal como, por exemplo, o sistema de insulina.

[004] Medir o próprio nível de vitamina D é de pouco benefício para determinar o status da vitamina D de um paciente, uma vez que as concentrações de vitamina D (vitamina D2 e vitamina D3) oscilam muito, dependendo da absorção de alimentos ou exposição à luz solar. Além disso, a vitamina D relativamente possui uma meia-vida biológica curta na circulação (24 horas) e, por conseguinte, também não é um parâmetro adequado para determinar o status da vitamina D de um paciente. O mesmo também se aplica às formas fisiologicamente ativas da vitamina D (1,25-hidroxivitamina D). Estas formas biologicamente ativas também relativamente ocorrer nas concentrações pequenas e altamente flutuantes em comparação com a 25-hidroxivitamina D. Por todas estas razões, a quantificação da 25-hidroxivitamina D em particular, é um meio adequado para globalmente analisar o status geral da vitamina D de um paciente.

[005] Os metabólitos da vitamina D, tal como a 25-hidroxivitamina D estão ligados com afinidade elevada através da proteína de ligação da vitamina D e a uma extensão limitada também à albumina e algumas lipoproteínas. Os métodos adequados para a liberação de um metabólito da vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D em circunstâncias normais também será mais do que adequado para a liberação de um metabólito da vitamina D também a partir de qualquer outra proteína.

[006] A ligação da 25-hidroxivitamina D ou de outros compostos de vitamina D com a proteína de ligação da vitamina D enormemente dificulta a determinação dos compostos de vitamina D. Todos os métodos conhecidos necessitam que o composto de vitamina D a ser analisado seja liberado ou separado do complexo que forma com a proteína de ligação da vitamina D. Na sequência, este é dito como a liberação de um composto de vitamina D a partir de proteína de ligação da vitamina D, por uma questão de simplificação, embora, naturalmente, ele somente possa ser liberado a partir de um complexo do composto de vitamina D e da proteína de ligação da vitamina D, e não a partir da proteína de ligação da vitamina D sozinha.

[007] A proteína de ligação da vitamina D é desdobrada em pH ácido, mas apresenta uma tendência elevada para corretamente redobrar e religar o analito, quando o pH é deslocado de volta para condições neutras. Por conseguinte, muitas vezes é necessário liberar os compostos de vitamina D em primeiro lugar e, em seguida, separar a proteína de ligação da vitamina D a partir dos compostos de vitamina D a serem analisados.

[008] Devido à importância clínica elevada da 25-hidroxivitamina D, é conhecido um grande número de métodos a partir da literatura, o que permite que a 25-hidroxivitamina D seja relativamente determinada de maneira confiável.

[009] Haddad, J. G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992995, e Eisman, JA et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305 descrevem, por exemplo, a determinação das concentrações da 25-hidroxivitamina D nas amostras de sangue, utilizando a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

[010] Outras abordagens para a determinação da 25- hidroxivitamina D são com base, entre outras, na utilização das proteínas de ligação da vitamina D tais como aquelas que estão presentes no leite. Por conseguinte, Holick, M. F. e Ray, R. (patente US 5.981.779) e DeLuca et al., (patente EP 0.583.945) descreve as análises da vitamina D para a hidroxivitamina D e dihidroxivitamina D que são com base na ligação destas substâncias na proteína de ligação da vitamina D, em que as concentrações destas substâncias são determinadas por meio de um procedimento de teste competitivo. No entanto, um pré-requisito deste método é que os metabólitos da vitamina D a serem determinados, em primeiro lugar devem ser isolados a partir das amostras de sangue ou de soro original e devem ser purificados, por exemplo, através da cromatografia.

[011] Armbruster, F.P. et al., (WO 99/67211) ensinam que uma amostra de soro ou plasma deve ser preparada para a determinação da vitamina D através da precipitação do etanol. Neste método, o precipitado de proteína é removido através da centrifugação e o sobrenadante de etanol contém os metabólitos solúveis da vitamina D. Estes podem ser medidos em uma análise de ligação competitiva.

[012] De maneira alternativa, a patente EP 0.753.743 ensina que as proteínas podem ser separadas a partir das amostras de sangue ou de soro utilizando um sal periodato. Neste caso, os compostos de vitamina D são determinados no sobrenadante livre de proteínas a partir das amostras tratadas com o periodato. Em alguns testes comerciais, a acetonitrila é recomendada para a extração da amostra de soro ou de plasma (por exemplo, o radioimunoensaio da DiaSorin ou no teste da vitamina D da “Immundiagnostik” Company).

[013] Nos últimos anos uma série de diferentes reagentes de liberação foi proposta, que deve ser, em princípio, adequada para a liberação dos compostos de vitamina D a partir de qualquer proteína de ligação presente na amostra. No entanto, esta liberação ou descolamento deve ser realizado em condições relativamente brandas, por conseguinte, permitindo uma utilização direta da amostra tratada com o reagente de liberação em um teste de ligação (vide, por exemplo, a publicação WO 02/57797 e patente US 2004/0.132.104). Apesar dos imensos esforços nos últimos anos, todos os métodos disponíveis para a determinação de vitamina D apresentam desvantagens: tais como a preparação trabalhosa da amostra, padronização ruim, acordo ruim entre os procedimentos de teste ou má recuperação da vitamina D cravada (vide, para isso em particular, Zerwekh, JE, supra).

[014] Na patente US 7.087.395, os hidróxidos de metais, bem como a ciclodextrina e seus derivados, e os salicilatos de metais são utilizados para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, que resulta em uma desnaturação irreversível da proteína de ligação da vitamina D ou outras proteínas séricas. Os tensoativos, tais como o Triton X100 ou Tween-20 foram utilizados para impedir que o composto de vitamina D seja não especificamente ligado aos lipídeos e proteínas na amostra após a desnaturação.

[015] É particularmente difícil automatizar um testar para um composto de vitamina D. A automação necessita da solução de um problema muito difícil, isto é, sobreviver a uma caminhada na corda bamba: Por um lado, é necessário liberar os compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D com o auxílio de um reagente de liberação adequado, por outro lado, as condições devem ser selecionadas de tal maneira que a amostra ainda possa ser diretamente analisada. Um pré-requisito desta análise adicional direta é que, por um lado, a proteína endógena de ligação da vitamina D não se ligue ou não mais se ligue de forma significativa aos compostos de vitamina D, durante esta análise e, por conseguinte, não interfira com esta análise e, por outro lado, que a liberação do reagente utilizado não interfira com a ligação dos reagentes de detecção, tais como os anticorpos, ou uma proteína de ligação da vitamina D. Além disso, é conhecido que diferentes alelos da proteína de ligação da vitamina D estão presentes na população humana que bioquimicamente se comportam de maneira diferente. A liberação e a medição dos compostos de vitamina D devem ser comparáveis para os diversos alelos / fenótipos.

[016] Por conseguinte, o objeto da presente invenção foi o de desenvolver uma composição reagente para a liberação dos compostos de vitamina D e, em particular, dos compostos da hidroxivitamina D para a proteína de ligação da vitamina D em uma amostra que, pelo menos, parcialmente possa resolver os problemas da técnica anterior. Uma composição reagente adequada para a liberação dos compostos de vitamina D, um método in vitro para a determinação dos compostos de vitamina D, a utilização da composição reagente e dos estojos para a determinação dos compostos de vitamina D, utilizando esta composição reagente estão descritos nos seguintes e estão englobados pelas reivindicações em anexo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[017] A presente invenção se refere a um método in vitro para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, que compreende a etapa de: (a) o fornecimento de uma amostra a ser investigada e (b) a mistura da amostra da etapa (a) com (i) um reagente que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, (ii) um agente de redução, e (iii) um agente alcalinizante, por conseguinte, liberando o composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[018] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a medição de um composto de vitamina D que compreende as etapas de (a) o fornecimento uma amostra a ser investigada, (b) a mistura da amostra da etapa (a) com (i) um reagente que contém um carbonato de hidrogênio sal e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, (ii) um agente de redução, e (iii) um agente alcalinizante, por conseguinte, liberando um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, e (c) a medição do composto de vitamina D liberado na etapa (b).

[019] Em uma outra realização, a presente invenção se refere à composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D que compreende um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M e um agente de redução.

[020] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma mistura do reagentes que compreende a amostra a ser investigada, uma composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D que compreende um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M e um agente de redução, e um agente alcalinizante.

[021] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um estojo para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, que contém a composição reagente que compreende um sal de carbonato de hidrogênio e um uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M e um agente de redução.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[022] A presente invenção se refere a um método in vitro para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, que compreende a etapa de: (a) o fornecimento de uma amostra a ser investigada, (b) a mistura da amostra da etapa (a) com (i) um reagente que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, (ii) um agente de redução, e (iii) um agente alcalinizante, por conseguinte, liberando o composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[023] Conforme utilizado no presente, cada um dos seguintes termos possui o significado associado a ela nesta seção.

[024] Os artigos “um” e “uma” são utilizados para se referir a um ou a mais do que um (isto é, a, pelo menos, um) do objeto gramatical do artigo.

[025] A expressão “um ou mais” significa de 1 a 50, de preferência, de 1 a 20, também preferidos são 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, ou 15.

[026] Se não for indicado de outra maneira, o termo “composto de vitamina D” é deve ser entendido como incluindo todos os compostos de ocorrência natural, que contêm a cadeia principal da vitamina D2 ou a cadeia principal da vitamina D3, de acordo com as seguintes Fórmulas Estruturais I e II.

[027] Nas Fórmulas Estruturais I e II, as posições da vitamina D são apresentadas de acordo com a nomenclatura dos esteróides. A 25- hidroxivitamina D indica os metabólitos de vitamina D que são hidroxilados na posição 25 das Fórmulas Estruturais I e II, isto é, a 25-hidroxivitamina D2, bem como a 25-hidroxivitamina D3. Os compostos adicionais de hidroxivitamina D conhecidos são, por exemplo, as formas da 1,25-dihidroxivitamina D e da 24,25- dihidroxivitamina D.

[028] A 1,25-dihidroxivitamina D Se refere às formas ativas de vitamina D (as denominadas hormonas D) que possuem uma hidroxilação na posição 1, bem como na posição 25 de uma das Fórmulas Estruturais I e II.

[029] Outros compostos de vitamina D bem conhecidos são a 24,25-dihidroxivitamina D2, 24,25-dihidroxivitamina D3 e C3-epi-25- hidroxivitamina D.

[030] Surpreendentemente, os Depositantes descobriram que a presença de um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em condições alcalinas no método in vitro, descrito na presente invenção, conduz à liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[031] O termo “íons de carbonato de hidrogênio” (íon de bicarbonato), de acordo com a presente invenção, é um ânion com a Fórmula Empírica HCO3- e uma massa molecular de 61,01 daltons.

[032] O termo “sal de carbonato de hidrogênio”, de acordo com a presente invenção, é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato hidrogênio de sódio (NaHCO3), carbonato hidrogênio de potássio (KHCO3), carbonato hidrogênio de amônio (NH4HCO3), carbonato hidrogênio de cálcio (Ca(HCO3)2) e carbonato de hidrogênio de magnésio (Mg(HCO3)2.

[033] O termo “substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise”, de acordo com uma realização da presente invenção, é um éster de carbonato.

[034] O termo “éster de carbonato”, de acordo com a presente invenção, é um grupo carbonila flanqueado por dois grupos alcóxi. A estrutura geral destes carbonatos é R1O(C=O)OR2. Existem ésteres carbonato cíclicos (por exemplo, o carbonato de etileno) ou ésteres de carbonato não cíclicos (por exemplo, o carbonato de dimetila), bem como os seus derivados disponíveis hidroxilados ou halogenados.

[035] De preferência, um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise de acordo com a etapa (i) do método possui uma concentração total de 0,1 M a 1,5 M, ou de 0,2 a 1,0 M de H, ou de, pelo menos, 0,1, 0,2, 0,3 ou 0,4 M, ou de, no máximo, 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 ou 0,75 M, respectivamente.

[036] Em uma realização preferida, o sal de carbonato de hidrogênio é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de hidrogênio de sódio, carbonato de hidrogênio de potássio, carbonato de hidrogênio de amônio, carbonato de hidrogênio de cálcio e carbonato de hidrogênio de magnésio. Em uma outra realização preferida, o sal de carbonato de hidrogênio é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de hidrogênio de sódio, carbonato de hidrogênio de potássio e carbonato de hidrogênio de amônio. Ainda de maior preferência, o sal de carbonato de hidrogênio é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de hidrogênio de sódio e carbonato de hidrogênio de potássio.

[037] Em uma realização preferida, a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise é um éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado ou hidroxilado, respectivamente. Em uma outra realização preferida, a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise é um éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado, respectivamente. Em uma outra realização preferida, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, de 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona, 4,5-dicloro-1,3- dioxolan-2-ona, éster de dimetila do ácido 2,5- dioxahexanedióico, carbonato de 1,2-butileno, carbonato de cis-2,3-butileno e carbonato de trans-2,3-butileno. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona e 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona.

[038] Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, 1,2-carbonato de glicerol, carbonato de propileno e carbonato de vinileno. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, 1,2-carbonato de glicerol e carbonato de propileno. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila e 1,2-carbonato de glicerol.

[039] É do conhecimento de um técnico do assunto que um ou mais sal(sais) de carbonato de hidrogênio e uma ou mais substância(s) capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-), por hidrólise, respectivamente, podem ser arbitrariamente misturados para obter o efeito descrito na presente invenção.

[040] Em uma realização, o reagente que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise da etapa (i), de acordo com o método da presente invenção é solúvel a, pelo menos, 2 M em uma solução aquosa em condições adequadas para liberar o composto de vitamina D a partir de uma proteína de ligação da vitamina D. Em uma outra realização, o reagente que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise da etapa (i), de acordo com o método da presente invenção é solúvel a, pelo menos, 1,5 M, ou de maior preferência, é solúvel a, pelo menos, 1,0 M, em uma solução aquosa em condições adequadas para a liberação de um composto de vitamina D a partir de proteína de ligação da vitamina D. É do conhecimento dos técnicos do assunto, como solubilizar um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em água para alcançar o reagente da etapa (i) do método de acordo com a presente invenção. O sal de carbonato de hidrogênio e a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise devem ser hidrossolúveis a 25° C. O sal de carbonato de hidrogênio e a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise solubilizados em uma solução aquosa devem ser armazenáveis a uma temperatura de 4° C sem redução ou cristalização.

[041] A proporção molar do sal de carbonato de hidrogênio e da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise para o agente alcalinizante, de preferência, é entre 1:3 e 3:1, de maior preferência, entre 1:2 e 2:1 e, de maior preferência ainda, entre 1:1,5 e 1,5:1.

[042] O técnico do assunto também está ciente, que a proporção molar do agente alcalinizante para o sal de carbonato de hidrogênio e/ou as substâncias capazes de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise é calculada nas concentrações correspondentes dos íons reativos OH- ou HCO3-.

[043] É do conhecimento do técnico do assunto que uma mistura de um sal de carbonato de hidrogênio e de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise pode ser utilizada em um método, de acordo com a presente invenção. A proporção molar de ditas misturas do sal de carbonato de hidrogênio e/ou da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise para o agente alcalinizante, de preferência, é entre 1:3 e 3:1, de maior preferência, entre 1:2 e 2:1 e, de maior preferência ainda, entre 1:1,5 e 1,5:1.

[044] Sem querer estar ligado a esta teoria, pode muito bem ser que a presença de um sal de carbonato de hidrogênio e de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise na composição reagente induza uma mudança do pH. As concentrações inferiores de dito sal de carbonato de hidrogênio e/ou de dita substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise de uma composição reagente ocasionam uma redução de pH mais lenta da mistura do reagente, durante a reação do pré-tratamento. As concentrações mais elevadas de dito sal de carbonato de hidrogênio e/ou de dita substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise de uma composição reagente ocasionam uma redução de pH mais rápida da mistura do reagente, durante a reação do pré-tratamento. Além disso, parece que devido à ação concertada de um sal de carbonato de hidrogênio e de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise e o agente de redução em condições alcalinas de tampão que uma desnaturação irreversível da proteína de ligação da vitamina D é alcançada e, por conseguinte, a detecção posterior de um composto de vitamina D é facilitada.

[045] Em uma realização, o agente de redução da etapa (ii), de acordo com o método, é selecionado a partir do grupo que consiste em 2- mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl, Ditiotreitol (DTT), N-metilmaleimida, reagente de Ellman e ácido 1,2-ditiolano-3-carboxílico.

[046] Em uma outra realização, o agente de redução da etapa (ii), de acordo com o método é caracterizado em que o agente de redução da etapa (ii) contém os grupos tiol.

[047] Em uma outra realização, o agente de redução da etapa (ii), de acordo com o método, é selecionado a partir do grupo que consiste em 2- mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl e ditiotreitol (DTT).

[048] Em uma realização, o agente de redução da etapa (ii), de acordo com o método, possui uma concentração de 2 mM a 30 mM, em uma outra realização, a partir de 3 mM para 20 mM, em uma outra realização, a partir de 3,5 mM a 15 mM, e ainda em uma outra realização, a partir de 4 a 10 mm.

[049] Um “agente alcalinizante” pode ser um hidróxido alcalino ou hidróxido de metal alcalino terroso (isto é, em uma solução aquosa). Um agente alcalinizante também pode compreender uma mistura de hidróxidos alcalinos e/ou hidróxidos de metais alcalino terrosos, isto é, NaOH e KOH, NaOH e LiOH, NaOH e Ca(OH2), KOH e Ca(OH2), KOH e LiOH, bem como outras combinações.

[050] Os “hidróxidos alcalinos” são uma classe de compostos químicos que são compostos por um cátion de metal alcalino e o ânion de hidróxido (OH-). Os hidróxidos alcalinos são os seguintes: NaOH, KOH, LiOH, RbOH e CsOH. Os “metais alcalinos” são uma série de elementos químicos que formam o grupo 1 (estilo IUPAC) da Tabela Periódica: lítio (Li), sódio (Na), potássio (K), rubídio (Rb), césio (Cs), e frâncio (Fr).

[051] Os “hidróxidos de metal alcalino terroso” são uma classe de compostos químicos que são compostos de um cátion de metal alcalino terroso e 2 anions de hidróxido (OH-). Os “metais alcalinos terrosos”, compreendem o Grupo 2 (estilo IUPAC) (Grupo IIA) da Tabela Periódica: berílio (Be), magnésio (Mg), cálcio (Ca), estrôncio (Sr), bário (Ba) e rádio (Ra).

[052] Em uma realização, o agente alcalinizante da etapa (iii), de acordo com o método da presente invenção, é selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH, KOH, Ca(OH2) e LiOH.

[053] Em uma outra realização, o agente alcalinizante da etapa (iii), de acordo com o método, possui uma concentração de 0,1 M a 2,0 M, ou de 0,1 a 1,5 M de H, ou de 0,2 M a 1,75 M ou de 0,2 M a 1,0 M, ou de pelo menos, 0,1, 0,2, 0,3 ou 0,4 M, ou de, no máximo, 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 ou 0,75 M, respectivamente.

[054] Em uma outra realização, o agente alcalinizante da etapa (iii), de acordo com o método, é selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH e KOH.

[055] Em uma outra realização, o agente alcalinizante utilizado no método, de acordo com a presente invenção, possui em uma mistura de amostra + reagente i) + agente de redução ii) + agente alcalinizante iii), a concentração final de 0,1 M a 0,6 M ou de 0,2 M a 0,5 M, ou de, pelo menos, 0,1 ou 0,2 M, ou no máximo de 0,6 a 0,5 M, respectivamente.

[056] Em uma outra realização do método, a proporção da mistura dos três reagentes das etapas (i), (ii) e (iii), respectivamente, para uma amostra a ser investigada, de preferência, é entre 1:3 e 3:1.

[057] Uma realização no amostra da etapa (a), o reagente da etapa (i) contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise + o agente de redução da etapa (ii) + agente alcalinizante da etapa (iii), de acordo com o método pode ser adicionado em qualquer sequência de pipetagem.

[058] Após a mistura, a etapa (b), de acordo com o método da presente invenção, pode estar em uma outra realização, caracterizada em que possui, pelo menos, durante 10, 12, 15, ou 20 segundos um valor de pH de 9,5 a 14, a etapa (b), de maior preferência, possui após a mistura, pelo menos, durante 10, 12, 15 ou 20 segundos um valor de pH de 10,5 a 14.

[059] Em uma realização do método, a amostra a ser investigada da etapa (a) é misturada na etapa (b) com o reagente da etapa (i) que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-), por hidrólise, o agente de redução da etapa (ii), o agente alcalinizante da etapa iii) e incubada. A incubação da etapa (b) pode ser tão longa quanto necessário. O tempo de incubação, por exemplo, é de 15 segundos a 24 horas. Em uma realização, a mistura da etapa (b), de acordo com o método da presente invenção, é incubada durante de 1 a 60 minutos, por conseguinte, liberando o composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[060] As concentrações dos componentes da etapa (b), de acordo com o método, são facilmente selecionadas por um técnico do assunto de maneira que o intervalo especificado de pH e as concentrações desejadas de um sal de carbonato de hidrogênio e de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, o agente de redução e o agente alcalinizante, respectivamente, durante a incubação com a amostra a ser investigada sejam adequados para liberar o composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[061] As condições alcalinas resultam na desnaturação da proteína de ligação da vitamina D e na liberação da vitamina D presente na amostra a ser investigada. A concentração do agente alcalinizante deve ser suficiente para aumentar o pH da “mistura do reagente” (= uma amostra a ser investigada + composição reagente, de acordo com a presente invenção + agente alcalinizante) para, pelo menos, pH 10,0, de preferência, para pelo menos, pH 10,5, de maior preferência, para pelo menos, 11,0 na reação do pré- tratamento. O técnico do assunto está ciente, que o pH da mistura do reagente deve ser medido no momento da mistura da amostra a ser investigada + composição reagente, de acordo com a presente invenção + agente alcalinizante. Devido à hidrólise do sal de carbonato de hidrogênio e/ou à substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-), por hidrólise, o pH irá ser reduzido na mistura do reagente (vide Figura 1 e Exemplo 1.5).

[062] O termo “amostra”, conforme utilizado no presente, se refere a uma amostra biológica obtido de um indivíduo para o propósito da avaliação in vitro. Nos métodos da presente invenção, a amostra a ser investigada em uma realização é uma amostra de líquido. A amostra pode compreender em uma outra realização da presente invenção, qualquer fluido corporal. Em uma outra realização, a amostra a ser investigada é o sangue, soro ou plasma, de maior preferência, sendo o soro ou plasma. Em uma outra realização, a amostra líquida é secada em papel filtro ou membrana. Em uma realização, a amostra utilizada se refere a uma alíquota de uma amostra obtida de um indivíduo.

[063] A presente invenção, em uma outra realização, compreende um método in vitro para a medição de um composto de vitamina D que compreende as etapas de (a) liberar um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D e (b) medir o composto de vitamina D liberado na etapa (a).

[064] Em uma outra realização, a presente invenção compreende um método in vitro para a medição em composto de vitamina D que compreende as etapas de (a) liberar um composto de vitamina D ligado à proteína de ligação da vitamina D em uma amostra de interesse e (b) medir os compostos de vitamina D liberados na etapa (a).

[065] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método in vitro para a medição de um composto de vitamina D que compreende as etapas de (a) o fornecimento uma amostra a ser investigada, (b) a mistura da amostra da etapa (a) com (i) um reagente que contém um carbonato de hidrogênio sal e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 a 2,0 M, (ii) um agente de redução, e (iii) um agente alcalinizante, por conseguinte, liberando um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, e (c) a medição do composto de vitamina D liberado na etapa (b).

[066] Em uma outra realização, a presente invenção compreende um método in vitro para a medição de um composto de vitamina D, em que o composto de vitamina D medido é selecionado a partir do grupo que compreende a 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3, 24,25-dihidroxivitamina D2, 24,25-dihidroxivitamina D3 e C3-epi-25-hidroxivitamina D.

[067] Em uma outra realização, a presente invenção compreende um método in vitro para a medição de um composto de vitamina D, em que o composto de vitamina D medido é selecionado a partir do grupo que compreende a 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3, 24,25-dihidroxivitamina D2 e 24, 25-dihidroxivitamina D3.

[068] Em uma outra realização, a presente invenção compreende um método in vitro para a medição de um composto de vitamina D, em que os compostos de vitamina D, 25-hidroxivitamina D2 e/ou 25-hidroxivitamina D3 são determinados.

COMPOSIÇÃO REAGENTE

[069] Em uma realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir de proteína de ligação da vitamina D em uma amostra a ser investigada, que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise em uma concentração, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 a 2,0 M, e um agente de redução.

[070] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D na amostra a ser investigada, que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 a 1,5 M, e um agente de redução.

[071] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D na amostra a ser investigada, que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,2 a 1,0 M, e um agente de redução.

[072] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D na amostra a ser investigada, que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de, pelo menos, 0,1, 0,2, 0,3 ou 0,4 M, e um agente de redução.

[073] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D na amostra a ser investigada, que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é no máximo de 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 ou 0,75 M, e um agente de redução.

[074] Em uma outra realização preferida, o sal de carbonato de hidrogênio na composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de hidrogênio de sódio, carbonato de hidrogênio de potássio, carbonato de hidrogênio de amônio, carbonato de hidrogênio de cálcio e carbonato de hidrogênio de magnésio. Ainda de maior preferência, o sal de carbonato de hidrogênio na composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato hidrogênio de sódio, carbonato de hidrogênio de potássio e carbonato de hidrogênio de amônio. Ainda de maior preferência, o sal de carbonato de hidrogênio na composição reagente é o carbonato de hidrogênio de sódio e/ou o carbonato de hidrogênio de potássio.

[075] Em uma outra realização preferida, a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise na composição reagente é um éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado ou hidroxilado, respectivamente.

[076] Em uma outra realização preferida, a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise na composição reagente é um éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado, respectivamente. Em uma outra realização preferida, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado a composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3- dioxolan-2-ona, 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona, éster de dimetila do ácido 2,5 dioxahexanedióico, carbonato de 1,2 butileno, carbonato de cis-2,3-butileno e carbonato de trans-2,3-butileno. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico ou um seu derivado halogenado na composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3- dioxolan-2-ona e 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico na composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, 1,2-carbonato de glicerol, carbonato de propileno, carbonato de vinileno. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico na composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, 1,2-carbonato de glicerol e carbonato de propileno. Ainda de maior preferência, o éster de carbonato cíclico ou não cíclico na composição reagente é selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila e 1,2 de carbonato de glicerol.

[077] A presente invenção se refere, em uma outra realização, à composição reagente caracterizada em que o agente de redução é selecionado a partir do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl, Ditiotreitol (DTT), N-metilmaleimida, reagente de Ellman e ácido 1,2- ditiolano-3-carboxílico.

[078] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente caracterizada em que o agente de redução contém os grupos tiol.

[079] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a uma composição reagente caracterizado em que o agente de redução é selecionado a partir do grupo que consiste em 2 mercaptoetanol, 2- mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl e ditiotreitol (DTT).

[080] A concentração de um agente de redução em uma determinada realização da presente invenção é a partir de 2 mM e 30 mM, em uma outra realização a partir de 3 mM para 20 mM, em uma outra realização a partir de 3,5 mM a 15 mM e em uma outra realização a partir de 4 mM a 10 mM.

[081] É do conhecimento do técnico do assunto, que a capacidade de um agente de redução está dependente da presença de características funcionais, isto é, grupos de redução. Por conseguinte, é do conhecimento do técnico do assunto selecionar a concentração adequada de um agente de redução levando em conta seu número de grupos ativos de redução.

[082] O gene que codifica para a proteína de ligação da vitamina D ocorre na população humana sob a forma de diferentes alelos. Sabe-se que os polipeptídeos codificados por esses alelos diferem bioquimicamente, isto é, eles conduzem a diferentes fenótipos. Essas diferenças bioquímicas também influenciam a ligação e liberação dos compostos de vitamina D. A composição reagente, de acordo com a presente invenção, é adequada para a liberação dos compostos de vitamina D independentemente do fenótipo da proteína de ligação da vitamina D. Por conseguinte, uma realização preferida da presente invenção é a utilização de uma composição reagente, de acordo com a presente invenção, para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[083] A composição reagente, de acordo com a presente invenção, em uma realização é utilizada para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D nas amostras a serem investigadas irrespectivamente e independentemente dos fenótipos de proteína de ligação da vitamina D.

[084] Para o propósito da liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, a composição reagente, de acordo com a presente invenção, é misturada com uma amostra a ser investigada, por exemplo, o soro ou plasma, e um agente alcalinizante.

MISTURA DO REAGENTE

[085] O termo “mistura do reagente”, conforme utilizado abaixo no presente, compreende uma amostra a ser investigada, uma composição reagente de acordo com a presente invenção, e um agente alcalinizante.

[086] Em uma outra realização, a mistura do reagente é caracterizada em que o agente alcalinizante é selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH, KOH, Ca(OH2) e LiOH.

[087] Em uma outra realização, a mistura do reagente é caracterizada em que o agente alcalinizante utilizado possui uma concentração de 0,1 M a 2,0 M, ou de 0,1 a 1,5 M, ou de 0,2 M a 1,75 M, ou de 0,2 M a 1,0 M, ou de, pelo menos, 0,1, 0,2, 0,3 ou 0,4 M, ou de, no máximo, 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 ou 0,75 M, respectivamente.

[088] Em uma outra realização, a mistura do reagente alcalinizante é caracterizada em que o agente é selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH e KOH.

[089] Em uma outra realização, o agente alcalinizante utilizado no método, de acordo com presente invenção, possui em uma mistura do reagente, uma concentração final de 0,1 M a 0,6 M ou de 0,2 M a 0,5 M de, ou de, pelo menos, 0,1, ou 0,2 M, ou no máximo de 0,6, ou 0,5 M, respectivamente.

[090] A proporção da mistura da composição reagente e do agente alcalinizante para uma amostra a ser investigada, de preferência, é em uma realização, entre 1:3 e 3:1.

[091] Uma amostra a ser investigada, a composição reagente descrita e um agente alcalinizante podem ser adicionados em qualquer sequência de pipetagem para formar a mistura do reagente. Após a mistura, a mistura do reagente, em uma outra realização, é caracterizada em que possui, pelo menos, durante 10, 12, 15, ou 20 segundos um valor de pH de 9,5 a 14, ainda de maior preferência, a mistura do reagente possui, após a mistura, pelo menos, durante 10, 12, 15 ou 20 segundos um valor de pH de 10,5 a 14.

[092] A amostra a ser investigada é misturada com a composição reagente, de acordo com a presente invenção, e um agente alcalinizante e incubada. Esta etapa também pode ser denominada etapa do pré-tratamento. A etapa do pré-tratamento pode ser realizada durante o tempo necessário. O tempo de incubação, por exemplo, é durante de 15 segundos a 24 horas. A mistura do reagente, em uma realização, é incubada durante de 1 a 60 minutos para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D. A mistura do reagente, em outra realização, é incubada durante de 4 a 10 minutos para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[093] A mistura do reagente e as concentrações dos seus componentes são facilmente selecionadas por um técnico do assunto de maneira que o intervalo especificado de pH e as concentrações desejadas de um sal de carbonato de hidrogênio e de uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, o agente de redução e o agente alcalinizante, respectivamente, durante a incubação com uma amostra a ser investigada sejam adequados para liberar os compostos de vitamina D a partir de proteína de ligação da vitamina D.

[094] A mistura do reagente, em uma realização, também compreende as substâncias preferidas e/ou a concentração de um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, conforme descrito para a composição reagente da presente invenção.

[095] A detecção de um composto de vitamina D, de preferência, é realizada de tal maneira que, pelo menos, um composto de vitamina D, é selecionado a partir do grupo que compreende a 25-hidroxivitamina D2, 25- hidroxivitamina D3, 24,25-dihidroxivitamina D2, 24,25-dihidroxivitamina D3 e C3- epi-25-hidroxivitamina D é detectado.

[096] Na detecção específica de um composto de vitamina D, outras etapas de incubação são realizadas após a etapa do pré-tratamento. O restante do agente de redução presente na mistura do reagente pode ser bloqueado através da adição de proteínas não específicas, de preferência, por exemplo, a albumina do soro humano (HSA). As proteínas não específicas podem ser separadamente adicionadas ou podem ser simplesmente incluídas na solução que também compreende o reagente de detecção. Ao bloquear a capacidade de redução residual do agente de redução, é possível uma detecção não compromissada de um composto de vitamina D, utilizando um agente de ligação específico proteico de um composto de vitamina D.

[097] Como o técnico do assunto irá considerar, a solução que compreende o agente de ligação específico irá conter um sistema de tampão de pH que assegura, após a adição da solução que contém o agente de ligação específico para a mistura do reagente, que o pH é um pré-requisito para a ligação de um composto de vitamina D para o agente de ligação específico. Nem necessariamente o sistema de tampão necessário, nem o pH final é crítico, desde que a ligação do agente de ligação específico para um composto de vitamina D ocorra. No caso em que a proteína de ligação da vitamina D é utilizada como um agente de ligação específico, o pH, durante esta etapa de incubação, de preferência, é selecionado entre pH 6,0 e pH 9,0. No caso em que um anticorpo é utilizado como um agente de ligação específico para um composto de vitamina D, o pH, durante esta etapa de incubação, de preferência, estará entre pH 5,5 e pH 7,5.

[098] A solução que compreende o agente de ligação específico, de preferência, contém um sistema de tampão que é de 20 mm a 400 mm. Também de preferência, dito tampão possui uma molaridade de entre 50 mM e 350 mM ou entre 100 mM e 300 mM.

[099] O método in vitro para a detecção de um composto de vitamina D pode - com base na descrição da presente invenção - ser realizado de diversas maneiras.

[100] Em princípio, todos os parceiros de ligação proteicos, tais como especificamente os polipeptídeos de ligação que se ligam a um ou mais compostos de vitamina D podem ser utilizados como um agente de ligação específico. Um agente de ligação específico pode ser um anticorpo ou a própria proteína de ligação da vitamina D.

[101] Muitos sistemas de teste comerciais são com base na utilização das fases sólidas revestidas com avidina ou estreptavidina (SA), por exemplo, as placas de microtitulação revestidas com SA com ou látices revestidas com SA.

[102] Um derivado de analito biotinilado, por exemplo, é ligado a esta fase sólida SA antes ou durante o procedimento de teste. Ao detectar o composto de vitamina D, este composto derivado de analito biotinilado, por exemplo, pode ser uma 25-hidroxivitamina D2 biotinilada e/ou uma 25- hidroxivitamina D3 biotinilada.

[103] Em uma realização da presente invenção, o método in vitro de detecção é realizado como uma análise competitiva. Em tal teste competitivo, um derivado do composto de vitamina D adicionado em uma quantidade definida ao teste compete com um composto correspondente de vitamina D a partir da amostra para os locais de ligação do agente de ligação específico. Quanto mais composto de vitamina D estiver presente na amostra, menor será o sinal de detecção.

[104] Em uma realização, o derivado de um composto de vitamina D é um composto de vitamina D biotinilado. Em uma outra realização, o composto de vitamina D biotinilado é a 25-hidroxivitamina D2 biotinilada e/ou 25- hidroxivitamina D3 biotinilada. Em uma outra realização, o composto de vitamina D biotinilado é a 25-hidroxivitamina D2 biotinilada.

[105] Conforme mencionado acima, os agentes de ligação específicos para a utilização em um método de detecção, conforme descrito na presente descrição são os anticorpos e a proteína de ligação da vitamina D. A proteína de ligação da vitamina D, se utilizada em um formato de análise competitiva, irá conduzir a uma medida integrada de todos os compostos de vitamina D que competem com a sua ligação a um ou mais derivados do composto de vitamina D (biotinilado). Em uma realização, a proteína de ligação da vitamina D será detectávelmente etiquetada, por exemplo, rutenilatada

UTILIZAÇÃO

[106] Em uma realização, a presente invenção se refere à utilização de uma composição reagente juntamente com um agente alcalinizante para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D.

[107] Em uma outra realização, a presente invenção se refere à utilização de uma composição reagente juntamente com um agente alcalinizante para a liberação de um composto de vitamina D que deve estar presente em uma amostra a ser investigada a partir de proteína de ligação a vitamina D.

[108] Em uma outra realização, a presente invenção se refere à utilização de uma composição reagente juntamente com um agente alcalinizante para a liberação do composto de vitamina D, em um método para detectar um composto de vitamina D.

[109] Em uma outra realização, a presente invenção se refere à utilização de uma composição reagente que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) do sal de carbonato de hidrogênio e liberado a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, 2 mM a 30 mM de um agente de redução, juntamente com uma solução de 1 M a 1,5 M de um agente alcalinizante para a liberação do composto de vitamina D que deve estar presentes em uma amostra a ser investigada a partir de proteína de ligação da vitamina D no método de detecção de um composto de vitamina D.

[110] A utilização da composição reagente, em uma realização, também compreende as substâncias preferidas e/ou a concentração de um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, conforme descrito para a composição reagente da presente invenção.

ESTOJO

[111] Em uma realização, a presente invenção se refere a um estojo para a liberação de um composto de vitamina D a partir de proteína de ligação da vitamina D, que contém uma composição reagente que compreende um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, e um agente de redução.

[112] Em uma realização, a presente invenção se refere a um estojo para a detecção de um composto da vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, caracterizado em que compreende uma composição reagente que possui um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, um agente de redução, e um agente alcalinizante.

[113] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um estojo para a detecção de um composto da vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, caracterizado em que compreende uma composição reagente que possui um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de um agente de redução, e um agente alcalinizante.

[114] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um estojo para a detecção de um composto da vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, caracterizado em que compreende uma composição reagente que possui um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de um agente de redução, uma solução de 1 M a 1,5 M de um agente alcalinizante, além dos componentes de detecção.

[115] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um estojo para a detecção de um composto de vitamina D, caracterizado em que compreende uma composição reagente que possui um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-), por hidrólise, um agente de redução, uma solução de um agente alcalinizante, além de uma solução que compreende um agente de ligação específico.

[116] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um estojo para a detecção de um composto de vitamina D, caracterizado em que compreende uma composição reagente que possui um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de um agente de redução, uma solução de 1 M a 1,5 M de um agente alcalinizante e uma solução que compreende um agente de ligação específico.

[117] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um estojo para a detecção de um composto de vitamina D, caracterizado em que compreende uma composição reagente que possui um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberada a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) é de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de um agente de redução selecionado a partir do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl e ditiotreitol (DTT), uma solução de 1 M a 1,5 M de um agente alcalinizante selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH, KOH, Ca(OH2) e LiOH e uma solução que compreende um agente de ligação específico.

[118] O estojo também compreende, em uma realização, as substâncias preferidas e/ou as concentrações de um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, conforme descrito para a composição reagente da presente invenção.

[119] A composição reagente, de acordo com a presente invenção, provou ser adequada para a utilização em um teste automatizado para os compostos de vitamina D. A presente invenção, de preferência, se refere à utilização de uma composição reagente, de acordo com a presente invenção, para a liberação dos compostos de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, especialmente em um teste para a determinação dos compostos de vitamina D.

[120] O teste para um composto de vitamina D, de preferência, é completamente automatizado. O termo “totalmente automatizado”, neste caso, significa que o experimentador somente precisa colocar uma amostra a ser investigada e uma embalagem do reagente que contém todos os componentes para a medição de um composto de vitamina D em um analisador automático e todas as outras etapas são automaticamente realizadas pelo analisador. O teste completamente automatizado é particularmente, de preferência, realizado em um analisador Elecsys® da Roche Diagnostics.

[121] A composição reagente, de acordo com a presente invenção, em uma outra realização, é utilizada em um método in vitro para a detecção de um composto de vitamina D selecionado a partir do grupo que compreende a 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3, 24,25- dihidroxivitamina D2, 24,25 dihidroxivitamina D3 e C3-epi-25-hidroxivitamina D.

[122] Conforme anteriormente mencionado acima, a 25- hidroxivitamina D2 e a 25-hidroxivitamina D3 são formas particularmente relevantes da vitamina D para o diagnóstico. No método in vitro, de acordo com a presente invenção, a detecção específica da 25-hidroxivitamina D2 e a 25- hidroxivitamina D3ou por meio de um anticorpo específico da 25-hidroxivitamina D2 e a 25-hidroxivitamina D3 também representa uma realização preferida.

[123] A presente invenção ainda é elucidada através dos seguintes Exemplos e Figuras. O escopo de proteção real resulta a partir das reivindicações para a presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[124] Figura 1: alteração do pH da mistura do reagente durante a etapa do pré-tratamento. A análise foi realizada conforme descrito no Exemplo 1.5. A composição reagente (A) contém diversas concentrações do carbonato de etileno (EC): 0,00 M (•), 0,10 M (♦), 0,30 M (□), 0,50 M (▲), 0,75 M (o), 1,00 M (■), 1,50 M (◊) EC. O eixo X mostra o tempo em minutos, o eixo Y mostra o pH.

[125] Figura 2: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 1.5 com a composição reagente (A) que contém diversas concentrações do carbonato de etileno (EC): 1,50 M (•), 1,00 M (□), 0,75 M (♦), 0,50 M (o), 0,30 M (▲) e 0,10 M (◊) CE. O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[126] Figura 3: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 1.5 com a composição reagente (A) contêm diversas concentrações do agente de redução de ditiotreitol (DTT) 1,0 mM (□), 2,0 mM (•), 4,0 mM (♦), 6,7 mM (o), mM/12.0 10,0 mM (▲), 15,0 mM (◊). O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[127] Figura 4a: Comparação do Método: A análise da vitamina D (exemplo 1) e a 25-hidroxivitamina D da espectrometria de massa do arranjo contíguo de sequência da cromatografia líquida (LC-TMS) foram determinadas por meio de LC-TMS, bem como por meio da análise de vitamina D do Exemplo 1.5, em que a composição reagente (A), com 0,5 M de carbonato de etileno (CE) foi utilizada para a incubação. Os resultados em ng/mL para diversas amostras de soro são representados graficamente no eixo X para a LC-TMS e no eixo Y para a análise de vitamina D do Exemplo 1.5. (---) y = x (-) Regressão Linear Análise de Vitamina D = 2,0116 + 0,9036 * x, Pearson r = 0,9509

[128] Figura 4b: Comparação do Método: A análise da vitamina D (Exemplo 1) e a25-hidroxivitamina D da LC-TM foram determinadas por meio da LC-TMS, bem como por meio da análise de vitamina D do Exemplo 1.5, em que a composição reagente (A) sem o carbonato de etileno (CE) foi utilizada para a incubação. Os resultados em ng/mL para as diversas amostras de soro são representados graficamente no eixo X para a LC-TMS e no eixo Y para a análise de vitamina D do exemplo 1.5. (---) y = x (-) Regressão Linear Análise de Vitamina D = 0,7496 + 0,7338 * x, Pearson r = 0,7914

[129] Figura 5: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 2 com a composição reagente (A) contêm 0,5 M de carbonato de etileno (♦), 0,5 M de Na2CO3 (o), 0,5 M de NaH2PO4 (▲), 0,5 M de NaCl (◊) e controle (□). O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[130] Figura 6: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 3, com a composição reagente (A) que contém: ♦ 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC, ou ♦ : 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT M, ou ♦ : 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA.

[131] O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[132] Figura 7: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 4 com a composição reagente (A) contêm: o: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5), ou ♦ 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de carbonato de dimetila.

[133] O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[134] Figura 8: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 5 com a composição reagente (A) contêm: ♦: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5), ou o: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de NaHCO3, ou ▲: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M NaHCO3 + 0,5 M de etileno glicol, ou □: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT

[135] O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[136] Figura 9: As curvas de calibração de uma análise de vitamina D, conforme descritas no Exemplo 4 com a composição reagente (A) contêm: ♦: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5) ou o: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de 1,2- carbonato de glicerol.

[137] O eixo X mostra a concentração em ng/mL, o eixo Y mostra as contagens determinadas como usuais utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

EXEMPLO 1 ANÁLISES PARA A DETECÇÃO DA 25-HIDROXIVITAMINA D

[138] As análises comerciais são utilizadas de acordo com as instruções do fabricante. As determinações da 25-hidroxivitamina D são realizadas por meio de HPLC (teste para a 25(OH) vitamina D3, a partir do “Immundiagnostik” Company, Bensheim, ordem número KC 3400) ou por meio de LC-MS/MS (Vogeser, M. et al., Clin Chem. 50 (2004) 1.415-1.417) conforme descrito na literatura.

[139] A preparação dos ingredientes e o processo do teste geral para um novo teste está descrito no seguinte:

1.1 SÍNTESE DO ÉTER 3-2'-ClANOETILA DA HlDROXIVITAMINA D2

[140] 20,6 mg (50 μmol) de 25-hidroxivitamina D2 (Fluka número 17.937) são dissolvidos em um balão de fundo redondo de 25 mL de três bocas com um termômetro interno, em 10 mL de acetonitrila seca sob uma atmosfera de árgon. 1,5 mL de terc-butanol / acetonitrila (9:1) são adicionados à solução e resfriados a 6° C em um banho de gelo. Posteriormente, 820 μl de uma solução de acrilonitrila (86 μl de acrilonitrila em 1,0 mL de acetonitrila) são adicionados e agitados durante 15 minutos a 6° C. Em seguida, são adicionados 205 μl de uma solução de hidreto de potássio (25 mg de KH em 0,5 mL de terc-butanol / acetonitrila 9:1). Uma breve floculação ocorre após uma solução límpida ser obtida. A solução de reação é agitada durante mais 45 minutos a 6° C e, posteriormente, durante 60 minutos a 4° C.

[141] Posteriormente, a solução de reação é diluída com 10 mL de éter metil-terc-butílico e lavada duas vezes com 10 mL de H2O de cada vez. A fase orgânica é seca com cerca de 1 g de sulfato de sódio anidro, filtrada através de uma frita de vidro G3 e evaporada em um evaporador rotativo. Ela é seca em vácuo elevado para formar um resíduo viscoso límpido com uma massa de cerca de 55 mg.

1.2 SÍNTESE DO ÉTER 3-3-AMINOPROPILA DA HIDROXIVITAMINA D2

[142] Toda a nitrila obtida acima é dissolvida em 15 mL de éter dietílico e misturada com uma suspensão de 7,5 mg de hidreto de lítio em 7,5 mL de éter dietílico com agitação. A mistura de reação é agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, uma suspensão de 38,4 de hidreto de alumínio e lítio em 6,6 mL de éter dietílico é adicionada. Isto resulta em uma forte turvação da mistura. A mistura de reação é agitada durante mais uma hora à temperatura ambiente, em seguida, a mistura de reação é resfriada para de 0 a 5° C em um banho de gelo e 35 mL de água são cuidadosamente adicionados. O pH é produzido fortemente básico através da adição de 6,6 mL da solução de hidróxido de potássio a 10 M.

[143] É extraída três vezes com 65 mL de éter metil-terc-butílico de cada vez. As fases orgânicas combinadas são secas utilizando 5 g de sulfato de sódio anidro, filtradas e evaporadas à temperatura ambiente sobre um evaporador rotativo. O resíduo é seco para a constância de massa utilizando uma bomba de óleo. O produto bruto é dissolvido em 5 mL de DMSO e 3,0 mL de acetonitrila e purificado por meio da HPLC preparativa.

[144] As frações, cujo teor do produto é superior a 85%, de acordo com a HPLC analítica (Vydac C18/300A/5 μm, 4,6 x 250 mm) são reunidas em um balão de fundo redondo e liofilizadas. 13,7 mg (rendimento: 58 %) são obtidos na forma de um liofilizado incolor.

1.3 SÍNTESE DO CONJUGADO DE 3-3'-N-(HEMISUBERIL)AMINOPROPIL-ÉTER-BIOTIN- (BETA-ALA)-GLU-GLU-LIS(EPSILON) DA HIDROXIVITAMINA D2 (= AG-BI)

[145] 13,7 mg (25 μmol) do éter 3-3'-aminopropila da hidroxivitamina D2 são dissolvidos em 3,5 mL de DMSO, 28,7 mg (30 μmol) de éster de biotina-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lis(epison)-hemi-suberato-N- hidroxissuccinimida (Roche Applied Science, Número 11.866.656) e 12,5 μl de trietilamina são adicionados e agitados durante a noite à temperatura ambiente. A solução de reação é diluída com 4,5 mL de DMSO, filtrada através de um microfiltro de 0,45 μm e, posteriormente, purificada por meio de HPLC preparativa (condições, vide o Exemplo 2.3 b)). As frações que contêm uma quantidade superior a 85% do produto, de acordo com a HPLC analítica, são reunidas e liofilizadas. 9.8 (rendimento: 30%) do conjugado de biotina purificado são obtidos.

1.4 RUTENILAÇÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DA VITAMINA D E A PURIFICAÇÃO ATRAVÉS DA CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL

[146] A proteína de ligação da vitamina D é transferida para o tampão de 100 mM de fosfato de potássio / 150 mM de cloreto de sódio, pH 8,5 e a concentração de proteína é ajustada para de 5 a 10 mg/mL. O reagente de rutenilação (éster de rutênio (II), tris (bipiridil)-N-hidroxissuccinimida) é dissolvido em DMSO e adicionado à solução do anticorpo a uma proporção molar de 3 para 1. Após um tempo de reação de 45 min, a reação é interrompida através da adição de L-lisina e a proteína de ligação da vitamina D rutenilada (=DBP-Ru) é purificada através da filtração em gel em uma coluna Superdex 200.

1.5 PROCEDIMENTO DO T ESTE NA ANÁLISE

[147] A amostra a ser investigada é medida utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company.

[148] A mistura do reagente é formada através da mistura de uma amostra a ser investigada com a composição reagente (A) e um agente alcalinizante (B).

[149] Neste exemplo, a mistura do reagente é formada por 15 μl da amostra misturada com 15 μl da composição reagente (A) e 10 μl do agente alcalinizante (B). A mistura do reagente foi incubada durante 9 minutos. Na etapa seguinte, 70 μl do reagente de detecção (Solução C) são adicionados à mistura do reagente e incubados durante mais nove minutos. Na última etapa, o antígeno biotinilado da parede (Solução D) (60 μl), bem como 30 μl de partículas de poliestireno magnetizáveis revestidas com a estreptavidina (SA) (30 μl) (Suspensão E) são adicionados. Após mais 9 minutos de incubação, a quantidade de ligação da proteína de ligação da vitamina D rutenilada é determinada como de costume (vide Figuras 1, 2, 3, 4a, 4b).

[150] A composição reagente (A) contém: 10 mM de NaOH 4 mM de EDTA 6,7 mM ditiotreitol (DTT) 0,5 M de carbonato de etileno (EC) pH 5,5

[151] O agente (B) alcalinizante contém: 1,375 M de NaOH

[152] A Solução C com a proteína de ligação da vitamina D rutenilada (DBP- Ru) contém: 0,2 M de bis-tris-propano (pH 7,5) 2,5 % de albumina do soro humano (HSA) 50 mM de NaCl 1% de manitol 0,1% de oxipiriona 0,12 μg/mL de DBP- Ru

[153] A Solução D com o antígeno biotinilado a parede contém: 0,2 M de bis-tris-propano (pH 8,6) 0,5% de solução tween-20 0,1% de oxipiriona 30 ng/mL de biotina 0,0108 mg/mL de Ag-Bi (do Exemplo 1.1)

[154] A Suspensão E com as partículas de látex revestidas por AS contém: 0,72 mg/mL de partículas de poliestireno magnetizáveis revestidas por SA - possui uma capacidade de ligação de 470 ng/mL.

EXEMPLO 2 COMPARAÇÃO DO ÉSTER DE CARBONATO COM UM SAL DE METAL, UM TAMPÃO DE FOSFATO E UM CARBONATO

[155] A amostra a ser investigada é medida utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company. O procedimento total da análise é mostrado no Exemplo 1.5.

[156] Em anomalia ao Exemplo 1.5, a composição reagente (A) contém 0,5 M de carbonato de etileno (EC), 0,5 M de Na2CO3, 0,5 M de NaCl ou 0,5 M de NaH2PO4, respectivamente.

[157] Composição reagente (A): 10 mM de NaOH 4 mM de EDTA 6,7 mM de DTT 0,5 M de EC, Na2CO3, NaCl ou NaH2PO4

[158] Como controle, uma composição reagente (A) que contém 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, é utilizada. Os resultados são mostrados na Figura 5. O éster de carbonato (0,5 M de EC (♦) presente no pré-tratamento alcalino (mistura do reagente) ocasiona um efeito de intensificação do sinal na análise competitiva. Especialmente a dinâmica do sinal é aprimorada em comparação com um teste sem o EC (□). Um sal (0,5 M de NaCl, (◊)) não mostra nenhum efeito. A adição de 0,5 M de Na2CO3 (o) ou 0,5 M de NaH2PO4 (▲) mostra um efeito inferior ao sinal.

EXEMPLO 3 PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO COM / SEM O ÉSTER DE CARBONATO

[159] A amostra a ser investigada é medida utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company. O procedimento da análise é mostrado no Exemplo 1.5.

[160] Em anomalia ao Exemplo 1.5, três diferentes composições do reagente foram preparadas que contêm ou: ♦ : 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5) ou ♦ : 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT ou ♦ : 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA.

[161] Após uma incubação de pré-tratamento de 4 min da amostra + ou a ♦ (composição reagente (A) + o agente alcalinizante (B) conforme descrito no Exemplo 1.5), ▲, ou □, respectivamente (= mistura do reagente) e antes da adição de uma solução de C, o pH da mistura do reagente foi ajustado para pH 9 através da adição de cloreto de bis-tris- propano pH 6,3 (Figura 6). O éster de carbonato EC presente no pré- tratamento alcalino (mistura do reagente) ocasiona um efeito de intensificação do sinal na análise competitiva. Especialmente a dinâmica do sinal é aprimorada em comparação com um teste sem o EC.

EXEMPLO 4 CARBONATO DE ETILENO VERSUS CARBONATO DE DIMETILA

[162] A amostra a ser investigada é medida utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company. O procedimento da análise é mostrado no Exemplo 1.5.

[163] Em anomalia ao Exemplo 1.5, duas diferentes composições do reagente (A) foram preparadas que contêm ou: o: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5) ou ♦: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de carbonato de dimetila.

[164] Ambos, o carbonato de éster, carbonato de etileno ou carbonato de dimetila, respectivamente, mostram o mesmo desempenho da análise (Figura 7).

EXEMPLO 5 EFEITO DOS PRODUTOS DA HIDRÓLISE DO CARBONATO DE ETILENO

[165] A amostra a ser investigada é medida utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company. O procedimento da análise é mostrado no Exemplo 1.5.

[166] Em anomalia ao Exemplo 1.5, cinco diferentes composições do reagente (A) foram preparadas que contêm ou: ♦: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5) ou o: 10 mM NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de NaHCO3 ou ▲: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M NaHCO3 3 + 0,5 M de etilenoglicol □: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT

[167] O produto de hidrólise alcalina de EC é o etileno glicol, que não possui nenhuma influência sobre a análise (▲). Um sal de carbonato de hidrogênio (NaHCO3) também mostra um efeito intensificado do sinal, mas não tanto como um éster de carbonato (Figura 8).

EXEMPLO 6 CARBONATO DE ETILENO VERSUS 1 ,2-CARBONATO DE GLICEROL

[168] A amostra a ser investigada é medida utilizando o sistema Elecsys® da Roche Diagnostics company. O procedimento da análise é mostrado no Exemplo 1.5.

[169] Em anomalia ao Exemplo 1.5, duas diferentes composições do reagente (A) foram preparadas que contêm ou: ♦: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de EC (vide Exemplo 1.5) ou o: 10 mM de NaOH, 4 mM de EDTA, 6,7 mM de DTT, 0,5 M de 1,2- carbonato de glicerol.

[170] Ambos o carbonato de éster, carbonato de etileno ou 1,2- carbonato de glicerol, respectivamente, mostram o mesmo desempenho da análise (Figura 9).

Claims (12)

1. MÉTODO IN VITRO PARA A LIBERAÇÃO DE UM COMPOSTO DE VITAMINA D, a partir de proteína de ligação de vitamina D, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecimento de uma amostra a ser investigada e (b) mistura da amostra da etapa (a) com (i) um reagente que contém um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberado a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) ser de 0,1 M a 2,0 M, (ii) um agente de redução, e (iii) um agente alcalinizante, por conseguinte, liberando o composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, em que a substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise é um éster de carbonato selecionado a partir do grupo que consiste em carbonato de etileno, carbonato de dimetila, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, bis-carbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, de 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona, 4,5-dicloro-1,3- dioxolan-2-ona, éster de dimetila do ácido 2,5- dioxahexanedióico, carbonato de 1,2-butileno, carbonato de cis-2,3-butileno e carbonato de trans-2,3-butileno.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo reagente, tal como definido na etapa (i), ser solúvel em uma solução aquosa em condições adequadas para a liberação de um composto de vitamina D a partir de proteína de ligação de vitamina D.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela amostra ser uma amostra líquida.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela amostra ser sangue, soro ou plasma.

5. MÉTODO IN VITRO PARA MEDIÇÃO DE UM COMPOSTO DE VITAMINA D, caracterizado por compreender as etapas de (a) liberar um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação de vitamina D, de acordo com o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e (b) medir o composto de vitamina D liberado na etapa (a).

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo composto de vitamina D ser selecionado a partir do grupo que consiste em 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3, 24,25-dihidroxivitamina D2, 24,25 dihidroxivitamina D3 e C3-epi-25-hidroxivitamina D.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelos compostos da vitamina D 25-hidroxivitamina D2 e/ou 25-hidroxivitamina D3 serem determinados.

8. USO DE UMA COMPOSIÇÃO REAGENTE, caracterizado por ser para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, compreendendo um sal de carbonato de hidrogênio e uma substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) por hidrólise, em que a concentração total dos íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) a partir do sal de carbonato de hidrogênio e liberados a partir da substância capaz de liberar os íons de carbonato de hidrogênio (HCO3-) ser de 0,1 M a 2,0 M, e um agente de redução e um agente alcalinizante.

9. USO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo agente de redução ser selecionado a partir do grupo que consiste em 2- mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl, Ditiotreitol (DTT), N-metilmaleimida, reagente de Ellman e ácido 1,2-ditiolano-3-carboxílico.

10. USO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo agente de redução ser selecionado a partir do grupo que consiste em 2- mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl e Ditiotreitol (DTT).

11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo agente de redução possuir uma concentração de 2 mM a 30 mM.

12. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado por ser com um agente alcalinizante selecionado a partir do grupo que consiste em NaOH, KOH, Ca(OH)2 e LiOH para a liberação de um composto de vitamina D a partir da proteína de ligação da vitamina D, em que o agente alcalinizante possui uma concentração de 0,1 M a 2,0 M.

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