ES2933993T3

ES2933993T3 - Reactivo de liberación para compuestos de vitamina D

Info

Publication number: ES2933993T3
Application number: ES18171023T
Authority: ES
Inventors: Christian Vogl; Sascha Antoni
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2023-02-15
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: MX2014005642A; BR112014009500A2; US20160245829A1; EP3467510A1; CN103946710A; HK1195359A1; KR20140096286A; CA2852275A1; SG11201402196YA; US20160025750A1; EP3467510B1; KR102108582B1; US20200072854A1; JP2014533826A; CN103946710B; WO2013072342A1; AU2012338908A1; JP6038945B2; US20170363649A1; US11187709B2

Abstract

La presente invención se refiere a una composición de reactivo para liberar compuestos de vitamina D unidos a la proteína de unión a la vitamina D, un método in vitro para la detección de un compuesto de vitamina D en el que el compuesto de vitamina D se libera de la proteína de unión a la vitamina D mediante el uso de esta composición de reactivos y la mezcla de reactivos así obtenida. También se refiere al uso de la composición reactiva descrita para liberar compuestos de vitamina D, así como a un kit para detectar un compuesto de vitamina D que contiene la composición reactiva para liberar compuestos de vitamina D además de reactivos de detección comunes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivo de liberación para compuestos de vitamina D

Información sobre antecedentes

La presente invención se refiere a una composición de reactivo para liberar compuestos de vitamina D unidos a la proteína de unión a la vitamina D, un procedimiento in vitro para la detección de un compuesto de vitamina D en el que el compuesto de vitamina D se libera de la proteína de unión a la vitamina D por el uso de esta composición de reactivo y la mezcla de reactivo obtenida de esta manera. También se refiere al uso de la composición de reactivo divulgada para liberar compuestos de vitamina D, así como a un kit para detectar un compuesto de vitamina D que contiene la composición de reactivo para liberar compuestos de vitamina D además de reactivos de detección comunes.

Un aporte adecuado de vitamina D es vital, como ya sugiere el término "vitamina". Una carencia de vitamina D da lugar a enfermedades graves, tales como raquitismo u osteoporosis. Aunque la vitamina D todavía se consideraba como una única sustancia a principios del siglo pasado, el sistema de vitamina D ha cambiado en el transcurso de las últimas décadas en una red compleja y diversa de metabolitos de la vitamina D. Actualmente son conocidos más de 40 productos metabólicos de la vitamina D diferentes (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281).

Los seres humanos solo pueden producir vitaminas D³o calciferoles por la acción de los rayos ultravioleta de la luz solar sobre la piel. En la sangre, la vitamina D³se une a la llamada proteína de unión a la vitamina D y se transporta al hígado donde se convierte en 25-hidroxivitamina D³por 25-hidroxilación. Actualmente son conocidos una multitud de otros tejidos que están implicados en el metabolismo de la vitamina D, además de la piel y el hígado, los dos órganos que ya se han mencionado (Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47). 25-hidroxivitamina D y más específicamente 25-hidroxivitamina D²y 25-hidroxivitamina D³son la forma de almacenamiento principal de la vitamina D en el organismo humano con respecto a sus cantidades. Cuando sea necesario, estos precursores se pueden convertir en los riñones para formar la 1a,25-dihidroxivitamina D biológicamente activa, la llamada hormona D. La vitamina D biológicamente activa regula, entre otras, la absorción de calcio del intestino, la mineralización ósea e influye en un gran número de otras vías metabólicas, tales como, por ejemplo, el sistema insulínico.

La medición del nivel de vitamina D por sí misma es de poco beneficio cuando se determina la situación de vitamina D de un paciente, ya que las concentraciones de vitamina D (vitamina D²y vitamina D³) fluctúan en gran medida dependiendo de la absorción de alimentos o de la exposición a la luz solar. Además, la vitamina D tiene una semivida biológica relativamente corta en la circulación (24 horas) y, por lo tanto, también por este motivo no es un parámetro adecuado para determinar la situación de vitamina D de un paciente. También se aplica lo mismo a las formas fisiológicamente activas de la vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D). Estas formas biológicamente activas también se producen en concentraciones relativamente pequeñas y altamente fluctuantes en comparación con 25-hidroxivitamina D. Por todos estos motivos, la cuantificación de 25-hidroxivitamina D en particular es un medio adecuado para analizar globalmente la situación de vitamina D total de un paciente.

Los metabolitos de la vitamina D, como 25-hidroxivitamina D, se unen con alta afinidad por la proteína de unión a la vitamina D y, en menor medida, también a la albúmina y algunas lipoproteínas. Los procedimientos apropiados para liberar un metabolito de la vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D también serán, en circunstancias normales, más que apropiados para liberar un metabolito de la vitamina D también de cualquier otra proteína.

La unión de 25-hidroxivitamina D u otros compuestos de vitamina D a la proteína de unión a la vitamina D complica enormemente la determinación de los compuestos de vitamina D. Todos los procedimientos conocidos requieren que el compuesto de vitamina D que se va a analizar se libere o se separe del complejo que forma con la proteína de unión a la vitamina D. En lo que sigue, esto se denomina liberación de un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D, por motivos de simplificación aunque, por supuesto, solo se puede liberar de un complejo de compuesto de vitamina D y proteína de unión a la vitamina D y no de la proteína de unión a la vitamina D sola.

La proteína de unión a la vitamina D se despliega a pH ácido, pero tiene una alta tendencia a replegarse correctamente y a volver a unirse al analito cuando el pH se vuelve a cambiar a condiciones neutras. Por tanto, a menudo es necesario liberar en primer lugar los compuestos de vitamina D y a continuación separar la proteína de unión a la vitamina D de los compuestos de vitamina D que se van a analizar.

Debido a la alta importancia clínica de 25-hidroxivitamina D, son conocidos un gran número de procedimientos de la literatura que permiten que la 25-hidroxivitamina D se determine de forma más o menos fiable.

Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995, y Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305, por ejemplo, describen la determinación de las concentraciones de 25-hidroxivitamina D en muestras de sangre usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).

Otros enfoques para la determinación de 25-hidroxivitamina D se basan, entre otros, en el uso de proteínas de unión a la vitamina D como las que están presentes en la leche. Por tanto, Holick, M.F. y Ray, R. (documento US 5.981.779) y DeLuca et al. (documento ^eP 0583945) describen ensayos de vitamina D para hidroxivitamina D y dihidroxivitamina D que se basan en la unión de estas sustancias a la proteína de unión a la vitamina D donde las concentraciones de estas sustancias se determinan por medio de un procedimiento de prueba competitiva. Sin embargo, un requisito previo de este procedimiento es que los metabolitos de la vitamina D que se van a determinar en primer lugar se deben aislar de las muestras de sangre o suero originales y se deben purificar, por ejemplo, por cromatografía.

Los documentos WO 2008/092917 A1 y WO 2007/140962 A2 divulgan un procedimiento para la medición del contenido de vitamina D. Armbruster, F.P. et al. (documento WO 99/67211) enseñan que se debe preparar una muestra de suero o plasma para la determinación de vitamina D por precipitación con etanol. En este procedimiento, el precipitado de proteína se retira por centrifugación y el sobrenadante etanólico contiene metabolitos de vitamina D solubles. Estos se pueden medir en un ensayo de unión competitiva.

De forma alternativa, el documento EP 0753 743 enseña que las proteínas se pueden separar de muestras de sangre o suero usando una sal de peryodato. En este caso, se determinan los compuestos de vitamina D en el sobrenadante sin proteínas de las muestras tratadas con peryodato. En algunas pruebas comerciales, se recomienda acetonitrilo para la extracción de la muestra de suero o plasma (por ejemplo, en el radioinmunoanálisis de DiaSorin o en la prueba de vitamina D de la empresa "Immundiagnostik").

En los últimos años, se propusieron una serie de reactivos de liberación diferentes que, en principio, deben ser adecuados para liberar compuestos de vitamina D de cualquier proteína de unión presente en la muestra. Sin embargo, esta liberación o separación se debe llevar a cabo en condiciones relativamente suaves, permitiendo por tanto un uso directo de la muestra tratada con el reactivo de liberación en una prueba de unión (véanse, por ejemplo, los documentos WO 02/57797 y US 2004/0132104). A pesar de los inmensos esfuerzos en los últimos años, todos los procedimientos disponibles para determinar la vitamina D tienen desventajas tales como preparación de muestras laboriosa, mala estandarización, mala concordancia entre los procedimientos de prueba o mala recuperación de vitamina D enriquecida (para esto véase, en particular, Zerwekh, J.E., supra).

En el documento US 7.087.395, se han usado hidróxidos de metales así como ciclodextrina y derivados de la misma, y salicilatos de metales para liberar los compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D, lo que da como resultado una desnaturalización irreversible de la proteína de unión a la vitamina D u otras proteínas séricas. Se han usado tensioactivos como Triton X100 o Tween-20 para evitar que el compuesto de vitamina D se una de forma inespecífica a lípidos y proteínas en la muestra después de la desnaturalización.

Es en particular difícil automatizar una prueba para un compuesto de vitamina D. La automatización requiere resolver un problema muy difícil, es decir, sobrevivir a un camino en la cuerda floja: por una parte, es necesario liberar los compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D con la ayuda de un reactivo de liberación adecuado, por otra parte, se deben seleccionar las condiciones de modo que la muestra se pueda analizar además directamente. Un requisito previo de este análisis directo adicional es que, por una parte, la proteína de unión a la vitamina D endógena no se una o ya no se una de manera significativa a los compuestos de vitamina D durante este análisis y, por tanto, no interfiera con este análisis y, por otra parte, que el reactivo de liberación usado no interfiera con la unión de los reactivos de detección tales como anticuerpos o la proteína de unión a la vitamina D. Además, es conocido que están presentes alelos diferentes de la proteína de unión a la vitamina D en la población humana que se comportan de forma bioquímicamente diferente. La liberación y medición de los compuestos de vitamina D debe ser comparable para diversos alelos/fenotipos.

Por tanto, el objetivo de la presente invención fue desarrollar una composición de reactivo para la liberación de compuestos de vitamina D y en particular para compuestos de hidroxivitamina D de la proteína de unión a la vitamina D en una muestra, lo que puede superar al menos parcialmente los problemas de la técnica anterior. En lo que sigue, se describen una composición de reactivo adecuada para liberar compuestos de vitamina D, un procedimiento in vitro para determinar compuestos de vitamina D, el uso de la composición de reactivo y kits para la determinación de compuestos de vitamina D usando esta composición de reactivo, y se engloban por las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D que comprende la etapa de a) proporcionar una muestra que se va a investigar y b) mezclar la muestra de la etapa (a) con i) un reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³") de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M, ii) un agente reductor y iii) un agente alcalinizante, liberando de este modo el compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D que comprende las etapas de a) proporcionar una muestra que se va a investigar, b) mezclar la muestra de la etapa (a) con i) un reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO3-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M, ii) un agente reductor y iii) un agente alcalinizante, liberando de este modo un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D, y c) medir el compuesto de vitamina D liberado en la etapa (b).

También se describe una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D que comprende una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M y un agente reductor.

También se divulga una mezcla de reactivo que comprende una muestra que se va a investigar, una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D que comprende una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M y un agente reductor y un agente alcalinizante.

Se divulga un kit para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D, que contiene una composición de reactivo que comprende una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO3-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M y un agente reductor.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D que comprende la etapa de a) proporcionar una muestra que se va a investigar, b) mezclar la muestra de la etapa (a) con i) un reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M, ii) un agente reductor y iii) un agente alcalinizante, liberando de este modo el compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones modificadas.

Como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con el mismo en esta sección.

Los artículos "un/uno" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo.

La expresión "uno o más" indica de 1 a 50, preferentemente de 1 a 20, también preferente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 15.

Si no se establece de otro modo, se debe entender que el término "compuesto de vitamina D" incluye todos los compuestos naturales que contienen la cadena principal de la vitamina D2 o la cadena principal de la vitamina D3 de acuerdo con las siguientes fórmulas estructurales I y II.

Fórmula I

En las fórmulas estructurales I y II, las posiciones de la vitamina D se establecen de acuerdo con la nomenclatura de los esteroides. La 25-hidroxivitamina D indica metabolitos de la vitamina D que están hidroxilados en la posición 25 de las fórmulas estructurales I y II, es decir, la 25-hidroxivitamina D²así como la 25-hidroxivitamina D³. Los compuestos de hidroxivitamina D conocidos adicionales son, por ejemplo, las formas 1,25-dihidroxivitamina D y 24.25- dihidroxivitamina D.

1.25- dihidroxivitamina D se refiere a las formas activas de la vitamina D (las llamadas hormonas D) que tienen una hidroxilación en la posición 1, así como en la posición 25, de las fórmulas estructurales I y II.

Otros compuestos de vitamina D bien conocidos son 24,25-dihidroxivitamina D², 24,25-dihidroxivitamina D³y C3-epi 25-hidroxivitamina D.

De forma sorprendente, se ha descubierto por los autores de la invención, que la presencia de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³- ) tras la hidrólisis en condiciones alcalinas en el procedimiento in vitro divulgado en la presente invención da lugar a la liberación de compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

Un "ion hidrogenocarbonato" (ion bicarbonato) de acuerdo con la presente invención es un anión con la fórmula empírica HCO³- y una masa molecular de 61,01 dáltones.

Una "sal de hidrogenocarbonato" de acuerdo con la presente invención es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3), hidrogenocarbonato de potasio (KHCO³), hidrogenocarbonato de amonio (NH⁴HCO³), hidrogenocarbonato de calcio (Ca(HCO3)2) e hidrogenocarbonato de magnesio (Mg(HCO3)2.

Una "sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis" de acuerdo con un modo de realización de la presente invención es un éster de carbonato.

Un "éster de carbonato" de acuerdo con la presente invención es un grupo carbonilo flanqueado por dos grupos alcoxi. La estructura general de estos carbonatos es R-ⁱO(C=O)OR². Existen ésteres de carbonato cíclicos (por ejemplo, carbonato de etileno) o ésteres de carbonato no cíclicos (por ejemplo, carbonato de dimetilo), así como derivados hidroxilados o halogenados de los mismos disponibles.

Preferentemente, una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis de acuerdo con la etapa i) del procedimiento tiene una concentración total de 0,1 M a 1,5 M, o de 0,2 M a 1,0 M, o de al menos 0,1, 0,2, 0,3 o 0,4 M, o como máximo 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 o 0,75 M, respectivamente.

En un modo de realización preferente, la sal de hidrogenocarbonato se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio, hidrogenocarbonato de amonio, hidrogenocarbonato de calcio e hidrogenocarbonato de magnesio. En otro modo de realización preferente, la sal de hidrogenocarbonato se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio e hidrogenocarbonato de amonio. Más preferente, la sal de hidrogenocarbonato se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio e hidrogenocarbonato de potasio.

En un modo de realización preferente, la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado hidroxilado o halogenado del mismo, respectivamente. En otro modo de realización preferente, la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado halogenado del mismo, respectivamente. En otro modo de realización preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico o el derivado halogenado del mismo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, biscarbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona, 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona, éster dimetílico del ácido 2.5- dioxahexanodioico, carbonato de 1,2-butileno, carbonato de cis-2,3-butileno y carbonato de trans-2,3-butileno. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico o el derivado halogenado del mismo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, biscarbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona y 4.5- dicloro-1,3-dioxolan-2-ona.

Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, 1,2-carbonato de glicerol, carbonato de propileno y carbonato de vinileno. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, 1,2-carbonato de glicerol y carbonato de propileno. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo y 1,2-carbonato de glicerol.

Es conocido para un experto en la técnica que una o más sales de hidrogenocarbonato y una o más sustancias que pueden liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') tras la hidrólisis, respectivamente, se pueden mezclar arbitrariamente para lograr el efecto divulgado en la presente invención.

En un modo de realización, el reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³- ) tras la hidrólisis de la etapa (i) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es soluble a al menos 2 M en una solución acuosa en las condiciones apropiadas para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D. En otro modo de realización, el reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³- ) tras la hidrólisis de la etapa (i) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es soluble a al menos 1,5 M, o, más preferente, es soluble a al menos 1,0 M, en una solución acuosa en las condiciones apropiadas para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D. Es conocido para el experto en la técnica cómo solubilizar una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis en agua para lograr el reactivo de la etapa (i) del procedimiento de acuerdo con la presente invención. La sal de hidrogenocarbonato y la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis debe ser soluble en agua a 25 °C. La sal de hidrogenocarbonato y la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis solubilizada en una solución acuosa debe ser almacenable a una temperatura de 4 °C sin separación o cristalización.

La proporción molar de la sal de hidrogenocarbonato y la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis con respecto al agente alcalinizante está preferentemente entre 1 : 3 y 3 : 1, más preferentemente entre 1 : 2 y 2 : 1 y más preferentemente entre 1 : 1,5 y 1,5 : 1.

El experto en la técnica también es consciente de que la proporción molar de agente alcalinizante con respecto a sal de hidrogenocarbonato y/o sustancias que pueden liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³- ) tras la hidrólisis se calcula sobre las correspondientes concentraciones de los iones reactivos OH- o HCO³- .

Es conocido para el experto en la técnica que una mezcla de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis se puede usar en un procedimiento de acuerdo con la presente invención. La proporción molar de dichas mezclas de sal de hidrogenocarbonato y/o la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis con respecto al agente alcalinizante está preferentemente entre 1 : 3 y 3 : 1, más preferentemente entre 1 : 2 y 2 : 1 y más preferentemente entre 1 : 1,5 y 1.5 : 1.

Sin querer vincularse a esta teoría, bien puede ser que la presencia de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis en la composición de reactivo induzca un cambio de pH. Concentraciones menores de dicha sal de hidrogenocarbonato y/o dicha sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis en una composición de reactivo provocan una reducción de pH más lenta de la mezcla de reactivo durante la reacción de pretratamiento. Concentraciones mayores de dicha sal de hidrogenocarbonato y/o dicha sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis en la composición de reactivo provocan una reducción de pH más rápida de la mezcla de reactivo durante la reacción de pretratamiento. También parece que debido a la acción concertada de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis y el agente reductor en condiciones tamponadoras alcalinas, se logra una desnaturalización irreversible de la proteína de unión a la vitamina D y de este modo se facilita la detección posterior de un compuesto de vitamina D.

En un modo de realización, el agente reductor de la etapa ii) de acuerdo con el procedimiento se selecciona del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl, ditiotreitol (DTT), N-metilmaleimida, reactivo de Ellman y ácido 1,2-ditiolano-3-carboxílico.

En otro modo de realización, el agente reductor de la etapa ii) de acuerdo con el procedimiento está caracterizado por que el agente reductor de la etapa ii) contiene grupos tiol.

En otro modo de realización, el agente reductor de la etapa ii) de acuerdo con el procedimiento se selecciona del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl y ditiotreitol (DTT).

En un modo de realización, el agente reductor de la etapa ii) de acuerdo con el procedimiento tiene una concentración de 2 mM a 30 mM, en otro modo de realización de 3 mM a 20 mM, en otro modo de realización de 3.5 mM a 15 mM, y en otro modo de realización de 4 mM a 10 mM.

Un "agente alcalinizante" puede ser un hidróxido alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo (es decir, en una solución acuosa). Un agente alcalinizante también puede comprender una mezcla de hidróxidos alcalinos y/o hidróxidos de metal alcalinotérreo, es decir, NaOH y K^oH, NaOH y LiOH, NaOH y Ca(OH)², KOH y Ca(OH)², ^kO^hy LiOH, así como otras combinaciones.

Los "hidróxidos alcalinos" son una clase de compuestos químicos que están compuestos de un catión de metal alcalino y el anión hidróxido (OH-). Los hidróxidos alcalinos son tales como NaOH, KOH, LiOH, RbOH y CsOH. Los "metales alcalinos" son una serie de elementos químicos que forman el grupo 1 (estilo IUPAC) de la tabla periódica: litio (Li), sodio (Na), potasio (K), rubidio (Rb), cesio (Cs) y francio (Fr).

Los "hidróxidos de metal alcalinotérreo" son una clase de compuestos químicos que están compuestos de un catión de metal alcalinotérreo y 2 aniones hidróxido (OH-). "Metales alcalinotérreos" que comprenden el grupo 2 (estilo IUPAC) (grupo IIA) de la tabla periódica: berilio (Be), magnesio (Mg), calcio (Ca), estroncio (Sr), bario (Ba) y radio (Ra).

En un modo de realización, el agente alcalinizante de la etapa iii) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en NaOH, KOH, Ca(OH)²y LiOH.

En otro modo de realización, el agente alcalinizante de la etapa Ni) de acuerdo con el procedimiento tiene una concentración de 0,1 M a 2,0 M, o de 0,1 M a 1,5 M, o de 0,2 M a 1,75 M o de 0,2 M a 1,0 M, o de al menos 0,1, 0,2, 0,3 o 0,4 M, o de como máximo 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 o 0,75 M, respectivamente.

En otro modo de realización, el agente alcalinizante de la etapa iii) de acuerdo con el procedimiento se selecciona del grupo que consiste en NaOH y KOH.

En otro modo de realización, el agente alcalinizante usado en el procedimiento de acuerdo con la presente invención tiene en la mezcla de muestra reactivo i) agente reductor ii) agente alcalinizante iii) una concentración final de 0,1 M a 0,6 M, o de 0,2 M a 0,5 M, o de al menos 0,1 o 0,2 M, o de como máximo 0,6 o 0,5 M, respectivamente.

En otro modo de realización del procedimiento, la proporción de mezcla de los tres reactivos de las etapas i), ii) y iii), respectivamente, con respecto a una muestra que se va a investigar está preferentemente entre 1 : 3 y 3 : 1.

En un modo de realización, se podrían añadir la muestra de la etapa a), el reactivo de la etapa i) que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis el agente reductor de la etapa ii) el agente alcalinizante de la etapa iii) de acuerdo con el procedimiento en cualquier secuencia de pipeteo. Tras mezclar, la etapa b) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, en otro modo de realización, se puede caracterizar por que tiene al menos durante 10, 12, 15 o 20 segundos un valor de pH de 9,5 a 14, otra etapa preferente b) tiene, tras mezclar al menos durante 10, 12, 15 o 20 segundos, un valor de pH de 10,5 a 14.

En un modo de realización del procedimiento, la muestra que se va a investigar de la etapa a) se mezcla en la etapa b) con el reactivo de la etapa i) que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, el agente reductor de la etapa ii), el agente alcalinizante de la etapa iii), y se incuba. La etapa de incubación b) puede ser tan larga como se requiera. El tiempo de incubación es, por ejemplo, de 15 segundos a 24 h. En un modo de realización, la mezcla de la etapa b) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención se incuba durante de 1 a 60 minutos, liberando, de este modo, el compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

Las concentraciones de los componentes de la etapa b) de acuerdo con el procedimiento se seleccionan fácilmente por un experto en la técnica de modo que el intervalo de pH especificado y las concentraciones deseadas de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, el agente reductor y el agente alcalinizante, respectivamente, durante la incubación con la muestra que se va a investigar sean apropiados para liberar el compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

Las condiciones alcalinas dan como resultado la desnaturalización de la proteína de unión a la vitamina D y la liberación de vitamina D presente en la muestra que se va a investigar. La concentración del agente alcalinizante debe ser suficiente para incrementar el pH de la "mezcla de reactivo" (= una muestra que se va a investigar composición de reactivo de acuerdo con la presente invención agente alcalinizante) a al menos pH 10,0, preferentemente a al menos pH 10,5, más preferentemente a al menos 11,0 en la reacción de pretratamiento. El experto en la técnica es consciente de que el pH de la mezcla de reactivo se debe medir en el momento de la mezcla de la muestra que se va a investigar composición de reactivo de acuerdo con la presente invención agente alcalinizante. Debido a la hidrólisis de la sal de hidrogenocarbonato y/o la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, el pH se reducirá en la mezcla de reactivo (véanse la fig. 1 y el ejemplo 1.5).

El término "muestra" como se usa en el presente documento se refiere a una muestra biológica obtenida de un individuo para el propósito de su evaluación in vitro. En los procedimientos de la presente invención, la muestra que se va a investigar es en un modo de realización una muestra líquida. La muestra puede comprender en otro modo de realización de la presente invención cualquier líquido corporal. En otro modo de realización, la muestra que se va a investigar es sangre, suero o plasma, siendo suero o plasma lo más preferente. En otro modo de realización, la muestra líquida se seca en un papel de filtro o membrana. En un modo de realización, la muestra usada en el presente documento se refiere a una alícuota de una muestra obtenida de un individuo.

La presente invención en otro modo de realización comprende un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D que comprende las etapas de (a) liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D y (b) medir el compuesto de vitamina D liberado en la etapa (a).

En otro modo de realización, la presente invención comprende un procedimiento in vitro para medir el compuesto de vitamina D que comprende las etapas de (a) liberar un compuesto de vitamina D unido a la proteína de unión a la vitamina D en una muestra de interés y (b) medir los compuestos de vitamina D liberados en la etapa (a).

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D que comprende las etapas de a) proporcionar una muestra que se va a investigar, b) mezclar la muestra de la etapa (a) con i) un reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 a 2,0 M, ii) un agente reductor y iii) un agente alcalinizante, liberando de este modo un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D, y c) medir el compuesto de vitamina D liberado en la etapa (b).

En otro modo de realización, la presente invención comprende un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D, en el que el compuesto de vitamina D medido se selecciona del grupo que comprende 25-hidroxivitamina D², 25-hidroxivitamina D³, 24,25-dihidroxivitamina D², 24,25-dihidroxivitamina D³y C3-epi 25-hidroxivitamina D.

En otro modo de realización, la presente invención comprende un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D, en el que el compuesto de vitamina D medido se selecciona del grupo que comprende 25-hidroxivitamina D², 25-hidroxivitamina D³, 24,25-dihidroxivitamina D²y 24,25-dihidroxivitamina D³.

En otro modo de realización, la presente invención comprende un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D, en el que se determinan los compuestos de vitamina D 25-hidroxivitamina D²y/o 25-hidroxivitamina D3.

Composición de reactivo:

En un modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D en una muestra que se va a investigar, que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') tras la hidrólisis en una concentración, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³') de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') es de 0,1 a 2,0 M, y un agente reductor.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D en una muestra que se va a investigar, que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') tras la hidrólisis, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³') de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') es de 0,1 a 1,5 M, y un agente reductor.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D en una muestra que se va a investigar, que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') tras la hidrólisis, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³') de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') es de 0,2 a 1,0 M, y un agente reductor.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D en una muestra que se va a investigar, que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') tras la hidrólisis, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³') de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') es de al menos 0,1, 0,2, 0,3 o 0,4 M y un agente reductor.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D en una muestra que se va a investigar, que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') tras la hidrólisis, en la que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³') de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³') es de como máximo 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 o 0,75 M, y un agente reductor.

En otro modo de realización preferente, la sal de hidrogenocarbonato en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio, hidrogenocarbonato de amonio, hidrogenocarbonato de calcio e hidrogenocarbonato de magnesio. Más preferente, la sal de hidrogenocarbonato en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, hidrogenocarbonato de potasio e hidrogenocarbonato de amonio. Más preferente, la sal de hidrogenocarbonato en la composición de reactivo es hidrogenocarbonato de sodio y/o hidrogenocarbonato de potasio.

En otro modo de realización preferente, la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis en la composición de reactivo es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado hidroxilado o halogenado del mismo, respectivamente.

En otro modo de realización preferente, la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis en la composición de reactivo es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado halogenado del mismo, respectivamente. En otro modo de realización preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico o el derivado halogenado del mismo en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, biscarbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona, 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona, éster dimetílico del ácido 2,5-dioxahexanodioico, carbonato de 1,2-butileno, carbonato de cis-2,3-butileno y carbonato de trans-2,3-butileno. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico o el derivado halogenado del mismo en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, carbonato de propileno, carbonato de vinileno, carbonato de trimetileno, biscarbonato de eritritol, 1,2-carbonato de glicerol, 4-cloro-1,3-dioxolan-2-ona y 4,5-dicloro-1,3-dioxolan-2-ona. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, 1,2-carbonato de glicerol, carbonato de propileno, carbonato de vinileno. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo, 1,2-carbonato de glicerol y carbonato de propileno. Más preferente, el éster de carbonato cíclico o no cíclico en la composición de reactivo se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, carbonato de dimetilo y 1,2-carbonato de glicerol.

La presente invención se refiere en otro modo de realización a una composición de reactivo caracterizada por que el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCE^p, cisteína-HCl, ditiotreitol (DTT), N-metilmaleimida, reactivo de Ellman y ácido 1,2-ditiolano-3-carboxílico.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo caracterizada por que el agente reductor contiene grupos tiol.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición de reactivo caracterizada por que el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEp , cisteína-HCl y ditiotreitol (DTT).

La concentración de un agente reductor en un determinado modo de realización de la presente invención es de 2 mM a 30 mM, en otro modo de realización de 3 mM a 20 mM, en otro modo de realización de 3,5 mM a 15 mM y en otro modo de realización de 4 mM a 10 mM.

Es conocido para el experto en la técnica que la capacidad de un agente reductor es dependiente de la presencia de grupos funcionales, es decir, reductores. Por lo tanto, es conocido para el experto en la técnica seleccionar la concentración apropiada de un agente reductor teniendo en cuenta su número de grupos reductores activos.

El gen que codifica la proteína de unión a la vitamina D se produce en la población humana en forma de alelos diferentes. Es conocido que los polipéptidos codificados por estos alelos difieren bioquímicamente, es decir, dan lugar a fenotipos diferentes. Estas diferencias bioquímicas también influyen en la unión y liberación de compuestos de vitamina D. La composición de reactivo de acuerdo con la invención es adecuada para liberar compuestos de vitamina D independientemente del fenotipo de la proteína de unión a la vitamina D. Por tanto, un modo de realización preferente de la presente invención es el uso de una composición de reactivo de acuerdo con la invención para liberar compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

La composición de reactivo de acuerdo con la invención se usa, en un modo de realización, para liberar compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D en muestras que se van a investigar indistinta e independientemente de los fenotipos de la proteína de unión a la vitamina D.

Para el propósito de liberar compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D, se mezcla la composición de reactivo de acuerdo con la invención con una muestra que se va a investigar, por ejemplo, suero o plasma, y un agente alcalinizante.

Mezcla de reactivo:

El término "mezcla de reactivo" como se usa en el presente documento a continuación comprende una muestra que se va a investigar, una composición de reactivo de acuerdo con la presente invención y un agente alcalinizante.

En otro modo de realización, la mezcla de reactivo está caracterizada por que el agente alcalinizante se selecciona del grupo que consiste en NaOH, KOH, Ca(OH)²y LiOH.

En otro modo de realización, la mezcla de reactivo está caracterizada por que el agente alcalinizante usado tiene una concentración de 0,1 M a 2,0 M, o de 0,1 M a 1,5 M, o de 0,2 M a 1,75 M, o de 0,2 M a 1,0 M, o de al menos 0,1, 0,2, 0,3 o 0,4 M, o de como máximo 2,0, 1,7, 1,5, 1,3, 1,0 o 0,75 M, respectivamente.

En otro modo de realización, la mezcla de reactivo está caracterizada por que el agente alcalinizante se selecciona del grupo que consiste en NaOH y KOH.

En otro modo de realización, el agente alcalinizante usado en el procedimiento de acuerdo con la presente invención tiene en la mezcla de reactivo una concentración final de 0,1 M a 0,6 M, o de 0,2 M a 0,5 M, o de al menos 0,1 o 0,2 M, o de como máximo 0,6 o 0,5 M, respectivamente.

La proporción de mezcla de la composición de reactivo y el agente alcalinizante con respecto a una muestra que se va a investigar, en un modo de realización, está preferentemente entre 1 : 3 y 3 : 1.

Se podrían añadir una muestra que se vaya a investigar, la composición de reactivo divulgada y un agente alcalinizante en cualquier secuencia de pipeteo para formar la mezcla de reactivo. Tras mezclar, la mezcla de reactivo en otro modo de realización está caracterizada por que tiene al menos durante 10, 12, 15 o 20 segundos un valor de pH de 9,5 a 14, más preferente, la mezcla de reactivo tiene tras mezclar al menos durante 10, 12, 15 o 20 segundos un valor de pH de 10,5 a 14.

La muestra que se va a investigar se mezcla con la composición de reactivo de acuerdo con la invención y un agente alcalinizante y se incuba. Esta etapa también se puede llamar etapa de pretratamiento. La etapa de pretratamiento se puede realizar tan larga como se requiera. El tiempo de incubación es, por ejemplo, durante de 15 segundos a 24 h. La mezcla de reactivo, en un modo de realización, se incuba durante de 1 a 60 minutos para liberar compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D. La mezcla de reactivo, en otro modo de realización, se incuba durante de 4 a 10 minutos para liberar los compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

La mezcla de reactivo y las concentraciones de los componentes en ella se seleccionan fácilmente por un experto en la técnica, de modo que el intervalo de pH especificado y las concentraciones deseadas de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³- ) tras la hidrólisis, el agente reductor y el agente alcalinizante, respectivamente, durante la incubación con una muestra que se va a investigar sean apropiados para liberar los compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

La mezcla de reactivo comprende en un modo de realización también las sustancias y/o concentraciones preferentes de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis como se describe para la composición de reactivo de la presente invención.

La detección de un compuesto de vitamina D se lleva a cabo preferentemente de modo que se detecte al menos un compuesto de vitamina D seleccionado del grupo que comprende 25-hidroxivitamina D², 25-hidroxivitamina D³, 24,25-dihidroxivitamina D², 24,25-dihidroxivitamina D³y C3-epi 25-hidroxivitamina D.

En la detección específica de un compuesto de vitamina D, otras etapas de incubación siguen después de la etapa de pretratamiento. Los restos del agente reductor presentes en la mezcla de reactivo se pueden bloquear por adición de proteínas inespecíficas, preferentemente, por ejemplo, seroalbúmina humana (SAH). Estas proteínas inespecíficas se pueden añadir por separado o se pueden incluir simplemente en la solución que también comprende el reactivo de detección. Bloqueando la capacidad reductora residual del agente reductor, es posible una detección no comprometida de un compuesto de vitamina D usando un agente de unión específica proteínico a un compuesto de vitamina D.

Como apreciará el experto en la técnica, la solución que comprende el agente de unión específica contendrá un sistema tampón de pH que garantiza después de la adición de la solución que contiene el agente de unión específica a la mezcla de reactivo que el pH es un requisito previo para la unión de un compuesto de vitamina D al agente de unión específica. Ni el sistema tampón necesariamente requerido ni el pH final son críticos siempre que tenga lugar la unión del agente de unión específica a un compuesto de vitamina D. En caso de que se use la proteína de unión a la vitamina D como un agente de unión específica, el pH durante esta etapa de incubación se selecciona preferentemente entre pH 6,0 y pH 9,0. En caso de que se use un anticuerpo como agente de unión específica para un compuesto de vitamina D, el pH durante esta etapa de incubación estará preferentemente entre pH 5,5 y pH 7,5.

La solución que comprende el agente de unión específica contiene preferentemente un sistema tampón que es de 20 mM a 400 mM. También preferente, el tampón tiene una molaridad de entre 50 mM y 350 mM o entre 100 mM y 300 mM.

El procedimiento in vitro para la detección de un compuesto de vitamina D, en base a la divulgación de la presente invención, se puede llevar a cabo de diversas formas.

En principio, se pueden usar todos los compañeros de unión proteínicos, tales como polipéptidos de unión de forma específica que se unan a uno o más compuestos de vitamina D, como agente de unión específica. Un agente de unión específica puede ser un anticuerpo o bien una proteína de unión a la vitamina D por sí misma.

Muchos sistemas de prueba comerciales se basan en el uso de fases sólidas recubiertas con avidina o estreptavidina (ES), por ejemplo, placas de microvaloración recubiertas con ES o látex recubiertos con ES.

Un derivado de analito biotinilado se une, por ejemplo, a esta fase sólida con ES antes o durante el procedimiento de prueba. Cuando se detecta un compuesto de vitamina D, este compuesto derivado de analito biotinilado puede ser, por ejemplo, una 25-hidroxivitamina D²biotinilada y/o una 25-hidroxivitamina D³biotinilada.

En un modo de realización de la presente invención, se lleva a cabo el procedimiento de detección in vitro como un ensayo competitivo. En dicha prueba competitiva, un derivado del compuesto de vitamina D añadido en una cantidad definida a la prueba compite con el correspondiente compuesto de vitamina D de la muestra por los sitios de unión del agente de unión específica. Cuanto más compuesto de vitamina D está presente en la muestra, más pequeña es la señal de detección.

En un modo de realización, el derivado de un compuesto de vitamina D es un compuesto de vitamina D biotinilada. En otro modo de realización, el compuesto de vitamina D biotinilada es una 25-hidroxivitamina D²biotinilada y/o 25-hidroxivitamina D³biotinilada. En otro modo de realización, el compuesto de vitamina D biotinilada es una 25-hidroxivitamina D²biotinilada.

Como se menciona anteriormente, los agentes de unión específica preferentes para su uso en un procedimiento de detección como se divulga en la presente descripción son anticuerpos y proteína de unión a la vitamina D. La proteína de unión a la vitamina D, si se usa en un formato de ensayo competitivo, dará lugar a una medición integrada de todos los compuestos de vitamina D que compiten con su unión a uno o más derivados del compuesto de vitamina D (biotinilada). En un modo de realización, la proteína de unión a la vitamina D se marcará, por ejemplo, se rutenilará, de forma detectable.

Uso:

En un modo de realización, la presente invención se refiere al uso de una composición de reactivo conjuntamente con un agente alcalinizante para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere al uso de una composición de reactivo conjuntamente con un agente alcalinizante para liberar un compuesto de vitamina D que se espera que esté presente en una muestra que se va a investigar de la proteína de unión a la vitamina D.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere al uso de una composición de reactivo conjuntamente con un agente alcalinizante para liberar un compuesto de vitamina D en un procedimiento de detección de un compuesto de vitamina D.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere al uso de una composición de reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³") tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³") de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³") es de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de un agente reductor, conjuntamente con una solución de 1 M a 1,5 M de un agente alcalinizante para liberar un compuesto de vitamina D que se espera que esté presente en una muestra que se va a investigar de la proteína de unión a la vitamina D en un procedimiento de detección de un compuesto de vitamina D.

El uso de la composición de reactivo comprende en un modo de realización también las sustancias y/o concentraciones preferentes de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³") tras la hidrólisis como se describe para la composición de reactivo de la presente invención.

Kit:

En un modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la liberación de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D, que contiene una composición de reactivo que comprende una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³") tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³") de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³") es de 0,1 M a 2,0 M, y un agente reductor.

En un modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D, caracterizado por que comprende una composición de reactivo que tiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³") tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M, un agente reductor, y un agente alcalinizante.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D, caracterizado por que comprende una composición de reactivo que tiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2.0 M, de 2 mM a 30 mM de un agente reductor y un agente alcalinizante.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de vitamina D a partir de proteína de unión a la vitamina D, caracterizado por que comprende una composición de reactivo que tiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2.0 M, de 2 mM a 30 mM de un agente reductor, una solución de 1 M a 1,5 M de un agente alcalinizante, además de los componentes de detección.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de vitamina D caracterizado por que comprende una composición de reactivo que tiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, un agente reductor, una solución de un agente alcalinizante, además de una solución que comprende un agente de unión específica.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de vitamina D caracterizado por que comprende una composición de reactivo que tiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de un agente reductor, una solución de 1 M a 1,5 M de un agente alcalinizante y una solución que comprende un agente de unión específica.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de vitamina D caracterizado por que comprende una composición de reactivo que tiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO³-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) es de 0,1 M a 2,0 M, de 2 mM a 30 mM de un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl y ditiotreitol (DTT), una solución de 1 M a 1,5 M de un agente alcalinizante seleccionado del grupo que consiste en NaOH, KOH, Ca(OH)²y LiOH y una solución que comprende un agente de unión específica.

El kit comprende en un modo de realización también las sustancias y/o concentraciones preferentes de una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO³-) tras la hidrólisis como se describe para la composición de reactivo de la presente invención.

La composición de reactivo de acuerdo con la invención ha demostrado ser adecuada para su uso en una prueba automatizada para determinar compuestos de vitamina D. La presente invención se refiere preferentemente al uso de una composición de reactivo de acuerdo con la invención para liberar compuestos de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D, especialmente en una prueba para la determinación de compuestos de vitamina D.

La prueba para determinar un compuesto de vitamina D preferentemente está completamente automatizada. Completamente automatizada en este caso quiere decir que el experimentador solo tiene que colocar una muestra que se va a investigar y un envase de reactivo que contiene todos los componentes para medir un compuesto de vitamina D en un analizador automatizado y todas las demás etapas se llevan a cabo automáticamente por el analizador. La prueba completamente automatizada se lleva a cabo de forma particularmente preferente en un analizador Elecsys® de Roche Diagnostics.

La composición de reactivo de acuerdo con la invención en otro modo de realización se usa en un procedimiento in vitro para la detección de un compuesto de vitamina D seleccionado del grupo que comprende 25-hidroxivitamina D², 25-hidroxivitamina D³, 24,25-dihidroxivitamina D², 24,25-dihidroxivitamina D³y C3-epi 25-hidroxivitamina D.

Como ya se menciona anteriormente, 25-hidroxivitamina D²y 25-hidroxivitamina D³son formas pertinentes en particular de la vitamina D para el diagnóstico. En el procedimiento in vitro de acuerdo con la invención, la detección específica de 25-hidroxivitamina D²o 25-hidroxivitamina D³, o ambas, por medio de un anticuerpo específico para 25-hidroxivitamina D²o 25-hidroxivitamina D³también representa un modo de realización preferente.

La invención se aclara además por los siguientes ejemplos y figuras. El alcance de protección real resulta de las reivindicaciones adjuntas a la presente invención.

Descripción de las figuras:

Figura 1: Cambio de pH de la mezcla de reactivo durante la etapa de pretratamiento. Se realizó el ensayo como se explica en el ejemplo 1.5. La composición de reactivo (A) contiene diversas concentraciones de carbonato de etileno (CE): CE 0,00 M (•), 0,10 M (♦), 0,30 M (□), 0,50 M (▲), 0,75 M (O), 1,00 M (■), 1,50 M (O). El eje X muestra el tiempo en minutos, el eje Y el pH.

Figura 2: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 1.5 conteniendo la composición de reactivo (A) diversas concentraciones de carbonato de etileno (CE): CE 1,50 M (•), 1,00 M (□), 0,75 M (♦), 0,50 M (O), 0,30 M (A ) y 0,10 M (O). El eje X muestra la concentración en ng/ml, el eje Y muestra los recuentos determinados como de costumbre usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics.

Figura 3: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 1.5 conteniendo la composición de reactivo (A) diversas concentraciones del agente reductor ditiotreitol (DTT): 1,0 mM (□), 2,0 mM (•), 4,0 mM (♦), 6,7 mM (O), 10,0 mM/12,0 mM (A ), 15,0 mM (O). El eje X muestra la concentración en ng/ml, el eje Y muestra los recuentos determinados como de costumbre usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics.

Figura 4a: Comparación de procedimientos: Ensayo de vitamina D (ejemplo 1) y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (CL-EMT). Se determinó 25-hidroxivitamina D por medio de CL-EMT, así como por medio del ensayo de vitamina D del ejemplo 1.5, donde se usó la composición de reactivo (A) con carbonato de etileno (CE) 0,5 M para la incubación. Los resultados en ng/ml para múltiples muestras de suero se representan en el eje X para la CL-EMT y en el eje Y para el ensayo de vitamina D del ejemplo 1.5.

(---) y = x

(— ) Regresión lineal

Ensayo de vitamina D = 2,0116 0,9036*x, r de Pearson = 0,9509

Figura 4b: Comparación de procedimientos: Ensayo de vitamina D (ejemplo 1) y CL-EMT. Se determinó 25-hidroxivitamina D por medio de CL-EMT, así como por medio del ensayo de vitamina D del ejemplo 1.5, donde se usó la composición de reactivo (A) sin carbonato de etileno (CE) para la incubación. Los resultados en ng/ml para múltiples muestras de suero se representan en el eje X para la CL-EMT y en el eje Y para el ensayo de vitamina D del ejemplo 1.5.

(---) y = x

(— ) Regresión lineal

Ensayo de vitamina D = 0,7496 0,7338*x, r de Pearson = 0,7914

Figura 5: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 2 conteniendo la composición de reactivo (A) carbonato de etileno 0,5 M (♦), Na2CO30,5 M (O), NaH2PO40,5 M (A ), NaCl 0,5 M (O) y control (□). El eje X muestra la concentración en ng/ml, el eje Y muestra los recuentos determinados como de costumbre usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics.

Figura 6: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 3 conteniendo la composición de reactivo (A):

♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M o

A : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM o

□ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM.

El eje X muestra la concentración en ng/ml, el eje Y muestra los recuentos determinados como de costumbre usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics.

Figura 7: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 4 conteniendo la composición de reactivo (A):

O: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o

♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, carbonato de dimetilo 0,5 M.

Figura 8: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 5 conteniendo la composición de reactivo (A):

♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o

O: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, NaHCOa 0,5 M o

▲: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, NaHCOa 0,5 M etilenglicol 0,5 M o

□ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM.

Figura 9: Curvas de calibración de un ensayo de vitamina D como se describe en el ejemplo 4 conteniendo la composición de reactivo (A):

♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o

O: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, 1,2-carbonato de glicerol 0,5 M.

Ejemplo 1

Ensayos para la detección de 25-hidroxivitamina D

Se usan ensayos comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevan a cabo las determinaciones de 25-hidroxivitamina D por medio de HPLC (prueba para determinar 25(OH)vitamina Da, de la empresa "Immundiagnostik", Bensheim, n.° de referencia KC 3400) o por medio de CL-EM/EM (Vogeser, M. et al., Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417) como se describe en la literatura.

En lo que sigue, se describe la preparación de los ingredientes y el procedimiento de prueba general para una nueva prueba:

1.1 Síntesis de éter hidroxivitamina D ² -3-2'-cianoetílico

Se disuelven 20,6 mg (50 |jmol) de 25-hidroxivitamina D²(Fluka, n.° 17937) en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 25 ml con un termómetro interno en 10 ml de acetonitrilo seco en una atmósfera de argón. Se añaden 1.5 ml de terc-butanol/acetonitrilo (9:1) a la solución y se enfría hasta 6 °C en un baño de hielo. Posteriormente, se añaden 820 |jl de una solución de acrilonitrilo (86 |jl de acrilonitrilo en 1,0 ml de acetonitrilo) y se agita durante 15 minutos a 6 °C. A continuación, se añaden 205 j l de una solución de hidruro de potasio (25 mg de KH en 0,5 ml de terc-butanol/acetonitrilo 9:1). Se produce una breve floculación, después de la que se obtiene una solución transparente. Se agita la solución de reacción durante otros 45 minutos a 6 °C y posteriormente durante 60 minutos a 4 °C.

Posteriormente, se diluye la solución de reacción con 10 ml de éter metil-terc-butílico y se lava dos veces con 10 ml de H²O cada vez. Se seca la fase orgánica con aproximadamente 1 g de sulfato de sodio anhidro, se filtra sobre una frita de vidrio G3 y se evapora en un rotavapor. Se seca en alto vacío para formar un residuo transparente viscoso con una masa de aproximadamente 55 mg.

1.2 Síntesis de éter hidroxivitamina D ² -3-3'-aminopropílico

Se disuelve todo el nitrilo obtenido anteriormente en 15 ml de éter dietílico y se mezcla con una suspensión de 7.5 mg de hidruro de litio en 7,5 ml de éter dietílico mientras se agita. Se agita la mezcla de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, se añade una suspensión de 38,4 de hidruro de litio y aluminio en 6,6 ml de éter dietílico. Esto da como resultado una fuerte turbidez de la mezcla. Se agita la mezcla de reacción durante otra hora a temperatura ambiente, a continuación se enfría la mezcla de reacción hasta 0-5 °C en un baño de hielo y se añaden cuidadosamente 35 ml de agua. Se hace que el pH sea fuertemente básico por adición de 6,6 ml de solución de hidróxido de potasio 10 M.

Se extrae tres veces con 65 ml de éter metil-ferc-butílico cada vez. Se secan las fases orgánicas combinadas usando aproximadamente 5 g de sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora a temperatura ambiente en un rotavapor. Se seca el residuo hasta una constancia en la masa usando una bomba de aceite. Se disuelve el producto bruto en 5 ml de DMSO y 3,0 ml de acetonitrilo y se purifica por medio de HPLC preparativa. eluyente A = Millipore-H²O ácido trifluoroacético al 0,1 %;

eluyente B = acetonitrilo al 95 % Millipore-H²O al 5 % TFA al 0,1 %;

gradiente: de un 50 % de B a un 100 % de B en 100 min

caudal: 30 ml/min

temperatura: temperatura ambiente

dimensión de columna: 0 = 5,0 cm; L = 25 cm

material de columna: Vydac C18/300 Á/15-20 |jm

longitud de onda det.: 226 nm

Se agrupan las fracciones con contenido de producto mayor de un 85 % de acuerdo con la HPLC analítica (Vydac C18/300 Á/5 |jm, 4,6 x 250 mm) en un matraz de fondo redondo y se liofiliza. Se obtienen 13,7 mg (rendimiento: 58 %) como un liofilizado incoloro.

1.3 Síntesis del conjugado éter hidroxivitamina D ² -3-3'-N-(hemisuberil)aminopropílico-biotina-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(épsilon) (= Ag-Bi)

Se disuelven 13,7 mg (25 jmol) de éter hidroxivitamina D2-3-3'-aminopropílico en 3,5 ml de DMSO, se añaden 28,7 mg (30 jmol) de biotina-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(épsilon)-éster de hemi-suberato-N-hidroxisuccinimida (Roche Applied Science, n.° 11866656) y 12,5 j l de trietilamina y se agita durante la noche a temperatura ambiente. Se diluye la solución de reacción con 4,5 ml de DMSO, se filtra a través de un microfiltro de 0,45 jm y posteriormente se purifica por medio de HPLC preparativa (para las condiciones, véase el ejemplo 2.3 b)). Se agrupan las fracciones que contienen más de un 85 % de producto de acuerdo con la HPLC analítica y se liofiliza. Se obtiene 9,8 (rendimiento: 30 %) de conjugado de biotina purificado.

1.4 Rutenilación de proteína de unión a la vitamina D y purificación por cromatografía de filtración en gel Se transfiere la proteína de unión a la vitamina D a un tampón fosfato de potasio 100 mM/cloruro de sodio 150 mM, pH 8,5, y se ajusta la concentración de proteína a 5-10 mg/ml. Se disuelve el reactivo de rutenilación (éster de tris(bipiridil)-N-hidroxisuccinimida-rutenio(II)) en DMSO y se añade a la solución de anticuerpo en una proporción molar de 3 a 1. Después de un tiempo de reacción de 45 min, se detiene la reacción por adición de 1-lisina y se purifica la proteína de unión a la vitamina D rutenilada (= DBP-Ru) por filtración en gel en una columna Superdex 200.

1.5 Procedimiento de prueba en el ensayo

Se mide la muestra que se va a investigar usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics.

Se forma la mezcla de reactivo mezclando una muestra que se va a investigar con la composición de reactivo (A) y un agente alcalinizante (B).

En este ejemplo, se forma la mezcla de reactivo de 15 j l de muestra mezclada con 15 j l de la composición de reactivo (A) y 10 j l del agente alcalinizante (B). Se incuba la mezcla de reactivo durante 9 minutos. En la siguiente etapa, se añaden 70 j l de reactivo de detección (solución C) a la mezcla de reactivo y se incuba durante otros 9 minutos. En la última etapa, se añaden antígeno de pared biotinilado (solución D) (60 jl), así como 30 j l de partículas de poliestireno magnetizables recubiertas con estreptavidina (ES) (30 j l) (suspensión E). Después de otros 9 minutos de incubación, se determina la cantidad de proteína de unión a la vitamina D rutenilada unida como de costumbre (véanse las fig. 1, 2, 3, 4a, 4b).

La composición de reactivo (A) contiene:

10 mM NaOH

4 mM EDTA

6,7 mM ditiotreitol (DTT)

0,5 M carbonato de etileno (CE)

pH 5,5

El agente alcalinizante (B) contiene:

1,375 M NaOH

La solución C con la proteína de unión a la vitamina D rutenilada (DBP-Ru) contiene:

0,2 M bis-tris-propano (pH 7,5)

2,5 % seroalbúmina humana (SAH)

50 mM NaCl

1 % manitol

0,1 % Oxy-Pyrion

0,12 pg/ml DBP-Ru

La solución D con el antígeno de pared biotinilado contiene:

0,2 M bis-tris-propano (pH 8,6)

0,5 % solución de tween-20

0,1 % Oxy-Pyrion

30 ng/ml biotina

0,0108 pg/ml Ag-Bi (del ejemplo 1.1)

La suspensión E con partículas de látex recubiertas con ES contiene:

0,72 mg/ml Partículas de poliestireno magnetizables recubiertas con ES que tienen una capacidad de unión de 470 ng/ml.

Ejemplo 2

Comparación del éster de carbonato con una sal de metal, un tampón fosfato y un carbonato

Se mide la muestra que se va a investigar usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics. Se muestra el procedimiento de ensayo total en el ejemplo 1.5.

A diferencia del ejemplo 1.5, la composición de reactivo (A) contiene carbonato de etileno (CE) 0,5 M, Na2CO3 0,5 M, NaCl 0,5 M o bien NaH2PO40,5 M, respectivamente.

Composición de reactivo (A):

10 mM NaOH

4 mM EDTA

6,7 mM DTT

0,5 M de CE, Na2CO3, NaCl o bien NaH2PO4

Como control se ha usado una composición de reactivo (A) que contiene NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM.

Los resultados se muestran en la figura 5. El éster de carbonato (CE 0,5 M (♦) presente en el pretratamiento alcalino (mezcla de reactivo) provoca un efecto de potenciación de señal en el ensayo competitivo. Especialmente, se mejora la dinámica de señal en comparación con una prueba sin CE (□). Una sal (NaCl 0,5 M, (O)) no muestra ningún efecto. La adición de Na2CO30,5 M (O) o NaH2PO40,5 M (A ) muestra un efecto menor en la señal. Ejemplo 3

Pretratamiento alcalino con/sin éster de carbonato

Se mide la muestra que se va a investigar usando el sistema Elecsys® de la empresa Roche Diagnostics. El procedimiento de ensayo se muestra en el ejemplo 1.5.

A diferencia del ejemplo 1.5, se han preparado tres composiciones de reactivo diferentes que contienen:

♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o

A : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM o bien

□ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM.

Después de una incubación como pretratamiento de 4 min de la muestra ♦ (composición de reactivo (A) agente alcalinizante (B) como se describe en el ejemplo 1.5), A , o bien □, respectivamente, (= mezcla de reactivo) y antes de la adición de solución C, se ha fijado el pH de la mezcla de reactivo a pH 9 por adición de bis-tris-propano, pH 6,3 (fig. 6). El éster de carbonato CE presente en el pretratamiento alcalino (mezcla de reactivo) provoca un efecto de potenciación de señal en el ensayo competitivo. Especialmente, se mejora la dinámica de señal en comparación con una prueba sin CE.

Ejemplo 4

Carbonato de etileno frente a carbonato de dimetilo

A diferencia del ejemplo 1.5, se han preparado dos composiciones de reactivo (A) diferentes que contienen: O: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o bien

♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, carbonato de dimetilo 0,5 M.

Tanto el éster de carbonato, el carbonato de etileno como el carbonato de dimetilo, respectivamente, muestran el mismo rendimiento de ensayo (fig. 7).

Ejemplo 5

Efecto de los productos de hidrólisis de carbonato de etileno

A diferencia del ejemplo 1.5, se han preparado cinco composiciones de reactivo (A) diferentes que contienen: ♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o

O: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, NaHCO30,5 M o bien

A : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, NaHCO30,5 M etilenglicol 0,5 M

□ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM.

El producto de hidrólisis alcalina de CE es etilenglicol, que no tiene influencia sobre el ensayo (A ). Una sal de hidrogenocarbonato (NaHCO3) también muestra un efecto de potenciación de señal, pero no tanto como un éster de carbonato (fig. 8).

Ejemplo 6

Carbonato de etileno frente a 1,2-carbonato de glicerol

A diferencia del ejemplo 1.5, se han preparado dos composiciones de reactivo (A) diferentes que contienen: ♦ : NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, CE 0,5 M (véase el ejemplo 1.5) o bien

O: NaOH 10 mM, EDTA 4 mM, DTT 6,7 mM, 1,2-carbonato de glicerol 0,5 M.

Tanto el éster de carbonato, el carbonato de etileno como el 1,2-carbonato de glicerol, respectivamente, muestran el mismo rendimiento en el ensayo (fig. 9).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D que comprende la etapa de:

a) proporcionar una muestra que se va a investigar y

b) mezclar la muestra de la etapa (a) con

i) un reactivo que contiene una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO3-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO3-) de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO3-) es de 0,1 M a 2,0 M,

ii) un agente reductor y

iii) un agente alcalinizante,

liberando de este modo el compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el reactivo de acuerdo con la etapa (i) es soluble en una solución acuosa en las condiciones apropiadas para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D.

3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO3-) tras la hidrólisis es un éster de carbonato cíclico o no cíclico o un derivado hidroxilado o halogenado del mismo, respectivamente.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra es una muestra líquida.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra es sangre, suero o plasma.

6. Un procedimiento in vitro para medir un compuesto de vitamina D que comprende las etapas de:

a) liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y

b) medir el compuesto de vitamina D liberado en la etapa (a).

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el compuesto de vitamina D se selecciona del grupo que consiste en 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3, 24,25-dihidroxivitamina D2, 24,25-dihidroxivitamina D3 y C3-epi 25-hidroxivitamina D.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que se determinan los compuestos de vitamina D 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3.

9. Uso de una composición de reactivo que comprende una sal de hidrogenocarbonato y una sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO3-) tras la hidrólisis, en el que la concentración total de iones hidrogenocarbonato (HCO3') de la sal de hidrogenocarbonato y liberados de la sustancia que puede liberar iones hidrogenocarbonato (HCO3-) es de 0,1 M a 2,0 M, y un agente reductor, conjuntamente con un agente alcalinizante para liberar un compuesto de vitamina D de la proteína de unión a la vitamina D en una muestra.

10. Uso de la composición de reactivo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el agente alcalinizante se selecciona del grupo que consiste en NaOH, KOH, Ca(OH⁾²y LiOH.

11. Uso de la composición de reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado por que el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl, ditiotreitol (DTT), N-metilmaleimida, reactivo de Ellman y ácido 1,2-ditiolano-3-carboxílico.

12. Uso de la composición de reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado por que el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina-HCl, TCEP, cisteína-HCl y ditiotreitol (DTT).

13. Uso de la composición de reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado por que el agente reductor tiene una concentración de 2 mM a 30 mM.

14. Uso de la composición de reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el agente alcalinizante tiene una concentración de 0,1 M a 2,0 M.