JPS5923252A - チロキシンの蛍光測定もしくは比色による定量分析法 - Google Patents
チロキシンの蛍光測定もしくは比色による定量分析法Info
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、蛋白質含有試料液中の低分子量成分の定量法
に関するものである。さらに訂しくは、本発明は、血液
、血清、血しょう、尿、骨髄液、もしくはそれらの処理
物のような各種の生物体由来の試料液中に含まれており
、かつ該蛋白質に対する結合能を有する低分子量成分を
定量する方法に関するものである。
に関するものである。さらに訂しくは、本発明は、血液
、血清、血しょう、尿、骨髄液、もしくはそれらの処理
物のような各種の生物体由来の試料液中に含まれており
、かつ該蛋白質に対する結合能を有する低分子量成分を
定量する方法に関するものである。
生物体由来の試料液中に含まれている低分子量成分を定
量する際に、その試料液中に共存している４ｆｉ白質が
その定量分析を妨害する場合があることは良く知られて
いる。これは、試料Ｊｉ’＃中において、その低分子量
成分の大部分が蛋白質と結合した状ｙハチで存在してい
るため、遊離状態にある低分子量成分の固有の物理的あ
るいは化学的特性を利用する定量分析操作が妨害される
ことに起因するものである。
量する際に、その試料液中に共存している４ｆｉ白質が
その定量分析を妨害する場合があることは良く知られて
いる。これは、試料Ｊｉ’＃中において、その低分子量
成分の大部分が蛋白質と結合した状ｙハチで存在してい
るため、遊離状態にある低分子量成分の固有の物理的あ
るいは化学的特性を利用する定量分析操作が妨害される
ことに起因するものである。
−１−二記のような結合しやすい関係にある低分子量成
分と蛋白質との代表的な組合わせの例としては、甲状Ｉ
Ｉ！ホルモンと、アルブミン、チロキシン綻１合グロブ
リン（ＴＢＧ）あるいはプレアルブミンなととの組合わ
せを挙げることがてきる。
分と蛋白質との代表的な組合わせの例としては、甲状Ｉ
Ｉ！ホルモンと、アルブミン、チロキシン綻１合グロブ
リン（ＴＢＧ）あるいはプレアルブミンなととの組合わ
せを挙げることがてきる。
すなわち、血液中に微量に存在するチロキシン（Ｔ４）
のような甲状腺ホルモンの定量、１．は、一般に、抗原
・抗体反応を利用して行なわれることが多い。しかし、
血液中には甲状腺ホルモンと結合しやすい前記のような
蛋白質も共イｒしており、実際には、血液中において甲
状腺ホルモンの大部分がそれらの蛋白質と結合した状態
てイｒ在しているため、甲状腺ホルモンの定量が妨害さ
れる結果となる。従って、そのような甲状腺ホルモンの
足部に際しては、共存蛋白質による定量反応の妨害を防
止するための様々な方法が利用されている。
のような甲状腺ホルモンの定量、１．は、一般に、抗原
・抗体反応を利用して行なわれることが多い。しかし、
血液中には甲状腺ホルモンと結合しやすい前記のような
蛋白質も共イｒしており、実際には、血液中において甲
状腺ホルモンの大部分がそれらの蛋白質と結合した状態
てイｒ在しているため、甲状腺ホルモンの定量が妨害さ
れる結果となる。従って、そのような甲状腺ホルモンの
足部に際しては、共存蛋白質による定量反応の妨害を防
止するための様々な方法が利用されている。
上記の蛋白質による妨害除去のための方法は、試料液へ
の有機溶媒の添加、試料液のｐＨの調整あるいは、−・
般にブロッカ−と名（＝ｊけられている化合物の添加な
どの方法により、試料液中の甲状腺ホルモンと蛋白質と
の結合を切り離して甲状腺ホルモンの大部分をＭ＃状態
に移行させ、これを定量反応にかけることを原理として
いるものが多い。この内で、ブロッカ−を添加する方法
は操作が筒中であるところから、従来より一般的に利用
されており、そのようなブロッカ−としては、サリチル
酸ナトリウム、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン
酸（ＡＮＳ）およびメルチオレート（チメロサール）な
どが知られている。このようなブロンカーを試料液に添
加した場合の試料液中の蛋白質と甲状腺ホルモンとの挙
動は、次のような仮想平衡式により、その概略を示すこ
とかできる。
の有機溶媒の添加、試料液のｐＨの調整あるいは、−・
般にブロッカ−と名（＝ｊけられている化合物の添加な
どの方法により、試料液中の甲状腺ホルモンと蛋白質と
の結合を切り離して甲状腺ホルモンの大部分をＭ＃状態
に移行させ、これを定量反応にかけることを原理として
いるものが多い。この内で、ブロッカ−を添加する方法
は操作が筒中であるところから、従来より一般的に利用
されており、そのようなブロッカ−としては、サリチル
酸ナトリウム、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン
酸（ＡＮＳ）およびメルチオレート（チメロサール）な
どが知られている。このようなブロンカーを試料液に添
加した場合の試料液中の蛋白質と甲状腺ホルモンとの挙
動は、次のような仮想平衡式により、その概略を示すこ
とかできる。
蛋白質・甲状昧ホルモン 十 ソロ、カーラ１蛋白質・
ブロッカ−十 甲状１腺ホルモンすなわち、試料液中で
結合状７ハ；にある［蛋白質・甲状腺ホルモンコにブロ
ンカーを共存させることにより、ブロッカ−が蛋白質に
１盆先的に結合して大？“イ１（分の甲状腺ホルモン０
１Ｆ状１店とする現象を利用した方法である。
ブロッカ−十 甲状１腺ホルモンすなわち、試料液中で
結合状７ハ；にある［蛋白質・甲状腺ホルモンコにブロ
ンカーを共存させることにより、ブロッカ−が蛋白質に
１盆先的に結合して大？“イ１（分の甲状腺ホルモン０
１Ｆ状１店とする現象を利用した方法である。
たとえば、定量反応として抗原・抗体反応を利用する甲
状腺ホルモンの定量は、−・般に一］−記のようなブロ
ンカーを試料液に共存させることにより甲状腺ホルモン
を遊離状態にして、このＭ＃した甲状腺ホルモンについ
て抗原・抗体反応を行なうことにより実施している。と
ころで、プロ・ンカー共イｆ下の甲状腺ホルモンの遊離
は、上記仮想平衡式により示されているように、甲状腺
ホルモンの蛋白質への結合と平衡関係にあるところから
、甲状腺ホルモンの定量反応の反Ｉｑ’、、速度の増大
、すなわち、定量に要する時間の短縮、および定量の精
度の向上のためには、ブロンカーは、上記の仮想１１衡
式を可能な限り右に寄せるようなものであることが望ま
しい。
状腺ホルモンの定量は、−・般に一］−記のようなブロ
ンカーを試料液に共存させることにより甲状腺ホルモン
を遊離状態にして、このＭ＃した甲状腺ホルモンについ
て抗原・抗体反応を行なうことにより実施している。と
ころで、プロ・ンカー共イｆ下の甲状腺ホルモンの遊離
は、上記仮想平衡式により示されているように、甲状腺
ホルモンの蛋白質への結合と平衡関係にあるところから
、甲状腺ホルモンの定量反応の反Ｉｑ’、、速度の増大
、すなわち、定量に要する時間の短縮、および定量の精
度の向上のためには、ブロンカーは、上記の仮想１１衡
式を可能な限り右に寄せるようなものであることが望ま
しい。
従って、ブロンカーとしては、蛋白質に対して強い結合
性を有するものが好ましいが、従来より知られているサ
リチル酸ナトリウム、ＡＮＳおよびチメロサールなどの
ブロッカ−は、蛋白質との結合性において充分とは言い
難い。特に試料液中に蛋白質が高濃度で含まれている場
合には、これらの公知のブロッカ−では充分なブロッキ
ンク効果、すなわち、蛋白質に優先的に結合することに
より、定１桂目的の低分子成分を速やかにＭｐ！＃状態
に移行させる効果が得られにくいとの難点があった。
性を有するものが好ましいが、従来より知られているサ
リチル酸ナトリウム、ＡＮＳおよびチメロサールなどの
ブロッカ−は、蛋白質との結合性において充分とは言い
難い。特に試料液中に蛋白質が高濃度で含まれている場
合には、これらの公知のブロッカ−では充分なブロッキ
ンク効果、すなわち、蛋白質に優先的に結合することに
より、定１桂目的の低分子成分を速やかにＭｐ！＃状態
に移行させる効果が得られにくいとの難点があった。
フロンカーとしての高い効果をこれらの化合物に求めよ
うとするためには、試料液にこれらの化合物を高い濃度
′となるように多量溶解して用いる方法も考えられるが
、実際にはこれらの従来から利用されている化合物を多
量で用いても充分な効果が得られにくいとの問題がある
。またさらに、ＡＮＳについては、その高濃度溶液が着
色を示すため、のちに比色法や蛍光法なとを利用して試
料液を測定する際に、その′ｌｌ１ｌ＋定を妨゛−イす
るとの欠点がある。−力、チメロサールは水銀を含む化
合物であるため、定ｍ反応として酵素反応を利用する場
合などにおいては、その酵素反応を妨害することがある
との欠点がある。
うとするためには、試料液にこれらの化合物を高い濃度
′となるように多量溶解して用いる方法も考えられるが
、実際にはこれらの従来から利用されている化合物を多
量で用いても充分な効果が得られにくいとの問題がある
。またさらに、ＡＮＳについては、その高濃度溶液が着
色を示すため、のちに比色法や蛍光法なとを利用して試
料液を測定する際に、その′ｌｌ１ｌ＋定を妨゛−イす
るとの欠点がある。−力、チメロサールは水銀を含む化
合物であるため、定ｍ反応として酵素反応を利用する場
合などにおいては、その酵素反応を妨害することがある
との欠点がある。
本発明は、各種の蛋白質に対する結合性が公知のソロ、
カーに比較して顕著に高い新規なブロッカ−を利用する
蛋白質含有試料液中の低分子−量成分の定量法を提供す
るものである。
カーに比較して顕著に高い新規なブロッカ−を利用する
蛋白質含有試料液中の低分子−量成分の定量法を提供す
るものである。
また本発明は、ブロッカ−を相対的に多量用いることに
より、蛋白質が高濃度に含まれている試料液中において
も、精度の高い定量−を可能とする新規なソロツカ−を
用いるイド白ｒり含有試料液中の低分子量成分の定量法
を提供するものである。
より、蛋白質が高濃度に含まれている試料液中において
も、精度の高い定量−を可能とする新規なソロツカ−を
用いるイド白ｒり含有試料液中の低分子量成分の定量法
を提供するものである。
すなわち本発明は、蛋白質を含有する生物体由来の試料
液中に含まれており、かつ該蛋白質に対する結合能をイ
イする低分子量成分を定（５１するに際して、該試オ゛
１７夜中に一般式（１）：％式％（） （ここで、Ｍは水素イオン、アルカリ金属イオンもしく
はアンモニウムイオンてあり；Ｘは直鎖もしくは分岐を
有する炭素原子数６個以」−のアルキル基、アルケニル
基、フッ素化アルキル基もしくはフッ素化アルケニル基
であり；Ｙは二価の有機残基であり；そしてｐはＯもし
くは１である）で表わされる化合物を共存させることを
特毒とする蛋白質含有試料液中の低分子量成分の定量法
からなるものである。
液中に含まれており、かつ該蛋白質に対する結合能をイ
イする低分子量成分を定（５１するに際して、該試オ゛
１７夜中に一般式（１）：％式％（） （ここで、Ｍは水素イオン、アルカリ金属イオンもしく
はアンモニウムイオンてあり；Ｘは直鎖もしくは分岐を
有する炭素原子数６個以」−のアルキル基、アルケニル
基、フッ素化アルキル基もしくはフッ素化アルケニル基
であり；Ｙは二価の有機残基であり；そしてｐはＯもし
くは１である）で表わされる化合物を共存させることを
特毒とする蛋白質含有試料液中の低分子量成分の定量法
からなるものである。
次に本発明の詳細な説明する。
本発明は、蛋白質を含有する試料液中に存在する低分子
量成分の定量を行なうに際して、その試料中にブロッカ
−として特定のスルホン酸もしくはスルホン耐塩を添加
し、このブロッカ−を試料液に共存させながら低分子量
成分の定量のだめの反応を実施することからなるもので
ある。
量成分の定量を行なうに際して、その試料中にブロッカ
−として特定のスルホン酸もしくはスルホン耐塩を添加
し、このブロッカ−を試料液に共存させながら低分子量
成分の定量のだめの反応を実施することからなるもので
ある。
本発明においてソロツカ−として用いるヌルホン酸もし
くはスルホン酸基は、 １ｆｉ７述のように一般式（１
）： ％式％（） て表わされる化合物である。
くはスルホン酸基は、 １ｆｉ７述のように一般式（１
）： ％式％（） て表わされる化合物である。
」４記・般式（Ｉ）において、Ｍは水素イオン；ナトリ
ウムイオン、カリウ１＼イオンなとのようなアルカリ金
属イオン；もしくは、アンモニウムイオン（低級アルキ
ルアミンの第四級塩なども含む）であり、Ｘは、直鎖も
しくは分岐を有する炭素原ｆ数６個以上（好ましくは、
８個以」二、そして２２個以下）のアルキル基、アルケ
ニル基、フッ素化アルキル基、もしくはフッ素化アルケ
ニル基である。
ウムイオン、カリウ１＼イオンなとのようなアルカリ金
属イオン；もしくは、アンモニウムイオン（低級アルキ
ルアミンの第四級塩なども含む）であり、Ｘは、直鎖も
しくは分岐を有する炭素原ｆ数６個以上（好ましくは、
８個以」二、そして２２個以下）のアルキル基、アルケ
ニル基、フッ素化アルキル基、もしくはフッ素化アルケ
ニル基である。
１−記一般式（１）において、Ｙは二価の有機残基であ
り、ｐはＯもしく１第１である。従って、一般式（Ｉ）
の化合物においては、Ｙに相当する有機残基は必ずしも
必要ではない。
り、ｐはＯもしく１第１である。従って、一般式（Ｉ）
の化合物においては、Ｙに相当する有機残基は必ずしも
必要ではない。
一般式（Ｉ）の化合物にＹが存在する場合には七のＹは
一価もしくは−５二価の芳香環を有する二価の有機残基
であることが好ましい。そのような好ましい二価の４４
機残基の例としては、次に示すような有機残基を挙げる
ことができる。
一価もしくは−５二価の芳香環を有する二価の有機残基
であることが好ましい。そのような好ましい二価の４４
機残基の例としては、次に示すような有機残基を挙げる
ことができる。
（１）−［芳香環］−〇−（ＣＨｚ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ−
（ただし、芳香環は、ヒドロキシ、アルコキシ、アリー
ルオキシ、アルキル バミル、アミド、スルファミド、ハロゲン、カルボキシ
ル、スルホンなどの置換基を有していてもよく、ｍはＯ
〜３の整数であり，そして、Ａは水素原子もしくは低級
アルキル基である、以下同じ） （２）− ［芳香環］ −０ （ＣＨＣＨ２０）ｍ−
（３）− ［芳香環］ （ Ｏ Ｃ Ｈ ２ Ｃ
Ｈ ２ ） ｍ−（ただし、ｎは１〜５の整数であり、
モしてＤは水素原子もしくは低級アルキ ル基である） （５）− ［芳香環コーＺ− （ただし、Ｚは単なる連結を意味するかもしくは二価の
有機残基である、以 ド同し） （６）−ＮＨＣＯ− ［芳香環］−Ｚ−〇 （９） −ＣＯＮ− ［芳香環］−Ｚ−（１ ０）
−ＮＨＣＯＮＨ− ［芳香環］−Ｚ−（１ １）
−ＮＨＣＳＮＨ− ［芳香環］−Ｚ〜（１２） −Ｓ
− ［芳香環］−２−（１３） −０−Ｚ− ［芳香
環コー■ （１４） −Ｎ−Ｚ＝ ［芳香環コー（たたし、■は
一価の有機残７１（、以ド同じ）Ｃ１６）
Ｖ ＣＨ−Ｚ− （１７） Ｖ 一ＣＯーＮーＺ− ［芳香環］− 上記の一般弐（１）で表わされるプロ・ンカーの代表的
な例としては、次に示す化合物を挙げることができる。
（ただし、芳香環は、ヒドロキシ、アルコキシ、アリー
ルオキシ、アルキル バミル、アミド、スルファミド、ハロゲン、カルボキシ
ル、スルホンなどの置換基を有していてもよく、ｍはＯ
〜３の整数であり，そして、Ａは水素原子もしくは低級
アルキル基である、以下同じ） （２）− ［芳香環］ −０ （ＣＨＣＨ２０）ｍ−
（３）− ［芳香環］ （ Ｏ Ｃ Ｈ ２ Ｃ
Ｈ ２ ） ｍ−（ただし、ｎは１〜５の整数であり、
モしてＤは水素原子もしくは低級アルキ ル基である） （５）− ［芳香環コーＺ− （ただし、Ｚは単なる連結を意味するかもしくは二価の
有機残基である、以 ド同し） （６）−ＮＨＣＯ− ［芳香環］−Ｚ−〇 （９） −ＣＯＮ− ［芳香環］−Ｚ−（１ ０）
−ＮＨＣＯＮＨ− ［芳香環］−Ｚ−（１ １）
−ＮＨＣＳＮＨ− ［芳香環］−Ｚ〜（１２） −Ｓ
− ［芳香環］−２−（１３） −０−Ｚ− ［芳香
環コー■ （１４） −Ｎ−Ｚ＝ ［芳香環コー（たたし、■は
一価の有機残７１（、以ド同じ）Ｃ１６）
Ｖ ＣＨ−Ｚ− （１７） Ｖ 一ＣＯーＮーＺ− ［芳香環］− 上記の一般弐（１）で表わされるプロ・ンカーの代表的
な例としては、次に示す化合物を挙げることができる。
Ｙが１−記（１）の有機残基であるもの：Ｙが上記（２
）の有機残基であるもの：Ｙが上記（３）の有機残基で
あるもの：Ｙが」二記（４）の有機残基であるもの：Ｙ
が上記（５）の有機残基であるもの：Ｙが上記（６）の
有機残基であるもの２Ｈ Ｓ Ｏ３Ｎ ａ Ｙがに記（７）の有機残基であるもの：Ｙか−に記（８
）の有機残基であるもの：Ｃ， Ｈ２，ＯＳＯ３Ｎａ
（８°）ｃ，。Ｈ，、ＯＳ０３Ｎ
ａ （８ｂ）Ｙがｆ．ｚ記（９
）の有機残基であるもの：ＮＨＣＯＣ９Ｈ１９ＮＨＣＯ
Ｃ１ｌＨ２３ＳＯＮａ
ＳＯＮａ３ Ｙが」二記（１０）の有機残基であるもの：０３Ｎａ Ｙが上記（１１）の有機残基であるもの：ｏ Ｎａ Ｙが上記（１２）の有機残基であるもの：Ｙが上記（１
３）の有機残基であるもの：Ｙが上記（１４）の有機残
基であるもの：Ｃ□２Ｈ２５ＮＨｃＨ２ｃＨ２ｓｏ３Ｎ
ａ（１４ａ）Ｃ□２Ｈ２５１ｉ１ｃＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎ
ａ （１４ｂ）Ｙが」−記（１５）の有機残
基であるもの二Ｙが−１−記（１６）の有機残基である
もの：Ｙが１−、記（１７）の有機残基であるもの：ｐ
がＯｌすなわちＹが存在しないもの：０８Ｆ１７−３Ｏ
３Ｋ （＋８ａ）ＣＨ３（Ｃ
Ｈ２）□。ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−８０３Ｎａ（１８ｂ）本
発明においてブロッカ−として用いられる上記一般式（
Ｉ）で表される化合物は、たとえば。
）の有機残基であるもの：Ｙが上記（３）の有機残基で
あるもの：Ｙが」二記（４）の有機残基であるもの：Ｙ
が上記（５）の有機残基であるもの：Ｙが上記（６）の
有機残基であるもの２Ｈ Ｓ Ｏ３Ｎ ａ Ｙがに記（７）の有機残基であるもの：Ｙか−に記（８
）の有機残基であるもの：Ｃ， Ｈ２，ＯＳＯ３Ｎａ
（８°）ｃ，。Ｈ，、ＯＳ０３Ｎ
ａ （８ｂ）Ｙがｆ．ｚ記（９
）の有機残基であるもの：ＮＨＣＯＣ９Ｈ１９ＮＨＣＯ
Ｃ１ｌＨ２３ＳＯＮａ
ＳＯＮａ３ Ｙが」二記（１０）の有機残基であるもの：０３Ｎａ Ｙが上記（１１）の有機残基であるもの：ｏ Ｎａ Ｙが上記（１２）の有機残基であるもの：Ｙが上記（１
３）の有機残基であるもの：Ｙが上記（１４）の有機残
基であるもの：Ｃ□２Ｈ２５ＮＨｃＨ２ｃＨ２ｓｏ３Ｎ
ａ（１４ａ）Ｃ□２Ｈ２５１ｉ１ｃＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎ
ａ （１４ｂ）Ｙが」−記（１５）の有機残
基であるもの二Ｙが−１−記（１６）の有機残基である
もの：Ｙが１−、記（１７）の有機残基であるもの：ｐ
がＯｌすなわちＹが存在しないもの：０８Ｆ１７−３Ｏ
３Ｋ （＋８ａ）ＣＨ３（Ｃ
Ｈ２）□。ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−８０３Ｎａ（１８ｂ）本
発明においてブロッカ−として用いられる上記一般式（
Ｉ）で表される化合物は、たとえば。
次に示す刊行物に記載されている（−３ｏ３Ｍ）２．４
を有する界面活性剤の製造法、もしくはそれに！（Ｌ！
する方法に従って製造することができる。
を有する界面活性剤の製造法、もしくはそれに！（Ｌ！
する方法に従って製造することができる。
界面活性剤（合成編Ｉ、■、■、および応用縮重、■、
■）、小田良平、寺村−広共著（槙書店、１９６５） 新界面活性剤、堀口博著（三共出版、 １９７５） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ５ｃｉｅｎｃｅ ５ｅｒｉｅｓ
、 Ｖｏｌ、 ７，８．＋０，１１Ｍａｒｔｉｎ Ｊ
、 ５ｃｈｉｃｋ、 Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ、 Ｆｏ
ｗｋｅｓ（Ｍａｒｃｅｌ ロｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ、
、 Ｎ、Ｙ、＆ Ｂａ５ｅｌ、１９７６）Ｍｅ（１
：ｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ＆
Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’
ｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｍｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏ、、 ＋９７９） 本発明において定量の対象となる低分子量成分としては
、甲状腺ホルモンなどのホルモン、ビリルビンあるいは
、各種の薬剤投与を受けている川。
■）、小田良平、寺村−広共著（槙書店、１９６５） 新界面活性剤、堀口博著（三共出版、 １９７５） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ５ｃｉｅｎｃｅ ５ｅｒｉｅｓ
、 Ｖｏｌ、 ７，８．＋０，１１Ｍａｒｔｉｎ Ｊ
、 ５ｃｈｉｃｋ、 Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ、 Ｆｏ
ｗｋｅｓ（Ｍａｒｃｅｌ ロｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ、
、 Ｎ、Ｙ、＆ Ｂａ５ｅｌ、１９７６）Ｍｅ（１
：ｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ＆
Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’
ｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｍｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏ、、 ＋９７９） 本発明において定量の対象となる低分子量成分としては
、甲状腺ホルモンなどのホルモン、ビリルビンあるいは
、各種の薬剤投与を受けている川。
志などの血液、血清、血しよう、尿、骨髄液などの体液
あるいはその処理物を含む液体中に現われる薬剤及びそ
の代謝物を挙げることができる。
あるいはその処理物を含む液体中に現われる薬剤及びそ
の代謝物を挙げることができる。
そのような薬剤としては、フェノパルビクール、フェニ
トイン、カルバマゼピン、パルプロイン酸、ピリミドン
、エトスクシミド、メｉ・スフシミ１ペ メフェニトイ
ンなどのてんかん治療薬；テオフィリンなどのぜん息治
療薬；ジゴキシンなどの強心剤；キニジン、リドカイン
、プロ力インアミト、Ｎ−アセチルプロ力インアミド、
ヂソビラミドなどの不整脈治療薬；ペニシリン、セファ
ロスホリン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカ
シン、クロラムフェニコールなどの抗生物質；アンフェ
タミン、エフェドリンなどの中枢神経賦活剤；メト］・
レキセードなどの抗腫瘍剤−などを挙げることができる
。
トイン、カルバマゼピン、パルプロイン酸、ピリミドン
、エトスクシミド、メｉ・スフシミ１ペ メフェニトイ
ンなどのてんかん治療薬；テオフィリンなどのぜん息治
療薬；ジゴキシンなどの強心剤；キニジン、リドカイン
、プロ力インアミト、Ｎ−アセチルプロ力インアミド、
ヂソビラミドなどの不整脈治療薬；ペニシリン、セファ
ロスホリン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカ
シン、クロラムフェニコールなどの抗生物質；アンフェ
タミン、エフェドリンなどの中枢神経賦活剤；メト］・
レキセードなどの抗腫瘍剤−などを挙げることができる
。
本発明の定量法における試料液である生物体由来の試料
液の例としては、血液、血清、血しょう、尿、骨髄液、
もしくはそれらの処理物を挙げることができる。これら
の試料液中に含有されている蛋白質の例としては、前述
のアルブミン、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）お
よびプレアルブミンの他に、α−グロブリンおよびβ−
グロブリンなどを挙げることができる。試料液中におい
て上記のホルモン、薬剤などの低分子量成分の一部もし
くは大部分がそれらの蛋白質と結合状態にある場合に、
その低分子量成分を定量する際に、本発明の定量法は有
効に利用することができる。
液の例としては、血液、血清、血しょう、尿、骨髄液、
もしくはそれらの処理物を挙げることができる。これら
の試料液中に含有されている蛋白質の例としては、前述
のアルブミン、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）お
よびプレアルブミンの他に、α−グロブリンおよびβ−
グロブリンなどを挙げることができる。試料液中におい
て上記のホルモン、薬剤などの低分子量成分の一部もし
くは大部分がそれらの蛋白質と結合状態にある場合に、
その低分子量成分を定量する際に、本発明の定量法は有
効に利用することができる。
すなわち、試料液中の定量対象の低分子量成分の一部あ
るいは大部分が、その試料液中で蛋白質と結合状態にあ
る場合に、必要に応じて試料液のｐＨを６．０〜１０．
５程度に調節するための緩衝剤を添加したのち、前記一
般式（Ｉ）で表わされるブロッカ−を試料液に添加して
、そのブロッカ−を重量反応系に共存させて低分子量成
分の一部もしくは大部分を遊離の状態に変える。そして
、定量対象の低分子量成分をｍ１ｌｉｌＩ状態に置きな
がら、その低分子量成分の定量反応、たとえば、その低
分子量成分と特異的に結合する蛋白質（たとえば、抗体
など）と、放射性物質、蛍光物質、蛍光プレカーサー、
酵素阻害物質、酵素基質、補酵素、酵素などの標識物質
により標識した標識化合物（たとえば、定量対象の低分
子量成分と同一の物質など）などを添加し、抗原・抗体
反応、あるいは競争的結合反応などを利用して、結合蛋
白質に結合した標識化合物、あるいは結合しなかった遊
離の標識化合物を検出定量する。
るいは大部分が、その試料液中で蛋白質と結合状態にあ
る場合に、必要に応じて試料液のｐＨを６．０〜１０．
５程度に調節するための緩衝剤を添加したのち、前記一
般式（Ｉ）で表わされるブロッカ−を試料液に添加して
、そのブロッカ−を重量反応系に共存させて低分子量成
分の一部もしくは大部分を遊離の状態に変える。そして
、定量対象の低分子量成分をｍ１ｌｉｌＩ状態に置きな
がら、その低分子量成分の定量反応、たとえば、その低
分子量成分と特異的に結合する蛋白質（たとえば、抗体
など）と、放射性物質、蛍光物質、蛍光プレカーサー、
酵素阻害物質、酵素基質、補酵素、酵素などの標識物質
により標識した標識化合物（たとえば、定量対象の低分
子量成分と同一の物質など）などを添加し、抗原・抗体
反応、あるいは競争的結合反応などを利用して、結合蛋
白質に結合した標識化合物、あるいは結合しなかった遊
離の標識化合物を検出定量する。
ただし、ブロッカ−が共存している試料液においては、
′Ｍｆ１１の低分子量成分と蛋白質に結合したままの低
分子量成分とが、前述のように平衡関係にあるため、遊
離低分子量成分が抗原抗体反応などの定量反応により他
の結合状態に移行した場合には、」二記の蛋白質に結合
したままの低分子量成分は順にＭ＃の状ｙ〃ｉに移行す
る。従って、試料液に含有されていた低分子量成分は、
蛋白質に結合していたもの、そして遊離の状態にあった
ものを問わず、実質的に全ての低分子量成分が定量反応
に感応する結果となる。
′Ｍｆ１１の低分子量成分と蛋白質に結合したままの低
分子量成分とが、前述のように平衡関係にあるため、遊
離低分子量成分が抗原抗体反応などの定量反応により他
の結合状態に移行した場合には、」二記の蛋白質に結合
したままの低分子量成分は順にＭ＃の状ｙ〃ｉに移行す
る。従って、試料液に含有されていた低分子量成分は、
蛋白質に結合していたもの、そして遊離の状態にあった
ものを問わず、実質的に全ての低分子量成分が定量反応
に感応する結果となる。
なお、試料液中の低分子量成分の含有量の定量結果は、
通常、この定量値と、定量対象の低分子量成分の濃度を
種々変えた試料液を利用して作成した検量線とを比較す
ることにより容易に知ることができる。
通常、この定量値と、定量対象の低分子量成分の濃度を
種々変えた試料液を利用して作成した検量線とを比較す
ることにより容易に知ることができる。
上記の定量反応において試料液に添加する一般式（Ｉ）
のブロッカ−の添加量は、試料液中の蛋白質の含有量お
よび定量対象の低分子量成分の含有量によっても異なる
が、５重量％以下、通常は、Ｏ，０１〜２重量％である
。
のブロッカ−の添加量は、試料液中の蛋白質の含有量お
よび定量対象の低分子量成分の含有量によっても異なる
が、５重量％以下、通常は、Ｏ，０１〜２重量％である
。
以上述べたように、前記の一般式（Ｉ）で表されるブロ
ッカ−を、蛋白質を含有する生物体由来の試料液中に含
ませ、かつ該蛋白質に対して結合能を有する低分子量成
分を定量するに際して共存させた場合、そのブロッキン
グ作用は従来利用されていたブロッカ−に比較して顕著
に高く、さらに、蛋白質の含有量が高い試料液に共存さ
せた場合においても一般式（Ｉ）で表されるブロッカ−
は高いブロッキング作用を示す。そして、この一般式（
Ｉ）で表されるブロッカ−は試料液に対する溶解度も高
く、かつ高濃度にしても着色を殆ど示すこともなく、ま
た低分子酸成分の定量に一般に利用される反応を妨害す
ることもない。
ッカ−を、蛋白質を含有する生物体由来の試料液中に含
ませ、かつ該蛋白質に対して結合能を有する低分子量成
分を定量するに際して共存させた場合、そのブロッキン
グ作用は従来利用されていたブロッカ−に比較して顕著
に高く、さらに、蛋白質の含有量が高い試料液に共存さ
せた場合においても一般式（Ｉ）で表されるブロッカ−
は高いブロッキング作用を示す。そして、この一般式（
Ｉ）で表されるブロッカ−は試料液に対する溶解度も高
く、かつ高濃度にしても着色を殆ど示すこともなく、ま
た低分子酸成分の定量に一般に利用される反応を妨害す
ることもない。
次に本発明の実施例および比較例を記載する。
なお、それらの実施例などで用いた各試薬は次に述べる
方法により調製したものである。
方法により調製したものである。
［Ａ、フルオレセイン標識チロキシン
（ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４）の合成］１）ｔ−ブトキ
シカルボニルグリシルチロキシンメチルエステル（Ｂｏ
ａ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ −０ＣＨ３）の合成 し−ブトキシカルボニルグリシンスクシニルエステル（
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ３ｕ）３２９ ｍ ｇ （１、２１
ミリモル）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５ｍＭに溶
解した。別に、チロキシンメチルエステル塩酸塩１．０
ｇ（１，２１ミリモル）をＴＨＦ１５ｍ立に溶解し、そ
こへＴ ＨＦ ３ ｍ、 Ｍに溶解したトリエチルアミ
ン１７０ｐ文（１，２１ミリモル）を加えた。
シカルボニルグリシルチロキシンメチルエステル（Ｂｏ
ａ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ −０ＣＨ３）の合成 し−ブトキシカルボニルグリシンスクシニルエステル（
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ３ｕ）３２９ ｍ ｇ （１、２１
ミリモル）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５ｍＭに溶
解した。別に、チロキシンメチルエステル塩酸塩１．０
ｇ（１，２１ミリモル）をＴＨＦ１５ｍ立に溶解し、そ
こへＴ ＨＦ ３ ｍ、 Ｍに溶解したトリエチルアミ
ン１７０ｐ文（１，２１ミリモル）を加えた。
前記のＨｏｅ−Ｇｌｙ−Ｏ９ｕ溶液に、氷冷しながら、
チロキシンメチルエステル溶液を加え、室温に戻し１．
５時間攪拌した。この反応液を一夜静置したのち、蒸留
水２５ｍＭおよび酢酸エチル５０ｍＭを加え、酢酸エチ
ルによる抽出を行なったのち、さらに酢酸エチル２５＋
ｎＪＬを用いて抽出を３回繰返した。それらの酢酸エチ
ル抽出液を一緒にし、これを無水硫酸マグネシウムで乾
燥した。この乾燥！夜をロータリーエバポレーターで濃
井宿したのち、セファデックスＬＨ−２０（商標名：フ
ァルマシア社製）を充填したカラムを用いてゲルクロマ
トグラフィーを行なった。このときの展開溶媒はアセト
ン４容量部とメタノール１容着部との混合物を用いた。
チロキシンメチルエステル溶液を加え、室温に戻し１．
５時間攪拌した。この反応液を一夜静置したのち、蒸留
水２５ｍＭおよび酢酸エチル５０ｍＭを加え、酢酸エチ
ルによる抽出を行なったのち、さらに酢酸エチル２５＋
ｎＪＬを用いて抽出を３回繰返した。それらの酢酸エチ
ル抽出液を一緒にし、これを無水硫酸マグネシウムで乾
燥した。この乾燥！夜をロータリーエバポレーターで濃
井宿したのち、セファデックスＬＨ−２０（商標名：フ
ァルマシア社製）を充填したカラムを用いてゲルクロマ
トグラフィーを行なった。このときの展開溶媒はアセト
ン４容量部とメタノール１容着部との混合物を用いた。
ＴＬＣで確認しながら目的物の分画を採取し、減圧濃縮
することにより結晶化を行ない、９５０ ｍ ｇの目的
物を得た。（収率：８２゜５％） ２）ＢＯＣ（７）除去（Ｇｌｙ−Ｔ ａ−ＯＣＨ３トリ
フルオロ酢酸塩の取得） 上記ｌ）にて合成したＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔ ４−０ＣＨ
２９５０ｍｇ （１ミリモル）をトリフルオロ酢酸１０
ｍ９に溶解し、水冷下に１０分間撹拌したのち４゜°Ｃ
以下の温度で減圧留去操作を行ない、Ｂｏｃを除去した
。得られた残存について上記１）と同様の条件でゲルク
ロマトグラフィーを行ない、目的物の分画を採取し、こ
れを結晶化させて７００ｍｇのｌｊｌ的物を得た。（収
率：８２．５％）３）フルオレセインインチオシアン酸
グリシルチロキシン（ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ ）の
合成上記２）において得たＧｌｙ−Ｔ ａ −ＯＣＨｇ
トリフルオロ酢酸塩３２０ｍｇ（０，３３ミリモル）
とトリエチルアミン４７ｐＬｌ （０，３３ミリモル）
とを５＋ｎＪｌｊのメタノールに溶解し、その溶液を、
ＦＩＴｅｌ ３０ｍｇ （０、３３ミリモル）を４５ｍ
１のメタノールに溶解した溶液に加えた。室温で２４Ｉ
ＩＩ間の反応を行なったのち、４０°Ｃ以下の温度で１
成圧留去操作を行ない、残存をメタノール・アルカリ混
合液中でけん化し、中和したのち、蒸発乾固し、その残
存について前記の１）と同様な条件でゲルクロマトグラ
フィーを行ない、目的物の分画を採取し、次いで結晶化
を行なった。得られた結晶は橙色を示し、収量は２９０
ｍｇであった。
することにより結晶化を行ない、９５０ ｍ ｇの目的
物を得た。（収率：８２゜５％） ２）ＢＯＣ（７）除去（Ｇｌｙ−Ｔ ａ−ＯＣＨ３トリ
フルオロ酢酸塩の取得） 上記ｌ）にて合成したＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔ ４−０ＣＨ
２９５０ｍｇ （１ミリモル）をトリフルオロ酢酸１０
ｍ９に溶解し、水冷下に１０分間撹拌したのち４゜°Ｃ
以下の温度で減圧留去操作を行ない、Ｂｏｃを除去した
。得られた残存について上記１）と同様の条件でゲルク
ロマトグラフィーを行ない、目的物の分画を採取し、こ
れを結晶化させて７００ｍｇのｌｊｌ的物を得た。（収
率：８２．５％）３）フルオレセインインチオシアン酸
グリシルチロキシン（ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ ）の
合成上記２）において得たＧｌｙ−Ｔ ａ −ＯＣＨｇ
トリフルオロ酢酸塩３２０ｍｇ（０，３３ミリモル）
とトリエチルアミン４７ｐＬｌ （０，３３ミリモル）
とを５＋ｎＪｌｊのメタノールに溶解し、その溶液を、
ＦＩＴｅｌ ３０ｍｇ （０、３３ミリモル）を４５ｍ
１のメタノールに溶解した溶液に加えた。室温で２４Ｉ
ＩＩ間の反応を行なったのち、４０°Ｃ以下の温度で１
成圧留去操作を行ない、残存をメタノール・アルカリ混
合液中でけん化し、中和したのち、蒸発乾固し、その残
存について前記の１）と同様な条件でゲルクロマトグラ
フィーを行ない、目的物の分画を採取し、次いで結晶化
を行なった。得られた結晶は橙色を示し、収量は２９０
ｍｇであった。
（収率；７０％）
［Ｂ 、抗チロキシン血清の調製］
１）Ｎ−メチル−Ｎ−力ルボキシメチルグリシルチロキ
シンメチルエステル・（Ｔ４−ＭＥ旧ＤＡ）の合成 チロキシンメチルエステル塩酸塩２ｇを１５ｍ文のジメ
チルホルムアミド（Ｄ Ｍ Ｆ）に溶解し、これに５０
０ｐ文のトリエチルアミンを加えた。
シンメチルエステル・（Ｔ４−ＭＥ旧ＤＡ）の合成 チロキシンメチルエステル塩酸塩２ｇを１５ｍ文のジメ
チルホルムアミド（Ｄ Ｍ Ｆ）に溶解し、これに５０
０ｐ文のトリエチルアミンを加えた。
１０分後に、この溶液に、Ｎ−メチルイミノニ酢酸０．
５５ｇをＴ ＨＦ ５ ｍ ！ｌに溶解したものを加え
た。反応液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残存
を５０ ｍ ｆＬのＴＨＦに溶解し、さらに酢酸エチル
１５０ｍＭを加え、振とう攪拌し、酢酸エチル層を分取
し、これを蒸留水で３回、飽和食１スジ水で１回洗浄し
た。次いで酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し
、上澄液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した
。残存に２０ｍ文のＴＨＦを加えたのちｎ−ヘキサンを
少量加え、生成した沈澱物を吸引濾過して白色結晶を得
た。
５５ｇをＴ ＨＦ ５ ｍ ！ｌに溶解したものを加え
た。反応液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残存
を５０ ｍ ｆＬのＴＨＦに溶解し、さらに酢酸エチル
１５０ｍＭを加え、振とう攪拌し、酢酸エチル層を分取
し、これを蒸留水で３回、飽和食１スジ水で１回洗浄し
た。次いで酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し
、上澄液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した
。残存に２０ｍ文のＴＨＦを加えたのちｎ−ヘキサンを
少量加え、生成した沈澱物を吸引濾過して白色結晶を得
た。
結晶を減圧デシケータ−内で乾燥し、２．３ｇの白色結
晶とした。（収率：６９％） ２）抗チロキシン血清の調製 」−２の１）で調製したＴ４−ＭＥＭＩＤＡＩ ００ｍ
ｇを、乾燥したＤＭＦ２．０＋ｎＪ１に溶解した。次い
て、この溶液にＮ−ヒドロキシコハク−酸イミド１５ｍ
ｇを加えたのち、２５ｍｇの１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を
水冷ｆに加え、４°Ｃで一夜反応させノこ。
晶とした。（収率：６９％） ２）抗チロキシン血清の調製 」−２の１）で調製したＴ４−ＭＥＭＩＤＡＩ ００ｍ
ｇを、乾燥したＤＭＦ２．０＋ｎＪ１に溶解した。次い
て、この溶液にＮ−ヒドロキシコハク−酸イミド１５ｍ
ｇを加えたのち、２５ｍｇの１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を
水冷ｆに加え、４°Ｃで一夜反応させノこ。
１−記の操作により得られた溶液を水冷下、生血！＾ア
ルブミン（マイルスφラボラトリーズ社製、フラクショ
ンＶ）ｌｏｏｍｇを含む０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９
，０）２０ｍ文中に滴下し、反１心させた。反応液を同
じ緩衝液に対して二昼夜透析（２文×４回）して未反応
物を除去し１次に、蒸留水に対して二昼夜透析（２文×
４回）を行ない脱塩したのち、凍結乾燥した。Ｙｊ、＋
られた乾燥固形物は約１３０ｍｇであった。この乾燥固
形物は、赤外吸収スペクトルの測定により、生血清アル
ブミン１分子に対して約２０個のハプテンが導入された
ものであることがわかった。
ルブミン（マイルスφラボラトリーズ社製、フラクショ
ンＶ）ｌｏｏｍｇを含む０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９
，０）２０ｍ文中に滴下し、反１心させた。反応液を同
じ緩衝液に対して二昼夜透析（２文×４回）して未反応
物を除去し１次に、蒸留水に対して二昼夜透析（２文×
４回）を行ない脱塩したのち、凍結乾燥した。Ｙｊ、＋
られた乾燥固形物は約１３０ｍｇであった。この乾燥固
形物は、赤外吸収スペクトルの測定により、生血清アル
ブミン１分子に対して約２０個のハプテンが導入された
ものであることがわかった。
上記において得られた乾燥固形物を用いて常法に従いウ
サギに免疫処理し、抗チロキシン抗血清を得た。
サギに免疫処理し、抗チロキシン抗血清を得た。
［実施例１］
０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，０）にＦＩ’ｌ’Ｃ−Ｇｌｙ−Ｔ ４をＯ，１ｇＭの
濃度に溶解してＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ溶液とした。
，０）にＦＩ’ｌ’Ｃ−Ｇｌｙ−Ｔ ４をＯ，１ｇＭの
濃度に溶解してＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ溶液とした。
抗チロキシン」ｍ、古を１００ｍｆｌとり、これに、０
．３％ウシ血清アルブミンおよび０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）１９
．９ｍ文を加えて箱釈し、抗チロキシン血清溶液とした
。
．３％ウシ血清アルブミンおよび０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）１９
．９ｍ文を加えて箱釈し、抗チロキシン血清溶液とした
。
ヒト血清（コンセーラ：１」水製桑■商標）を１ｍＭと
り、これに、Ｏ，１５Ｍ１ｌ化すトリウムを含む０．０
２Ｍリン酸緩栴緩衝液Ｈ７，３、以下ＰＢＳという）９
ｍＭを加えて６釈し血清溶液とした。
り、これに、Ｏ，１５Ｍ１ｌ化すトリウムを含む０．０
２Ｍリン酸緩栴緩衝液Ｈ７，３、以下ＰＢＳという）９
ｍＭを加えて６釈し血清溶液とした。
次に記載する化合物のブロッカ−としての作用を評価す
るために、それぞれをｌ ｊｌｊ 、１−％濃度の水溶
液またはアルカリ性溶液とした。
るために、それぞれをｌ ｊｌｊ 、１−％濃度の水溶
液またはアルカリ性溶液とした。
化合物−１チメロサール
化合物−２サリチル酸すトリウム
化合物３ １−アニリノ−８−ナフタレンスルポン
酸（ＡＮＳ） （以に、公知のブロッカ−） ｆヒ合物−４前掲化合物（１ａ） 化合物−５前掲化合物（３ａ、ただしオキシエチレンノ
、（が２〜４のも のの混合物） 化合物−６前掲化合物（ｔ６ａ） 化合物−７前掲化合物（１７ａ） 化合物−８前掲化合物（８ａ） 化合物−９前掲化合物（１８ｂ） 化合物−１Ｏ前掲化合物（１８ａ） 化合物−１１前掲化合物（５ａ） 化合物−１２ｎＱ掲化合物（５ｂ） 化合物−１３前掲化合物（１ｂ） 化合物−１４前掲化合物（６ａ） 化合物−１５前掲化合物（１４ｃ） 化合物−１６前掲化合物（１５ａ） ブロッキンク効果評価法 試験管に、 ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ溶液２５０ｐ文
、血清溶液１００ＪＪ、文、と記の化合物の溶液（プロ
・ンカー溶液）１００ｇ文、および０．３Ｍグリシン・
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）５５０角文を入
れて総量Ｊ、ｍ！；Ｌの試験液を調製し、これを撹拌混
合したのち、室温にて約１０分間放置した。次に、分光
蛍光光度計６５０−１０ （■日立製作所製）を用い、
励起波長４９２ｎｍそして測定蛍光波長５２５ｎｍにて
その試験液の蛍光強度を測定した。この測定値をｒＨｓ
蛍光強度」と名刺ける。
酸（ＡＮＳ） （以に、公知のブロッカ−） ｆヒ合物−４前掲化合物（１ａ） 化合物−５前掲化合物（３ａ、ただしオキシエチレンノ
、（が２〜４のも のの混合物） 化合物−６前掲化合物（ｔ６ａ） 化合物−７前掲化合物（１７ａ） 化合物−８前掲化合物（８ａ） 化合物−９前掲化合物（１８ｂ） 化合物−１Ｏ前掲化合物（１８ａ） 化合物−１１前掲化合物（５ａ） 化合物−１２ｎＱ掲化合物（５ｂ） 化合物−１３前掲化合物（１ｂ） 化合物−１４前掲化合物（６ａ） 化合物−１５前掲化合物（１４ｃ） 化合物−１６前掲化合物（１５ａ） ブロッキンク効果評価法 試験管に、 ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ溶液２５０ｐ文
、血清溶液１００ＪＪ、文、と記の化合物の溶液（プロ
・ンカー溶液）１００ｇ文、および０．３Ｍグリシン・
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）５５０角文を入
れて総量Ｊ、ｍ！；Ｌの試験液を調製し、これを撹拌混
合したのち、室温にて約１０分間放置した。次に、分光
蛍光光度計６５０−１０ （■日立製作所製）を用い、
励起波長４９２ｎｍそして測定蛍光波長５２５ｎｍにて
その試験液の蛍光強度を測定した。この測定値をｒＨｓ
蛍光強度」と名刺ける。
血清溶液を同量の抗チロキシン血清溶液に変えた以外は
上記と同様に試験液を調製し、これを同様に処理した後
、蛍光強度の測定を行なった。この測定値をｒＡｂ蛍光
強度」と名刺ける。
上記と同様に試験液を調製し、これを同様に処理した後
、蛍光強度の測定を行なった。この測定値をｒＡｂ蛍光
強度」と名刺ける。
なお、」−記のブロッカ−溶液の代りに同量のＰＢＳを
加えた以外は」−記と同様にして試験液を調製し、これ
を対照液とした。この対照液を同様に処理した後、蛍光
強度の測定を行なった。
加えた以外は」−記と同様にして試験液を調製し、これ
を対照液とした。この対照液を同様に処理した後、蛍光
強度の測定を行なった。
それぞれの測定における蛍光強度を第１表に示す。なお
、第１表は、ブロッカ−溶液として前記化合物−７を用
いたＡｂｆｆｌ光強度の測定値を１００とした相対価で
表わしている。
、第１表は、ブロッカ−溶液として前記化合物−７を用
いたＡｂｆｆｌ光強度の測定値を１００とした相対価で
表わしている。
第１表
番号 ＡｂＨｓＡｂ−Ｈｓ
１ ９９ ８８
１１２ １０５ ８６ １９
３ ８ ６ ４２
４４４ １０７ ４３
６４５ １０６ ４
０ ６６６ １０１ ４
０ ６１７ １００ ４
０ ６０８ １０６ ４
４ ６２９ １０４ ４
４ ６０１０ １０７
４６ ６１１１ １００
４３ ５７１２ １０８
４８ ６０１３ １０７
４９ ５８１４ １１２
６３ ４９１５ １０５
４１ ６４１６ １０２
５０ ５２対照液 １０６
１１６ −１０訂・試験液中の化合物の濃度は約
０．１％（重量／容量）である。
１１２ １０５ ８６ １９
３ ８ ６ ４２
４４４ １０７ ４３
６４５ １０６ ４
０ ６６６ １０１ ４
０ ６１７ １００ ４
０ ６０８ １０６ ４
４ ６２９ １０４ ４
４ ６０１０ １０７
４６ ６１１１ １００
４３ ５７１２ １０８
４８ ６０１３ １０７
４９ ５８１４ １１２
６３ ４９１５ １０５
４１ ６４１６ １０２
５０ ５２対照液 １０６
１１６ −１０訂・試験液中の化合物の濃度は約
０．１％（重量／容量）である。
なお、上記の血清溶液あるいは抗チロキシン血詰溶液の
代りに同ｈ１のＰＢＳを加えた以外は同様に各化合物を
添加した試験液を調製し、これをブランクとした。この
ブランクを同様に処理した後イｉ≦光強度の測定を行な
ったところ、その蛍光強度はいずれの化合物においても
約４２（第１表中の数値と同様の相対値）の仙を示した
。
代りに同ｈ１のＰＢＳを加えた以外は同様に各化合物を
添加した試験液を調製し、これをブランクとした。この
ブランクを同様に処理した後イｉ≦光強度の測定を行な
ったところ、その蛍光強度はいずれの化合物においても
約４２（第１表中の数値と同様の相対値）の仙を示した
。
第１表に示した蛍光強度の値は次のような意味を有する
ものと占えられる。
ものと占えられる。
試験液に添加されたＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａの蛍光発
生物質（ＦＩＴＣ）はヨウ素により消光（クエンチング
）される性質がある。そして、分子・中に四個のヨウ素
を含むチロキシンとの結合状態においては、 ＦＩＴ
Ｃとチロキシンは立体的に近接した位置にあるためその
蛍光強度は低いレベルにある（」１記のブラ〉′りの試
験液における蛍光強度参照）。
生物質（ＦＩＴＣ）はヨウ素により消光（クエンチング
）される性質がある。そして、分子・中に四個のヨウ素
を含むチロキシンとの結合状態においては、 ＦＩＴ
Ｃとチロキシンは立体的に近接した位置にあるためその
蛍光強度は低いレベルにある（」１記のブラ〉′りの試
験液における蛍光強度参照）。
このＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４溶液に抗チロキシン血清
（抗体）が添加された場合には、そのチロキシン（Ｔ４
）の大部分は添加された抗チロキシン血清と結合し、蛍
光発生物質（ＦＩＴＣ）とチロキシンとの距離が遠くな
る、すなわち、ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４結合体内にお
けるそれぞれの基の立体的な位置関係において、 ＦＩ
Ｔ’ＣとＴ４との間の距離が離れるため、 ＦＩＴＣは
ヨウ素による消光作用を受けにくくなる。従って、その
溶液の蛍光強度は高くなる（」１記の対照液におけるＡ
ｂ蛍光強度参照）。
（抗体）が添加された場合には、そのチロキシン（Ｔ４
）の大部分は添加された抗チロキシン血清と結合し、蛍
光発生物質（ＦＩＴＣ）とチロキシンとの距離が遠くな
る、すなわち、ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４結合体内にお
けるそれぞれの基の立体的な位置関係において、 ＦＩ
Ｔ’ＣとＴ４との間の距離が離れるため、 ＦＩＴＣは
ヨウ素による消光作用を受けにくくなる。従って、その
溶液の蛍光強度は高くなる（」１記の対照液におけるＡ
ｂ蛍光強度参照）。
また、ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４溶液に、チロキシン結
合性の蛋白質成分を含有する血清が添加された場合にも
、そのチロキシン（Ｔ４）の大部分が蛋白質と結合する
ため、蛍光発生物質（ＦＩＴＣ）はチロキシンのヨウ素
による消光作用を受けに〈〈なり、従ってその溶液の蛍
光強度は上１する（」−記の対照液におけるＨｓ蛍光強
度参照）。
合性の蛋白質成分を含有する血清が添加された場合にも
、そのチロキシン（Ｔ４）の大部分が蛋白質と結合する
ため、蛍光発生物質（ＦＩＴＣ）はチロキシンのヨウ素
による消光作用を受けに〈〈なり、従ってその溶液の蛍
光強度は上１する（」−記の対照液におけるＨｓ蛍光強
度参照）。
一方、ＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａ溶液にチロキシン結合
性の蛋白質成分を含有する血清が添加された場合であっ
てもブロッキング作用の高いブロッカ−が共存している
場合には、そのブロッカ−が優先的に蛋白質と結合する
ため、ＦＩＴＧ−Ｇｌｙ−”１− ａのチロキシン（Ｔ
４）の大部分は血清の蛋白質の影響を受けず、蛍光発生
物質（ＦＩＴＧ ）に近接した立体位置を維持する。従
ってその溶液の蛍光強度は、血清溶液を添加していない
場合のフ１ｆ光強ＩＩ！ｔ（本例では、上記のブランク
の試験液における蛍光強度の約４２に該当）と同等であ
る（変化なし）か、あるいは僅かに高くなる程度である
。これに対して、用いたブロンカーのブロッキング作用
が低い場合には、血清中の蛋白質のうちの少なからぬ部
分がブロンカーと結合せずにチロキシンと結合するため
、チロキシンは蛍光発生物質（ＦＩＴＣ）から離れた位
置に移動するため、ＦＩＴＣはチロキシンの影響を受け
なくなり、従ってその試験液の蛍光強度は上昇する。
性の蛋白質成分を含有する血清が添加された場合であっ
てもブロッキング作用の高いブロッカ−が共存している
場合には、そのブロッカ−が優先的に蛋白質と結合する
ため、ＦＩＴＧ−Ｇｌｙ−”１− ａのチロキシン（Ｔ
４）の大部分は血清の蛋白質の影響を受けず、蛍光発生
物質（ＦＩＴＧ ）に近接した立体位置を維持する。従
ってその溶液の蛍光強度は、血清溶液を添加していない
場合のフ１ｆ光強ＩＩ！ｔ（本例では、上記のブランク
の試験液における蛍光強度の約４２に該当）と同等であ
る（変化なし）か、あるいは僅かに高くなる程度である
。これに対して、用いたブロンカーのブロッキング作用
が低い場合には、血清中の蛋白質のうちの少なからぬ部
分がブロンカーと結合せずにチロキシンと結合するため
、チロキシンは蛍光発生物質（ＦＩＴＣ）から離れた位
置に移動するため、ＦＩＴＣはチロキシンの影響を受け
なくなり、従ってその試験液の蛍光強度は上昇する。
以」−の理由から、本実施例においては、ブロッカ−を
添加した試験液におけるＨｓ蛍光強度がブランクの試験
液の蛍光強度の約４２に近い場合には、そのブロンカー
はブロッキング作用が高いことを意味し、これに対して
、ブロッカ−を添加した試験液におけるＨｓ蛍光強度か
、ブロッカ−が添加されていない対照液のＨｓ蛍光強度
（本例では、上記の対照液における蛍光強度の約１１６
に該当）に近い場合には、そのブロッカ−の・プロ。
添加した試験液におけるＨｓ蛍光強度がブランクの試験
液の蛍光強度の約４２に近い場合には、そのブロンカー
はブロッキング作用が高いことを意味し、これに対して
、ブロッカ−を添加した試験液におけるＨｓ蛍光強度か
、ブロッカ−が添加されていない対照液のＨｓ蛍光強度
（本例では、上記の対照液における蛍光強度の約１１６
に該当）に近い場合には、そのブロッカ−の・プロ。
キング作用は低いことを意味するものと考えられる。
なお、本実施例では、ブロッカ−として用いた化合物と
抗ヂロキシン血清とがＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４溶液の
蛍光強度に与える影響をそれぞれのブロッカ−について
測定し、そこで得られたＡｂ蛍光強度をそのソロツカ−
化合物添加系の基準（ｉ＆として、その値とＨｓ蛍光強
度との差（Ａｂ−Ｈｓ）を算出することにより、プロ・
ンカー化合物の蛋白質に対するフロンキング作用を更に
厳密に比較する数台（ｉを（’４た。すなわち第１表に
おζするＡｂ−Ｈｓの欄に記載された数値は、パックグ
ラウンドを補償したプロ・ンキング作用を意味する数値
であり、その数値が高い程ブロッキング作用が高いこと
を意味するものと考えられる。
抗ヂロキシン血清とがＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４溶液の
蛍光強度に与える影響をそれぞれのブロッカ−について
測定し、そこで得られたＡｂ蛍光強度をそのソロツカ−
化合物添加系の基準（ｉ＆として、その値とＨｓ蛍光強
度との差（Ａｂ−Ｈｓ）を算出することにより、プロ・
ンカー化合物の蛋白質に対するフロンキング作用を更に
厳密に比較する数台（ｉを（’４た。すなわち第１表に
おζするＡｂ−Ｈｓの欄に記載された数値は、パックグ
ラウンドを補償したプロ・ンキング作用を意味する数値
であり、その数値が高い程ブロッキング作用が高いこと
を意味するものと考えられる。
ちなみに、本実施例１における各ブロンカーのブロッキ
ング作用の評価結果は、後述の実施例４に見られるよう
に、たとえば「ホモジニアス酵素イムノアンセイへの応
用」における各ブロッカ−の評価結果と強い相関関係に
あることが確かめられている。
ング作用の評価結果は、後述の実施例４に見られるよう
に、たとえば「ホモジニアス酵素イムノアンセイへの応
用」における各ブロッカ−の評価結果と強い相関関係に
あることが確かめられている。
［実施例２］ 蛍光分析法によるノロツカ−の評価 −
血清濃度の高い試料液に おけるソ゛ロッカーの計イ曲 試験管に０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，０）を８００ μ、 Ｕ 取’Ｊ１．＝ｈを
ｌｌｊ発乾固した。
血清濃度の高い試料液に おけるソ゛ロッカーの計イ曲 試験管に０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，０）を８００ μ、 Ｕ 取’Ｊ１．＝ｈを
ｌｌｊ発乾固した。
Ｊ−記の試験管に、
ヒト血清（コンモーラ：１コ水製薬■商標）８００ｐＬ
文 ； ０．３Ｍのクリシン争水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ
９、０） ニＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａを０．５ルＭの
濃度に溶解して調製したＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ４溶液５
０ル文； ０．２５Ｍ水酎水酸化ナトリウム緩衝液２表に記載の化
合物（ブロッカ−）を５０ｍＭの濃度に溶解して調製し
たブロッカ−溶液５０ｊＬ文；および、 抗チロキシン血清１００に文。
文 ； ０．３Ｍのクリシン争水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ
９、０） ニＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ａを０．５ルＭの
濃度に溶解して調製したＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ４溶液５
０ル文； ０．２５Ｍ水酎水酸化ナトリウム緩衝液２表に記載の化
合物（ブロッカ−）を５０ｍＭの濃度に溶解して調製し
たブロッカ−溶液５０ｊＬ文；および、 抗チロキシン血清１００に文。
を入れ、総量を１ ｍ ｆＬの試験液とした。これを撹
拌混合したのち、室温にて約１０分間放置した。
拌混合したのち、室温にて約１０分間放置した。
次に、分光蛍光光度計６５０−１０ （■日立製作所製
）を用い、励起波長４９２ ｎｍそして測定蛍光波長５
２５ｎｍにてその試験液の蛍光強度を測定した。このＭ
ＩＩ定値をｒＨｓ・Ａｂ蛍光強度」と名付ける。
）を用い、励起波長４９２ ｎｍそして測定蛍光波長５
２５ｎｍにてその試験液の蛍光強度を測定した。このＭ
ＩＩ定値をｒＨｓ・Ａｂ蛍光強度」と名付ける。
抗チロキシン血清溶液を同量のＰＢＳに変えた以外は上
記と同様に試験液を調製し、これを同様に処理した後、
蛍光強度の測定を行なった。この′Ａ１１１定値を［Ｈ
ｓ−ＰＢＳ蛍光強度」と名付ける。
記と同様に試験液を調製し、これを同様に処理した後、
蛍光強度の測定を行なった。この′Ａ１１１定値を［Ｈ
ｓ−ＰＢＳ蛍光強度」と名付ける。
それぞれの測定における蛍光強度を第２表に示す。なお
、第２表は、実施例１の化合物−７のブロッカ−溶液に
おけるＡｂ蛍光強度の測定値を１００とした相対値で表
わしている。
、第２表は、実施例１の化合物−７のブロッカ−溶液に
おけるＡｂ蛍光強度の測定値を１００とした相対値で表
わしている。
第２表
番号 Ｈｓ拳Ａｂ Ｈｓ＠ＰＢＳ Ｈｓ＊ Ａｂ
−Ｈｓ争ＰＢＳ２ ７７ ７７
０３ ７６ ７４．５
１．５４ ６５ ５７
８５ ６６ ５５．５ ＩＯ，
，５６６６，５４６２０，５ 対照液 ８２ ４６ −２ 計：第２表に記載した化合物番号は実施例１に記載した
化合物番号に対応するものである。
−Ｈｓ争ＰＢＳ２ ７７ ７７
０３ ７６ ７４．５
１．５４ ６５ ５７
８５ ６６ ５５．５ ＩＯ，
，５６６６，５４６２０，５ 対照液 ８２ ４６ −２ 計：第２表に記載した化合物番号は実施例１に記載した
化合物番号に対応するものである。
第２表に示したＨｓφＡｂ蛍光強度とＨｓ拳ＰＢ Ｓ
ｉｉｆ光強度との差（Ｈｓ＊＾ｂ −Ｈｓ−ＰＢＳ ）
は、実施例１に記載した理由と同様な理由により、その
数値が高い程、その化合物のブロッキング作用が高いこ
とを意味する。
ｉｉｆ光強度との差（Ｈｓ＊＾ｂ −Ｈｓ−ＰＢＳ ）
は、実施例１に記載した理由と同様な理由により、その
数値が高い程、その化合物のブロッキング作用が高いこ
とを意味する。
［実施例３］ 蛍光分析法によるブロッカ−の評価 −
ブロッカ−の共存下にお けるチロキシンの検量線の作成 試験管に、 ０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，０）にＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４をｏ、ｉ用Ｍの濃度
に溶解して調製したＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ４溶液２５０
に文； ０．３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで２００倍に
希釈した抗チロキシン血清を１００ ル父 ； ０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，０）４５０用交； ０．０５Ｍ水酸化すトリウム水溶液に下記の化合物（ブ
ロッカ−）を１％（重量／容量）濃度に溶解して調製し
たプロ、２カー溶液１００メＬ交；および、 種々の濃度のチロキシンを添加したヒト血清１００メＬ
３コ一、 を入れ、総値を１ｍＭの試験液とした。これをＩＷ拌混
合したのち、室温にて約１０分間放置した。
ブロッカ−の共存下にお けるチロキシンの検量線の作成 試験管に、 ０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，０）にＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ ４をｏ、ｉ用Ｍの濃度
に溶解して調製したＦＩＴＣ−Ｇｌｙ−Ｔ４溶液２５０
に文； ０．３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで２００倍に
希釈した抗チロキシン血清を１００ ル父 ； ０．３Ｍのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，０）４５０用交； ０．０５Ｍ水酸化すトリウム水溶液に下記の化合物（ブ
ロッカ−）を１％（重量／容量）濃度に溶解して調製し
たプロ、２カー溶液１００メＬ交；および、 種々の濃度のチロキシンを添加したヒト血清１００メＬ
３コ一、 を入れ、総値を１ｍＭの試験液とした。これをＩＷ拌混
合したのち、室温にて約１０分間放置した。
次に、分光蛍光光度計６５０−１０（■ＩＪ立製作所製
）を用い、励起波長４９２ｎｍそして測定蛍光波長５２
５ｎｍにてその試験液の蛍光強度を測定した。
）を用い、励起波長４９２ｎｍそして測定蛍光波長５２
５ｎｍにてその試験液の蛍光強度を測定した。
なおに記の血清は、Ｍ ｉ ｔｓｕｍａらの方法［Ｔ、
旧ｔｓｕｍａ、 Ｊ、Ｃｏ１ｕｃｃｉ、 Ｌ、Ｓｈｅｎ
ｋｍａｎ ＆ Ｃ，Ｓ、Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ。
旧ｔｓｕｍａ、 Ｊ、Ｃｏ１ｕｃｃｉ、 Ｌ、Ｓｈｅｎ
ｋｍａｎ ＆ Ｃ，Ｓ、Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ。
Ｂｉｎｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
ｓ、 ４８．２１０７−２＋１３ （１９７２）］に
従って、活性炭を用いて血清中に存在する生体由来のチ
ロキシンを除去して用いた。
ａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
ｓ、 ４８．２１０７−２＋１３ （１９７２）］に
従って、活性炭を用いて血清中に存在する生体由来のチ
ロキシンを除去して用いた。
試料液中のチロキシンの最終濃度を横軸にとり縦軸に蛍
光強度の′Ａｔ１ｌ定値を、チロキシンの最終濃度が２
１Ｌｇ／ｄ５．の時の測定イＩｉ′１を１００としたと
きの相対値により表示し、それぞれのブロッカ−化合物
について検量線を作成した。
光強度の′Ａｔ１ｌ定値を、チロキシンの最終濃度が２
１Ｌｇ／ｄ５．の時の測定イＩｉ′１を１００としたと
きの相対値により表示し、それぞれのブロッカ−化合物
について検量線を作成した。
イリられた検量線をｉ１図に示す。木実施例において用
いたブロッカ−化合物およびそれぞれに対応する検量線
は次の通りである。なお、化合物番号は実施例１に記載
した化合物番号に対応するものである。； 化合物−３（ＡＮＳ） −検量線３ 化合物−４−検量線４ 化合物−５−検量線５ 化合物−６−検量線６ 化合物−７−検量線７ 水（対照） −検量線Ｗ 第１図に示された検量線のうち本発明で規定した化合物
（化合物−４〜化合物−７）を共存させた場合の検量線
は、測定レンジか広いことがわ力）る。この１ｌｌ１１
定レンジが広いとの点は、高い測定精度が得られること
を意味するものである。
いたブロッカ−化合物およびそれぞれに対応する検量線
は次の通りである。なお、化合物番号は実施例１に記載
した化合物番号に対応するものである。； 化合物−３（ＡＮＳ） −検量線３ 化合物−４−検量線４ 化合物−５−検量線５ 化合物−６−検量線６ 化合物−７−検量線７ 水（対照） −検量線Ｗ 第１図に示された検量線のうち本発明で規定した化合物
（化合物−４〜化合物−７）を共存させた場合の検量線
は、測定レンジか広いことがわ力）る。この１ｌｌ１１
定レンジが広いとの点は、高い測定精度が得られること
を意味するものである。
［実施例４コ ホモジニアス酵素イムノアンセイへの応
用 １）チロキシンとリンゴ酸脱水素酵素との結合物の調製 乾燥したジメチルホルムアミド２００角文中（こ１０ｍ
ｇのＴ ａ −ＭＥＭＩＤＡを溶角了し、これ番こＮ−
ヒドロキシコハク６衾イミド１．５ｍｇを力（１え、ン
ｋｌ令ドにさらに２．５ｍｇのｌ−ｘチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル て４°Ｃで一夜反応させて活性エステル溶液を調製した
。
用 １）チロキシンとリンゴ酸脱水素酵素との結合物の調製 乾燥したジメチルホルムアミド２００角文中（こ１０ｍ
ｇのＴ ａ −ＭＥＭＩＤＡを溶角了し、これ番こＮ−
ヒドロキシコハク６衾イミド１．５ｍｇを力（１え、ン
ｋｌ令ドにさらに２．５ｍｇのｌ−ｘチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル て４°Ｃで一夜反応させて活性エステル溶液を調製した
。
別に、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＩ、ブタ心筋ミトコン
ドリア由来、ベーリンカーマン／＼イム社ｙ ） ２
５ ｍ ｇを、０ 、 ０ ５ Ｍ炭ＭすトリウムＳｄ
ｌｌ’ｊ液（ｐＨ９ 、２）５ｍＭに溶解し、氷冷ドに
１−記の活性エステル溶液をｌＯｐ文／分で添加した。
ドリア由来、ベーリンカーマン／＼イム社ｙ ） ２
５ ｍ ｇを、０ 、 ０ ５ Ｍ炭ＭすトリウムＳｄ
ｌｌ’ｊ液（ｐＨ９ 、２）５ｍＭに溶解し、氷冷ドに
１−記の活性エステル溶液をｌＯｐ文／分で添加した。
添加綿ｒ後、反応液を水冷Ｆで２時間攪拌し、次いでセ
ファデフクスＧ − ５ ０ （商標名：ファルマシア
社製）を用いてゲル濾過し、ＭＤＩの分画を得た。この
分画は、もとのＭＤＨの１０〜２０％の酵素活性を示し
た。
ファデフクスＧ − ５ ０ （商標名：ファルマシア
社製）を用いてゲル濾過し、ＭＤＩの分画を得た。この
分画は、もとのＭＤＨの１０〜２０％の酵素活性を示し
た。
２）ヒト血清の調製
実施例３に記載したＭｉｔｓｕｍａ らの方法に従って
、活性炭を用いてｎｕ清中に存在する生体由来のチロキ
シンを除去したヒト血清にチロキシンを濃度が５、ｌＯ
および２０ｐ．ｇ／ｄ９となるように添加してチロキシ
ン含有ヒト仙消を調製した。
、活性炭を用いてｎｕ清中に存在する生体由来のチロキ
シンを除去したヒト血清にチロキシンを濃度が５、ｌＯ
および２０ｐ．ｇ／ｄ９となるように添加してチロキシ
ン含有ヒト仙消を調製した。
３）ホモジニアス酵素イムノアッセイへの応用試験管に
上記のヒト血清を５０ｇ’ｌとり、これに、下記のブロ
ッカ−化合物を０．３Ｍグリシン・水酪化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，０）に濃度５ｍＭとなるように溶解させ
た溶液５０ル文を加えて撹拌し、約１０分間室温に放置
した。これに抗チロキシン血清２川文およびβ−ＮＡＤ
（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を８
０ｍｇ含む０．１５Ｍグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ５，
５）を１ｍＪｌｊ加えて攪拌し、約５分間室温に放置し
た。さらにこれに、０．３ＭのＬ−リンゴ酎を含む０．
３Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，３）
を５５０弘立添加して総量１６５０ル文とし、よく攪拌
した。
上記のヒト血清を５０ｇ’ｌとり、これに、下記のブロ
ッカ−化合物を０．３Ｍグリシン・水酪化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，０）に濃度５ｍＭとなるように溶解させ
た溶液５０ル文を加えて撹拌し、約１０分間室温に放置
した。これに抗チロキシン血清２川文およびβ−ＮＡＤ
（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を８
０ｍｇ含む０．１５Ｍグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ５，
５）を１ｍＪｌｊ加えて攪拌し、約５分間室温に放置し
た。さらにこれに、０．３ＭのＬ−リンゴ酎を含む０．
３Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，３）
を５５０弘立添加して総量１６５０ル文とし、よく攪拌
した。
上記の溶液についてＵＶ−２４０型分光光度計（■島津
製作所製）を用いて波長３４０ｎｍにおける吸光度の変
化を測定した。
製作所製）を用いて波長３４０ｎｍにおける吸光度の変
化を測定した。
初期吸光度と１５分後の吸光度の差をとり、これらの吸
光度差をプロットして第２図に示すグラフを得た。
光度差をプロットして第２図に示すグラフを得た。
本実施例において用いたブロッカ−化合物およびそれぞ
れに対応する応答曲線は次の通りである。なお、化合物
番号は実施例１に記載した化合物番号に対応するもので
ある。； 化合物−４−応答曲線４ 化合物−５−応答曲線５ 化合物−６−応答曲線６ ＰＢＳ （対照）−応答曲線ＰＢＳ 第２図に示された応答曲線のうち本発明で規定した化合
物（化合物−４〜化合物−６）を用いた場合の応答曲線
は測定レンジが広いこと、すなわち、チロキシンの添加
量に応じて高いレベルで応答することがわかる。この点
は、高い測定精度が得られることを意味するものである
。すなわち、本発明において規定したブロッカ−に含ま
れるこれらの化合物は酵素活性を阻害することもなく、
高い精度の定量反応に利用することがｏｆ能であること
がわかる。
れに対応する応答曲線は次の通りである。なお、化合物
番号は実施例１に記載した化合物番号に対応するもので
ある。； 化合物−４−応答曲線４ 化合物−５−応答曲線５ 化合物−６−応答曲線６ ＰＢＳ （対照）−応答曲線ＰＢＳ 第２図に示された応答曲線のうち本発明で規定した化合
物（化合物−４〜化合物−６）を用いた場合の応答曲線
は測定レンジが広いこと、すなわち、チロキシンの添加
量に応じて高いレベルで応答することがわかる。この点
は、高い測定精度が得られることを意味するものである
。すなわち、本発明において規定したブロッカ−に含ま
れるこれらの化合物は酵素活性を阻害することもなく、
高い精度の定量反応に利用することがｏｆ能であること
がわかる。
第１図は、ブロッカ−の共イｒドにおけるチロキシンの
検量線（蛍光分析法による）の例を示し、そして第２図
は、ホモジニアス酵素イムノアッセイにおけるチロキシ
ンの添加量に対するブロッカ−の共存下での応答曲線の
例を示すものである。 特許出願人 富士写真フィルム株式会社代理人 弁
理士 柳川泰男 す 値 引 ヒ ÷ロ青シン恣加−に、（ＪＪ（１／ｄｉ）第１図
検量線（蛍光分析法による）の例を示し、そして第２図
は、ホモジニアス酵素イムノアッセイにおけるチロキシ
ンの添加量に対するブロッカ−の共存下での応答曲線の
例を示すものである。 特許出願人 富士写真フィルム株式会社代理人 弁
理士 柳川泰男 す 値 引 ヒ ÷ロ青シン恣加−に、（ＪＪ（１／ｄｉ）第１図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■。蛋白質を含有する生物体由来の試料液中に含まれて
おり、かつ該蛋白質に対する結合能を有する低分子量成
分を定量するに際して、該試料液中に一般式（Ｉ）： Ｘ （Ｙ）Ｐ ＳＯ３Ｍ （Ｉ）（ここて、Ｍ
は水素イオン、アルカリ金属イオン、もしくはアンモニ
ウムイオンであり；Ｘは直鎖もしくは分岐を有する炭素
原子ａ ６個以上のアルキル基、アルケニル基、フッ素
化アルキル基もしくはフッ素化アルケニル基であり；Ｙ
は二価の有機残基であり；そしてｐは０もしくは１であ
る）で表わされる化合物を共存させることを特徴とする
蛋白質含有試料液中の低分子量成分の定量法。 ２゜低分子量成分の定量を抗原・抗体反応を利用して行
なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白
質含有試料液中の低分子量成分の定量法。 ３゜試料液が、血液、血清、血しょう、尿、骨髄液、も
しくはそれらの処理物であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の蛋白質含有試料液中の低分子量成分
の定量法。 ４゜低分子単成分が、甲状腺ホルモンであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白質含有試料液中
の低分子量成分の定量法。 ５゜蛋白質が、アルラミン、グロブリンもしくはプレア
ルブミンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の蛋白質含有試料液中の低分子単成分の定量法。 ６゜一般式（１）のＸが、直鎖もレイは分岐を有する炭
素原ｆ数８〜２２個のアルキル基、アルケニル基、フン
素化アルキル基、もしくはフ・ン素化アルケニル基でち
ることを特徴とするＩＩ ｇｌ請求の範囲第１項記載の
蛋白質台イ１試料液中の低分子が成分の定量法。 ７゜一般式（Ｉ）のｐが０である化合物を用いることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白質含有試料
液中の低分子￥成分の定量法。 ８゜一般式（Ｉ）のｐが１で、Ｙが一価もしくは二価の
力香環を含む二価の有機残基であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の蛋白質含有゛試料液中の低分
子量成分の定量法。 ９゜一般式（Ｉ）のｐが１で、Ｙが一画もしくは二価の
ベンセン環もしくはナツタ１／ン環を含む一価の有機残
基であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
蛋白質含有試料液中の低分子量成分の定量法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57132252A JPS5923252A (ja) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | チロキシンの蛍光測定もしくは比色による定量分析法 |
| EP83107530A EP0100543B1 (en) | 1982-07-30 | 1983-07-30 | Method for quantitative analysis of low molecular weight components contained in protein-containing liquid sample |
| DE8383107530T DE3367282D1 (en) | 1982-07-30 | 1983-07-30 | Method for quantitative analysis of low molecular weight components contained in protein-containing liquid sample |
| US07/036,143 US4771008A (en) | 1982-07-30 | 1987-04-06 | Method for quantitative analysis of thyroid hormone |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57132252A JPS5923252A (ja) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | チロキシンの蛍光測定もしくは比色による定量分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5923252A true JPS5923252A (ja) | 1984-02-06 |
| JPH0376422B2 JPH0376422B2 (ja) | 1991-12-05 |
Family
ID=15076924
Family Applications (1)
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| JP57132252A Granted JPS5923252A (ja) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | チロキシンの蛍光測定もしくは比色による定量分析法 |
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Citations (1)
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| JPS58187862A (ja) * | 1982-04-27 | 1983-11-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定改良剤および改良方法 |
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-
1987
- 1987-04-06 US US07/036,143 patent/US4771008A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3367282D1 (en) | 1986-12-04 |
| EP0100543A1 (en) | 1984-02-15 |
| JPH0376422B2 (ja) | 1991-12-05 |
| EP0100543B1 (en) | 1986-10-29 |
| US4771008A (en) | 1988-09-13 |
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