JP3864261B2 - マイコフェノリック酸アッセイのための試薬 - Google Patents
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Description
1.本発明の分野
マイコフェノリック酸(MPA)はいくつかのペニシリウム属の発酵によって産生される。それらは活性の広いスペクトル、特別の作用モードを有し、そして最少の副作用をもって大量投与に耐えることができる。Epinett et al.,Journal of the American Academy of Dermatology 17(6):962−71(1987)MPAは抗腫瘍、抗ウイルス、抗乾癬、免疫抑制、抗炎症活性を示し、Lee,et al.,Pharmaceutical Research 7(2):161−166(1990),かほにも抗バクテリアおよび抗カビ活性を示す。Nelson et al.,Journal of Medicinal Chemistry 33(2):833−838(1990)それはプリンヌクレオチドの新合成における酵素である、イノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。TおよびBリンパ球はこの新合成に大きく依存するので、MPAは免疫応答の主要ファクターである、リンパ球増殖を阻害することができる。MPAのモルホリノエチルエステルである。(E)−6−(1,3−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−6−メトキシ−7−メチル−3−オキソ−5−イソベンゾフリル)−4−メチル−4−ヘキセン酸モルホリノエチルエステル(MPA−M)は生体内でMPAへ急速に加水分解される。このエステルの形のMPAの投与はMPAのバイオアベラビリティーを大きく改善する。
MPAは強力な生物学的に活性な物質であるため、効果的なイムノアッセイはそのバイオアベラビリティのモニタリングにおいて有用であろう。加えて、治療用薬物レベル、すなわち適切な免疫抑制に必要な最適薬物レベルをモニターすることは重要であり得る。MPA−Mは急速にMPAへ加水分解されるため、MPAのためのアッセイはMPA−M投与量の規制および最適化の手段を提供するであろう。
患者サンプル中のMPAレベルは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定されていた。HPLC分析を行う前に、測定すべきサンプルは有機溶媒溶出を用いる固相抽出、または直接有機溶媒抽出にかけられた。
2.関連技術の説明
Nowak,et al.,Clin.Chem(1995)41(7):1011−1017は、マイコフェノリック酸のヒト血清アルブミンへの結合、キヤラクタリゼーションおよび薬力学を論ずる。
Langman,et al.,Therapeutic Drug Monitoring(1994)16:802−807は、マイコフェノリック酸の血中分布を論ずる。
ヨーロッパ特許0218309B1は、生物学的流体中の遊離リガンドを測定する方法を開示する。トリヨードチロニンおよびテトラヨードチロニンの標識した類縁体のアルブミンおよび甲状腺ホルモン結合プレアルブミンへ結合を防止するため、サリチル酸ナトリウムおよび2,4−ジニトロフェノールが使用された。
ヨーロッパ特許出願0392332A2は、蛍光分極イムノアッセイおよびそのための試薬を開示する。血清アルブミンおよび他のタンパクへ結合したマリハナ代謝物を遊離形へ変換するための種々の化合物が開示された。これら化合物は、中でも8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸(ANS)、サリチル酸および5−メトキシサリチル酸を含んでいる。
本発明の概要
本発明の一面は、遊離マイコフェノリック酸をマイコフェノリック酸とタンパクとの複合体から遊離する方法である。該複合体の含有が疑われる媒体はマイコフェノリック酸を該複合体から遊離するために有効量の遊離剤と混合される。
本発明の他の一面は、マイコフェノリック酸およびマイコフェノリック酸へ結合する内因性タンパクを含有することが疑われるサンプル中のマイコフェノリック酸の総量を測定するためのアッセイ方法である。この方法においては、サンプルと、マイコフェノリック酸の量を測定するためのアッセイ試薬と、マイコフェノリック酸を内因性タンパクとの複合体から遊離するための有効量の遊離剤とが媒体中で混合される。マイコフェノリック酸の量はアッセイ試薬によって決定される。
本発明の他の一面は、マイコフェノリック酸の含有を疑われるサンプル中のマイコフェノリック酸の測定方法の改良である。この方法は、(a)アッセイ媒体中にサンプルとマイコフェノリック酸の結合パートナーとの組合せを提供し、(b)マイコフェノリック酸に対する結合パートナーの結合を検出するステップよりなる。改良は、アッセイ媒体中に、マイコフェノリック酸を内因性タンパクとの複合体から遊離するために有効量の遊離剤を含めることを含む。
本発明の他の具体例は、マイコフェノリック酸の含有を疑われるサンプル中のマイコフェノリック酸の測定のための上の方法において、遊離剤がアニス酸または8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸である改良である。
本発明の他の一具体例は、マイコフェノリック酸およびマイコフェノリック酸へ結合する内因性タンパクを含有することが疑われるサンプル中のマイコフェノリック酸の量を測定する方法である。この方法は、(a)水性媒体中、(i)サンプルと、(ii)検出し得る標識へのマイコフェノリック酸接合体と、(iii)マイコフェノリック酸へ結合することができる抗体を合併し、(b)前記サンプルの前記標識の活性に対する影響を測定することよりなる。改良は、マイコフェノリック酸をその内因性タンパクとの複合体から遊離するために有効量の遊離剤を媒体中に含めることを含む。
本発明の他の一面は、マイコフェノリック酸の測定のためのアッセイを実施するためのキットである。このキットは、包装した組合せ中、(a)マイコフェノリック酸へ結合することができる抗体と、(b)検出し得る標識へ結合したマイコフェノリック酸よりなる化合物と、(c)遊離剤の有効量とを含む。
特定具体例の説明
MPAは血漿中高度にタンパク結合すること(83〜>98%)が知られている。分析すべき患者血液サンプルは例えばアルブミンのような多数のタンパクを含んでいることも知られている。MPAのこの高レベルのタンパク結合にもかかわらず、当初我々は、MPA含有の疑いあるサンプルをイムノアッセイ等のようなアッセイ方法へかける時、投与量応答曲線が得られることを発見した。それ故、患者サンプル中のMPAの測定のためのイムノアッセイを実施するために、MPAを結合タンパクから遊離する必要性は存在しなかった。較正液のための一平均タンパク濃度をすべての患者サンプルを代表するものとして採用できるように見えた。加えて、アルブミンへ分子の結合は典型的には約106Mのオーダーであるが、抗体のそれらのそれぞれの同族への結合は約109のオーダーである。このように期待は、より強い抗体結合がより弱いアルブミンへの結合を圧倒することであった。
しかしながら驚くべきことに、我々はMPAによる治療を受けている一部の患者からのサンプルについて実施したイムノアッセイは矛盾する結果を与えたことを発見した。検討により、我々は一部の患者は非常に低い血中タンパク濃度を有し、これが上の較正液を用いる、そのような患者からのサンプルの分析において過大定量をもたらしたことを発見した。
さらに、MPAおよびシクロスポリンもしくはタクロリムスによる治療下の患者は、アザチオプリン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、抗ウイルス剤、抗生物質、抗カビ剤、心脈管剤、糖尿病剤および利尿剤を含むがそれらに限らない多数の薬物を同時投与され得る。これら薬物の多数に代識は顕著な影響を有し、種々の血清/血漿成分の濃度に変動をもたらす。また、一部の薬物、例えばサリチル酸および上の薬物の一部は、患者中観察し得る濃度においてサリチル酸が添加される時、MPA遊離分画の増加を発生させることが知られている。例えば前出Nowakを見よ。それ故、これら成分により、標的患者集団中のMPAの測定に直接もしくは間接に妨害の可能性が存在する。
本発明の特定具体例の説明へ進む前に、多数の術語を定義する。
「マイコフェノック酸エステル」は、MPA−Mのように、MPAイソベンゾフラニル環系の1’位において接続した側鎖のカルボン酸基におけるMPAのエステルを含むがそれに限らない。
「MPA代謝物」は、MPAの代謝生産物、好ましくはイソベンゾフラニル環系を含んでいる生産物、さらに好ましくは、アシルまたはMPAのフェノール性グルクロナイドのような側鎖の一部分をも含んでいる生産物である。
「MPAの量の測定」MPAの測定のための定量的、半定量的、定性的および他の方法は、MPAの量を測定する方法であると考えられる。例えば、MPA含有の疑いあるサンプル中の存在または不存在を単に検出する方法は本発明の範囲に含まれると考えられる。術語「検出」および「測定」および測定のための他の普通の同義語は、本発明の範囲内であることが意図される。
「MPA含有の疑いあるサンプル」は、通常、宿主の器官または他の体部分から切除した組織を含む生物学的組織、および体液、例えば尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、大便、喀痰、脳脊髄液、涙液、粘液等である。好ましくはサンプルは血漿または血清である。
「識別することができる」とは、第2のリガンドに比較して第1のリガンドへ優先的に結合する受容体または抗体の能力である。抗体をリガンドを含有するサンプルと混合する時、第2のリガンドよりも少なくとも5倍多く第1のリガンドが通常結合するであろう。好ましくは少なくとも10倍多く、もっと好ましくは少なくとも20倍多く第1のリガンドが結合するであろう。各リガンドの相対的結合はサンプル中の相対濃度に依存するであろうが、通常、これらの条件は第1のリガンドに対する抗体の結合定数が第2のリガンドに対する結合定数に少なくとも等しい時、そして第2のリガンドに対する結合定数の好ましくは少なくとも10倍、もっと好ましくは少なくとも50倍である時に満たされる。第1のリガンドに対する抗体の交差反応性とは、二つのリガンドが等しい量で結合する、第2のリガンドの濃度に対する第1のリガンドの濃度の比を意味する。交差反応の「高い」または「低い」程度の定量化、すなわち許容できる交差反応性の程度は、交差反応剤の予期される最大濃度と、そのアッセイに要求される感度および必要な精度に依存する。例えば、もしある抗体がMPA−Gと10%交差反応性であり、そしてサンプル中MPA−Gが検出すべきMPAの最低レベルよりも5倍量多く存在すれば、そのときMPAの測定したレベルはMPAがその最低レベルである時よりも50%高過ぎるであろう。もし5%の僅かの誤差しか許容されないならば、交差反応性は1%未満でなければならないであろう。
「接合体」は、二以上の分子が、場合により連結基を介して単一構造を形成するように結合してなる分子である。結合は分子間の直接結合(例えば化学結合手)により、または連結基の使用によって形成することができる。例えば、酵素へ接合したMPA類縁体は、MPA類縁体−酵素接合体である。
「連結基」は、二つ以上の下部構造を接続する構造の一部分である。連結基は結合手であることができ、または下部構造間を延びる水素(または他の1価原子)以外の原子の少なくとも一つの中断されない鎖を持つことができる。鎖中の原子の数は少なくとも1個であり、そして接続されている下部構造間の最短ルートに沿って水素以外の原子の数を数えることによって決定され、そして各自炭素、酸素、窒素、イオウおよびリンよりなる群から独立に選ばれた、典型的には1〜30,通常2〜10,好ましくは3〜8原子である。連結基中の原子の総数は、全体の炭素、酸素、窒素、イオウおよびリン原子、すなわち水素以外の原子を数えることによって決定される。典型的には、連結基は合計30未満、好ましくは20未満、もっと好ましくは10未満の原子を有する。一般則として、特定の連結基の長さは、合成の便利さおよび所望基の取込みのために任意に選択することができる。連結基は、通常ジアゾ基、芳香族基も含まれるであろうが、脂肪族または芳香族でもよい。酸素は、通常炭素、イオウ、窒素またはリンへ結合したオキソもしくはオキシとして存在し、窒素は通常炭素、酸素、イオウまたはリンへ結合したニトロ、ニトロソもしくはアミノとして存在し、イオウは酸素と類似であろう。リンは、通常ホスホネートおよびホスフェートモノ−もしくはジエステルとして、炭素、イオウ、酸素または窒素へ結合するであろう。
連結基と、接合すべき分子の間の共有結合手を形成する官能基は、アルキルアミン、アミジン、チオアミジン、ジチオール、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテル、カルボキシレート、スルホネート、ホスフェートエステル、アミドおよびチオエステルである。
「MPA類縁体」は、受容体に対しその類似するMPAと競合し得る修飾したMPAであり、修飾はMPAを他の分子へ結合する手段を提供する。MPA類縁体は通常MPA類縁体をハブもしくは標識へ連結する結合手での水素の置換以上にMPAと異なるであろうが、しかし必ずしもそうではない。MPA類縁体はMPAに類似の態様で受容体へ結合することができる。類縁体は、例えばMPAに対する抗体のイディオタイプに向けられた抗体であることができる。
「特異的結合ペアのメンバー(sbpメンバー)」は、表面上または空胴中に特異的に結合する領域を有し、それ故他の分子の特定の空間的およひ極性組織と相補的であると定義される一つまたは二つの異なる分子である。sbpのメンバーは、免疫学的ペア、例えば抗原−抗体のように、リガンドおよび受容体と呼ぶことができる。相補的sbpメンバーは、例えばリガンドとその相補的受容体のように相互に結合する。二つの相補的sbpメンバーに関し、一方は他方に対し「結合パートナー」と呼んでも良い。sbpメンバーは、抗原と抗体のような免疫学的ペアでも、またはアビジンとビオチンのような非免疫学的ペアであることができる。sbpメンバーはまた、小分子もしくは小分子の残基およびそれらの受容体であることができる。小分子は100〜2000,好ましくは150〜1000の分子量を有し、そして小分子の受容体は実在するか、または調製することができる。小分子の例は、ビオチン誘導体、リセルグ酸、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体およびビタミンB12を含み、対応する受容体はそれぞれアビジンもしくはストレプトアビジン、抗リセルグ酸、抗フルオレセインおよび内因子である。小分子はしばしば他のsbpメンバーへ、少なくとも1個しばしば2〜20個の小分子を有する接合体を形成するように共有結合される。sbpメンバーへの小分子の結合は、小分子の水素原子のsbpメンバーへの結合手による置換を生ずる化学反応により、または任意のサイズしかし好ましくは小分子のための受容体とsbpメンバーの両者の接合体へ結合を許容するのに必要なよりも大きくないサイズのsbpメンバーと小分子の間の連結基によって達成することができる。
「リガンド」は、それに対する受容体が天然に存在するか、または調製することができる任意の有機化合物である。
「受容体(抗リガンド)」は、ある分子の特定の空間的および極性組織、例えばエピトープもしくは決定子部位を認識することができる任意の化合物または組成物である。例示的な受容体は、天然に存在する受容体例えばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Fabフラグメント、レクチン、核酸、タンパクA、補体成分Clq等を含む。
「特異的結合」は、二つの異なる分子の一方の他方に対する、ほかの分子に対する低い認識に比較して特異的な認識である。一般に、分子はそれらの表面または空胴中に、二つの分子間の特異的認識を与える領域を持っている。特異的結合の例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。
「非特異的結合」は、特異的表面構造とは比較的無関係な分子間の非共有結合である。非特異的結合は、分子間の疎水的相互作用を含む、いくつかの要因から発生し得る。
「MPAの非特異的複合体」は、他の物質、通常分析すべきサンプル中に存在する内因性物質へ非特異的に結合したMPAである。内因性物質は、一般に血漿タンパク、例えばアルブミン、グロブリン、糖タンパク、リポタンパク等のような内因性タンパクである。
「抗体」は、他の分子へ特異的に結合し、これ故他の分子の特定の空間的および極性組織へ相補的であると定義される免疫グロブリンである。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができ、そして宿主を免疫化し、血清を採取する(ポリクローナル)ようなこの分野でよく知られた技術により〔例えばParke,Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds,Prentice−Hall(Englewood Cliffs,N.J.,U.S.,1976);Butler,J.Immunol.Meth.7:1−24(1975);Broughton and Strong,Clin.Chem.22:726−732(1976);Playfain,et al.,Br.Med.Bull.30:24−31(1974)を見よ〕、または連続ハイブリッド細胞ラインを調製し、分泌したタンパクを採取する(モノクローナル)ことにより〔例えばKohler and Milstein,Nature 265:495−497,1975;Lymphocyte Hybridomas,ed.Melchers,et al.,Spring−Verlag(New York 1978);Nature 266:495(1977);Science 208:692(1980);Methods of Enzymology 73(Part B):3−46(1981)を見よ)、または天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列もしくはその変異体をクローニングおよび発現することによって調製することができる。抗体は完全な免疫グロブリンまはたそのフラグメントを含むことができ、そのような免疫グロブリンはIgA,IgD,IgE,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgM等のような種々のクラスおよびイソタイプを含む。そのフラグメントは、Fab,Fv,F(ab’)2,Fab’等を含み得る。加えて、免疫グロブリンまたはそのフラグメントの集塊、ポリマーおよび接合体は、特定の分子に対する結合親和性が保たれている限り、適切な場合に使用できる。
「ハプテン」は、抗体の調製のための免疫原(または抗原)としてそれ自身作用しないが、対応する抗体へ特異的に結合することができる化合物である。ハプテンを認識する抗体は、免疫原(または抗原)担体へ連結したハプテンよりなる化合物に対して調製することができる。ハプテンはリガンドの下位セットである。
「免疫原担体」は、ハプテンへ接合しそして哺乳類へ注射した時、免疫応答を誘発しそしてハプテン、この場合はMPAへ結合する抗体の生産を引出すグループである。免疫原担体は抗原担体とも呼ばれる。典型的な免疫原担体は、限定でなしに、ポリ(アミノ酸)、ポリサッカライド、核酸および粒子(生物学的および合成物質)を含む。多種類のそのような担体は、ここに参照として取入れるDavalian,et al.,米国特許No.5,089,390,カラム4,57行ないしカラム5,5行に開示されている。他の適切な免疫原抗体は、アルブミン、血清タンパク例えばグロブリン、眼レンズタンパクおよびリポタンパクを含む。例示的タンパクは、ウシ血清アルブミン、キーホールリムペットヘモシアニン(KLH)、卵アルブミンおよびウシガンマグロブリンを含む。
「支持体または表面」は、ストリップ、ロッド、プレート、ウエル、粒子およびビーズのような多数の形状の一つを持つことができる多孔質または非多孔質水不溶性材料である、固相、典型的には支持体または表面である。多種類の適当な支持体は、ここに参照として取入れる、Ulman et al.,米国特許No.5,185,243、カラム10−11,Kurn,et al.,米国特許No.4,868,104、カラム6,21−42行、およびMilburn,et al.,米国特許No.4,959,303、カラム6,14−31行に開示されている。支持体または表面へのsbpメンバーの結合は、文献に普通に出ている良く知られた技術によって達成できる。例えば千畑一郎、Immobilized Enzymes,Halsted Press,New York(1978)およびCuatrecasas,J.Biol.Chem.,245:3059(1970)を見よ。ここで使用するように、術語「支持体へ結合することができる」とは、例えば抗検体抗体のような試薬が第1のsbpメンバーまたは小分子へ結合し、そして相補的な第2のsbpメンバーまたは小分子のための受容体が支持体へ結合することを意味する。代わって、抗マウス抗体のような抗検体抗体のための受容体が支持体へ結合され、抗検体抗体の捕獲に使用される。それ故、抗検体抗体は支持体へ実際に結合されず、相補的sbpメンバーまたは受容体が加えられた時結合されるであろう。
「信号発生システム(sps)」は、結合したおよび/または結合しなかった標識の量、すなわち検出しようとする化合物へ結合した、または結合しなかった標識の量に関する検出可能な信号を発生する、少なくとも一つは検出可能な成分である、一以上の成分である。標識は信号を発生する、または信号を発生するように誘発されることができる任意の分子であり、そして好ましくは発蛍光団、放射性ラベル、酵素、化学発光団、光増感剤である。このように、信号は蛍光またはルミネセンス、放射能、酵素活性または吸光度を検出することにより検出および/または測定される。
好適な標識は、例示としてそして限定でなく、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)および西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素;リボチーム;QBレプリカーゼのようなレプリカーゼ;プロモーター;染料;フルオレセイン,ローダミン化合物、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフイコシアニン、0−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンのような発蛍光剤;イソルミノールのような化学発光剤;増感剤;補酵素;酵素基質;125I,131I,14C,3H,57Coおよび75Seのような放射性ラベル;ラテックスまたは炭素粒子のような粒子;金属ゾル;クリスタライト;リポソーム;細胞等を含み、これらはさらに染料、触媒または他の検出し得る基で標識されることができる。好適な酵素および補酵素は、Litman,et al.,米国特許No.4,275,149,カラム19−28,およびBoguslaski,et al.,米国特許No.4,318,980,カラム10−14に、好適な発蛍光剤および化学発光剤はLitman,et al.,米国特許No.4,275,148,カラム30−31に記載されており、これらを参照としてここに取り入れる。
外部手段により、例えば望ましくは目視検査により、または電磁線、熱および化学試薬によって検出できる信号を発生させることができる多くの方法が存在する。標識または他のspsメンバーはまた、sbpメンバーもしくは他の分子へ、または支持体へ結合することもできる。
標識は信号を直接発生することができ、それ故信号発生のめたに追加の成分を必要としない。多数の有機分子、例えば発蛍光剤は紫外および可視光を吸収することができ、その場合、光吸収はエネルギーをこれら分子へ伝達し、そしてそれらを励起エネルギー状態へ上昇させる。この吸収したエネルギーは第2の波長の光の放出によって発散する。信号を直接発生する他の標識は放射性アイソトープおよび染料を含む。
代わって、標識は信号を発生するために他の成分を必要とすることができ、そして信号発生システムはその時測定し得る信号を発生するために必要なすべての成分を含むであろう。そのような成分は、補酵素、エンハンサー、追加の酵素、酵素製品と反応する基質、触媒、アクチベーター、助因子、阻害剤、スキヤベンジャー、および信号発生物質の結合に必要とする特異性結合物質を含むことができる。適当な信号発生システムの詳細な議論は、ここに参照として取り入れるUllman et al.,米国特許No.5,185,243,カラム11−13に見ることができる。
標識は多数のsbpメンバー、すなわち抗体,抗体のための受容体、抗体へ接合した小分子へ結合することができる受容体、またはリガンド類縁体へ共有結合することができる。sbpメンバーへの標識の結合は、標識の水素原子をsbpメンバーへの結合手で置換する化学反応により達成することができ、または標識とsbpメンバーの間に連結基を含むことができる。他のsbpメンバーはsbpメンバーへ共有結合することができる。例えば、発蛍光剤および消光剤のような二つのsbpメンバーは、検体と特異的複合体を形成する異なる抗体へ各自結合させることができる。複合体の形成は発蛍光剤と消光剤を接近にもたらし、そのため消光剤が発蛍光剤と信号を発生するように相互作用することを許容する。接合方法はこの分野において既知である。例えば、ここに参照として取り入れる、Rubenstein,et al.,米国特許No.3,817,837を見よ。本発明はまた、抗体を第1のsbpメンバーへ結合し、第2のsbpメンバーとして検出可能な標識を有することを企図する。例えば、検出可能な標識をリガンド類縁体へ結合する時、抗体の類縁体への結合の程度はsbpメンバー間の相互作用によって発生した信号を検出することによって測定することができる。
「補助材料」種々の補助材料がしばしば本発明に従ったアッセイに使用されるであろう。例えば、緩衝剤およびアッセイ媒体とアッセイ成分のための安定剤が通常アッセイ媒体中に存在するであろう。しばしば、これら添加剤のほかに、アルブミンのような追加のタンパク、または界面活性剤特に非イオン界面活性剤、結合増強剤例えばポリアルキレングリコール、保存剤、抗微生物剤等を含めることができる。
前に述べたように、本発明の一面は、マイコフエノリック酸と、マイコフェノック酸へ結合する内因性タンパクを含有することが疑われるサンプル中のマイコフエノリック酸の量を測定するためのアッセイ方法である。この方法において、サンプルと、マイコフエノリック酸の量を測定するためのアッセイ試薬と、マイコフエノリック酸を内因性タンパクとの複合体から遊離する有効量の遊離剤とが媒体中で合併される。マイコフエノリック酸の量はアッセイ試薬によって決定される。
遊離剤は、そのタンパク複合体からMPAを遊離することができる任意の化合物である。好適な遊離剤は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸、アニス酸、クロフィブリック酸(p−クロロフェノキシジメチル酢酸)、安息香酸、3−(p−ヒドロキフェニル)プロピオン酸、サリチレート(サリチル酸)、p−メトキシサリチル酸などを含む。
本発明においては、遊離剤はMPAのアッセイに使用されるsbpメンバーまたはMPAのための結合パートナーへ有意義な程度に結合しないことが重要である。何が有意義な程度を構成するかはアッセイのために必要な感度に依存し、アッセイのために必要な感度が高ければ高い程、sbpメンバーまたは検体のかめの結合パートナー間の許容できる許容量が小さくなる。有意義な程度とは、特定の遊離剤がアッセイ結果の正確性または定量的もしくは定性的性格に影響する程度にsbpメンバーまたは結合パートナーに結合しないことを意味する。従って、特定の遊離剤と、sbpメンバーまたは結合バートナーとの間の結合は好ましくは1%未満、もっと好ましくは0.01%未満、最も好ましくは0%でなければならない。さらに、選択した特定の遊離剤は、sbpメンバー相互の結合を、またはサンプル中のMPAの存在もしくは量に関連した信号を発生する信号発生システムの能力を、もしあっても最小の妨害を持たなければならない。
有効量とは、MPAのそのような複合体から遊離し、MPAの好ましくは少なくとも90%,もっとも好ましくは少なくとも95%,さらに好ましくは少なくと99%,最も好ましくは100%がそのような複合体を含まない形とするの十分な量を意味する。特定のアッセイに使用される遊離剤の有効量は、アッセイの性格およびそれに使用される試薬に依存するであろう。好ましくは、有効量はサンプル中のMPAの推定濃度を基にして実験的に決定される。一般に、遊離剤の有効量はMPAの推定量より過剰量である。MPAのアッセイのため、例示であって限定ではなく、サンプル中の薬物の推定レベルが1.5〜45μMである場合、アッセイ媒体中の遊離剤の有効量は約0.1〜100mM,好ましくは約1〜25mM,もっと好ましくは約2〜12mMである。
本発明において遊離剤として有用な化合物の多くは市販されているか、および/またはそれらの合成は文献に既知である。
MPAのためのアッセイは、アッセイ成分および生成物の分離なし(均質)または分離あり(不均質)のどちらでも実施することができる。均質イムノアッセイは、Rubenstein,et al.,米国特許No.3,817,877,カラム3,6行〜カラム6,64行に記載されているEMITTMアッセイ製品(Behring Diagnostics Inc.以前Syva Company,San Jose,CA)、Ullman,et al,米国特許No.3,996,345,カラム17,59行〜カラム23,25行に開示されているイムノ蛍光法,およびMaggio,et al.,米国特許No.4,233,402,カラム6,25行〜カラム9,63行に開示されている酵素チャンネリング技術によって例示され、そしてELISAのような他の酵素イムノアッセイはMaggio,E.T.前出に論じられている。不均質アッセイの例は、Yalow,et al.,J.Clin.Invest.39:1157(1960)に開示されているラジオイムノアッセイである。これらの開示を参照としてここに取り入れる。イムノアッセイは検体の検出にイムノアッセイ試薬を使用することを含む。そのようなイムノアッセイ試薬は抗体、抗原およびハプテン、および標識したまたはしないその接合体を含む。
アッセイは、通常緩和なpHに、一般に最適なアッセイ感度を提供するpHの水性緩衝化媒体中で実施される。水性媒体は水だけでよく、またはある%の共溶媒、例えば有機溶媒の0.1〜40体積%を含んでもよい。媒体のためのpHは通常4〜11の範囲、もっと普通には5〜10の範囲、好ましくは6.5〜9.5の範囲にあるであろう。pHは、通常特異的結合ペアの結合メンバーの最適な結合と、本発明による非特異性複合体からのMPAの最適な遊離と、信号発生システムのメンバーのようなアッセイの他の試薬のための最適なpHとの間の妥協である。
望むpHを得、そしてそのpHを測定の間維持するために種々緩衝剤を使用することができる。例示的緩衝剤は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリスおよびバルビタールを含む。使用する特定の緩衝剤は本発明にとって重要ではないが、個々のアッセイにおいて別々の緩衝剤が好ましいことがあり得る。
アッセイを実施するため緩和な温度が通常採用され、そして測定の間、特に率測定のため通常コンスタントな温度が使用される。インキュベーション温度は通常5〜40℃,もっと普通には15〜40℃の範囲であろう。測定の間の温度は一般に10〜50℃,もっと普通には15〜40℃の範囲であろう。
アッセイし得るMPAの濃度は、一般に10-4ないし10-13M,もっと普通には10-5ないし10-7Mを変動するであろう。アッセイが定性的か、半定量的か、または定量的であるか(サンプル中に存在する検体の量に関して)、特定の検出技術および検体濃度のような配慮が通常種々の試薬の濃度を決定するであろう。
アッセイ媒体中の種々の試薬の濃度は、一般にMPAの関心ある濃度範囲によって決定されるであろう。しかしながら試薬各自の最終濃度はその範囲にわたってアッセイの感度を最適化するように実験的に決められるであろう。すなわち、有意であるMPA濃度の変動が正確に測定可能な信号差を提供しなければならない。
添加順序は大幅に変動し得るが、アッセイの性格に応じていくつかの優先性が存在する。最も簡単な添加順序はすべての材料を同時に添加し、そして均質アッセイにおけるようにアッセイ媒体が信号に持つ影響を測定することである。代わりに、試薬は逐次的に合併することができる。場合により、各添加の後に、一般30秒ないし6時間、もっと普通には1分ないし1時間の範囲のインキュベーションステップが含まれる。
以下の実施例は、本発明の特定具体例をさらに記載し、そして本発明を記載するがその範囲を制限することを意図しない。
均質アッセイにおいては、すべての試薬を合併した後、信号が測定され、そしてサンプル中のMPAの量に相関される。例えば、MPAのためのEMITにおいては、MPAを含有する疑いのあるサンプルは水性媒体中でMPA−酵素接合体と、そしてMPAおよび接合体を認識することができる抗体と合併される。媒体はまた、遊離剤の有効量を含んでいる。一般に酵素のための基質が加えられ、これは酵素触媒反応に際し発色団または発蛍光団生成物の形成を結果する。好ましい酵素はグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。遊離剤は、サンプル中に存在し得るどんな非特異性複合体からもMPAを遊離するように作用する。MPAとMPA−酵素接合体とは抗体の結合部位に向かって競合する。媒体中の酵素活性が通常分光光度的手段によって決定され、そして既知量のMPAが存在する較正または参照サンプルがテストされた時に決定された酵素活性と比較される。典型的には、較正液はMPMを含んでいる疑いのあるサンプルのテストと同様な態様でテストされる。較正液は、典型的には決定すべきMPA検体の様々のしかし既知の濃度を含んでいる。好ましくは、較正液中に存在する濃度範囲は未知サンプル中の推測されるMPA濃度範囲をカバーするであろう。
不均質アッセイは、通常一以上の分離ステップを含み、そして競合法または非競合法であることができる。種々の競合および非競合アッセイフォーマットがここに参照として手取り入れるDavalian et al.,米国特許No.5,089,390,カラム14,25行ないしカラム15,9行に開示されている。典型的な競合アッセイにおいては、それへ結合したMPAのための抗体を有する支持体がサンプルと、酵素のような検出可能な標識へ接合したMPAを含んでいる媒体と接触させられる。媒体はまた、遊離剤の有効量を含んでいる。支持体と媒体を分離した後、支持体または媒体の標識活性が慣用の技術によって決定され、そしてサンプル中のMPAの量と関係づけられる。
以前に述べたように、本発明はいくつかの利益を提供する。較正マトリックスに関するタンパク濃度の関数としてのMPAの変動する回収率は実質減らされるかなくされる。さらに、同時投与薬物の存在の関数としてのMPAの変動する回収率も、内因性非特異的結合物質に対する、MPAとそのような物質へ結合する他の薬物との間の競合が減少またはなくされるので、実質上減少またはなくされる。
本発明による一つのMPAアッセイにおいては、MPAおよびそのエステルおよび代謝物へ結合し得る抗体が使用される。本発明による他のMPAアッセイにおいては、MPAと、MPA−Mのようなマイコフェノリック酸エステルとを識別することができる抗体が使用される。本発明によるMPAアッセイの他の具体例においては、MPAと、MPA−GのようなMPA代謝物とを識別することができる抗体が使用される。
抗体のMPAへの結合は、この分野で良く知られた多数の方法で検出することができる。抗体とMPAの結合は、直接または間接に検出できる免疫複合体を形成する。この免疫複合体は、例えば使用された抗体が標識へ接合している時は直接検出される。免疫複合体は、信号発生システムに対する、アッセイ媒体中の免疫複合体生成の影響を調べることにより、または本発明の抗体へ特異的に結合する標識したレポーターを使用することによって間接的に検出される。
本発明の他の一面は、MPAの測定のためのアッセイを便利に実施するために有用なキットに関する。本発明に従ったキットは、包装した組合せにおいて、MPAのための結合パートナーと遊離剤を含んでいる。キットは検出し得る標識へ結合したMPAの接合体をさらに含むことができる。
本発明の融通性を高めるため、キット試薬は、試薬の比が方法およびアッセイの実質的最適化を提供するように、液体または凍結乾燥した形で、同じまたは別の容器内に包装した組合せとして提供されることができる。試薬は各自別々の容器内でもよく、または一つまたはそれ以上の試薬を試薬の交差反応性および安定性に応じて一以上の容器に合併することができる。例えば、遊離剤の水溶液を別の容器に提供することができる。代わって、遊離剤はアッセイを実施するための試薬の一つに含めることができる。例えば、遊離剤は抗体試薬を含有する水性媒体中に含めることができ、そのような媒体は別の容器に包装される。
キットは、追加のsbpメンバー、および補助酵素基質のような補助試薬のようなアッセイを実施するための他の別に包装した試薬をさらに含むことができる。キット中の種々の試薬の相対量は、本方法の間発生することが必要な反応を実質上最適化し、そしてさらにアッセイの感度を実質上最適化する試薬濃度を提供するように、広く変動することができる。適切な状況下では、キット中の一または二以上の試薬は、溶解時本発明に従ったアッセイを実施するための適切な濃度を有する試薬溶液を提供する、賦形剤を含む乾燥した、通常凍結乾燥した粉末として提供することができる。キットは、上に記載した本発明に従った方法の説明書をさらに含むことができる。
実施例
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。その中の部および%は特記しない限り重量による。温度は摂氏(℃)である。
実施例1
MPAのアッセイ
以下の試薬が準備された。
(1)Galfre et al.,(1981)Preparation of monoclonal antibodies:strategies and procedures,Methds Enymol.73:3−46の記載と同様な態様で調製した。
(2)Grabarek,et al.(1990)Zero−length crosslinking procedure with the use of active esters,Anal.Biochem.185:131−135記載と同様な態様で調製した。
(3)PluronicはBASF Corporationの登録商標である。
略号:
NAD:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
G6P:D−グルコース−6−リン酸モノナトリウム塩
o−アニス酸:o−メトキシ安息香酸
BSA:ウシ血清アルブミン
Na2EDTA:エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム二水塩
MIT:N−メチルイソチアゾロン塩酸塩
MPA:マイコフェノリック酸
トリス塩基:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
トリスHCl:トリス塩酸塩
BLG:β−ラクトグロブリン
MPA−G6PDH:グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼへ接合したマイコフェノリック酸
試薬AおよびBは以下のように調製した。
両方の試薬に使用するため、Pluronic 25R2の1.028%w/w溶液を2〜25℃において調製した。
試薬Aは、最初アニス酸溶液をつくることによって調製した。アニス酸はアニス酸1.52gあたり25mLに等しい量で1N NaOHに溶解した。別の容器に脱イオン水の最終重量の70%を秤量し、それへ成分1ないし5全部と、そしてPluronic 25R2の調製した溶液を最終溶液1017.9g(または1L)あたり10mL用いて成分6を加えた。この溶液を攪拌し、そしてアニス酸溶液を加えた。もし必要ならば、pHを6N NaOHで5.50〜5.70の範囲内に調節した。次に成分8および9を加え、溶液を攪拌した。もし必要ならば、pHを上の範囲へ調節した。溶液を次に脱イオン水で最終重量とし、0.2ミクロフィルターで濾過した。最終pHは5.50〜5.70であった。生成する溶液はA希釈液と命名された。試薬Aは抗体すなわち成分10を最終抗体濃度7.5mg/L(または7.5μg/mL)に希釈液Aへ加えることにより完成された。
試薬Aは、ヒト血清アルブミンと同様にMPAを結合するBSAを含んでいることが注目される。しかしながら、BSAは、評価した他のいくつかのタンパクを上廻る試薬Aのための好ましい安定剤であることがわかったので、この理由のため試薬Aへ含めた。それ故、このBSAの影響と、分析されるサンプルからのどんな結合をも克服するMPAのためのどんな遊離剤も処方できるであろう。上の処方は、試薬A中のBSAに対し500モル過剰より大きいo−アニス酸を持っていた。o−アニス酸のこの濃度は系内のMPAの全部を遊離し、そしてそれを遊離して維持するのに十分以上であることがわかった。
試薬Bのため、最終重量の80%に等しい量の脱イオン水を秤量した。この水へ成分12ないし17の全部と、そして最終溶液1016.1g(または1L)あたりPluronic 25R2溶液30mLを用いて成分18を加えた。溶液を脱イオン水で最終重量とし、pHを8.0〜8.3に調節し、0.2ミクロンフィルターで濾過した。この点では溶液はB希釈液と命名され、成分19および20の相対的に無視し得る体積もしくは重量の添加によんで試薬Bをつくるために使用された。例えば、20.6mg/mLにおいて安定化抗体0.37mLと、0.8mg/mLにおいて接合体6.1mLが試薬B 10L(または10.18kg)へ加えられた。安定化抗体である成分20は、0.75mg/L(または0.75μg/mL)の最終濃度へ加えられた。接合体すなわち成分19は、300±10mA/minの速度を達成するように添加された。速度とは、反応時間1分あたり340nmにおける吸光度の変化として定義され、通常mA/minで表わされる。
速度はCabas Mira PlusTM(Roche Diagnostics Systems,Inc.,Branchburg,New Jersey)上で決定された。温度は全アッセイについて37℃に保たれた。タイミングは各サイクルが25秒であるサイクルで実施された。サイクル1すなわち最初のサイクルにおいて、水75μLおよびサンプル3μLが0.6cm通路長のクベット中でA希釈液155μLと混合された。この混合液はサイクル7において試薬Bの添加までインキュベートされた。結合速度を確立するため、使用したサンプルはMPAを含有していなかった。サイクル7において、試薬Bの75μLと水20μLがクベットへ加えられ、混合され、そしてサイクル25終わりまでインキュベートされ、アッセイを終了した。アッセイの間、340nmにおける吸光度読みがすべてのサイクルの終わりに行われた。分で表わした時間に対するサイクル14から25までの12連続吸光度読みを用いて最良の直線フィットがつくられた。この線の傾斜が速度であった。
試薬Aの調製は、A希釈液へ様々のレベルで抗体を加えることによって行われた。これらの滴定レベルは試薬Bと、そしてMPAの異なるレベル(例えば0,0.5,2.0,5.0,10.0および15.0μg/mL)を有する較正液について行われた。二つの低濃度側較正液間および二つの高濃度側較正液間で最大の速度分離を与える抗体のレベルが最終試薬Aを処方するために使用された。
試薬AおよびBが調製されたならば、それらはMPAの未知濃度を決定するため較正液と共に使用された。
未知MPA濃度を決定するため、較正液が試薬AおよびBでテストされ、そして抗体を含有する試薬AをA希釈液に代えたことを除き、各自について上に記載したように速度が決定された。各較正液について典型的には二度速度が決定され、平均された。較正曲線は、MPA濃度、平均較正液速度、およびlogit/log4モデルフィットのような適当な数学的モデルを使用して計算された。フィットは分析機により、または以下の計算式中のパラメーターRo,Kc,aおよびbを最適化する適当なコンピュータープログラムにより、オンラインでなされた。
ここでRo,Kc,a,bはカーブパラメーター、
CはMPA濃度
RはMPA濃度について観察された速度
結果を以下に要約する。
o−アニス酸を含む処方の有効性は、正常ヒト血漿プール(NHP)中の10μg/mL MPA添加の定量と、BioWhittaker,Walkersvill,Marylandから購入したDulbeccoリン酸塩緩衝化食塩水(PBS)中の同様な添加の間の一致を測定することによって評価された。NHPおよびPBSの両方について二つの別の添加がなされた。PBSは、最終pH6.4ないし7.6において、KCl 0.2g/L,KH2PO4 0.2g/L,Na2HPO4・7H2O 2.16g/LおよびNaCl 8.0g/Lを含んでいた。PBSはタンパクを持っておらず、そのためタンパク結合が起こることはあり得ない。較正液は、MPAを0,0.3,0.5,2.5,5,10および20μg/mLの7レベルで含有するNHPであった。NHPおよびPBSの添加は殆ど同じに定量され、それぞれ平均10.2および10.4μg/mL MAAを与えた(プールした標準偏差sd=0.4μg/mL)。これらの結果は、この方法は総MPAを測定し、MPAの正常血清アルブミン結合によって影響されなかったことを示す。
実施例2
この実施例においては、4種の試薬、o−アニス酸(O−AA)、そのメタ(n−AA)およびパラ(p−AA)異性体、および8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸(ANS)が比較された。すべてのアニス酸はSigma Chemical Company,St.Louis,Missouriから購入し、ANSはCalbiochem,La Jolla,Californiaから得た。
これら実験において、試薬A(RgtA)のための希釈液は実施例といくらか違ってつくられた。しかしながら成分7(遊離剤o−アニス酸)および成分10(MPA抗体の濃度)を除いて、組成は同じであった。4種は上の剤の各自の一つを含み、剤を含まない対照の5種の希釈液が調製された。最初実施例に記載した態様で、しかし挙げた量の2倍で成分5ないし6のみを有する2×溶液がつくられた。次に希釈液3種のため、3種のアニス酸異性体の各自を最終モル濃度12.5mMを得るように秤量し、水の最終体積の1/4および最小量の6N NaOH(アニス酸0.2gにつき約6滴)中に予備溶解した。4番目の希釈液のため、剤ANSを最終濃度0.25mMを与えるように秤量し、水の最終体積の1/4へ加えた。5番目の希釈液、対照は遊離剤を含まなかった。これら5種の希釈液を調製するため、2×溶液の適量、成分8のBSAの1×量、成分6のPluronic 25Rの1×量を合併した。このときこれらのうちの4種は適切な剤を持っていた。すべて良く混合した。必要な場合、以前のようにpH調節し、各液剤は成分の1×濃度を得るように脱イオン水で最終体積にされた。これらA希釈液の各自は0.2ミクロンフィルターで濾過された。各自については最終pH測定は5.5ないし5.7であった。これら5種のA希釈液について、MPAに対する抗体が最終濃度6.5μg/mLになるように添加することにより、対応する試薬Aが調製された。試薬B(Rgt B)は、成分20を省き、0.1%BSA(Miles Diagnostics,Kankakee,Illinois)でBLGを置き換えたことを除き、実施例に記載したように調製した。
試薬A中のANSの濃度はそのバックグランド吸光度への寄与のため制限されたことを注意すべきである。ANSの濃度が高ければ高い程、オフスケール吸光度読みを発生し、速度データの収集を妨げる。さらに、試薬A調製液は、タンニン様黄色を有するANS含有試薬Aを除いて目視上無色であることも注意すべきである。
合計2系列の実験において、剤を含まない対照に比較して4種の剤の各自の効果が、(1)340nmにおけるバックグランド吸光度、(2)陰性MPAサンプルの速度、(3)MPA 0および10μg/mL間の速度、およびNHPおよび緩衝液中のMPA 10μg/mLの一致する速度の接近度について検討された。両方の実験は対照試薬Aを含んでいた。1回目の実験はANSを有する試薬Aを評価し、2回目はアニス酸の構造異性体を含んでいる試薬A調製物を評価した。
MPAは10μg/mLのMPA最終濃度を得るようにNHPおよび緩衝液中に添加された。この実施例における緩衝液は50mM MES(2−〔N−モルホリノ〕−エタンスルホン酸,Sigma Chemical Companyから得た)へアジ化ナトリウムを0.1%w/v%添加したpH7.1の緩衝液であった。PBSと同様に、この緩衝液はタンパクを有せず、そのためMPAのタンパク結合は発生し得ない。
両方の実験において、各試薬Aについて340nmにおけるバックグランド吸光度が、陰性NHP3μL,脱イオン水72μLおよび試薬A155μLの混合液230μLを用いて2回測定された。セル通路長は0.6cmであった。平均A340(A=吸光度)値は表1のカラムCに見られる。2回の速度は、実施例1と同様に添加したおよび添加しないNHPと、緩衝液で決定された。速度決定のため実施例1からの唯一の変更はプロトコールタイミングにある。これらの変更は以下のとおりである。試薬Bおよび水はサイクル4において加えられた。分析はサイクル15の終わりに終了した。速度はサイクル11ないしサイクル15の吸光度読みを用いて決定された。
これら速度の平均値を表1のカラムE〜Hに要約する。
遊離剤の有効性は、添加緩衝液速度から添加NHP速度を引算する(カラムH−カラムF)ことによって決定された。この値が0に近いほど遊離効果が良い。
すべて4種の剤は、対照値に比較して陰性速度および/または速度差に対しある効果を示した。これは剤はNHPのマトリックス効果を減らす以外の効果を持っていることを指示する。アニス酸は対照を上廻る陰性速度に著しい上昇を持つが、ANSは少しもまたは少ししか効果を持たない。ANSは速度差に最大の増加を有していた。
実施例3
同時投与した薬物およびサリチル酸の存在下におけるMPA速度に対するアニス酸およびANSの効果
別の研究において、MPA血漿添加の速度に対するサリチル酸の影響を排除するo−アニス酸およびANSの能力を比較した。抗体試薬(試薬A)の3セットは上の実施例に記載した基本処方へ調製された。第1の試薬には遊離剤を添加せず、第2の試薬にはo−アニス酸が12.5mM添加され、第3の試薬にはANSが0.27mM添加された。共通の試薬Bは実施例2に記載するように調製した。血漿中4レベルのMPA添加および血漿対照の速度は各試薬セットを使って測定された。同様な血漿添加のセットは非妨害同時投与薬物を含んでいる血漿で調製され、血漿添加の他のセットは非妨害薬物とサリチル酸を含有する血漿で調製された。μg/mLで表わした非妨害薬物の濃度は以下のとおりである。アンピシリン36;セファクロール26;クロラムフェニコール64;トリメトプリム2;アルブテロール7;イソプロテレノール18;メトプロロール77;ジルチアゼム28;ニフエジピン22;ベラパミル12;フエノプロフェン16;インドメサシン36;ケトコナゾール75;ミコナゾール106;イソニアジド120;5−フルオロウラシル23;グリセオフルビン10;メトトレキセート52;プロカインアミド64;メトクロプラミド5;ナイアシン25;ナイアシンアミド47;アセタミノフェン87;およびリドカイン43。サリチル酸は659μg/mLで存在した。
速度は、吸光度読みウインドウをアッセイが終わるサイクル20まで延長したことを除き、上の実施例2に記載のように決定された。速度はサイクル11から20までの10の連続吸光度読みを用いて決定された。結果を表に要約する。
要約すると、サリチル酸は、アッセイにおいてMPAの不正確な定量を生じ得る遊離剤不存在下、正常ヒト血漿中のMPAの速度を増加した。抗体試薬中の遊離剤の存在は、MPAアッセイにおけるこの潜在的問題を排除した。
上の議論は、本発明に含まれるメカニズムについてある理論を含んでいる。本発明は記載した結果を達成したので、これらの理論は本発明を何らかの態様で制限するものと考えてはならない。
以上の説明および実施例は、好ましい具体例を含む本発明を完全に開示する。当業者に自明な記載した方法の修飾は請求の範囲内であることが意図される。
Claims (26)
- マイコフェノリック酸と、マイコフェノリック酸と複合体を形成する内因性タンパクの含有の疑いあるサンプル中のマイコフェノリック酸の量を測定するアッセイ方法であって、
(a)水性媒体中で、(i)前記サンプルと、(ii)サンプル中のマイコフェノリック酸の量に応じて検出可能な信号を発生する信号発生システムを含んでいる少なくとも1種のアッセイ試薬であって、前記信号発生システムがマイコフェノリック酸へ特異的に結合する特異的結合パートナーを含んでいる前記アッセイ試薬と、(iii)内因性タンパクとの複合体からマイコフェノリック酸を遊離し、
マイコフェノリック酸の少なくとも90%を複合体を含まない形で提供するのに有効な量の遊離剤とを合併し、
(b)前記信号発生システムによって発生した信号を測定することによってマイコフェノリック酸の量を決定すること、
を含むアッセイ方法。 - 前記遊離剤は、アニス酸、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸からなる群から選ばれる請求項1のアッセイ方法。
- 前記信号発生システムは、酵素を含んでいる請求項1のアッセイ方法。
- マイコフェノリック酸と結合する内因性タンパクと複合体化したマイコフェノリック酸の含有の疑いあるサンプル中のマイコフェノリック酸の量を決定する方法であって、
(a)アッセイ媒体中で、(i)前記サンプルと、(ii)マイコフェノリック酸に対する外因性結合パートナーであって、マイコフェノリック酸へ特異的に結合する分子を含んでいる外因性結合パートナーと、(iii)内因性タンパクとの複合体からマイコフェノリック酸を遊離し、マイコフェノリック酸の少なくとも90%を複合体を含まない形で提供するのに有効な量の遊離剤とを合併し、
(b)マイコフェノリック酸に対する前記外因性結合パートナーの結合を検出すること、
を含む方法。 - 前記遊離剤は、アニス酸、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸からなる群から選ばれる請求項4の方法。
- 前記アッセイ媒体は、サンプル中のマイコフェノリック酸の量に応じて検出可能な信号を発生する標識を含んでいる少なくとも1種の試薬をさらに含んでいる請求項4の方法。
- 前記ステップ(a)は、マイコフェノリック酸の標識した類縁体とサンプルとを接触させることをさらに含んでいる請求項4の方法。
- 前記結合パートナーは支持体へ結合される請求項4の方法。
- 前記結合パートナーは抗体である請求項4の方法。
- マイコフェノリック酸と結合する内因性タンパクと複合体化したマイコフェノリック酸の含有の疑いあるサンプル中のマイコフェノリック酸の量を測定する方法であって、
(a)水性媒体中で、
(i)前記サンプルと、
(ii)検出可能な活性を有する標識へ接合したマイコフェノリック酸と、
(iii)マイコフェノリック酸へ結合することができる抗体を合併し、
(b)前記媒体中に、内因性タンパクとの複合体からマイコフェノリック酸を遊離し、マイコフェノリック酸の少なくとも90%を複合体を含まない形で提供するのに有効な量の遊離剤を添加し、
(c)サンプル中のマイコフェノリック酸の量に応答して前記標識の活性の増大または減少を決定すること、
を含んでいる方法。 - 前記遊離剤は、アニス酸または8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸である請求項10の方法。
- 前記検出可能な標識は酵素であり、前記ステップ(c)は酵素の活性を測定することを含んでいる請求項10の方法。
- 前記酵素と反応する前記酵素のための基質を提供することをさらに含んでいる請求項12の方法。
- 前記酵素は、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼまたはアルカリ性フォスファターゼである請求項12の方法。
- 前記遊離剤は、アニス酸である請求項10の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である請求項10の方法。
- 前記抗体は、支持体へ結合される請求項10の方法。
- 前記抗体は、マイクロフェノリック酸に対してそのエステルよりも優先的に結合する請求項10の方法。
- 前記抗体は、マイコフェノリック酸に対してその代謝物よりも優先的に結合する請求項10の方法。
- 均質イムノアッセイであり、そしてステップ(c)において観察された標識の活性を既知量のマイコフェノリック酸を含んでいるサンプルについて測定された活性と比較するステップをさらに含んでいる請求項10の方法。
- マイコフェノリック酸と、マイコフェノリック酸と結合する内因性タンパクとを含んでいる疑いのあるサンプル中のマイコフェノリック酸の量を決定するためのキットであって、
(a)マイコフェノリック酸へ結合することができる抗体と、
(b)検出可能な標識へ結合したマイコフェノリック酸を含んでいる化合物と、
(c)マイコフェノリック酸の少なくとも90%を前記内因性タンパクを含まない形で提供するのに有効な量の遊離剤とを、包装した組み合わせ中に含んでいるキット。 - 前記抗体は、モノクローナル抗体である請求項21のキット。
- 前記抗体は、支持体へ結合される請求項21のキット。
- 前記抗体は、マイコフェノリック酸に対しそのエステルよりも優先的に結合する請求項21のキット。
- 前記抗体は、マイコフェノリック酸に対しその代謝物よりも優先的に結合する請求項21のキット。
- 前記信号発生システムは、マイコフェノリック酸に対する標識した外因性結合パートナーか、または標識したマイコフェノリック酸類縁体であり、前記標識はサンプル中のマイコフェノリック酸の量に応じて検出可能な信号を発生する請求項1のアッセイ方法。
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