DE69722917T2

DE69722917T2 - Reagenzien für tests für mycophenolsäure

Info

Publication number: DE69722917T2
Application number: DE69722917T
Authority: DE
Inventors: A. Mark STAPLES; J. Carolyn HALEY; F. Richard PARRISH; W. Wesley ZMOLEK
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1996-07-18
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-07-18
Also published as: JP3706895B2; JP2001513877A; US20050191762A1; ES2198583T3; DE69722917D1; CA2231775A1; EP0880705B1; US6887669B1; WO1998003877A1; US6171801B1; EP0880705A1

Description

1. Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Liganden/Rezeptor-Bindungsassaytechniken. Die Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration eines Ligandanalyten, bei dem es sich um ein Mitglied eines aus dem Liganden und seinem komplementären Rezeptor bestehenden spezifischen Bindungspaars handelt („sbp-Mitglied"), in Serum oder anderen Körperflüssigkeiten ist in zunehmendem Maße auf spezifische Bindungsassaytechniken angewiesen. Diese Techniken beruhen auf der Bildung eines Komplexes zwischen sbp-Mitgliedern, bei dem der eine oder der andere des Komplexes mit einer Gruppierung, die entweder direkt oder indirekt ein Signal produziert, markiert sein kann. Bei kompetitiven spezifischen Bindungsassaytechniken konkurriert ein in einer auf seine Anwesenheit getesteten Flüssigkeitsprobe mit einer bekannten Menge an markiertem Analyt um die Bindung an eine begrenzte Menge eines komplementären sbp-Mitglieds. Somit variiert die Menge an an das sbp-Mitglied gebundenem markiertem Analyt umgekehrt proportional zu der Menge an Analyt in der Probe. Bei immunometrischen Assays handelt es sich bei dem Analyten normalerweise um einen Liganden, wobei in dem Assay ein komplementäres sbp-Mitglied sowie ein zweiter markierter Rezeptor, üblicherweise ein Antikörper, eingesetzt werden. In einem solchen Assay steht die Menge an mit dem Komplex assoziierten markiertem Rezeptor in direkter Beziehung zu der Menge an Analytsubstanz in der Flüssigkeitsprobe. Zahlreiche Abwandlungen des oben Gesagten werden ebenfalls beim Nachweis von Analyten verwendet, wie z. B. die Verwendung eines Rezeptors als Rezeptor für den Analyten oder andere Bindungspaare, wie z. B. Avidin-Biotin, u. ä.
Die Anwesenheit eines oder mehrerer störender Substanzen, wie etwa von Proteinen, z. B. Albumin, die an den betreffenden Analyten oder an ein in einem Assay für einen solchen Analyten eingesetztes Reagens in nicht spezifischer Weise binden, kann einen schwerwiegenden negativen Faktor für den quantitativen Charakter eines Liganden/Rezeptor-Assays darstellen. Der Analyt liegt normalerweise in sehr geringen Mengen vor. Eine Störsubstanz kann in größerer Menge vorliegen und an eine signifikante Anzahl von Analytmolekülen binden und somit die Empfindlichkeit des Assays herabsetzen. In vielen Situationen variiert die Menge an Störsubstanz von Probe zu Probe, wodurch ein exakter Bezug zu einem Standard bzw. einem Kalibrierungsmittel, der bzw. das typischerweise verwendet wird, um die Übersetzung des beobachteten Signals in die Konzentration des Analyten zu ermöglichen, verhindert wird. Um die Genauigkeit eines Assays zu verbessern, ist es wünschenswert, die Wirkung der Störsubstanz auf das beobachtete Signal zu verringern oder vollständig zu eliminieren.
Mycophenolsäure (Mycophenolic Acid, „MPA") wird durch die Fermentation mehrerer Penicilliumspezies erzeugt. Sie besitzt ein breites Wirkspektrum, eine spezifische Wirkungsweise und wird in großen Dosierungsmengen bei minimalen Nebenwirkungen vertragen, Epinette, et al., Journal of the American Academy of Dermatology 17(6): 962–71 (1987). Es konnte gezeigt werden, daß MPA Antitumor-, antivirale, Anti-Psoriasis, immunsuppressive und entzündungshemmende Aktivitäten, Leet, et al., Pharmaceutical Research 7(2): 161–166 (1990), ebenso wie antibakterielle und Anti-Pilz-Aktivitäten besitzt, Nelson, et al., Journal of Medicinal Chemistry 33(2): 833–838 (1990). Sie inhibiert Inosinmonophosphat-Dehydrogenase, ein Enzym in der de-novo-Synthese von Purinnukleotiden (Wu, Perspectives in Drug Discovery and Design (1994) 2: 185–204). Da T- und B-Lymphozyten größtenteils von dieser de-novo-Synthese abhängig sind, kann mit der MPA die Lymphozytenproliferation, die einen Hauptfaktor bei der Immunantwort darstellt, inhibiert werden.
Der Morpholinoethylester der MPA, (E)-6-(1,3-Dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-5-isobenzofuranyl)-4-methyl-4-hexensäure-morpholinoethylester (MPA-M") wird in vivo rasch zu MPA hydrolysiert. Durch Verabreichung der MPA in Form dieses Esters wird die Bioverfügbarkeit der MPA enorm verbessert.
Da es sich bei der MPA um ein wirkungsvolles biologisch aktives Material handelt, könnte ein effektiver Immunassay für die Überwachung ihrer Bioverfügbarkeit sinnvoll sein. Darüber hinaus könnte die Überwachung therapeutischer Medikamentenniveaus, d.h. der für eine ausreichende Immunsuppression notwendigen optimalen Medikamentenniveaus, von Wichtigkeit sein. Da MPA-M rasch zu MPA hydrolysiert wird, würde ein Assay für MPA einen Weg zur Regulierung und Optimierung von MPA-M-Dosierungen ermöglichen. Es ist bekannt, daß MPA im Plasma in hoch proteingebundener Form vorliegt (83 – >98%) und daß alle Faktoren, die die Plasmaproteinkonzentrationen in Patienten verändern, die Genauigkeit eines MPA-Assays beeinflussen könnten (Shaw, et al., Theraoeutic Drug Monitoring (1995) 17: 690–699).
Mit MPA und Cyclosporin bzw. Tacrolimus behandelten Patienten können gleichzeitig andere Medikamente, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Azathioprin, Prednison, Methylprednisolon, antivirale Mittel, Antibiotika, Antipilzmittel, Herzkreislaufmittel, Antidiabetika und Diuretika verabreicht werden. Viele dieser Medikamente wirken sich nachhaltig auf den Stoffwechsel aus und führen zu Konzentrationsveränderungen bei verschiedenen Serum/ Plasmabestandteilen. Diese Bestandteile besitzen daher ein Potential, die Bestimmung der MPA in der Patientenzielgruppe entweder direkt oder indirekt zu stören.
Serumassays werden im allgemeinen durch die Schwierigkeit hinsichtlich Plasmaproteinkonzentrationsschwankungen in Patientengruppen eingeschränkt. Weiterhin können Unterschiede bei den Probenmatrixbestandteilen, durch die die freien und gebundenen MPA-Fraktionen verändert werden, wie z. B. der Albuminkonzentration, zu ungenauen Immunassayergebnissen führen, wobei keine MPA aus ihrer gebundenen Fraktion freigesetzt wird. Insbesondere wäre, je nach der Proteinkonzentration der Probe, die scheinbare Konzentration der MPA höher oder niedriger. So sind beispielsweise in der frühen Posttransplantationsphase Albuminkonzentrationen gegenüber einer Eichsubstanz mit normalen Plasmaproteinkonzentrationen vergleichsweise niedrig, so daß die MPA-Quantifizierung dieser Patientenproben hohe Werte zeigen könnte. Eine Reihe von Faktoren, einschließlich der Zeit nach der Transplantation und metabolischer Unterschiede aufgrund von gleichzeitig verabreichten Medikamenten oder von Krankheitszuständen des Patienten, können zu abnormalen Proteinkonzentrationen führen. Durch diese abnormalen Proteinkonzentrationen kann das Verhältnis von freier zu gebundener MPA verändert und damit die Genauigkeit der Immunassayergebnisse beeinflußt werden. Die Schwankung in der Gewinnung in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration der Proben verhindert die Auswahl einer einzigen Durchschnittsproteinkonzentration für Eichsubstanzen, mit der alle Proben repräsentiert sind.
Salicylat erhöht bekanntermaßen den Anteil der freien MPA in normalem menschlichem Plasma, wenn es in Konzentrationen vorliegt, die bei chronischer Verabreichung von Aspirin beobachtet werden (Nowak, infra). Es wurde jedoch von uns gefunden, daß die Verwendung von Salicylat als Freisetzungsmittel zu einem 25–50%igen Abfall in der Gesamtdosis-Wirkungskurve bei einem MPA-Enzym-Immunassay führt. Es ist ebenfalls bekannt, daß 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-(ANS) als Freisetzungsmittel in Immunassays fungiert (Nerli, et al., Arch Int Physiol Biochim Biophys (1994) 102(1): 5–8 und Seth, et al., Clin Chem (1975) 21(10): 1406–1413. ANS besitzt jedoch Nachteile aufgrund ihrer Hintergrundabsorption bei 340 nm und ihrer Anfälligkeit gegenüber Abbau durch Licht. Die Hintergrundabsorption ist besonders nachteilig in Enzym-Immunassays. ANS wurde jedoch in gewissen Enzymassays unter Bedingungen verwendet, bei denen ihre Nachteile toleriert werden können.
Durch die vorliegende Erfindung werden die Mängel der obigen, als Freisetzungsmittel in Assays für Liganden verwendeten bekannten Verbindungen vermieden.
2. Beschreibung des Standes der Technik
In Nowak et al., Clin. Chem. (1995) 41(7): 1011–1017 wird die Bindung der Mycophenolsäure an menschliches Serumalbumin: Charakterisierung und Zusammenhang mit der Pharmakodynamik erörtert.
In Langman, et al., Therapeutic Drug Monitoringt (1994) 16: 802–807 wird die Blutverteilung der Mycophenolsäure erörtert.
Aus der europäischen Patentschrift 0 218 309 B1 ist ein Verfahren zur Messung freier Liganden in biologischen Flüssigkeiten bekannt. Natriumsalicylat und 2,4-Dinitrophenol wurden verwendet, um die Bindung von markierten Triiodthyronin- und Tetraiodthyroninanalogen an Albumin und Thyroxin-bindendes Präalbumin zu verhindern.
Aus der europäischen Patentanmeldung 0 392 332 A2 sind ein Fluoreszenzpolarisations-Imunoassay und Reagenzien dafür bekannt. Dabei wurden verschiedene Verbindungen zur Umwandlung eines Marihuana-Metaboliten, der an Serumalbumin und anderen, im Urin vorhandenen Proteinen gebunden war, in seine freie Form offenbart. Zu diesen Verbindungen gehörten unter anderem ANS, Salicylsäure und 5-Methoxysalicylsäure.
Aus der WO 96/02004 sind Antikörper bekannt, die zur Verwendung in Assays für Mycophenolsäure (MPA} geeignet sind. Dabei werden ebenfalls Konjugate von Markierungen und MPA bzw. MPA-Analogen ebenso wie ein Verfahren zur Bestimmung von MPA unter Verwendung der Antikörper und/oder Konjugate offenbart.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Freisetzung von Mycophenolsäure aus einem Komplex davon. Bei dem Verfahren wird ein Medium, von dem vermutet wird, daß es einen solchen Komplex enthält, mit einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel:
worin R¹ Alkyl; R² Wasserstoff oder Alkyl; X O, S oder N bedeutet; n gleich 1 ist, wenn X für O oder S steht, und n gleich 2 ist, wenn X für N steht; und m 1 oder 2 ist (Verbindung I), in Kontakt gebracht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einer Verbesserung eines Verfahrens zur Bestimmung von Mycophenolsäure in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Mycophenolsäure enthält. In dem Verfahren wird (a) die Probe sowie ein Bindungspartner für Mycophenolsäure in einem Assaymedium bereitgestellt und (b) die Bindung des Bindungspartners and Mycophenolsäure nachgewiesen. Die Verbesserung besteht darin, daß das Assaymedium die Verbindung I in einer zur Verbesserung der Genauigkeit der Bestimmung ausreichenden Menge enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Verbesserung eines Verfahrens zur Messung der Menge an Mycophenolsäure in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Mycophenolsäure sowie endogene Proteine, die an die Mycophenolsäure binden, enthält. Bei dem Verfahren werden (a) in einem wäßrigen Medium die Probe, an eine nachweisbare Markierung konjugierte Mycophenolsäure und ein zur Bindung an Mycophenolsäure fähiger Antikörper zusammengegeben und (b) die Wirkung der Probe auf die Aktivität der Markierung bestimmt. Die Verbesserung besteht darin, daß das Medium eine Verbindung der Formel:
worin R¹ Alkyl und R² Wasserstoff oder Alkyl bedeutet (Verbindung II), in einer Menge enthält, die die Freisetzung der Mycophenolsäure aus den endogenen Proteinen bewirkt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin einen Kit zur Durchführung eines Assays zur Bestimmung von Mycophenolsäure, in dem in abgepackter Form ein zur Bindung an Mycophenolsäure fähiger Antikörper, eine an eine nachweisbare Markierung gebundene Mycophenolsäure enthaltende Verbindung sowie die Verbindung I kombiniert sind.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Vor Beschreibung der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen soll eine Reihe von Begriffen definiert werden.
Mycophenolsäure kann direkt in einer Probe, wie z. B. biologischem Gewebe, einschließlich Körperflüssigkeiten, aus einem Wirt gefunden werden. Die Probe läßt sich direkt untersuchen oder kann vorbehandelt werden, um die Mycophenolsäure durch Abtrennung von unerwünschtem Material leichter nachweisbar zu machen. Die Probe kann vorbehandelt werden, um Zellen zu trennen oder zu lysieren; Proteine auszufällen, zu hydrolysieren oder zu denaturieren; Lipide zu hydrolysieren; Mycophenolsäure zu solubilisieren; u. ä. Eine solche Vorbehandlung kann, ohne darauf beschränkt zu sein: eine Zentrifugation; eine Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise einem Alkohol, wie z. B. Methanol; und eine Behandlung mit Detergenzien umfassen. Die Probe läßt sich in jedem herkömmlichen Medium, das den Assay nicht stört, präparieren. Dabei ist ein wäßriges Medium bevorzugt.
Weiterhin kann Mycophenolsäure bestimmt werden, indem ein Mycophenolsäure-anzeigendes Mittel, wie z. B. ein zur Mycophenolsäure komplementäres Mitglied eines spezifischen Bindungspartners, dessen Anwesenheit nur dann nachgewiesen wird, wenn Mycophenolsäure in einer Probe vorhanden ist, nachgewiesen wird. Somit wird das Mycophenolsäure-anzeigende Mittel zum Analyten, der in einem Assay nachgewiesen wird.
Das biologische Gewebe umfaßt aus einem Organ oder einem anderen Körperteil eines Wirts herausgeschnittenes Gewebe sowie Körperflüssigkeiten, z. B. Urin, Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, Samenflüssigkeit, Stuhl, Sputum, Liquor, Tränenflüssigkeit, Schleim, u. ä. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Plasma oder Serum.
Mycophenolsäureester -- umfaßt, ohne darauf beschränkt zu sein, Ester der MPA an der Carbonsäuregruppe der in 1 -Stellung des MPA-Isobenzofuranyl-Ringsystems gebundenen Seitenkette, wie z. B. MPA-M.
MPA-Metabolit -- ein Produkt des MPA-Stoffwechsels, vorzugsweise ein das Isobenzofuranyl-Ringsystem enthaltendes Produkt, besonders bevorzugt Produkte, die ebenfalls einen Teil der Seitenkette, wie z. B. das Acyl- oder phenolische Glucuronid der MPA, enthalten.
Messungen der Menge eines Analyten -- quantitative, halbquantitative und qualitative Verfahren ebenso wie alle anderen Verfahren zur Bestimmung eines Analyten werden als Verfahren zur Messung der Menge eines Analyten angesehen. So wird beispielsweise ein Verfahren, bei dem lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, nachgewiesen wird, als vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt angesehen. Die Begriffe „Nachweisen" und „Bestimmen" werden ebenso wie andere geläufige Synonyme für Messen als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
Fähig zur Unterscheidung zwischen -- die Fähigkeit eines Rezeptors oder Antikörpers, vorzugsweise an einen ersten Liganden verglichen mit einem zweiten Liganden zu binden. Üblicherweise wird wenigstens das 5fache des ersten Liganden gegenüber dem zweiten Liganden gebunden, wenn der Antikörper mit einer die Liganden enthaltenden Probe zusammengegeben wird. Vorzugsweise wird wenigstens das 10fache und besonders bevorzugt wenigstens das 20fache des ersten Liganden gebunden. Obwohl die relative Bindung eines Liganden jeweils von den relativen Konzentrationen in der Probe abhängt, werden diese Bedingungen normalerweise erfüllt, wenn die Bindungskonstante des Antikörpers an den ersten Liganden wenigstens gleich der Bindungskonstante an den zweiten Liganden ist und vorzugsweise wenigstens das 10fache, besonders bevorzugt wenigstens das 50fache der Bindungskonstante des zweiten Liganden beträgt.
Konjugat -- ein Molekül, das aus zwei oder mehreren Molekülen besteht, die unter Ausbildung einer einzigen Struktur gegebenenfalls über eine verknüpfende Gruppe zusammengebunden sind. Die Bindung kann entweder über eine direkte Verbindung (z. B. eine chemische Bindung) zwischen den Molekülen oder unter Verwendung einer verknüpfenden Gruppe hergestellt werden. So handelt es sich beispielsweise bei einem mit einem Enzym konjugierten Analytanalog um ein Analytanalog-Enzym-Konjugat.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaars („sbp"-Mitglied) -- eines von zwei unterschiedlichen Molekülen, mit einer auf der Oberfläche oder in einer Höhlung befindlichen Fläche, die spezifisch an eine besondere räumliche und polare Struktur des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des sbp können als Ligand und Rezeptor bezeichnet werden, wie z. B. Mitglieder eines immunologischen Paares, z. B. Antigen-Antikörper. Komplementäre sbp-Mitglieder binden aneinander, wie z. B. ein Ligand und sein komplementärer Rezeptor. Hinsichtlich zwei komplementären sbp-Mitgliedern kann man eines als den „Bindungspartner" des anderen bezeichnen. Bei den sbp-Migliedern kann es sich um immunologische Paare, wie z. B. Antigen und Antikörper, oder um nichtimmunologische Paare, wie z. B. Avidin und Biotin, handeln. Sbp-Mitglieder können auch kleine Moleküle oder Reste kleiner Moleküle und ihre Rezeptoren sein. kleine Moleküle besitzen ein Molekulargewicht von 100–2000, vorzugsweise 150–1000, wobei ein Rezeptor für das kleine Molekül entweder bereits vorliegt oder hergestellt werden kann. Zu den kleinen Molekülen gehören beispielsweise Derivate von Biotin, Lysergsäure, Fluoreszein oder ein Fluoreszeinderivat sowie Vitamin B₁₂, wobei es sich bei den entsprechenden Rezeptoren um Avidin bzw. Streptavidin, Antilysergsäure, Antifluoreszein bzw. „Intrinsic Factor" handelt. Kleine Moleküle werden oft kovalent an andere sbp-Mitglieder unter Ausbildung eines Konjugats, das wenigstens ein und häufig 2–20 kleine Moleküle aufweist, gebunden. Die Bindung des kleinen Moleküls an das sbp-Mitglied kann entweder über chemische Reaktionen, wobei ein Wasserstoffatom des kleinen Moleküls gegen eine Bindung an das sbp-Miglied ausgetauscht wird, oder über eine verknüpfende Gruppe zwischen dem kleinen Molekül und dem sbp-Miglied, die eine beliebige Größe aufweisen kann, jedoch vorzugsweise nicht größer als notwendig ist, um die Bindung sowohl eines Rezeptors für das kleine Molekül als auch des sbp-Mitglieds an das Konjugat zu gestatten, erfolgen.
Ligand -- eine beliebige organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlicherweise vorhanden ist oder ein solcher hergestellt werden kann.
Ligandanalog (oder Analytanalog) -- ein modifizierter Ligand, ein organischer Rest oder ein Analytanalog, üblicherweise mit einem Molekulargewicht von mehr als 100, der bzw. das mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurriert, wobei durch die Modifikation ein Weg zur Bindung eines Ligandanalogs an ein anderes Molekül geschaffen wird. Das Ligandanalog unterscheidet sich für gewöhnlich, jedoch nicht notwendigerweise, von dem Ligander, durch mehr als einen Austausch eines Wasserstoffatoms gegen eine Bindung, die das Ligandanalog mit einem Zentralmolekül oder einer Markierung verknüpft. Das Ligandanalog kann an den Rezeptor in einer ähnlichen Weise wie der Ligand binden. Bei clem Analog könnte es sich beispielsweise um einen gegen das Idiotyp eines Antikörpers gegen den Liganden gerichteten Antikörper handeln.
Rezeptor („Antiligand") -- eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Erkennung einer besonderen räumlichen und polaren Struktur eines Moleküls, z. B. eines Epitops oder einer Determinante, fähig ist. Zu beispielhaften Rezeptoren zählen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxinbindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Protein A, Komplementkomponente C1q, u. ä.
Spezifische Bindung -- die spezifische Erkennung eines der beiden unterschiedlichen Moleküle durch das jeweils andere verglichen mit der wesentlich schwächeren Erkennung anderer Moleküle. Im allgemeinen besitzen die Moleküle auf ihren Oberflächen oder in Höhlungen Flächen, die die spezifische Erkennung zwischen den beiden Molekülen bewirken. Beispielhafte spezifische Bindungen sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Polynukleotidwechselwirkungen, usw.
Nichtspezifische Bindung -- nichtkovalente Bindung zwischen Molekülen, die relativ unabhängig von spezifischen Oberflächenstrukturen ist. Nichtspezifische Bindung kann durch mehrere Faktoren, einschließlich hydrophober Wechselwirkungen zwischen Molekülen, verursacht werden.
Nichtspezifischer Komplex eines Liganden -- nicht spezifisch an eine andere Substanz, normalerweise in einer zu analysierenden Probe vorhandene endogene Substanzen, gebundener Ligand. Bei den endogenen Substanzen handelt es sich im allgemeinen um endogene Proteine, wie z. B. Plasmaproteine, z. B. Albumin, Globuline, Glykoproteine, Lipoproteine, u. ä.
Antikörper -- ein Immunglobulin, das spezifisch an eine besondere räumliche und polare Struktur eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und läßt sich mit Techniken, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, wie z. B. Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren (polyklonal) oder durch Herstellen von Hybrid-Dauerzellinien und Einsammeln des sezernierten Proteins (monoklonal) oder durch Klonieren und Exprimieren von Nukleotidsequenzen oder deren mutagenisierten Versionen, die mindestens für die spezifische Bindung der natürlichen Antikörper benötigten Aminosäuresequenzen kodieren, herstellen. Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder Fragmente davon enthalten, wobei zu den Immunglobulinen die verschiedenen Klassen und Isotypen, wie z. B. IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM usw., gehören. Fragmente davon können Fab, FV und F(ab)₂, Fab u. ä. umfassen. Darüber hinaus lassen sich gegebenenfalls Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder ihren Fragmenten verwenden, solange die Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül erhalten bleibt.
Antikörper (polyklonal) enthaltendes Antiserum wird mittels allgemein etablierter Techniken gewonnen, bei denen ein Tier, wie z. B. ein Kaninchen, Meerschweinchen oder eine Ziege, mit einem entsprechenden Immunogen immunisiert wird und Antiseren aus dem Blut des immunisierten Tieres nach einer entsprechenden Wartezeit gewonnen werden. Übersichtsartikel zum Stand der Technik finden sich bei Parker, Radioimmunassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N. J. U.S., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1–24 (1975); Broughton und Strong, Clin. Chem. 22: 726–732 (1976); und Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24–31 (1974).
Antikörper lassen sich auch mittels somatischen Zellhybridisierungstechniken gewinnen, wobei solche Antikörper allgemein als monoklonale Antikörper bezeichnet werden. Monoklonale Antikörper können gemäß den Standardtechniken von Köhler und Milstein, Nature 265: 495–497, 1975, produziert werden. Übersichtsartikel über monoklonale Antikörpertechniken finden sich bei Lymphocyte Hybridomas, Hrsg. Melchers, et al., Springer-Verlang (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), und Methods of Enzymology 73 (Part B): 3–46 (1981). Proben einer geeigneten Immunogenpräparation werden in ein Tier, wie z. B. eine Maus, injiziert, wobei nach einer ausreichenden Zeitspanne das Tier getötet wird und Milzzellen isoliert werden. Als Alternative dazu lassen sich die Milzzellen eines nicht immunisierten Tieres gegen das Immunogen in vitro sensibilisieren. Die die Basensequenzen für die gewünschten Immunglobine kodierenden Milzzellenchromosomen lassen sich durch Fusion der Milzzellen mit einer Myelomzellinie, im allgemeinen in Gegenwart eines nichtionischen Detergens, z. B. Polyethylenglykol, komprimieren. Man läßt die erhaltenen Zellen, unter denen sich die fusionierten Hybridomzellen befinden, in einem Selektionsmedium, wie z. B. HAT-Medium, wachsen, wobei die überlebenden unsterblichen Zellen in einem solchen Medium unter Verwendung der Bedingungen der limitierenden Verdünnung kultiviert werden. Die Zellen werden in einem geeigneten Behälter, z. B.
Mikrotiterwells, kultiviert, und der Überstand wird einem Screening auf monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifität unterzogen.
Zur Verbesserung der Ausbeuten an monoklonalen Antikörpern existieren verschiedene Techniken, wie z. B. die Injektion der Hybridomzellen in die Bauchhöhle eines Säugerwirts, der die Zellen toleriert, und das Ernten der Aszitesflüssigkeit. Sammelt sich in der Aszitesflüssigkeit nur eine unzureichende Menge an monoklonalem Antikörper an, so wird der Antikörper aus dem Blut des Wirts gewonnen. Als Alternative dazu läßt sich die den gewünschten Antikörper produzierende Zelle in einer Hohlfaser-Zellkulturvorrichtung oder einer Spinner-Flaschen-Vorrichtung, die beide im Fachgebiet allgemein bekannt sind, kultivieren. Für die Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen existieren verschiedene herkömmliche Wege (siehe Köhler und Milstein, supra).
In einem weiteren Ansatz zur Herstellung von Antikörpern läßt sich die für Antikörperbindungsstellen codierende Sequenz aus der chromosomalen DNA ausschneiden und in einen Klonierungsvektor einfügen, der dann zur Herstellung rekombinanter Proteine mit den entsprechenden Antikörperbindungsstellen in Bakterien exprimiert werden kann.
Im allgemeinen lassen sich Antikörper mit bekannten Techniken, wie z. B. Chromatographie, z. B. DEAE-Chromatographie, ABx-Chromatographie u. ä., Filtration, usw., reinigen.
Hapten -- eine zur spezifischen Bindung an entsprechende Antikörper fähige Verbindung, die jedoch selbst nicht als Immunogen (oder Antigen) bei der Herstellung der Antikörper fungiert. Antikörper, die ein Hapten erkennen, lassen sich gegen Verbindungen, die aus dem mit einem immunogenen (oder antigenen) Träger verknüpften Hapten bestehen, herstellen. Bei den Haptenen handelt es sich um eine Untergruppe der Liganden.
MPA-Analog -- modifizierte MPA. Durch die Modifikation werden Wege zur Bindung dieses Analogs an ein anderes Molekül bereitgestellt. Das Analog unterscheidet sich normalerweise von der MPA durch mehr als den Austausch eines Wasserstoffatoms gegen eine Bindung, die das Analog mit einem Zentralmolekül oder einer Markierung verknüpft.
Immunogener Träger -- eine Gruppe, die bei Konjugation mit einem Hapten und Injektion in einen Säuger eine Immunantwort induziert und die Produktion von Antikörpern, die an das Hapten, in diesem Fall MPA, binden, hervorruft. Immunogene Träger werden auch als antigene Träger bezeichnet. Zu den typischen immunogenen Trägern gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyaminosäuren, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Partikel (biologische und synthetische Materialien). Eine große Vielfalt solcher Träger ist in Davalian, et al., U.S. Patent-Nr. 5,089,390, Spalte 4, Zeile 57 bis Spalte 5, Zeile 5 offenbart. Zu weiteren geeigneten immunogenen Trägern gehören Albumine, Serumproteine, z. B. Globuline, Augenlinsenproteine und Lipoproteine. Beispielhafte Proteine umfassen Rinderserumalbumin, „Keyhole Limpet"-Hämocyanin („KLH"), Ovalbumin und Rinder-Gammaglobulin.
Träger oder Oberfläche -- eine Festphase, typischerweise ein Träger oder eine Oberfläche, die aus einem porösen oder nichtporösen wasserunlöslichen Material besteht, das eine beliebige Form aus einer Reihe von Formen, wie z. B. Streifen, Stab, Platten, Well, Partikel und Perlen, aufweisen kann. Eine große Vielfalt an geeigneten Trägern ist in Ullman, et al., U.S. Patent-Nr. 5,185,243, Spalten 10–11, Kum, et al., U.S. Patent-Nr. 4,868,104, Spalte 6, Zeilen 21–42 und Milburn, et al., U.S. Patent-Nr. 4,959,303, Spalte 6, Zeilen 14–31 offenbart. Die Bindung von sbp-Mitgliedern an einen Träger oder eine Oberfläche kann mit allgemein bekannten Techniken, die in der Literatur gemeinhin verfügbar sind, erfolgen. Siehe z. B., „Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970). Der Begriff „kann an einen Träger gebunden werden", wie er hierin verwendet wird, bedeutet beispielsweise, daß ein Reagens, wie z. B. der Antianalyt-Antikörper, an ein erstes sbp-Mitglied oder ein kleines Molekül gebunden wird und ein komplementäres zweites sbp-Mitglied oder ein Rezeptor für das kleine Molekül dann wiederum an einen Träger gebunden wird. Umgekehrt wird ein Rezeptor für den Antianalyt-Antikörper wie z. B. einen Anti-Maus-Antikörper, an einen Träger gebunden und zum Fangen des Antianalyt-Antikörpers eingesetzt. Daher wird der Antianalyt-Antikörper nicht direkt an einen Träger gebunden, sondern wird nur dann gebunden, wenn ein komplementäres sbp-Miglied oder ein Rezeptor zugegeben wird.
Signal-produzierendes System („sps") -- eine oder mehrere Komponenten, wobei es sich bei wenigstens einer Komponente um eine nachweisbare Markierung handelt, die ein nachweisbares Signal erzeugt, das in Beziehung zur Menge an gebundener und/oder ungebundener Markierung, d. h. der Menge an die nachgewiesene Verbindung gebundener bzw. nicht gebundener Markierung, steht. Bei der Markierung handelt es sich um ein beliebiges Molekül, das entweder ein Signal produziert oder dazu gebracht werden kann, ein Signal zu produzieren, und vorzugsweise um ein fluoreszierendes Molekül, eine radioaktive Markierung, ein Enzym, ein chemi lumineszierendes Molekül oder einen Photosensitizer. Somit wird das Signal durch Nachweis der Fluoreszenz oder Lumineszenz, Radioaktivität, Enzymaktivität oder Lichtabsorption nachgewiesen und/oder gemessen.
Zu den beispielhaften und nicht einschränkenden geeigneten Markierungen gehören Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase („G6PDH") und Meerrettich-Peroxidase; Ribozym; ein Substrat für eine Replikase, wie z. B. QB-Replikase; Promotoren; Farbstoffe; Fluoreszenzmoleküle, wie z. B. Fluoreszein, Rhodaminverbindungen, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin; Chemilumineszenzmoleküle, wie z. B. Isoluminol; Sensitizer; Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive Markierungen, wie z . B . ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, ⁵⁷Co und ⁷⁵Se; Partikel, wie z. B. Latex- oder Kohlenstoffpartikel; Metallsol; Kristallit; Liposomen; Zellen, usw., die weiter mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen nachweisbaren Gruppe markiert sein können. Geeignete Enzyme und Coenzyme sind in Litman, et al., U.S. Patent-Nr. 4,275,149, Spalten 19-28, und Boguslaski, et al., U.S. Patent-Nr. 4,318,980, Spalten 10–14 offenbart; geeignete Fluoreszenz- und Chemilumineszenzmoleküle sind in Litman, et al., U.S. Patent-Nr. 4,275,149, in Spalten 30 und 31 offenbart.
Es gibt zahlreiche Verfahren, bei denen von der Markierung ein mit externen Mitteln, beispielsweise direkter Beobachtung, elektromagnetischer Strahlung, Hitze und chemischen Reagenzien, nachweisbares Signal produziert wird. Die Markierung bzw. andere sps-Mitglieder können auch an ein sbp-Mitglied, ein anderes Molekül oder an einen Träger gebunden werden.
Die Markierung kann auch ein Signal direkt produzieren, so daß dann keine zusätzlichen Komponenten zur Erzeugung eines Signals benötigt werden. Zahlreiche organische Moleküle, z. B. Fluoreszenzmoleküle, sind in der Lage, ultraviolettes und sichtbares Licht zu absorbieren, wobei durch die Lichtabsorption Energie auf diese Moleküle übertragen wird und sie dadurch auf einen höheren, angeregten Energiezustand gebracht werden. Diese absorbierte Energie wird dann durch die Emission von Licht bei einer zweiten Wellenlänge abgegeben. Radioaktive Isotope und Farbstoffe gehören zu weiteren Markierungen, die ein Signal direkt produzieren.
Andererseits kann die Markierung weitere Komponenten zur Produktion eines Signals benötigen, wobei das Signal-produzierende System dann alle Komponenten umfassen würde, die zur Produktion eines meßbaren Signals erforderlich sind und wozu Substrate, Coenzyme, Enhancer, zusätzliche Enzyme, mit enzymatischen Produkten reagierende Substanzen, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Fängermoleküle, Metallionen sowie eine für die Bindung von Signalerzeugenden Substanzen benötigte spezifische Bindungssubstanz gehören. Eine ausführliche Erörterung geeigneter Signal-produzierender System findet sich in Ullman, et al., U.S. Patent-Nr. 5,185,243, Spalten 11–13.
Die Markierung läßt sich an zahlreiche sbp-Mitglieder: einen Antikörper; einen Rezeptor für einen Antikörper; einen zur Bindung an ein mit einem Antikörper konjugiertes kleines Molekül fähigen Rezeptor; oder ein Ligandanalog, covalent binden. Die Bindung der Markierung an das sbp-Mitglied kann mittels chemischer Reaktionen, durch die ein Wasserstoffatom der Markierung gegen eine Bindung an das sbp-Mitglied ausgetauscht wird, erfolgen oder kann eine zwischen der Markierung und dem sbp-Mitglied vorhandene verknüpfende Gruppe umfassen. Andere sps-Mitglieder können ebenfalls an sbp-Mitglieder covalent gebunden werden. So lassen sich beispielsweise zwei sps-Mitglieder, wie z. B. ein Fluoreszenzmolekül und ein Quenchermolekül, jeweils an einen unterschiedlichen Antikörper, der einen spezifischen Komplex mit dem Analyten bildet, binden. Die Ausbildung des Komplexes bringt das Fluoreszenzmolekül und das Quenchermolekül in enge Nachbarschaft, so daß das Quenchermolekül mit dem Fluoreszenzmolekül unter Produktion eines Signals Wechselwirken kann. Konjugationsverfahren sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe, z. B. Rubenstein, et al., U.S. Patent-Nr. 3,817,837. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Antikörper an ein erstes sps-Mitglied und eine nachweisbare Markierung als zweites sps-Mitglied gebunden. Wird beispielsweise die nachweisbare Markierung an ein Ligandanalog gebunden, läßt sich das Ausmaß der Bindung des Antikörpers an das Analog durch den Nachweis des aufgrund der Wechselwirkung der sps-Mitglieder produzierten Signals messen.
Hilfsmaterialien -- verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in einem erfindungsgemäßen Assay eingesetzt. Beispielsweise sind Puffer normalerweise ebenso im Assaymedium vorhanden wie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten. Zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen können häufig zusätzliche Proteine, wie z. B. Albumine, oder Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole, Konservierungsstoffe, antimikrobielle Agenzien u. ä. enthalten sein.
Verknüpfende Gruppe -- ein Teil einer Struktur, der 2 oder mehrere Unterstrukturen verbindet. Die verknüpfende Gruppe kann eine Bindung sein oder kann wenigstens 1, zwischen den Unterstrukturen verlaufende, ununterbrochene Kette von Atomen außer Wasserstoff (oder anderen einwertigen Atomen) aufweisen. Die Anzahl an Atomen in der Kette beträgt wenigstens eins und wird durch Zählen der Anzahl an Atomen außer Wasserstoff entlang des kürzesten Wegs zwischen den verbundenen Unterstrukturen bestimmt und beträgt typischerweise 1–30, üblicherweise 2–10, vorzugsweise 3–8 Atome, die jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor. Die Gesamtanzahl an Atomen in der verknüpfenden Gruppe wird durch Zählen der gesamten Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphoratome, d. h. aller Atome außer Wasserstoff, bestimmt. Typischerweise weist die verknüpfende Gruppe insgesamt weniger als 30 Atome, vorzugsweise weniger als 20 Atome, besonders bevorzugt weniger als 10 Atome auf. Als allgemeine Regel kann die Länge einer bestimmten verknüpfenden Gruppe willkürlich gewählt werden, um eine bequeme Synthese und den Einbau einer beliebigen gewünschten Gruppe zu ermöglichen. Die verknüpfenden Gruppen können aliphatisch oder aromatisch sein, doch sind bei den Diazogruppen normalerweise aromatische Gruppe beteiligt. Sauerstoff liegt normalerweise vor als Oxo oder Oxy, gebunden an Kohlenstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor; Stickstoff liegt normalerweise vor als Nitro, Nitroso oder Amino, normalerweise gebunden an Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel oder Phosphor; Schwefel wäre analog zu Sauerstoff; während Phosphor an Kohlenstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff gebunden wird, üblicherweise als Phosphonat und Phosphatmono- bzw. -diester.
Übliche funktionelle Gruppen bei der Ausbildung einer covalenten Bindung zwischen der verknüpfenden Gruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamin, Amidin, Thioamid, Dithiol, Ether, Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidin, Azo, Thioether und Carboxylat, Sulfonat und Phosphatester, Amide und Thioester.
Alkyl -- ein aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines H-Atoms abgeleiteter einwertiger gegebenenfalls verzweigter Rest; dazu zählen sowohl niederes Alkyl als auch höheres Alkyl.
Niederes Alkyl -- Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl, usw.
Höheres Alkyl -- Alkyl mit mehr als 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Hexyl, Heptyl, Octyl, usw.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Freisetzung eines Liganden aus einem nichtspezifischen Komplex davon, wie z. B. einem Komplex, in dem der Ligand nicht spezifisch an eine andere Substanz, wie z. B. endogene Probenproteine und andere nichtspezifische Substanzen, gebunden ist. Bei dem Verfahren wird ein Medium, von dem man annimmt, daß es einen solchen Komplex enthält, mit einer wirksamen Menge an Verbindung I in Kontakt gebracht.
Repräsentative Beispiele von Verbindungen mit der obigen Formel sind in Tabelle 1 in beispielhafter und nicht einschränkender Weise dargestellt.
Tabelle 1
Vorzugsweise stehen in den in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen die Carboxygruppe und der Substituent --XR¹ ortho zueinander, wobei die Verbindungen die Formel (mit der Bezeichnung Verbindungen I ):
aufweisen, wobei R¹ Alkyl, R² Wasserstoff oder Alkyl; X O, S oder N bedeutet. Beispielhafte und nicht beschränkende, repräsentative Verbindungen in dieser Kategorie sind die oben angegebenen Verbindungen I-M, I-P, I-S, I-V, I-Y und I-BB.
Bei bevorzugten Verbindungen der Formel I handelt es sich um solche mit der Formel der Verbindung II. Beispielhafte und nicht beschränkende, repräsentative Verbindungen in dieser Gruppe sind die obigen Verbindungen I-M, I-N, I-O, I-P, I-Q und I-R.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß geeignete Verbindungen solche mit der folgenden Formel (Verbindung III):
worin R¹ Alkyl und R² Wasserstoff oder Alkyl bedeutet. Beispielhafte und nicht beschränkende, repräsentative Verbindungen dieser Gruppe sind die obigen Verbindungen I-M und I-P. Besonders bevorzugte Verbindungen bei dieser Kategorie sind diejenigen, worin R¹ niederes Alkyl, besonders bevorzugt Methyl, bedeutet.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit der folgenden Formel (Verbindungen IV):
worin R³ niederes Alkyl bedeutet. Besonders bevorzugt ist o-Methoxybenzoesäure, auch bekannt unter dem Namen o-Anissäure.
Bei der vorliegenden Erfindung ist es wichtig, daß die jeweilige verwendete Verbindung I in keinem signifikanten Ausmaß an ein sbp-Mitglied oder einen Bindungspartner für Mycophenolsäure, das bzw. der im Assay für Mycophenolsäure verwendet wird, bindet. Was dabei ein signifikantes Ausmaß darstellt, hängt von der für den Assay benötigten Empfindlichkeit ab. Je höher die für den Assay benötigte Empfindlichkeit, desto geringer ist das tolerierbare Ausmaß der Bindung an ein sbp-Mitglied oder einen Bindungspartner für Mycophenolsäure. Unter dem Begriff „signifikantes Ausmaß" ist zu verstehen, daß die jeweilige Verbindung I nicht an ein sbp-Mitglied oder einen Bindungspartner in einem Ausmaß bindet, das die Genauigkeit oder die quantitative bzw. qualitative Eigenschaft des Testergebnisses beeinflussen würde. Dementsprechend sollte eine Bindung zwischen einer bestimmten Verbindung I und einem sbp-Mitglied oder einem Bindungspartner vorzugsweise weniger als 1%, besonders bevorzugt weniger als 0,01 und ganz besonders bevorzugt 0% betragen. Ein solcher Prozentanteil wird bestimmt, indem die scheinbare Mycophenolsäurequantitation der gegebenen Menge an Freisetzungsmittel gemessen und das Ergebnis als Bruchteil der tatsächlichen Konzentration ausgedrückt wird. Weiterhin darf die jeweilige ausgewählte Verbindung I die Bindung von sbp-Mitgliedern untereinander oder die Fähigkeit des Signalproduzierenden Systems, ein mit der Anwesenheit oder Menge der Mycophenolsäure in Beziehung stehendes Signal zu produzieren, nur in geringster Weise, wenn überhaupt, stören.
Unter dem Begriff „wirksame Menge" ist eine Menge zu verstehen, die ausreicht, die Freisetzung des Liganden aus einem solchen Komplex herbeizuführen, so daß vorzugsweise wenigstens etwa 90%, besonders bevorzugt wenigstens 99% und ganz besonders bevorzugt 100% des Liganden in einer von einem solchen Komplex freien Form vorliegt. Die wirksame Menge der zu verwendenden Verbindung I in einem bestimmten Assay hängt von der Beschaffenheit des Liganden sowie des Assays und der darin eingesetzten Reagenzien ab. Die wirksame Menge wird vorzugsweise empirisch auf Grundlage des vermuteten Konzentrationsbereichs der Mycophenolsäure in der Probe bestimmt. Eine wirksame Menge an Verbindung I ist im allgemeinen eine über die vermutete Menge an Mycophenolsäure hinausgehende Menge. In Anbetracht eines Assays für MPA, bei dem das erwartete Medikamentenniveau in einer Probe bei etwa 1,5 bis 45 μM liegt, beträgt die wirksame Menge der Verbindung I im Assaymedium etwa 0.1 bis etwa 100 mM, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 25 mM und besonders bevorzugt etwa 2 bis 12 mM.
Viele der für die vorliegende Erfindung geeigneten Verbindungen sind kommerziell erhältlich bzw. ihre Synthese ist aus der Literatur bekannt. Die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Verbindungen können mit bekannten Verfahrensweisen aus Ausgangsmaterialien, die leicht erhältlich sind, wie z. B. Benzoesäure oder Hydroxybenzoesäure, hergestellt werden. Bei solchen Verfahrensweisen werden eine oder mehrere Alkoxygruppen am Benzolring gebildet und die erhaltene Verbindung verestert, falls ein Ester erwünscht ist. Beide obigen Reaktionen lassen sich mit allgemein bekannten Verfahrensweisen durchführen, die an dieser Stelle nicht nochmal aufgeführt werden. Siehe z. B. Heathcock, et al., „Introduction to Organic Chemistry," MacMillan Publishing Company, New York, New York, Dritte Auflage, 1985, Seiten 814 und 493; Carey, „Organic Chemistry," McGraw Hill Inc., New York, New York, Zweite Auflage, 1987, Seiten 994–995 und 609.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf Assays zur Bestimmung der Mycophenolsäure, insbesondere auf die zur Bestimmung freier Mycophenolsäure anwenden. Im allgemeinen wird eine Probe, von der vermutet wird, daß sie Mycophenolsäure enthält, in einem Assaymedium mit einem Bindungspartner für Mycophenolsäure und, je nach dem jeweils durchgeführten Assay, weiteren Reagenzien zusammengegeben. Die Bindung des Bindungspartners an Mycophenolsäure, falls vorhanden, wird nachgewiesen. Das Assaymedium enthält eine wirksame Menge an Verbindung I. Der Assay läßt sich entweder ohne Abtrennung (homogen) oder mit Abtrennung (heterogen) einer der Assaybestandteile oder Produkte durchführen. Beispiele für homogene Immunassays sind die EMIT®-Assayprodukte (Behring Diagnostic Inc., vormals Syva Company, San Jose, CA), offenbart in Rubenstein, et al., U.S. Patent-Nr. 3,817,837, Spalte 3, Zeile 6 bis Spalte 6, Zeile 64; Immunfluoreszenzverfahren, wie z. B. die in Ullman, et al., U.S. Patent-Nr. 3,996,345, Spalte 7, Zeile 59 bis Spalte 23, Zeile 25 offenbarten; „Enzyme Channeling"-Techniken, wie z. B. die in Maggio, et al., U.S. Patent-Nr. 4,233,402, Spalte 6, Zeile 25 bis Spalte 9, Zeile 63 offenbarten; sowie weitere Enzymimmunassays, wie z. B. der „ELISA" (Enzyme Linked Immunosorbant Assay), werden in Maggio, E. T. supra erörtert. Beispiele für heterogene Assays sind die Radioimmunassays, offenbart in Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39:1157 (1960).
Ein typischer nicht kompetitiver Sandwich-Assay ist ein aus David, et al., U.S. Patent-Nr. 4,486,530, Spalte 8, Zeile 6 bis Spalte 15, Zeile 63, bekannter Assay. Bei diesem Verfahren wird ein Sandwich-Immunkomplex in einem eine wirksame Menge an Verbindung I enthaltenden Assaymedium gebildet. Der Komplex enthält den Analyten, einen ersten Antikörper (monoklonal oder polyklonal), der an den Analyten bindet, sowie einen zweiten Antikörper, der an den Analyten bzw. einen Komplex aus dem Analyten und dem ersten Antikörper bindet. Der Sandwich-Immunkomplex wird anschließend nachgewiesen und steht in Beziehung zur Menge des Analyten in der Probe. Der Sandwich-Immunkomplex wird anhand der Anwesenheit einer Markierung in dem Komplex nachgewiesen, wobei entweder der erste Antikörper oder der zweite Antikörper oder beide Antikörper Markierungen oder Substituenten, die mit Markierungen kombiniert werden können, enthalten, wie z. B. durch Bereitstellen des Antikörpers in mit Biotin verknüpfter Form und durch Bereitstellen von Avidin in an eine Markierung gebundener Form.
Ein weiteres Verfahren, das zur Durchführung des Assays der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist aus Ullman, et al., U.S. Patent-Nr. 4,857,453, Spalte 11, Zeile 21 bis Spalte 14, Zeile 42, und Spalte 18, Zeile 21 bis Spalte 21, Zeile 55 bekannt.
Der Assay wird normalerweise in einem wäßrigen gepufferten Medium bei einem mittleren pH-Wert, d. h. im allgemeinen einem Wert, bei dem eine optimale Assayempfindlichkeit vorliegt, durchgeführt. Bei dem wäßrigen Medium kann es sich lediglich um Wasser handeln, oder es kann einige Prozent eines Cosolvens, z. B. 0–40 Volumenprozent eines Cosolvens, enthalten. Der pH-Wert für das Medium liegt üblicherweise im Bereich von 4–11, besonders typisch im Bereich von 5–10 und bevorzugt im Bereich von 6,5 bis 9,5. Der pH-Wert ist normalerweise ein Kompromiß zwischen der optimalen Bindung der Bindungsmitglieder eines spezifischen Bindungspaars, der optimalen Freisetzung von Mycophenolsäure aus einem nichtspezifischen Komplex davon gemäß der vorliegenden Erfindung und dem pH- Optimum für weitere Reagenzien des Assays, wie z. B. für die Mitglieder des Signal-produzierenden Systems.
Zur Erreichung des gewünschten pH-Werts und Beibehaltung des pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Zu den beispielhaften Puffern gehören Borat, Phosphat, Carbonat, Tris und Barbital. Der jeweils eingesetzte Puffer ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, doch kann in einem individuellen Assay der eine oder andere Puffer bevorzugt sein.
Zur Durchführung des Assays werden normalerweise gemäßigte Temperaturen und während der Dauer der Messung, insbesondere bei Geschwindigkeitsbestimmungen, normalerweise konstante Temperaturen verwendet. Die Inkubationstemperaturen reichen normalerweise von 5–45°C, besonders typisch von 15–40°C. Die Temperaturen während der Messungen reichen im allgemeinen von 10–50°C, besonders typisch von 15–40°C.
Die in dem Assay bestimmbare Mycophenolsäurekonzentration variiert im allgemeinen von 10^–4 bis 10^–13 M, besonders typisch von 10^–5 bis 10^–7 M. Überlegungen, wie z. B. ob der Assay qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ (in bezug auf die in der Probe vorliegende Menge an Mycophenolsäure) ist, die jeweilige Nachweistechnik sowie die Mycophenolsäurekonzentration bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien.
Die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Assaymedium werden im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich der Mycophenolsäure festgelegt. Doch wird die Endkonzentration der Reagenzien normalerweise jeweils empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den Bereich zu optimieren. Das heißt eine Änderung in der Mycophenolsäurekonzentration, die von Bedeutung ist, sollte einen genau meßbaren Signalunterschied liefern.
Während die Reihenfolge der Zugabe in großem Ausmaß variiert werden kann, gibt es je nach Beschaffenheit des Assays gewisse Präferenzen. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe besteht darin, alle Materialien gleichzeitig zuzugeben und die Auswirkung des Assaymediums auf das Signal wie in einem homogenen Assay zu bestimmen. Als Alternative lassen sich die Reagenzien nacheinander zusammengeben. Gegebenenfalls kann nach jeder Zugabe ein Inkubationsschritt erfolgen, der im allgemeinen 30 Sekunden bis 6 Stunden, besonders typisch 1 Minute bis 1 Stunde, dauert.
In den folgenden Beispielen werden die erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen weiter beschrieben.
In einem homogenen Assay wird nach Zusammengeben aller Reagenzien das Signal bestimmt und auf die Menge an MPA in der Probe bezogen. So wird beispielsweise in einem EMIT-Assay für MPA eine Probe, von der man vermutet, daß sie MPA enthält, in einem wäßrigen Medium entweder gleichzeitig oder nacheinander mit einem MPA-Enzymkonjugat und einem zur Erkennung der MPA und des Konjugats fähigen Antikörper zusammengegeben. Das Medium enthält ebenfalls eine wirksame Menge an Verbindung I. Im allgemeinen wird ein Substrat für das Enzym zugegeben, wodurch ein chromogenes oder fluorogenes Produkt nach der Enzym-katalysierten Reaktion gebildet wird. Bevorzugte Enzyme sind Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und alkalische Phosphatase. Die Verbindung I bewirkt die Freisetzung der MPA aus einem nichtspezifischen Komplex davon, der in der Probe vorhanden sein kann. Die MPA und das MPA-Enzym-Konjugat konkurrieren um Bindungsstellen am Antikörper. Daraufhin wird die Enzymaktivität im Medium bestimmt, üblicherweise mittels Spektrophotometrie, und mit der Enzymaktivität verglichen, die beim Test von Kalibrierungsmitteln oder Referenzproben, in denen eine bekannte Menge an MPA vorhanden ist, bestimmt wurde. Typischerweise werden die Kalibrierungsmittel in einer ähnlichen Weise getestet wie die Probe, von der vermutet wird, daß sie MPA enthält. Die Kalibrierungsmittel enthalten typischerweise unterschiedliche, jedoch bekannte Konzentrationen des zu bestimmenden MPA-Analyten. Die in den Kalibrierungsmitteln vorhandenen Konzentrationsbereiche decken vorzugsweise den Bereich der vermuteten MPA-Konzentrationen in den unbekannten Proben ab.
Heterogene Assays enthalten normalerweise einen oder mehrere Trennschritte und können kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Verschiedene kompetitive und nichtkompetitive Assayformate sind aus Davalian, et al., U.S. Patent-Nr. 5,089,390, Spalte 14, Zeile 25 bis Spalte 15, Zeile 9 bekannt. In einem typischen kompetitiven Assay wird ein Träger mit daran gebundenem Antikörper gegen MPA mit einem Medium in Kontakt gebracht, das die Probe sowie mit einer nachweisbaren Markierung, wie z. B. einem Enzym, konjugierte MPA enthält. Das Medium enthält ebenfalls eine wirksame Menge an Verbindung I. MPA in der Probe konkurriert mit dem Konjugat um die Bindung an den Antikörper. Nach der Trennung des Trägers und des Mediums wird die Aktivität der Markierung auf dem Träger bzw. im Medium mittels herkömmlicher Techniken bestimmt und auf die Menge an MPA in der Probe bezogen.
Wie oben erwähnt, bringt die vorliegende Erfindung Vorteile gegenüber bekannten Verbindungen zur Freisetzung von Analyten aus nichtspezifischen Bindungssubstanzen, die in Analyseproben vorhanden sind. Mit der vorliegenden Erfindung können bis zu 100 Mycophenolsäure aus endogenen nicht spezifischen Bindungssubstanzen, wie z. B. Plasmaproteinen, freigesetzt werden. Somit wird die von der Proteinkonzentration abhängige Schwankung in der Mycophenolsäuregewinnung bezüglich einer Kalibrierungsmatrix weitgehend reduziert oder beseitigt. Weiterhin wird die von der Anwesenheit gleichzeitig verabreichter Medikamente abhängige Schwankung in der Mycophenolsäuregewinnung weitgehend reduziert oder beseitigt, da die Kompetition um Bindungsstellen an endogenen nichtspezifischen Bindungssubstanzen zwischen der Mycophenolsäure und anderen Medikamenten, die an solche Substanzen binden, reduziert oder aufgehoben wird. Die mit einigen der bekannten Agenzien in Zusammenhang gebrachte hohe Hintergrundabsorption wird bei der vorliegenden Erfindung vermieden. Dementsprechend bieten die vorliegenden Verfahren besondere Vorteile für Assays, in denen ein Signal-produzierendes System verwendet wird, das ein Signal im Bereich von etwa 300 bis etwa 700 nm produziert. Dies ist ein wichtiger Vorteil, insbesondere für Immunassays auf spektrophotometrischer Basis. Noch ein weiterer Vorteil der Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die ansonsten in Assays, in denen die vorliegenden Verbindungen nicht verwendet werden, auftretenden negativen Auswirkungen auf die Gesamtdosis-Wirkungskurven vermieden werden. Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das vorliegende Freisetzungsmittel keinen lichtempfindlichen Abbau zeigt.
In einem erfindungsgemäßen MPA-Assay werden Antikörper eingesetzt, die an MPA und an ihre Ester und Metabolite binden können. In einem weiteren erfindungsgemäßen MPA-Assay werden Antikörper verwendet, die zwischen MPA und Mycophenolsäureestern, wie z. B. MPA-M, unterscheiden können. In einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen MPA-Assays sind die eingesetzten Antikörper in der Lage, zwischen MPA und MPA-Metaboliten, wie z. B. MPA-G, zu unterscheiden.
Die Bindung des Antikörpers an MPA läßt sich auf vielfache, im Fachgebiet allgemein bekannte Weise nachweisen. Durch die Bindung des Antikörpers und MPA wird ein Immunkomplex gebildet, der direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. Die Immunkomplexe werden beispielsweise direkt nachgewiesen, wenn die eingesetzten Antikörper mit einer Markierung konjugiert sind. Der Immunkomplex wird indirekt nachgewiesen, indem die Wirkung der Ausbildung eines Immunkomplexes in einem Assaymedium auf ein Signal-produzierendes System untersucht oder ein markierter Rezeptor, der spezifisch an einen erfindungsgemäßen Antikörper bindet, eingesetzt wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Kits, die zur zweckmäßigen Durchführung eines Assays zur Bestimmung von Mycophenolsäure geeignet sind. Ein erfindungsgemäßer Kit enthält in abgepackter Form einen Bindungspartner für Mycophenolsäure kombiniert mit der Verbindung I. Der Kit kann weiterhin ein an eine nachweisbare Markierung gebundenes Mycophenolsäurekonjugat enthalten. Ein Kit zur Bestimmung einer MPA enthält in abgepackter Form einen zur Bindung an MPA fähigen Antikörper kombiniert mit einem Konjugat aus MPA und einer Markierung, sowie Verbindung I.
Um die Vielseitigkeit des Erfindungsgegenstandes zu erhöhen, können die Reagenzien des Kits in abgepackter Form kombiniert, im selben oder in getrennten Behältern, in flüssiger oder lyophilisierter Form bereitgestellt werden, so daß das Verhältnis der Reagenzien für die weitgehende Optimierung des Verfahrens und Assays sorgt. Die Reagenzien können jeweils in getrennten Behältern vorliegen, oder verschiedene Reagenzien können je nach Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagenzien in einem oder mehreren Behältern zusammengegeben werden. So kann beispielsweise eine wäßrige Lösung einer Verbindung I in einem getrennten Behälter bereitgestellt werden. Als Alternative kann eine Verbindung I in einem der Reagenzien zur Durchführung eines Assays enthalten sein. So kann beispielsweise die Verbindung I in einem wäßrigen Medium mit einem Antikörperreagens enthalten sein; ein solches wäßriges Medium kann in einem getrennten Behälter abgepackt sein.
Der Kit kann weiterhin andere getrennt abgepackte Reagenzien zur Durchführung eines Assays enthalten, wie z. B. zusätzliche sbp-Mitglieder, Hilfsreagenzien wie z. B. ein Hilfsenzymsubstrat, usw. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Kits können stark variiert werden, um so Reagenskonzentrationen zu schaffen, durch die die während des vorliegenden Verfahrens zu erfolgenden Reaktionen weitgehend optimiert werden, und um weiterhin die Empfindlichkeit des Assays weitgehend zu optimieren. Unter geeigneten Umständen können ein oder mehrere Reagenzien im Kit als Trockenpulver, üblicherweise lyophilisiert, bereitgestellt werden, einschließlich Hilfsstoffen, nach deren Lösung eine Reagenslösung mit den entsprechenden Konzentrationen zur Durchführung eines Verfahrens oder eines Assays gemäß der vorliegenden Erfindung bereitsteht. Der Kit kann weiterhin eine schriftliche Beschreibung eines wie oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch die folgenden veranschaulichenden Beispiele weiter erläutert. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Teil- und Prozentangaben auf das Gewicht. Temperaturen sind in Grad Celsius (°C) angegeben.
Beispiel 1
Ortho-Anissäure als Freisetzungsmittel in einem Assay für MPA
Es wurden die folgenden Reagenzien hergestellt:
REAGENS A
REAGENS B
Die Reagenzien A und B wurden wie folgt hergestellt.
Zur Verwendung in beiden Reagenzien wurde bei 2 bis 25°C eine 1,028%ige (w/w) Pluronic 25R2-Lösung hergestellt.
Das Reagens A wurde hergestellt, indem zunächst eine Anissäurelösung hergestellt wurde. Dabei wurde Anissäure in 1N NaOH in einer Menge, die 25 ml pro 1,52 Gramm Anissäure entsprach, gelöst. In einem getrennten Behälter wurden 70% des Endgewichts an deionisiertem Wasser eingewogen, zu dem die Bestandteile 1 bis einschließlich 5 und ebenfalls der Bestandteil 6, unter Verwendung von 10 ml der hergestellten Pluronic 25R2-Lösung pro 1017,9 g (bzw. 1,0 Liter) der endgültigen Lösung, gegeben wurden. Diese Lösung wurde gerührt und dabei die Anissäurelösung zugegeben. Falls notwendig, wurde der pH-Wert der Präparation mit 6N NaOH im Bereich von 5,50 bis 5,70 eingestellt. Als nächstes wurden die Bestandteile 8 und 9 zugegeben und die Lösung gerührt. Falls notwendig, wurde der pH-Wert auf den obigen Bereich eingestellt. Die Lösung wurde dann mit deionisiertem Wasser auf das Endgewicht gebracht und durch ein 0,2-Mikrometer-Filter filtriert. Der pH-Endwert betrug 5,50 bis 5,70. Die erhaltene Lösung wurde mit A-Verdünnungsmittel bezeichnet. Das Reagens A wurde durch Zugabe von Antikörper, d. h. des Bestandteils 10, zu dem A-Verdünnungsmittel auf eine Antikörper-Endkonzentration von 7,5 mg/l (bzw. 7,5 μg/ml) komplettiert.
Anzumerken ist hier, daß das Reagens A BSA enthielt, das wie menschliches Serumalbumin MPA bindet. BSA erwies sich jedoch als ein bevorzugter Stabilisator des Reagens A gegenüber gewissen anderen Proteinen, die in Betracht gezogen wurden, und wurde somit aus diesem Grund in Reagens A miteingeschlossen. Jedes Freisetzungsmittel für MPA würde daher so formuliert werden, daß dieser BSA-Effekt ebenso wie jegliche Bindung von der zu analysierenden Probe überwunden wird. Die obige Formulierung weist einen mehr als 500-molaren Überschuß an o-Anissäure gegenüber BSA in Reagens A auf. Diese o-Anissäurekonzentration erwies sich als mehr als ausreichend, um die gesamte MPA in dem System freizusetzen und in dieser freigesetzten Form zu halten.
Für das Reagens B wurde deionisiertes Wasser in einer Menge, die 80% des endgültigen Gewichts entsprach, eingewogen. Zu diesem Wasser wurden unter Rühren die Bestandteile 12 bis einschließlich 17 ebenso wie der Bestandteil 18 zugegeben, wobei 30 ml Pluronic 25R2-Lösung pro 1016,1 g (bzw. 1,0 Liter) der endgültigen Lösung verwendet wurden. Die Lösung wurde mit deionisiertem Wasser auf das Endgewicht gebracht, wobei der pH-Wert im Bereich von 8,0 bis 8,3 lag, und durch ein 0,2-Mikrometer-Filter filtriert. Die zu diesem Zeitpunkt erhaltene Lösung wurde als B-Verdünnungsmittel bezeichnet, die zur Herstellung des Reagens B verwendet wurde, indem weitgehend vernachlässigbare Volumina oder Gewichte der Bestandteile 19 und 20 zugegeben wurden. So wurden beispielsweise 0,37 ml Stabilisierungsantikörper mit 20,6 mg/ml und 6,1 ml Konjugat mit 0,8 mg/ml zu 10 1 (bzw. 10,18 kg) Reagens B gegeben. Der Stabilisierungsantikörper, Bestandteil 20, wurde mit einer Endkonzentration von 0,75 mg/l (bzw. 0,75 μg/ml) zugegeben. Das Konjugat, Bestandteil 19, wurde so zugegeben, daß eine Geschwindigkeit von 300 ± 10 mA/min erzielt wurde; die Geschwindigkeit ist definiert als Änderung in der Absorption bei 340 nm pro Minute Reaktionszeit und wird normalerweise in mA/min ausgedrückt.
Die Geschwindigkeiten wurden mit einem Cobas Mira Plus®-Meßgerät bestimmt (Roche Diagnostics Systems, Inc., Branchburg, New Jersey). Die Temperatur wurde während des gesamten Assays bei 37°C gehalten. Die Zeitnahmen erfolgten in Zyklen, wobei jeder Zyklus 25 Sekunden betrug. In Zyklus 1, dem ersten Zyklus, wurden 75 μl Wasser und 3 μl einer Probe mit 155 μl A-Verdünnungsmittel in einer Küvette mit einer Schichtdicke von 0,6 cm gemischt. Dieses Gemisch wurde bis zur Zugabe von Reagens B in Zyklus 7 inkubiert. Um die Geschwindigkeit des Konjugats zu bestimmen, enthielt die verwendete Probe keine MPA. In Zyklus 7 wurden 75 μl Reagens B und anschließend 20 μl Wasser in die Küvette gegeben, und danach gemischt und bis zum Ende von Zyklus 25 inkubiert, wonach der Assay beendet war. Während des Assays wurde am Ende eines jeden Zyklus die Absorption bei 340 nm abgelesen. Danach wurde eine optimale lineare Kurvenanpassung (Best Linear Fit) durchgeführt, wobei nur die 12 aufeinanderfolgenden abgelesenen Absorptionswerte der Zyklen 14 bis 25 gegen die Zeit in Minuten aufgetragen wurden. Die Steigung dieser Geraden ergab die Geschwindigkeit.
Danach wurden Präparationen des Reagens A hergestellt, in dem Antikörper mit unterschiedlichen Konzentrationswerten zu dem A-Verdünnungsmittel zugegeben wurde. Diese Titrationsniveaus wurden dann mit Reagens B und Kalibrierungsmitteln mit unterschiedlichen MPA-Konzentrationswerten (z. B. 0, 0,5, 2,0, 5,0, 10,0 und 15,0 μg/ml) gefahren. Das Antikörperniveau, bei dem sich die maximalen Geschwindigkeitsunterschiede zwischen den beiden Kalibrierungsmitteln am unteren Ende und den beiden Kalibrierungsmitteln am oberen Ende ergaben, wurde dann zur Formulierung des endgültigen Reagens A verwendet.
Nach Präparation der Reagenzien A und B wurden diese zusammen mit Kalibrierungsmitteln zur Bestimmung unbekannter MPA-Konzentrationen eingesetzt.
Zur Bestimmung einer unbekannten MPA-Konzentration wurden die Kalibrierungsmittel mit den Reagenzien A und B gefahren und die jeweiligen Geschwindigkeiten für jedes Kalibrierungsmittel wie zuvor beschrieben bestimmt, außer daß das A-Verdünnungsmittel durch Reagens A mit Antikörper ersetzt wurde. Für jedes Kalibrierungsmittel wurden typischerweise Doppelbestimmungen der Geschwindigkeiten durchgeführt und Bemittelt. Die Eichkurvenparameter wurden unter Verwendung der MPA-Konzentrationen, der Bemittelten Kalibrierungsgeschwindigkeiten und eines geeigneten mathematischen Modells, wie z. B. eines Logit/Log 4° Model-Fit, berechnet. Der Fit kann an die Gerade vom Anwender oder mittels geeigneter Computerprogramme, die die Parameter Ro, Kc, a und b in der folgenden Gleichung:
mit
Ro, Kc, a, b gleich Kurvenparameter,
C gleich MPA-Konzentration,
R gleich bei der MPA-Konzentration beobachtete Geschwindigkeit
optimieren, angepaßt werden.
Durch Auflösen dieser Gleichung nach C läßt sich die unbekannte MPA-Konzentration über ihre Geschwindigkeit R und die Kurvenparameter als: C = exp[[a + In[Kc/(R – Ro) – 1,0]]/–b]bestimmen.
Die Ergebnisse sind wie folgt zusammengefaßt: Die Wirksamkeit der Formulierung mit o-Anissäure wurde durch Messen der Übereinstimmung zwischen der Bestimmung eines 10 μg/ml MPA-Zusatzes in einem normalen menschlichen Plasma-Pool (NHP) und der Bestimmung eines ähnlichen Zusatzes in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS), bezogen von BioWhittaker, Walkersville, Maryland, ausgewertet. Für NHP und PBS wurden jeweils zwei getrennte Zusätze durchgeführt. PBS enthielt 0,2 g/l KCl, 0,2 g/l KH₂PO₄, 2,16 g/l Na₂HPO₄•7 H₂O und 8,0 g/l NaCl mit einem pH-Endwert von 6,4 bis 7,6. Die PBS-Lösung enthielt kein Protein, und somit kann keine Proteinbindung der MPA auftreten. Bei den Kalibrierungsmitteln handelte es sich um NHP mit 7 Konzentrationswerten an MPA mit 0, 0,3, 0,5, 2,5, 5, 10 und 20 μg/ml. Die NHP- und PBS-Zusätze ergaben nahezu dieselben Werte, mit Mittelwerten von 10,2 bzw. 10,4 μg/ml MPA (gepoolte Standardabweichung (Standard Deviation, sd) = 0,4 μg/ml). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß in dem Verfahren Gesamt-MPA gemessen wurde und daß das Verfahren nicht durch die normale Bindung von MPA an Serumalbumin beeinflußt wurde.
Beispiel 2
Veraleich von Anissäureisomeren und ANS als Freisetzungsmittel in einem MPA-Assay
In diesem Beispiel wurden vier Mittel, o-Anissäure (o-AA), ihre meta- (m-AA) und para- (p-AA) Isomere sowie das bekannte Freisetzungsmittel 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) verglichen. Alle Anissäuren wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, bezogen; die ANS wurde von Calbiochem, La Jolla, Kalifornien, bezogen.
In diesen Experimenten wurde das Verdünnungsmittel für Reagens A (Rgt A) etwas anders als in Beispiel 1 hergestellt. Die Zusammensetzung war jedoch die gleiche, außer bei Bestandteil 7 (Freisetzungsmittel, o-Anissäure) und Bestandteil 10 (Konzentration des MPA-Antikörpers). Fünf Verdünnungsmittel wurden hergestellt, und zwar vier mit jeweils einem der obigen Mittel und eine Kontrolle ohne Mittel. Zunächst wurde eine 2 -Lösung auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, die jedoch nur die Bestandteile 1 bis 5 sowie 9 in der doppelten aufgeführten Menge enthielt. Als nächstes wurden in drei der Verdünnungsmittel jeweils eines der drei Anissäureisomere eingewogen, so daß eine Endmolarität von 12,5 mM erreicht wurde, und in einem Viertel des Endvolumens an Wasser und einer Minimalmenge an 6 N NaOH (ungefähr 6 Tropfen pro 0,2 Gramm Anissäure) vorgelöst. Für das vierte Verdünnungsmittel wurde das Mittel, ANS, eingewogen, so daß sich eine Endkonzentration von 0,25 mM ergab, und zu einem Viertel des Endvolumens an Wasser gegeben. Das fünfte Verdünnungsmittel, die Kontrolle, enthielt kein Freisetzungsmittel. Zur Herstellung dieser fünf Verdünnungsmittel wurden jeweils die entsprechenden Mengen an 2 -Lösung, der 1 -Menge an BSA, dem Bestandteil 8 sowie der 1 -Menge Pluronic 25R-Lösung, Bestandteil 6, zusammengegeben. Von diesen wurden dann vier mit dem entsprechenden Mittel versetzt. Alle Lösungen wurden gut durchmischt. Falls notwendig, wurden pH-Einstellungen wie zuvor beschrieben vorgenommen, und jede Präparation wurde mit deionisiertem Wasser auf ihr Endvolumen gebracht, so daß die Bestandteile in 1×-Konzentrationen vorlagen. Jedes dieser A-Verdünnungsmittel wurde dann durch ein 0,2-Mikrometer-Filter filtriert. Alle pH-Endwertmessungen lagen zwischen 5,5 und 5,7. Für jedes dieser fünf A-Verdünnungsmittel wurde jeweils ein entsprechendes Reagens A hergestellt, indem Antikörper gegen MPA mit einer Endkonzentration von 6,5 μg/ml zugegeben wurde. Reagens B (Rgt B) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, außer daß der Bestandteil 20 weggelassen wurde und BLG durch 0,1% BSA (Miles Diagnostics, Kankakee, Illinois) ersetzt wurde.
Es sollte hier angemerkt werden, daß die ANS-Konzentration in Reagens A aufgrund ihres Beitrags zur Hintergrundabsorption begrenzt war. Höhere ANS-Konzentrationen führten zu einem Absorptionsmeßwert, der außerhalb der Meßskala lag, wodurch das Sammeln der Geschwindigkeitsdaten verhindert wurde. Es sollte weiterhin angemerkt werden, daß alle Reagens-A-Präparationen bei Sichtkontrolle farblos waren, außer die des Reagens A mit ANS, welche eine bräunlich-gelbe Farbe aufwies.
In insgesamt zwei Läufen wurden die Effekte jedes der vier Mittel relativ zu einer Kontrolle ohne Mittel im Hinblick auf (1) Hintergrundabsorption bei 340 nm, (2) der Geschwindigkeit einer negativen MPA-Probe, (3) dem Geschwindigkeitsunterschied zwischen 0 und 10 μg/ml MPA und (4) der Nähe der Übereinstimmung zwischen einem 10 μg/ml MPA-Zusatz in NHP und in Puffer untersucht. Beide Läufe enthielten die Kontrolle Reagens A. Im ersten Lauf wurde das Reagens A mit ANS bewertet, während im zweiten Lauf Reagens-A-Präparationen mit den Strukturisomeren der Anissäure ausgewertet wurden.
MPA wurde NHP und Puffer (Buff) so zugesetzt, daß eine Endkonzentration von 10 μg/ml MPA erzielt wurde. Bei dem Puffer handelte es sich in diesem Beispiel um 50 mM MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure, bezogen von Sigma Chemical Company) mit 0,1% (Gewicht/Volumen) Natriumazid, pH 7,1. Wie PBS enthält dieser Puffer kein Protein, womit keine Proteinbindung der MPA stattfinden kann.
In beiden Läufen wurde die Hintergrundabsorption bei 340 nm für jedes Reagens A jeweils in Doppelbestimmung in einem 230-μl-Ansatz aus 3 μl negativem NHP, 72 μl deionisiertem Wasser und 155 μl Reagens A gemessen. Die Schichtdicke der Zelle betrug 0,6 cm. Die Bemittelten A₃₄₀ (A = Absorption)-Werte finden sich in Spalte C der Tabelle 1. Die Geschwindigkeiten für NHP und Puffer, jeweils mit und ohne Zusatz, wurden in Doppelbestimmung ähnlich wie in Beispiel 1 ermittelt. Die einzigen Unterschiede zu Beispiel 1 hinsichtlich der Geschwindigkeitsbestimmungen bestanden im Zeitablauf der Vorschrift. Die Änderungen sind im folgenden angegeben. Reagens B und Wasser wurden in Zyklus 4 zugegeben. Die Analyse endete am Ende des Zyklus 15. Die Geschwindigkeiten wurden unter Verwendung der 5 Absorptionsmeßwerte der Zyklen 11 bis 15 bestimmt.
Mittelwerte dieser Geschwindigkeiten sind in Tabelle 2 in den Spalten E bis H zusammengefaßt.
Tabelle 2
Die Wirksamkeit des Freisetzungsmittels wurde bestimmt, indem die Geschwindigkeit für NHP mit Zusatz von der Geschwindigkeit des Puffers mit Zusatz subtrahiert wurde (Spalte H – Spalte F). Je näher dieser Wert bei Null lag, desto besser die Freisetzungswirkung. Auf der Grundlage dieses Kriteriums zeigten alle drei Anissäuremittel eine bessere MPA-Freisetzung im Vergleich mit der Kontrolle, wie anhand der Ergebnisse in Spalte J zu sehen ist. Somit verminderten bzw. beseitigten alle drei Anissäuremittel den NHP-Effekt auf die Messung der MPA, was darauf hindeutet, daß Gesamt-MPA gemessen wurde.
Weiterhin sieht man, daß, obwohl ANS als Freisetzungsmittel fungieren kann, ANS die Hintergrundabsorption verschlechterte (Spalte C und D), während die Strukturisomere der Anissäure keinen oder nur einen geringen Effekt auf die Hintergrundabsorption ausüben. Außerdem stellte sich heraus, daß sich Reagens A mit ANS deutlich verfärbt, wenn es mit Licht in Berührung kommt. Dies war nicht der Fall bei der Kontrolle oder den Anissäurereagenzien.
Alle vier Mittel zeigten gewisse positive bzw. tolerierbare Effekte gegenüber der negativen Geschwindigkeit und/oder dem Geschwindigkeitsunterschied verglichen mit Kontrollwerten. Dies deutete darauf hin, daß die Mittel neben der Verringerung des Matrixeffekts des NHP weitere Wirkungen aufwiesen. ANS wies den größten Anstieg beim Geschwindigkeitsunterschied auf. Die Anissäuren zeigten einen deutlichen Anstieg bei der negativen Geschwindigkeit gegenüber der Kontrolle, wohingegen ANS hier keine oder nur eine geringe Wirkung zeigte. Trotz des Auftretens dieser Effekte auf die negative Geschwindigkeit im Vergleich mit Reagenzien ohne Anissäure schien dies keine Auswirkung auf die Assayleistung zu haben, da die negativen Geschwindigkeiten für Puffer und NHP gleich waren (siehe Spalten E und G). Eine sehr gute Assayempfindlichkeit wurde mit o-Anissäure erzielt.
Insgesamt zeigten die Ergebnisse der Untersuchung, daß alle drei Anissäuren eine gute Leistung als Freisetzungsmittel zeigten, wobei o-Anissäure etwas bessere Ergebnisse zeigte als die meta- und para-Isomeren, bezogen auf den geringeren Effekt auf die negative Geschwindigkeit. Die Ergebnisse zeigten, daß ANS mehrere unerwünschte Auswirkungen auf die Leistung hatte, wie z. B. eine erhöhte Absorption und eine Verfärbung des Reagens bei Lichteinwirkung. ANS trägt in signifikanter Weise zur Hintergrundabsorption bei, selbst bei dem relativ niedrigen Konzentrationsniveau von 0,25 mM in Reagens A, womit ihre Verwendung in Assays, insbesondere in solchen mit einem Absorptionsmaximum, begrenzt ist.
Die Anissäureisomere zeigten diese Effekte auf die Absorption bzw. Färbung bei Lichteinwirkung nicht und waren allesamt wirkungsvoll bei der Freisetzung von MPA aus NHP, wie anhand der gleichwertigen oder nahezu gleichwertigen Geschwindigkeiten der MPA in einer Nicht-Protein-Matrix (Puffer) und NHP zu sehen ist. Ohne diese Mittel ergab die MPA in Puffer ein höhere Geschwindigkeit (mehr scheinbare MPA) als die gleiche Konzentration von MPA in NHP. Das ortho-Isomer hatte den geringsten Effekt auf die negative Geschwindigkeit. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß o-Anissäure zu einer äquivalenten MPA-Quantifizierung in einer Protein-freien Matrix und NHP führt.
Beispiel 3
Salicylsäure als Freisetzungsmittel
In einer separaten Untersuchung wurde ein weiteres Mittel, Salicylsäure (2-Hydroxybenzoesäure), mit 12,5 und 25 mM in das Reagens A formuliert. Dieses Mittel verringerte den Puffergeschwindigkeitsunterschied um 47% und erhöhte die negative Geschwindigkeit um 38% verglichen mit der Kontrolle ohne Freisetzungsmittel. Die Geschwindigkeiten wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Darüber hinaus trugen 25 mM Salicylsäure 0,311 Absorptionseinheiten oberhalb des Kontrollhintergrundes bei 340 nm bei. Es sollte ebenfalls angemerkt werden, daß die Reagens-A-Präparation der Salicylsäure eine leichte Pinkfärbung aufwies. Diese Farbe im sichtbaren Bereich sowie die Hintergrundabsorption bei 340 nm können auf die Wechselwirkung von Salicylsäure mit geringsten Konzentrationsniveaus an Eisensalzen zurückzuführen sein, wie im Merck-Index, elfte Auflage, Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, Seite 8300, angegeben. Aufgrund dieser experimentellen Ergebnisse wurde Salicylsäure von den ausführlicheren Vergleichsuntersuchungen ausgeschlossen.
Beispiel 4
Effekt der o-Anissäure auf MPA-Geschwindigkeiten in Gegenwart von gleichzeitig verabreichten Medikamenten und Salicylsäure
In einer getrennten Untersuchung wurde die Fähigkeit der o-Anissäure, den Effekt von Salicylat auf Geschwindigkeiten von MPA-Plasmazusätzen zu beseitigen, verglichen. Zwei Sätze von Antikörperreagenzien (Reagens A) wurden nach der oben in Beispiel 2 beschriebenen Grundformulierung hergestellt. Bei einem Reagens wurde kein Freisetzungsmittel zugegeben; bei einem weiteren Reagens wurde o-Anissäure mit 12,5 mM zugegeben. Ein gemeinsames Reagens B wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
Mit jedem Reagenziensatz wurden jeweils die Geschwindigkeiten für vier Konzentrationsniveaus von MPA-Zusätzen zu Plasma und eine Plasmakontrolle gemessen. Ein ähnlicher Satz Plasmazusätze wurde mit Plasma, das nicht störende, gleichzeitig verabreichte Medikamente enthielt, hergestellt, und ein weiterer Satz von Plasmazusätzen mit nicht störenden Medikamenten plus Salicylat wurde hergestellt. Die Konzentrationen der nicht störenden Medikamente in μg/ml waren wie folgt: Ampicillin, 36; Cefaclor, 26; Chloramphenicol, 64; Trimethoprim, 2; Albuterol, 7; Isoproterenol, 18; Metoprolol, 77; Diltiazem, 28; Nifedipin, 22; Verapamil, 12; Fenoprofen, 16; Indomethacin, 36; Ketoconazol, 75; Miconazol, 106; Isoniazid, 120; 5-Fluoruracil, 23; Griseofulvin, 10; Methotrexat, 2; Diphenhydramin, 93; Diephedrin, 103; Phenylephrin, 76; Disopyramid, 52; Procainamid, 64; Metoclopramid, 5; Niacin, 25; Niacinamid, 47; Acetaminophen, 87 und Lidocain, 43. Salicylat lag mit 659 μg/ml vor.
Die Geschwindigkeiten wurden wie in Beispiel 2 oben beschrieben bestimmt, mit Ausnahme des Absorptions-Ablesefensters, das bis zum Zyklus 20 erweitert wurde, wonach der Assay gestoppt wurde. Die Geschwindigkeiten wurden unter Verwendung der 10 aufeinanderfolgenden Absorptionsmeßwerte der Zyklen 11 bis 20 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3
Zusammengefaßt wurden durch Salicylat die Geschwindigkeiten der MPA in normalem menschlichem Plasma in Abwesenheit von Freisetzungsmitteln erhöht, was zu einer ungenauen Bestimmung der MPA in einem Assay führen könnte. Durch die Anwesenheit von o-Anissäure als Freisetzungsmittel im Antikörperreagens wurde dieses potentielle Problem bei einem Assay für MPA beseitigt.
Die obige Erörterung enthält gewisse Theorien bezüglich an der vorliegenden Erfindung beteiligter Mechanismen. Diese Theorien sollten nicht dahingehend verstanden werden, daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise beschränken, da gezeigt wurde, daß durch die vorliegende Erfindung die beschriebenen Ergebnisse erzielt werden.
Durch die obige Beschreibung und die obigen Beispiele wird die Erfindung einschließlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen vollständig offenbart.

Claims

Verfahren zur Freisetzung von Mycophenolsäure aus einem Komplex davon, wobei in dem Verfahren ein Medium, von dem vermutet wird, daß es den Komplex enthält, mit einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel:
worin R¹ Alkyl; R² Wasserstoff oder Alkyl; X O, S, oder N bedeutet; n gleich 1 ist, wenn X für O oder S steht, und n gleich 2 ist, wenn X für N steht; und m 1 oder 2 ist, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X für O steht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Verbindung um Methoxybenzoesäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei es sich bei der Verbindung um o-Methoxybenzoesäure handelt.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, wobei der Mycophenolsäurekomplex in einer Probe vorhanden ist und die Probe sowie die Verbindung und ein Bindungspartner für Mycophenolsäure in einem Assaymedium zur Bestimmung von Mycophenolsäure bereitgestellt werden und wobei die Menge der Verbindung ausreicht, um die Genauigkeit der Bestimmung zu verbessern.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem spezifischen Bindungspartner um einen Antikörper handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei ein markiertes Analog der Mycophenolsäure mit der Probe in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Bindungspartner an einen Träger gebunden ist oder dazu in der Lage ist, an einen Träger gebunden zu werden.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei es sich bei dem Komplex um einen Komplex aus Mycophenolsäure und endogenen Proteinen handelt und wobei an eine nachweisbare Markierung konjugierte Mycophenolsäure in einem wäßrigen Medium vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei der nachweisbaren Markierung um ein Enzym handelt und die Bestimmung die Messung der Aktivität des Enzyms umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei ein Substrat für das Enzym vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und alkalischer Phosphatase.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder dazu in der Lage ist, an einen Träger gebunden zu werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper dazu in der Lage ist, zwischen Mycophenolsäure und einem Ester davon zu unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper dazu in der Lage ist, zwischen Mycophenolsäure und einem Metaboliten der Mycophenolsäure zu unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem es sich um einen homogenen Immunassay handelt und wobei die Aktivität der nachweisbaren Markierung mit der bei einer Probe, die eine bekannte Menge der Mycophenolsäure enthält, beobachteten Enzymaktivität verglichen wird.
Kit zur Durchführung eines Assays zur Bestimmung von Mycophenolsäure, in dem in abgepackter Form: (a) ein Bindungspartner für die Mycophenolsäure (b) eine Verbindung der Formel
worin R¹ Alkyl; R² Wasserstoff oder Alkyl; X O, S, oder N bedeutet; n gleich 1 ist, wenn X für 0 oder S steht, und n gleich 2 ist, wenn X für N steht; und m 1 oder 2 ist, kombiniert sind.
Kit nach Anspruch 18, in dem weiterhin an eine nachweisbare Markierung gebundene Mycophenolsäure enthalten ist.
Kit nach Anspruch 18, wobei es sich bei der Verbindung um Methoxybenzoesäure handelt.
Kit nach Anspruch 18, wobei es sich bei der Verbindung um o-Methoxybenzoesäure handelt.
Kit nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Bindungspartner um einen Antikörper handelt.
Kit nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Kit nach Anspruch 22, wobei der Antikörper an einen Träger gebunden ist oder dazu in der Lage ist, an einen Träger gebunden zu werden.
Kit nach Anspruch 22, wobei der Antikörper dazu in der Lage ist, zwischen Mycophenolsäure und einem Ester davon zu unterscheiden.
Kit nach Anspruch 22, wobei der Antikörper dazu in der Lage ist, zwischen Mycophenolsäure und einem Metaboliten der Mycophenolsäure zu unterscheiden.