DE2830862C2

DE2830862C2 -

Info

Publication number: DE2830862C2
Application number: DE2830862A
Authority: DE
Inventors: Robert A. Mountain View Calif. Us Yoshida; Edward T. Redwood City Calif. Us Maggio; Robert F. Mountain View Calif. Us Zuk
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1977-07-14
Filing date: 1978-07-13
Publication date: 1988-06-01
Also published as: GB2001172B; CH648414A5; IT1105734B; IT7850259A0; DE2830862A1; AU3800278A; JPS5420134A; GB2001172A; AU518002B2; JPS631544B2; NL7807607A

Description

Das Interesse und das Bedürfnis zum Nachweis der verschie densten organischen Verbindungen nimmt in letzter Zeit ständig zu. Beispiele für Verbindungen, die dabei von Inte resse sind, sind Arzneistoffe, die bei der Behandlung von Krankheiten oder anormalen Zuständen verwendet werden, mißbräuchlich verwendete Drogen, natürliche, an den Körper funktionen beteiligte Verbindungen, umweltverschmutzende Bestandteile und Spurenverunreinigungen. Die hierbei besonders interessierenden Konzentrationen der meisten dieser Verbindungen liegen im allgemeinen in der Größenordnung von µg/ml oder darunter. In vielen Fällen sind dabei in der unmittelbaren Umgebung dieser Verbindungen eine oder mehrere Verbindungen ähnlicher Struktur vorhanden, so daß eine Unterscheidung von der in Frage stehenden Verbindung vorge nommen werden muß.

Es wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt, die als "kompetitive Proteinbindungstests" bezeichnet werden. Diese Bestimmungsverfahren beruhen auf der Fähigkeit eines Rezeptors, im allgemeinen eines Antikörpers, eine spezielle räumliche und ladungsmäßige Konformation zu erkennen. Die Bindung des Rezeptors an einen Liganden erlaubt eine Unterscheidung zwischen gebundenem und ungebundenem Liganden. Bei Verwendung eines markierten Liganden und bei Ermöglichung einer Konkurrenz zwischen markiertem Liganden und Liganden in der unbekannten Probe um den Rezeptor, ergibt sich eine Verteilung des Rezeptors zwischen markiertem und unmarkiertem Liganden. Bei Verwendung von entsprechenden Markierungen läßt sich eine Unterscheidung zwischen gebundenem, markiertem Liganden und ungebundenem, markiertem Liganden vornehmen, so daß dieses Verhältnis zur Menge des Liganden in der unbekannten Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Wenn der Rezeptor zu bestimmen ist, wird im wesentlichen das gleiche Verfahren angewendet, mit der Abänderung, daß der Rezeptor nicht zugesetzt wird und daß man keinen unmarkierten Liganden benötigt.

Bei der Entwicklung von kompetitiven Proteinbindungstests müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden. Ein wichtiger Gesichtspunkt liegt in der einfachen Herstellungs weise der verschiedenen Reagentien. Ebenfalls von Wichtigkeit sind die mit Handgriffen verbundenen Stufen des Tests, da es wünschenswert ist, die Fehlermöglichkeiten für das aus rührende Personal möglichst gering zu halten. Wichtig ist auch die Stabilität der Reagentien sowie die Einsetzbarkeit des Verfahrens mit zur Verfügung stehenden Vorrichtungen. Selbstverständlich ist es auch von Interesse, wie genau und zuverlässig das Verfahren bei geringen Materialkonzentra tionen arbeitet.

Aus der US-PS 38 17 837 ist ein homogener Enzymimmuntest bekannt. Die US-PSen 36 54 090, 37 91 932, 38 50 752 und 38 39 153 betreffen heterogene Enzymimmuntests. Auf dem Ninth Annual Symposium on Advanced Analytical Concepts for the Clinical Laboratory, 17. und 18. März 1977, Oakridge National Laboratory, wurde über einen Aufsatz von R. Wei und S. Reib mit dem Titel "Phospholipase C-Labeled Antihuman IgG: inhibition of enzyme activity by human IgG" berichtet. Die US-PSen 39 35 074 und 39 98 943 beschreiben Immuntests, bei denen eine sterische Hemmung zwischen zwei verschiedenen Rezeptoren für verschiedene epitope Stellen beteiligt ist. Carrico und Mitarb., Anal. Biochem., Bd. 72 (1976), S. 271 und Schroder und Mitarb., a.a.O., Bd. 72 (1976), S. 283 beschreiben kompetitive Proteinbindungstests, bei denen ein Marker an den Hapten gebunden wird, wobei der Marker einer enzymatischen Veränderung unter Erzeugung eines Signals unterzogen wird. Ein an das Enzym gebundener Antikörper hemmt eine Annäherung des Enzyms an die Markierung.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein empfind liches und genaues Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren, für dessen Durch führung in einem wäßrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt werden:

(A) die Probe,
(B) ein Enzymkonjugat, wobei das Enzym an einen der Bestandteile des immunologischen Paars gebunden (konjugiert) ist und das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält, wenn das Enzym konjugat an den reziproken Bestandteil des immuno logischen Paars unter Bildung eines Komplexes gebunden ist, und
(C) wenn es sich beim Enzymkonjugat und dem Analyten um den gleichen Bestandteil des immunologischen Paars handelt, der reziproke Bestandteil des immunologi schen Paars,
mit der Maßgabe, daß, wenn es sich um einen monoepitopen Liganden handelt und das Enzym mit dem Antiliganden konjugiert ist, ein Poly- (ligandenanaloges) im Testmedium enthalten ist, und
die enzymatische Aktivität im Medium im Vergleich zur enzymatischen Aktivität eines Mediums mit einer bekannten Analytenmenge bestimmt wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß man dem wäßrigen Medium zusätzlich
(D) einen Enzyminhibitor zusetzt, wobei der Inhibitor an einer Hemmung des Enzyms gehindert wird, wenn das Enzym im Komplex vorliegt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich ein zu analysierender Bestandteil (Analyt), der ein Bestandteil eines immunologischen Paars (Ligand und Rezeptor) darstellt, bestimmen. Das Verfahren beruht auf der Bildung eines Komplexes zwischen mindestens einem, im allge meinen mehr als einem, der Bestandteile des immunologischen Paars, einschließlich eines Enzyms, das entweder an einen Liganden (enzymgebundener Ligand) oder an einen Rezeptor (enzymgebundener Rezeptor) gebunden ist. Die Bildung des Komplexes verhindert die Annäherung des Enzymhibitors. Wenn das Enzymkonjugat mit dem gleichen Bestandteil des immuno logischen Paars wie der Analyt gebildet ist, wird der andere Bestandteil des immunologischen Paars als Reagenz zugesetzt. Dessen Zugabe ist aber nicht erforderlich, wenn das Enzym konjugat mit dem in bezug auf den Analyten homologen oder reziproken Bestandteil des immunologischen Paars gebildet ist.

Der Test wird in einem wäßrigen, gepufferten Medium durch geführt. Die einzelnen Reagentien können nach verschiedenen Verfahrensweisen gleichzeitig oder nacheinander zugesetzt werden. Die enzymatische Aktivität kann bestimmt werden, indem man die Enzymsubstrate zum Testmedium gibt. Durch einen Vergleich der an einer unbekannten Probe bestimmten enzymatischen Aktivität mit der Analytenmenge in einer bekannten Probe, kann die Analytenmenge in der unbekannten Probe halbquantitativ oder quantitativ bestimmt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines aus einem Enzymkonjugat, dem reziproken Bestand teil des immunologischen Paars, wenn es sich beim Analy ten und dem Enzymkonjugat um den gleichen Bestandteil des immunologischen Paars handelt, und einem Enzyminhibitor bestehenden Reagentiensatzes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren.

Erfindungsgemäß wird also ein empfindliches, genaues, Nachweis verfahren für einen Analyten zur Verfügung gestellt, bei dem eine Enzymmarkierung angewendet wird, wobei die enzymatische Aktivität im Testmedium mit der im Testmedium vor handenen Analytenmenge in Beziehung steht. Bei dem Verfahren wird ein Konjugat aus einem Enzym und einem Bestandteil eines immunologischen Paars angewendet, wobei das Enzymkonjugat einen wesentlichen Anteil seiner enzymatischen Aktivität, bis zu 100 Prozent der Aktivität des Enzymkonjugats, behält, wenn ein Komplex unter Beteiligung der Bestandteile des immunologischen Paars unter Einschluß von mindestens einem Enzymkonjugat gebildet wird. Ferner wird erfindungsgemäß ein Enzyminhibitor verwendet, der die enzymatische Aktivität wesentlich verringert. Bei diesem Verfahren wird die Annäherung des Enzyminhibitors an das Enzym durch den Komplex behindert. Bei Ligandentests mit enzymgebundenem Liganden wird die Menge des Antiliganden, der an den enzym gebundenen Liganden gebunden ist, durch die Menge des im Testmedium vorhandenen Liganden beeinflußt, während bei Antiligandentests mit enzymgebundenem Liganden die Menge des Antiliganden im Testmedium direkt in Beziehung zu dessen Menge in der unbekannten Probe steht. Bei Ligandentests mit enzymgebundenem Antiliganden steht die Menge des an den Liganden gebundenen, enzymgebundenen Antiliganden direkt in Beziehung mit der Menge des Liganden in der Probe, während bei Antiligandentests die Menge des an den Liganden gebundenen, enzymgebundenen Antiliganden durch die Menge des im Testmedium vorhandenen Antiliganden beeinflußt wird. Zweckmäßigerweise kann der Enzyminhibitor aus einem Anti körper für das Enzym bestehen, der in der Lage ist, bei Bindung an das Enzym die enzymatische Aktivität zu hemmen. Der Ligand oder enzymgebundene Ligand weist eine ausreichende Anzahl von epitopen Stellen auf, um die Annäherung des Enzyminhibitors zu hemmen, wenn diese Stellen mit Antiligandem bzw. enzymgebundenem Antiliganden gesättigt sind.

Nachstehend sind einige der hier verwendeten Begriffe erläutert:
Analyt: Zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, wobei es sich um mono- oder polyepitope, antigene oder haptenische, einzelne oder mehrere Verbindungen, die sich mindestens eine gemeinsame epitope Stelle eines Rezeptors teilen, handelt.

Ligand: Beliebige organische Verbindung, für die ein natür licher Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann.

Ligandenanaloges: Modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation bewirkt, daß das Ligandenanaloge an ein Enzym oder ein anderes Molekül gebunden werden kann.

Rezeptor: Eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung die in der Lage ist, eine spezielle räumliche oder ladungs mäßige Organisation eines Moleküls, d. h. einer epitopen Stelle, zu erkennen und normalerweise mehrwertig ist, d. h. mindestens zwei bindende Stellen aufweist. Spezielle Bei spiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Lectine und Fab-Fragmente. Für einen spezifischen Liganden wird der Rezeptor als Antiligand bezeichnet, beispielsweise wird ein Antikörper für ein Enzym als Antienzym bezeichnet. Der Rezeptor und dessen reziproker Ligand bilden ein immunologisches Paar.

Enzymgebundener Ligand: Ein Konjugat mit mindestens einem Enzymmolekül, das an mindestens ein Ligandenanaloges kovalent gebunden ist, wobei das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner enzymatischen Aktivität behält, wenn der Antiligand die zugänglichen epitopen Stellen absättigt, und die Bindung des Antiliganden an die ligandenepitopen Stellen die Bindung des Enzyminhibitors behindert.

Enzymgebundener Antiligand: Ein Konjugat mit mindestens einem Enzymmolekül, das an mindestens einen Rezeptor kovalent gebunden ist, wobei das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält, wenn das Konjugat die zugänglichen epitopen Stellen des Liganden absättigt, und die Bindung des Enzym-Antiliganden-Konjugats die Bindung des Enzyminhibitors behindert.

Komplex: Nicht-kovalente Bindung von mindestens einem der Bestandteile eines immunologischen Paars. Erfindungsgemäß umfaßt der Komplex im allgemeinen mindestens ein Enzymmolekül, das kovalent an einen der Bestandteile des immunologischen Paars gebunden (konjugiert) ist. Der Komplex kann relativ zweidimensional sein oder eine dreidimensionale Matrix darstellen, wobei in Analogie zu Polymerisaten, ge gebenenfalls Vernetzungen vorliegen können.

Enzyminhibitor: Ein Makromolekül, das zu einer wesentlichen Hemmung der enzymatischen Aktivität in der Lage ist, wenn es an ein Enzym gebunden ist. Die Hemmung ist entweder reversibel oder irreversibel. Die Hemmung des Enzyms wird verhindert, wenn der Rezeptor an den enzymgebundenen Liganden oder der enzymgebundenen Antiligand an den Liganden gebunden ist. Zweckmäßigerweise handelt es sich bei dem Enzyminhibitor um einen Antikörper, der ein spezielles Enzym erkennt und nach Bindung an das Enzym die enzymatische Aktivität wesentlich verringert, oder um ein Substrat, das an das Enzym gebunden wird und die gemessene enzymatische Aktivität verringert.

Nachstehend wird der erfindungsgemäße Test näher erläutert.

Der Test wird in einem wäßrigen Medium bei mäßigem pH-Wert durchgeführt, im allgemeinen in der Nähe des pH-Werts, bei der die Reaktion auf Veränderungen in der Analytenkonzentration möglichst groß ist. Das Testmedium zur Bestimmung des Analyten wird hergestellt, indem man eine entsprechend gepufferte wäßrige Lösung, die unbekannte Probe, die gegebenen falls eine Vorbehandlung unterzogen worden ist, das Enzym konjugat, den Enzyminhibitor, gegebenenfalls den reziproken Bestandteil des immunologischen Paars und Enzymsubstrate verwendet. Das Testmedium ist im allgemeinen homogen.

Das wäßrige Medium kann andere polare Lösungsmittel ent halten, beispielsweise oxygenierte organische Lösungsmittel mit 1 bis 6 und im allgemeinen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Alkohole und Ether. Im allgemeinen sind diese Kolösungs mittel in Mengen von weniger als etwa 20 Gewichtsprozent und insbesondere in Mengen von weniger als etwa 10 Gewichtspro zent vorhanden.

Der pH-Wert des Medium liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise von etwa 7 bis 9 und insbesondere von 7 bis 8,5. Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und zur Aufrechterhaltung dieses pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Beispiele für Puffer sind Borat-, Phosphat-, Tris- und Barbital puffer. Die Wahl des speziellen Puffers ist nicht kritisch, wobei aber in einzelnen Fällen einem Puffer der Vorzug gegeben werden kann.

Normalerweise wird der Test bei mäßigen Temperaturen durch geführt, wobei im allgemeinen während der Versuchsdauer die Temperatur konstant gehalten wird. Die Temperaturen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50 und insbesondere von etwa 15 bis 40°C.

Die Konzentration des zu bestimmenden Analyten variiert im allgemeinen von etwa 10^-4 bis 10^-15 und insbesondere von etwa 10^-6 bis 10^-13 m. Die Konzentration der anderen Reagentien wird normalerweise mit Rücksicht darauf festgelegt, ob der Test qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ durchgeführt werden soll und je nachdem welches Enzym und welches Nachweisverfahren für die enzymatische Aktivität gewählt wird und in welcher Konzentration der Analyt vorliegt. Bei einer kompetitiven Verfahrensweise, bei der die Reagentien um sterisch abgesperrte Stellen konkurrieren, sind die rela tiven Konzentrationen der Materialien recht wichtig. Dem gegenüber sind die relativen Konzentrationen der Reagentien zum Enzyminhibitor weniger wichtig, wenn andere Reagentien als der Enzyminhibitors zuerst zugesetzt werden und wenn nach der Zugabe eines Enzyminhibitors eine Gleichgewichtseinstellung ermöglicht wird.

Erfindungsgemäß wird die Bildung eines Komplexes zwischen den reziproken Bestandteilen eines immunologischen Paars dazu verwendet, die Annäherung eines Enzyminhibitors an ein Enzym, das kovalent an eines der Bestandteile gebunden ist, zu behindern. Das Enzym kann an beide Bestandteile des immuno logischen Paars gebunden sein. Somit umfaßt die Erfindung zwei Ausführungsformen:

(1) Test unter Beteiligung eines enzymgebundenen Liganden und
(2) Test unter Beteiligung eines enzymgebundenen Rezeptors.

Im folgenden wird zunächst auf die erste Ausführungsform, d. h. den Test unter Beteiligung eines enzymgebundenen Liganden, eingegangen.

Bei der ersten Ausführungsform wird die Menge des verwendeten Antiliganden normalerweise auf der Basis der Rezeptorstellen berechnet. Diese Menge kann mit der Konzentration des enzym gebundenen Liganden, dem Verhältnis von Liganden zu Enzym im enzymgebundenen Liganden und der Affinität des Rezeptors für den Liganden variieren. Im allgemeinen sind pro Molekül des enzymgebundenen Liganden mindestens eine aktive Rezeptor stelle und pro epitode Stelle des Liganden als enzymgebundenen Liganden weniger als etwa 20 aktive Stellen vorhanden. Das Verhältnis von epitoden Stellen an Rezeptor und Liganden kann aber auch eine Höhe von beispielsweise 100 : 1 erreichen, je nach der Art des Tests und der Affinität des Rezeptors. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Rezeptorbindungs stellen zu epitopen Stellen des Liganden als enzymgebundener Ligand mindestens 1, vorzugsweise mindestens 2 und nicht mehr als etwa 5 : 1.

Das Verhältnis von Enzym zu Liganden im enzymgebundenen Liganden kann je nach Enzym, insbesondere je nach dem Mole kulargewicht des Enzyms und der zugänglichen Stellen, sowie in Abhängigkeit vom Molekulargewicht des Liganden stark variieren. Für Haptentilganden mit einem Molekulargewicht unter 2000 und im allgemeinen unter 1200 liegt durchschnittlich mindestens 1 Ligand pro Enzym vor. Im allgemeinen ist nicht mehr als etwa 1 Ligand pro etwa 2000 Molekularge wichtseinheiten und insbesondere nicht mehr als 1 Ligand pro 5000 Molekulargewichtseinheiten des Enzyms vorhanden, insbesondere bei Enzymen mit einem Molekulargewicht unter 50 000. Bei antigenen Liganden, deren Molekulargewicht im allgemeinen über 2000 und insbesondere über 5000 liegt, besteht die Möglichkeit, daß für einen Liganden mehrere Enzyme existieren. Das Gewichtsverhältnis von Enzym zu Liganden kann von etwa 10^-6 bis 10² : 1 und insbesondere von etwa 10^-2 bis 10² : 1 variieren. Da der Ligand ein Virus oder eine Zelle sein kann, kann die Enzymanzahl bei einem derart großen Liganden in bezug auf das Molverhältnis groß und in bezug auf das Gewichtsverhältnis sehr klein sein. Bei Liganden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 600 000 ist im allgemeinen mindestens 1 Enzym pro Ligand und nicht mehr als 1 Enzym pro 5000 Molekulargewichtsein heiten des Liganden vorhanden.

Die Konzentrationen des enzymgebundenen Liganden und des Rezeptors (bezogen auf die Bindungsstellen) kann stark variieren. Sie betragen im allgemeinen etwa 10^-4 bis 10^-14 m und insbesondere 10^-6 bis 10^-12 m. Das Molverhältnis von enzym gebundenem Liganden zur maximalen in Frage kommenden Liganden konzentration beträgt im allgemeinen etwa 10^-4 bis 10 : 1 und insbesondere etwa 10^-3 bis 1 : 1.

Das Äquivalentverhältnis von Enzymhibitor zum Enzym, bezogen auf aktive Stellen, beträgt im allgemeinen etwa 0,1 und insbesondere mindestens 1. Der molare Überschuß kann 100-fach oder mehr sein.

Bei jedem speziellen Test werden die verschiedenen Ver hältnisse der Reagentien so ermittelt, daß Verhältnisse, die eine optimale Empfindlichkeit ergeben, gewährleistet sind. Die speziellen Verhältnisse hängen nicht nur von der Durchführungsweise des Tests, sondern jeweils auch vom Liganden, vom Enzym, dem Verhältnis von Enzym zu Liganden im enzymgebundenen Liganden, dem in Frage kommenden Kon zentrationsbereich und ähnlichen Faktoren ab.

Die Durchführungsweise des erfindungsgemäßen Tests kann stark variieren, je nach Art der Materialien, der gewünschten Empfindlichkeit und der Art der verwendeten Vorrichtung. Es können sowohl Kompetitiv- oder Gleichgewichtsverfahren angewendet werden. Bei der kompetitiven Ausführungsform konkurrieren sowohl die Antiligand als auch der Enzyminhibitor um den enzymgebundenen Liganden. Beim Gleichgewichtsver fahren kann der Antiligand mit dem enzymgebundenen Liganden ausreichend lang, daß sich ein Gleichgewicht einstellt, in Wechselwirkung treten. Anschließend wird dann der Enzym inhibitor zugesetzt. Der Enzymhibitor kann nur mit Enzym reagieren, bei dem nicht durch die Gegenwart des Antiliganden eine Annäherung sterisch verhindert wird.

Bei der kompetitiven Verfahrensweise zur Bestimmung des Liganden können der Antiligand und der Enzyminhibitor gleich zeitig zum Liganden und zum enzymgebundenen Liganden, zweck mäßigerweise als einziges Reagenz, zum Testmedium, das die Enzymsubstrate enthält, gegeben werden. Die enzymatische Aktivität wird zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten, die von der Zugabe der Reagentien ab gemessen werden, bestimmt. Die Differenz dieser beiden Werte kann mit Werte verglichen werden, die mit bekannten Ligandenmengen erhalten worden sind. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Substrate nach dem Zusatz der Reagentien zuzugeben und die Zeit von der Zugabe der Reagentien an zu berechnen. Zwischen der Zugabe der Reagentien und der Messung können verschiedene Inkubationszeiten eingehalten werden.

Beim Gleichgewichtsverfahren zur Bestimmung des Liganden wird der Antiligand gleichzeitig mit dem enzymgebundenen Liganden oder anschließend an die Zugabe desselben zum Liganden gegeben. Gemäß einer ersten Ausführungsform wird nach der Zugabe des Antiliganden und des enzymgebundenen Liganden das Testmedium ausreichend lang zur Erzielung des Gleichgewichtszustands inkubiert, wonach der Enzymin hibitor zugesetzt wird. Das Medium kann sodann ein zweites mal inkubiert werden, woran sich die Messungen der enzymatischen Aktivität anschließen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Antiliganden der Probe zuzusetzen und zu inkubieren, wonach die Zugabe des enzymgebundenen Liganden und eine weitere Inkubation erfolgt. Hierauf wird der Enzyminhibitor zugesetzt und gegebenenfalls eine dritte Inkubation vorgenommen. Es genügt zwar eine Messung, vorzugs weise werden jedoch für jeden Test zwei getrennte Messungen durchgeführt, wobei die Differenz zwischen den beiden Werten angegeben wird. In speziellen Fällen können auch Arbeitsweisen angewendet werden, die sich von den vorstehend ange gebenen unterscheiden.

Die Inkubationszeiten können stark variieren. Sie können weniger als 1/2 Minuten und im allgemeinen nicht mehr als 24 Stunden betragen. Vorzugsweise werden Inkubationszeiten von nicht mehr als 6 Stunden und insbesondere von nicht mehr als 30 Minuten eingehalten. Da das endgültige Ergebnis von den Ergebnissen abhängt, die mit Standards, die im wesent lichen auf die gleiche Weise und womöglich auf identische Weise behandelt worden sind, sind die spezielle Ausführungs form und die einzelnen Zeiten nicht kritisch, so lange bei verschiedenen Analytkonzentrationen signifikante, reprodu zierbare, unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden.

Je nach der Wahl des Testverfahrens, der verwendeten Vor richtung und der Konzentration des Analyten, kann das Test volumen bis herunter zu einem Volumen von 1 µl betragen. Im allgemeinen beträgt dieses Volumen mindestens 25 µl und insbesondere nicht mehr als 5 ml. Besonders bevorzugt ist ein Volumen von nicht mehr als etwa 2 ml.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann als Enzymin hibitor ein Fab-Fragment eines Antienzyms vorliegen. Dabei ist es zweckmäßig, den enzymgebundenen Liganden und das Fab-Antienzymfragment als ein einziges Reagenz zuzusetzen, so daß die Reagentien in einem vorbestimmten Verhältnis hergestellt werden können. Durch Vereinigung dieser Rea gentien werden Fehlermöglichkeiten verringert.

Bei der Bestimmung des Antiliganden wird im wesentlichen das vorbeschriebene Verfahren angewendet, mit der Abänderung, daß der enzymgebundene Ligand zuerst der Probe zugesetzt und inkubiert werden kann, wonach sich die Zugabe des Enzym inhibitors anschließt.

Nachstehend wird der erfindungsgemäße Test unter Verwendung von enzymgebundenen Antiliganden näher erläutert.

Im allgemeinen beträgt bei Polyepitopligandenanalyten die Konzentration des gesamten Antiliganden, bezogen auf die Bindungsstellen etwa das 1- bis 50-fache der minimalen oder maximalen in Frage kommenden Konzentration, bezogen auf die epitopen Stellen. Im allgemeinen beträgt diese Konzentration das 1- bis 10-fache und insbesondere das 1- bis 3-fache der maximalen in Frage kommenden Konzentration. Für mono epitope Ligandenanalyten und Rezeptoranalyten sind die ent sprechenden Konzentrationen von Poly-(ligandenanalogen) und markiertem Antiliganden etwa gleich der minimalen, in Frage kommenden Konzentration, bezogen auf bindende Stellen. Im allgemeinen geht diese Konzentration nicht über die maximale in Frage kommende Konzentration hinaus. Vorzugsweise beträgt sie nicht mehr als 10^-4 und insbesondere nicht mehr als 10^-2 der minimalen in Frage kommenden Konzentration. Die in Frage kommenden Konzentrations bereiche variieren im allgemeinen von etwa 10^-4 bis 10^-15 g/ml. Für monoepitope Analyten und Rezeptoranalyten betragen die Konzentrationen des gesamten Antiliganden, abgesehen von Analyten, bis zum 50-fachen der Konzentration des Poly-(ligandenanalogen) oder Liganden, vorzugsweise bis zum 10-fachen und insbesondere bis zum 3-fachen.

Die Konzentration des Enzyminhibitors variiert stark in Abhängigkeit von der Art des Inhibitors, dessen Wirksamkeit bei der Hemmung des Enzyms und ähnlichen Faktoren. Im allge meinen werden vernünftige Inhibitorüberschüsse verwendet, um eine rasche Hemmgeschwindigkeit zu gewährleisten und um sicherzustellen, daß die Konzentration des Inhibitors keine Beschränkung darstellt. Deshalb liegt der Enzyminhibitor in zumindest ausreichender Konzentration vor, um eine mindestens etwa 30-prozentige Hemmung und vorzugs weise eine 50-prozentige oder darüberliegende Hemmung zu ergeben. Dies bedeutet, daß in Abwesenheit des Analyten, eine Verringerung der enzymatischen Aktivität von mindestens 30 Prozent beobachtet wird.

Die Reihenfolge der Zugabe kann stark variieren. Im allge meinen werden die unbekannte Probe und der markierte Rezeptor vor Zugabe des Inhibitors in einem entsprechenden Medium vereinigt. Das Enzymsubstrat kann gleichzeitig oder anschließend an die Zugabe des Enzyminhibitors zugesetzt werden. Nach Vereinigung der unbekannten Probe mit dem markierten Rezeptor und gegebenenfalls mit dem Liganden oder dem Poly-(ligandenanalogen) kann das Testmedium für eine zur Komplexbildung ausreichende Zeit inkubiert werden.

Die Zeitspannen, die zwischen den verschiedenen Zugaben der Testbestandteile ablaufen und die für die beteiligten immuno logischen Reaktionen erforderlich sind, können je nach den beteiligten Verbindungen, der Art der Zugabe, der ange wandten Konzentrationen, der Bindungskonstanten der Rezeptoren und ähnlichen Faktoren stark variieren. Normaler weise betragen die Zeitspannen zwischen den einzelnen Zugaben wenige Sekunden bis viele Stunden. Im allgemeinen wird eine Zeitspanne von 12 Stunden und insbesondere von 6 Stunden nicht überschritten. Nach Zugabe der einzelnen Bestandteile zum Testgemisch können verschiedene Inkubations zeiten vor Zugabe des nächsten Bestandteils oder vor Durch führung der Messung eingehalten werden. Da die Endergebnisse von den Ergebnissen, die mit Standards, die im wesentlichen auf die gleiche Weise und womöglich auf identische Weise behandelt worden sind, abhängen, sind die einzelnen Ver fahrensweisen und Zeiten nicht kritisch, so lange bei unterschiedlichen Analytenkonzentrationen signifikante, reproduzierbare Unterschiede erhalten werden.

Je nach Wahl des Testverfahrens, der verwendeten Vorrichtung und der Analytenkonzentration können die Testvolumina bis auf etwa 1 µl heruntergehen. Im allgemeinen betragen sie mindestens 25 µl und insbesondere nicht mehr als 5 ml. Besonders bevorzugt sind Volumina von nicht mehr als etwa 2 ml.

Bei der Bestimmung des Antiliganden wird das gleiche Ver fahren angewendet, wobei aber das erhaltene Ergebnis ein Anstieg oder eine Abnahme des Signals in Abhängigkeit von den relativen Anteilen der verschiedenen Bestandteile sein kann. Dies bedeutet, daß der Antiligand das Enzym-Antiligand- Konjugat aus dem Komplex verdrängen kann oder die Komplex bildung fördern kann. Vorzugsweise wird eine Verfahrensweise angewendet, bei der der Antiligand das Enzym-Antiligand- Konjugat verdrängt.

Nachstehend werden die einzelnen Materialien näher erläutert.

Die Hauptbestandteile für den erfindungsgemäßen Test zur Bestimmung des Analyten sind: Der Analyt, enzymge bundener Ligand oder enzymgebundener Rezeptor, Enzym inhibitor und Enzymsubstrate.

Analyt

Der erfindungsgemäße Ligandenanalyt ist dadurch gekenn zeichnet, daß er monoepitop oder polyepitop ist. Bei den polyepitopen Ligandenanalyten handelt es sich im allgemeinen um Poly-(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Poly saccharide, Nucleinsäuren oder Kombinationen davon. Bei spielsweise für entsprechende Kombinationen sind Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne und Zellmembranen.

In den meisten Fällen haben die erfindungsgemäß verwendeten polyepitopen Ligandenanalyten ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000 und insbesondere von mindestens etwa 10 000. Die in Frage kommenden Polyaminosäuren haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 5 000 000 und ins besondere von etwa 20 000 bis etwa 1 000 000. In Frage kommende Proteine weisen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 600 000 auf, wozu Albumine und Globuline gehören. Das Molekulargewicht von in Frage kommenden Hormonen liegt bei etwa 5000 bis etwa 60 000.

Die monoepitopen Ligandenanalyten weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000 und insbesondere von 125 bis 1000 auf. Zu den in Frage kommenden Analyten gehören Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide und umweltver schmutzende Bestandteile.

Das Molekulargewicht von Rezeptoranalyten liegt im allge meinen im Bereich von 10 000 bis 2×10⁶ und insbesondere von 10 000 bis 10⁶. Bei den Immunoglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM variieren die Molekulargewichte im allgemeinen von etwa 160 000 bis etwa 10⁶. Enzyme weisen normalerweise ein Mole kulargewicht von etwa 10 000 bis etwa 600 000 auf. Natürliche Rezeptoren variieren stark in ihrem Molekulargewicht. Im allgemeinen beträgt dieses mindestens etwa 25 000 und kann bis zu 10⁶ oder darüber gehen. Hierzu gehören Substanzen, wie Avidin, thyroxinbindendes Globulin, thyroxinbindendes Prealbumin und Transcortin.

Weitere Beispiele für bestimmbare Analyten sind in der Offenlegungsschrift DE-OS 28 30 882, Seite 20-33, aufgeführt.

Enzymgebundene Liganden oder Rezeptoren

Das Enzymkonjugat wird hergestellt, indem man ein Enzym mit einem Bestandteil des immunologischen Paars konjugiert, entweder unter Verwendung eines difunktionellen Reagenz oder durch Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den im Bestandteil oder dem Enzym vorhandenen funktionellen Gruppen, die entweder natürlicherweise in diesen vorliegen oder durch Modifikation des Bestandteils oder des Enzyms eingeführt werden.

Die Anzahl der Enzyme pro Bestandteil des immunologischen Paars variiert stark je nach der Größe und der Art des Bestandteils des immunologischen Paars. Enzymgebundene Liganden unter Beteiligung von Haptenen weisen im allge meinen mindestens 1 und insbesondere mindestens 2 Haptene pro Enzym auf. Die Anzahl kann dem Molekulargewicht des Enzyms dividiert durch 15 000 entsprechen. Wenn der enzym gebundene Ligand Antigene umfaßt (Molekulargewicht <5000) kann das Molverhältnis von Enzym zu Ligand stark variieren, im allgemeinen liegt es im Bereich von etwa 0,01 bis 100 : 1. Wenn das Enzym an den Rezeptor gebunden ist, liegt das Mol verhältnis im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis 10 : 1.

Für eine Konjugation von Proteinen, einschließlich Enzymen, an eine Reihe von unterschiedlichen Materialien, wie Proteine, beispielsweise Antikörper, Polysaccharide und Nucleinsäuren, gibt es zahlreiche Beispiele in der Literatur. Es können die verschiedensten verbindenden Gruppen verwendet werden. Zweckmäßigerweise werden Nonoxocarbonyl-, Oxocar bonyl-, Diazo-, Sulfonyl-, Oximino-, Imido- und Thionogruppen verwendet. Bei Verwendung von Oxocarbonylgruppen wird vor zugsweise die reduktive Alkylierung angewendet. Die bindende Gruppe zwischen den funktionellen Gruppen kann aus einer einzelnen Bindung bestehen, im allgemeinen weist diese bindende Gruppe aber mindestens 1 Kohlenstoffatom, vorzugs weise mindestens 2 und nicht mehr als etwa 20 Kohlenstoff atome und insbesondere nicht mehr als 12 Kohlenstoffatome auf. Verfahren zur Konjugation von Enzymen an Proteine finden sich in den US-PS 37 91 932 und 38 39 153.

Verfahren zum Konjugieren von monoepitopen Liganden finden sich in der US-PS 38 17 837, insbesondere Spalten 31 bis 34, sowie in den Beispielen dieser Druckschrift.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymkonjugate ist es wünschenswert, daß ein wesentlicher Anteil der Aktivität des Enzymkonjugats erhalten bleibt, wenn ein Überschuß, bezogen auf bindende Stellen, des Rezeptors über den Liganden vorhanden ist, wobei das Enzym im Komplex (gebunden an einen der Bestandteile des Komplexes) einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält. Im allgemeinen bleiben mindestens etwa 20 Prozent der ursprünglichen Aktivität des Enzym konjugats und vorzugsweise mindestens etwa 30 und insbe sondere mindestens 50 Prozent erhalten. Es ist deshalb wünschenswert, daß Enzyme und Enzymkonjugate so verwendet werden, daß die Inaktivierung des Enzyms durch Bindung des Antiliganden an den Liganden verringert wird. Es können zwar beliebige Enzyme verwendet werden, meistens finden jedoch bestimmte Enzyme den Vorzug. Bei der Wahl eines Enzyms ist es wünschenswert, daß das Enzym nach der Konjugation eine hohe Wechselzahl (turnover rate) aufweist, daß das Enzym ohne signifikanten Aktivitätsver lust gelagert werden kann, daß ein zweckmäßiger Test für das Enzym zur Verfügung steht, der eine spektrophotometrische Bestimmung erlaubt, und daß der pH-Wert für die optimale Wechselzahl genügend nah am pH-Optimum für die Bindung des Antiliganden an den Liganden liegt. Selbstverständlich muß für die erfindungsgemäßen Zwecke auch ein makromolekularer Enzyminhibitor zur Verfügung stehen, der nach der Bindung des Antiliganden an den Liganden von einer Annäherung an das Enzym abgehalten wird. Ferner ist es auch wünschens wert, daß Enzymsubstrate zur Verfügung stehen, die ver glichen mit der Annäherung des Enzyminhibitors an das Enzym nicht von einer Annäherung an das aktive Zentrum des Enzyms abgehalten werden. Im allgemeinen weisen die Substrate Mole kulargewichte unter 5000, vorzugsweise unter etwa 2000 und insbesondere unter etwa 1000 auf.

In der nachstehenden Tabelle sind verschiedene Enzyme zusammengestellt, für die das erfindungsgemäße Verfahren von besonderem Interesse ist. Die Enzymnamen entsprechen der I.U.B.-Klassifikation.
1. Oxidoreduktase

1.1 Wirkung auf die CH-OH-Gruppe von Donatoren
- 1.1.1 Mit NAD oder NADP als Akzeptor
  - 1. Alkohol-dehydrogenase
  - 6. Glycerin-dehydrogenase
  - 26. Glyoxylat-reduktase
  - 27. L-Lactat-dehydrogenase
  - 37. Malat-dehydrogenase
  - 49. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
  - 17. Mannit-1-phosphat-dehydrogenase
- 1.1.2 Mit Cytochrom als Akzeptor
  - 3. L-Lactat-dehydrogenase
- 1.1.3 Mit O₂ als Akzeptor
  - 4. Glucose-oxidase
  - 9. Galactose-oxidase
1.2 Wirkung auf die CH-NH₂-Gruppe von Donatoren
- 1.4.5 Mit O₂ als Akzeptor
  - 2. L-Aminosäure-oxidase
  - 3. D-Aminosäure-oxidase
1.6 Wirkung auf reduziertes NAD oder NADP als Donator
- 1.6.99 Mit anderen Akzeptoren
  Diaphorase
1.10 Wirkung auf Diphenole und verwandte Substanzen als Donatoren
- 1.10.3 Mit O₂ als Akzeptor
  - 1. Polyphenol-oxidase
  - 3. Ascorbat-oxidase
1.11 Wirkung auf H₂O₂ als Akzeptor
- 1.11.1
  - 6. Katalase
  - 7. Peroxidase

3. Hydrolasen

3.1 Wirkung auf Ersterbindungen
- 3.1.1 Carbonsäureester-hydrolasen
  - 7. Cholinesterase
- 3.1.3 Phosphorsäuremonoester-hydrolasen
  - 1. alkalische Phosphatase
- 3.1.4 Phosphorsäurediester-hydrolasen
  - 3. Phospholipase C
3.2 Wirkung auf Glycosylverbindungen
- 3.2.1 Glycosid-hydrolasen
  - 1. α-Amylase
  - 4. Cellulase
  - 17. Lysozym
  - 23. β-Galactosidase
  - 27. Amylglucosidase
  - 31. β-Glucuronidase
3.4 Wirkung auf Peptidbindungen
- 3.4.2 Peptidyl-aminosäure-hydrolasen
  - 1. Carboxypeptidase A
- 3.4.4 Peptidyl-peptid-hydrolase
  - 5. α-Chymotrypsin
  - 10. Papain
3.5 Wirkung auf C-N-Bindungen mit Ausnahme von Peptid bindungen
- 3.5.1 In linearen Amiden
  - 5. Urease
3.6 Wirkung auf Säureanhydridbindungen
- 3.6.1 In Phosphorylgruppen enthaltenden Anhydriden
  - 1. Anorganische Pyrophosphatase

4. Lyasen

4.1 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen
- 4.1.2 Aldehyd-lyasen
  - 7. Aldolase
4.2 Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen
- 4.2.1 Hydrolasen
  - 1. Kohlensäureanhydrase
4.3 Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen
- 4.3.1 Ammoniaklyasen
  - 3. Histidase

Enzyminhibitoren

Enzyminhibitoren sind Makromoleküle, die auf das Enzym ein wirken oder mit diesem reagieren, so daß die Wechsel zahl des Enzyms wesentlich verringert wird und vorzugs weise auf 0 geht. Die Enzyminhibitoren können ihre Wirkung entweder auf physikalischem oder auf chemischem Wege erzielen. Eine physikalische Hemmung kann auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Entweder verhindert die Inhibitormasse die Annäherung des Enzymsubstrats oder die Bindung des Enzym inhibitors an das Enzym ergibt eine Konformationsänderung, die die Enzymaktivität beeinflußt. In einigen Fällen können beide Wirkungen gleichzeitig auftreten. In den meisten Fällen handelt es sich bei den physikalischen Inhibitoren um Antikörper, die das Enzym binden (Antienzym). Es können entweder ganze Antikörper oder Fab-Fragmente verwendet werden. Eine Anzahl von Antikörpern mit Hemmwirkung auf Enzyme sind im Handel erhältlich. Es können auch einzelne Enzyme als Antigene für die Herstellung von hemmenden Anti enzymen verwendet werden.

Bei chemisch wirkenden Inhibitoren tritt eine chemische Reaktion zwischen dem Inhibitor und dem Enzym ein. Es können insbesondere Inhibitoren verwendet werden, die mit dem Enzym reagieren und dabei die enzymatische Aktivität verringern oder ganz beseitigen. Es sind eine Reihe von irreversibel wirkenden Inhibitoren (Inaktivatoren) bekannt, die für bestimmte Enzyme spezifisch wirken und die verwendet werden können, soweit aus ihnen sogenannte "hub"-Makro moleküle entstehen und diese die Hemmwirkung behalten.

Nachstehend sind eine Reihe von Inhibitoren und die ent sprechenden Enzyme, die von diesen Inhibitoren gehemmt werden, zusammengestellt.

EnzymInhibitor

γ-Cystathionase2-Amino-4-pentinsäure (I)
2-Amino-4-chlor-4-pentensäure (II)
3-3-Dichloralanin (III)
3,3,3-Trichloralanin (IV) Alanin-racemase (IV)
D-Cycloserin
Tryptophanase (IV)
Tryptophan-synthase (β₂)
und (α₂b₂) (IV)
Lactat-oxidase2-Hydroxyl-3-butinsäure Monoamin-oxidaseN,N-Trimethyl-2-propinylamin
β-Aminopropionitril Plasma-amin-oxidase2-Bromethylamin
2-Propinylamin
2-Chlorallylamin
Phenylglycin
p-Nitrophenylglycin
Aminoacetonitril β-Cystathionase (IV)
2-Amino-3-hydroxypropyl-1-3′- carboxy-3′-amino-1′-propenyl-1- ether
Aspartat-aminotransferaseL-2-Amino-4-methoxy-trans-3- butensäure γ-Aminobuttersäure-α-
ketoglutarat-transaminaseEthanolamin-O-sulfat Formylglycinamid-ribonucleotid-
amidotransferaseAlbiziin
Azaserin
Diazooxonorleucin
Diazooxoanorvalin Transpeptidase (membrangebunden)6-Aminopenicillansäure B₆-gebundene EnzymeΔ³-7-Aminocephalosporinsäure
Mimosin Serin-proteasePhysostigim Glutamin-synthetaseMethionin-sulfoximin
Rotlauf-Toxin (wildfire toxin) Enzyme mit einem Bedarf
an Nucleotiden wie
Malatdehydrogenase und
LactatdehydrogenaseDextranblau Peroxidaseo-Dianisidin-dextran

Kompetitive, reversible Inhibitoren können verwendet werden, sind aber nicht bevorzugt, da sie mit dem Substrat um das Enzym konkurrieren und in unterschiedlichem Ausmaß die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit der Enzyme, die im mit nicht-gebundenem Enzym markierten Rezeptor vorhanden sind, verringert.

Neben den vorstehend aufgeführten, speziellen Enzymen können viele verwandte Enzyme verwendet werden, die durch die gleichen irreversiblen Inhibitoren inaktiviert werden. Es können auch viele Derivate von nicht-kompetitiven Inhibi toren hergestellt werden, die eine Hemmung durch Retention des aktiven Molekülteils hervorrufen können.

Handelt es sich beim Inhibitor nicht um ein Makromolekül, d. h. um ein Molekül mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 und insbesondere von mehr als 5000, so kann der Inhibitor an einen "hub"-Kern konjugiert werden, so daß er die erforderliche Größe erhält, daß eine Annäherung an den Komplex verhindert wird. Bei der Konjugation des Inhibi tors an einen "hub"-Kern wird eine Verbindungsstelle gewählt, die von dem Inhibitorteil, der an der Hemmreaktion beteiligt ist, entfernt liegt. Somit werden im allgemeinen vorzugsweise Inhibitoren verwendet, die Stellen aufweisen, die für die Hemmwirkung nicht kritisch sind, und die mit Enzymen, die in bezug auf die strukturellen Erfordernisse der entsprechenden Substrate nicht zu spezifisch sind, reagieren. Nachstehend sind Beispiele für mit Proteinmolekülen konjugierte Inhibitoren und für entsprechende Enzyme, die durch diese Inhibitoren gehemmt werden, aufgeführt.

A = O, NH, CH₂
P = PO₂H

Zur Verknüpfung des Inhibitors mit einem Makromolekül können herkömmliche Verfahren angewendet werden. Das jeweilige Verfahren hängt vom speziellen Inhibitor und von der Natur des "hub"-Kerns ab. In einigen Fällen kann das Vorliegen einer nicht-kovalenten Bindung des Inhibitors an ein Makromolekül vorliegen, wenn eine starke spezifische oder nicht-spezifische Bindung an den "hub"-Kern besteht, wobei noch eine Hemmung ermöglicht wird.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sämtliche Temperatur angaben sind in °C angegeben. Sofern nichts anderes ange geben ist, beziehen sich alle Prozent- und Teilangaben auf das Gewicht, mit Ausnahme von Flüssigkeitsgemischen, bei denen sich diese Angaben auf das Volumen beziehen. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden für die verschiedenen Reaktionen handelsübliche Produkte eingesetzt. Erläuterung von Abkürzungen: DMF = Dimethylformamid; THF = Tetrahydrofuran; G-6-PDH = Glucose-6-phosphat-dehydrogenase; BSA = Rinderserumalbumin; RSA = Kaninchenserumalbumin; HRP = Rettich-peroxidase; T-3 = Trÿodthyronin.

Beispiel 1 Konjugation von mit N-Methyl-N,N-dicarboxymethylaminanhydrid amidiertem Trÿodthyronin mit G-6-PDH (L. mesenteroides)

A. Die Umsetzung wird in einem 25 ml fassenden, mit einer Folie umwickelten Kolben, der mit einem Magnetrührer ausgerüstet ist und unter Argonatmosphäre steht, durchgeführt. Eine Lösung von 0,591 g T-3-Methylester-hydrochlorid wird in einem Lösungsmittelsystem aus 2 ml DMF und 2 ml THF gebildet. Diese Lösung wird mit 146 µl Triethylamin (1,25 Äquivalente) versetzt. Die Lösung wird 15 Minuten gerührt. Anschließend werden 0,130 g (1,20 Äquivalente) N-Methyl iminodiessigsäureanhydrid (MEMIDA-anhydrid) in einer einzigen Portion zugesetzt. Bei Dünnschichtchromatographie an SiO₂ ergibt sich eine vollständige Umsetzung (Lösungsmittel system für die Dünnschichtchromatographie Essigsäure/Methanol/ Chloroform = 5 : 10 : 85). Das Lösungsmittel wird mit einem Rotationsverdampfer entfernt, wobei zunächst eine Wasserstrahlpumpe und gegen Ende eine mechanische Vakuum pumpe verwendet wird. Die Wasserbadtemperatur steigt dabei nicht über 30°C. Der erhaltene Rückstand wird in 8,5 ml wasserfreiem THF gelöst. Die Lösung wird mit 76 ml Essigsäure ethylester versetzt. Das Gemisch wird gründlich geschüttelt. Die erhaltene Suspension wird mit Hilfe der Schwerkraft filtriert. Das Filtrat wird in einem Scheidetrichter mit 10 ml Wasser und sodann mit 20 ml gewaschen und sodann zur Trocknung 2 mal mit je 15 ml einer gesättigten Salzlösung versetzt. Eine weitere Trocknung wird mit MgSO₄ durchgeführt, welches anschließend mit Hilfe der Schwerkraft abfiltriert wird. Das Lösungsmittel wird am Rotationsver dampfer entfernt. Das Produkt wird in Chloroform suspendiert. Anschließend wird die Suspension mit Petrolether als Kolösungsmittel versetzt. Das Lösungsmittel wird sodann durch Filtration entfernt. Das feste Produkt wird in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Nach der Trocknung erhält man 0,346 g T-3-MEMIDA in Form eines weißen Pulvers.

B. In 1 ml THF werden 2,21 × 10^-2 g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Getrennt davon werden in 1 ml wasserfreiem THF 3,61 × 10^-2 g Dicyclohexylcarbodiimid gelöst. In einen Reaktions kolben werden 7 mg des vorstehend erhaltenen T-3-MEMIDA und 344 µl wasserfreies THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf Eisbadtemperatur gekühlt. Anschließend werden 46 µl der NHS-Lösung und 55 µl der DCC-Lösung zugesetzt. Das Reaktions gemisch wird gegen Lichteinstrahlung geschützt und etwa 27 Stunden im Kälteraum (2°C) gerührt. Hierauf wird die Lösung durch einen Glaswollpfropfen filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der erhaltene weiße Feststoff wird in etwa 1 ml einer Mischung von 20 Prozent n-Hexan in CH₂Cl₂ gelöst und mit einer mit Cellulosepulver gepackten Säule der Abmessungen 0,6 × 4,5 cm im gleichen Lösungsmittel chromatographiert. Die Elution wird mit dem vorgenannten Lösungsmittel mit schwerkraftbedingter Strömungsgeschwindigkeit durchgeführt. Es wird etwa die 2- fache Menge des Säulenvolumens an Laufmittel verwendet. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 0,25 ml aufgefangen. Die Fraktionen 2 bis 5 werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in wasserfreiem Diglykoldimethylether gelöst.

C. In 2 ml wasserfreiem 0,5 m Carbonatpuffer vom pH-Wert 9 werden 12,1 mg lyophilisiertes G-6-PDH (L. mesenteroides) gelöst. Die Lösung wird über Nacht gegen 350 ml des gleichen Puffers dialysiert. Der Rückstand im Dialyseschlauch wird mit Dialysat auf ein Volumen von 3 ml eingestellt.

Die Lösung wird sodann mit dem gleichen Puffer auf eine Konzentration von 2,16 mg/ml Enzym eingestellt. 3 ml der Lösung werden in einen Reaktionskolben gegeben, der mit einem Rührer ausgerüstet ist. Die Lösung wird über Nacht in einem Eisbad gekühlt. Sodann werden unter Kühlung 1 ml DMF in einer Geschwindigkeit von 150 µl pro Minute zugegeben. Anschließend wird ein Volumen von 1 ml entfernt. Die verbleibenden 3 ml werden nach folgenden Angaben mit T-3-MEMIDA-NHS- Ester in einer Konzentration von 0,385 Äquivalenten pro µl versetzt. Es werden zwei Zugaben von 10 µl, anschließend eine Zugabe von 20 µl, sodann zwei Zugaben von je 30 µl vorgenommen, wobei Abstände von 20 Minuten zwischen den einzelnen Zugaben eingehalten werden. Nach jeder Zugabe wird die enzymatische Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit von anti-T-3 ermittelt. Das Reaktionsgemisch wird in einen 23 mm- Spectrapor-Dialysebeutel ( Molekulargewicht-Ausschlußgrenze 25 000) gegeben und 2mal gegen je 0,5 Liter einer 0,05 m Tris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m KCl und 1 millimolar NaN₃ vom pH-Wert 8,0 im Kälteraum dialysiert. Die Dialyse wird wiederholt. Der nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 15 000 U/min und 2°C zur Entfernung des Dialyserückstands erhaltene Überstand wird an einer mit G-50M gepackten Säule der Abmessungen 0,9 × 98,5 cm in 0,05 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,1 m KCl und 1 millimolar NaN₃ chromatographiert. Die Elution wird mit dem vorgenannten Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 Tropfen/min durchgeführt. Es werden Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen. Die Fraktionen 29 bis 33 werden vereinigt und 10 Minuten bei 1°C und 17 000 U/min zentrifugiert.

In eine kalte Reaktionsampulle (Pierce Reactivial), die mit einem Rührstab versehen ist, werden 3 ml der vorgenannten Lösung und 1 ml einer kalten 4 m neutralisierten Hydroxyl aminlösung in Wasser innerhalb von 5 Minuten langsam zugegeben, wobei gerührt wird. Nach 10-minütiger Umsetzung bei Eisbadtemperatur wird die Reaktion weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Sodann wird das Reaktionsgemisch an einer der Sephadex G-50M gepackten Säule im vorstehend erläuterten Tris-Puffer chromatographiert und mit dem gleichen Puffer bei Raumtemperatur eluiert. Die Abmessungen der Säule sind 0,9 × 98 cm. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 4 Tropfen/min. Es werden Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen. Die Fraktionen 29 bis 34 werden vereinigt und im Kälteraum unter Verwendung einer Vorrichtung mit einem Collodiumbeutel mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 25 000 eingeengt. Der Rückstand wird mit 2 ml des vorstehend erläuterten Tris-HCl-Puffers eingestellt. Ein 1 ml- Aliquotanteil wird 2mal gegen je 250 ml kalten 50 millimolaren Carbonatpuffer vom pH-Wert 9,05 dialysiert.

Aufgrund einer Proteinbestimmung nach Lowry und einer radio aktiven Zählung (das MEMIDA ist mit ¹⁴C markiert) wird eine Anzahl von etwa 16 T-3-Gruppen pro Enzym berechnet.

Beispiel 2 Herstellung eines Konjugats aus Digoxin und G-6-PDH

A. Eine klare Lösung von 228 g (0,59 Millimol) 3-Keto digoxigenin, 140 mg (0,64 Millimol) Carboxymethoxylamin hydrochlorid und 294 mg (3,6 Millimol) Natriumacetat in 18 ml Methanol (getrocknet über Molekularsieb 3A) wird 3 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Die dünnschichtchromatographische Analyse eines Aliquotanteils ergibt eine vollständige Bildung des Oxinderivats (R_f-Wert = 0,33, Kieselgelplatte, Laufmittel: Essigsäure, Methanol und CHCl₃ = 0,5 : 1 : 10). Das erhaltene Reaktionsprodukt wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird bei 5 bis 10°C in 32 ml 5-prozentiger Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst. Die Lösung wird 3mal mit je 20 ml Chloroform extrahiert. Die Natriumhydrogencarbonatphase wird bei 5 bis 10°C mit 28 ml 1n Salzsäure auf den pH-Wert 2 bis 3 angesäuert und 10mal mit je 25 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die Essigsäureethylesterextrakte werden mit gesättigter Natrium chloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhält man einen Feststoff, der nach Kristallisation aus einer Mischung von Methanol, Essigsäureethylester und Hexan 188 mg weißen Feststoff vom F. 202 bis 220°C (Zers.) ergibt.

B. Ein trockener Kolben, der mit einem Serumstropfen und einem Trockenrohr versehen ist, wird mit 23,05 mg (0,05 Millimol) des Oxims und 250 µl DMF (getrocknet über 4°A-Molekularsieb) versetzt. Durch den Serumstropfen werden 7,1 µl (0,052 Millimol) wasserfreies Triethylamin mit einer Spritze zugesetzt, wobei bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach dem Abkühlen des Gemisches auf -14°C werden 9,34 µl (0,05 Millimol) Ethylen glykolchlorameisensäureester (carbitol chloroformate) unter die Oberfläche der Lösung gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt.

In einem getrennten Kolben werden 2 ml Glucose-6-phosphat- dehydrogenase (G-6-PDH) in einer Konzentration von etwa 1 bis 2 mg/ml in 0,55 m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,1 unter Rühren mit 20 mg Dinatriumsalz von Glucose-6-phosphat und mit 40 mg NADH versetzt. Während der Umsetzung werden Aliquot anteile entnommen, deren enzymatische Aktivität bestimmt wird, indem man einen 5 µl-Aliquotanteil der verdünnten Enzymlösung mit 1 ml Puffer und 50 µl Substrat verdünnt, die erhaltene Lösung in einen 1,5 ml Probenbehälter einführt und eine Durchflußzelle verwendet. Die Ablesung der enzymatischen Aktivität wird in Abständen von 60 Sekunden in einem Gilford- Spectrophotometer vorgenommen. Das Gemisch wird sodann auf 0°C gekühlt und langsam unter Rühren mit 1,08 ml Carbitol versetzt, das mit einer Spritze unter die Oberfläche der Lösung gegeben wird. Nach 30-minütigem Stehenlassen wird der gebildete Niederschlag 4 Minuten mit einer Brinkman-Zentrifuge abzentrifugiert. Der abgetrennte Überstand wird mit 1 n NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von etwa 9,0 gebracht. Zu diesem Zeitpunkt wird die enzymatische Aktivität kontrolliert.

Die Enzymlösung wird unter Rühren mit 1 µl Aliquotanteilen des auf die vorstehende Weise hergestellten gemischten Anhydrids in einer Geschwindigkeit von etwa 1 µl pro 1 Minute versetzt. Nach Zugabe von 10 µl des gemischten Anhydrids wird die prozentuale Hemmung und die prozentuale Inaktivierung ermittelt. Die prozentuale Hemmung wird bestimmt, indem man etwa 5 µl vollaktives Antidigoxin im vorgenannten Test verwendet. Etwa 35 bis 45 µl des gemischten Anhydrids werden zugesetzt, um eine Hemmung von etwa 50 Prozent und eine Inaktivierung von etwa 36 Prozent zu erzielen. Nach Erreichen der gewünschten Hemmung und Inaktivierung wird das Enzymkonjugat durch Dialyse gegen 0,055 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,1 mit einem Gehalt an 0,05 Prozent NaN₃ und 0,005 Prozent Thiomersal gereinigt.

Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhält man in einer ersten Umsetzung ein Enzymkonjugat mit 5 an das Enzym gebundenen Digoxingruppen, wobei das Enzym zu 36 Prozent inaktiviert und zu 50 Prozent gehemmt ist. In einer zweiten Reaktionsfolge erhält man ein Enzymkonjugat mit 9,2 Digoxin gruppen, wobei eine 48-prozentige Inaktivierung und 62-prozentige Hemmung vorliegt.

Beispiel 3 Konjugation von menschlichem γ-Globulin (hIgG) an HRP

A. 10,95 g lyophilisiertes HRP werden in 0,5 ml 0,3 m NaHCO₃- Puffer vom pH-Wert 8,6 gelöst. Die Lösung wird in einen Dialysebeutel gegeben und gegen 500 ml eiskalten Puffer (vgl. oben) 3 Stunden im Kälteraum dialysiert. Sodann wird der pH-Wert der Lösung auf 8,1 eingestellt und die Lösung wird weitere 4 Stunden dialysiert. Das Volumen der HRP-Lösung wird mit Dialysat auf 2 ml eingestellt. Nach spectrophoto metrischer Analyse ergibt sich eine Konzentration von 3,46 mg/ ml.

B. 1,5 ml der vorstehenden Lösung werden bei Raumtemperatur unter Rühren in 100 µl einer 1-prozentigen Lösung von Fluordinitrobenzol in 95-prozentigem Ethanol versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, wobei direkter Lichteinfall vermieden wird. Anschließend werden 1 ml einer 40 milli molaren Perjodatlösung zugesetzt. Das Gemisch wird unter den gleichen Bedingungen 1/2 Stunde gerührt. Anschließend werden 0,5 ml einer 0,34 m wäßrigen Ethylenglykollösung zugesetzt. Nach weiterem Rühren von 1 Stunde unter den gleichen Bedingungen wird das Reaktionsgemisch in einen Dialysebeutel gegeben und 3mal gegen je 900 ml 10 millimolaren NaHCO₃- Puffer vom pH-Wert 9,5 im Kälteraum dialysiert.

C. 9,7 mg lyophilisiertes hIgG (Miles Laboratories, lyophilisiert und mit DEAE-Cellulose behandelt, Chargen Nr. 24) werden in 0,5 ml 10 millimolarem NaHCO₃-Puffer vom pH-Wert 9,5 gelöst. Die Lösung wird 2mal gegen je 500 ml eiskalten Puffer (vgl. oben) dialysiert. Anschließend wird die Lösung mit Dialysat auf ein Volumen von 1,2 ml eingestellt. Nach 4-minütigem Zentrifugieren mit einer Brinkman-Mikrozentrifuge bei 2 bis 4°C ergibt die spectrophotometrische Analyse eine Konzentration von 5,28 mg/ml.

D. Der dialysierte Rückstand des HRP-Dialdehyds (5,2 ml HRP, 1,3 × 10^-1 µMol) wird bei 2 bis 4°C unter Rühren mit 0,95 ml des dialysierten hIgG-Rückstands (5 mg, 3,1 × 10^-2 µMol) versetzt. Das Gemisch wird 45 Minuten gerührt. Anschließend wird das Gemisch mit 5 mg (1,32 × 10^-4 Mol) NaBH₄ versetzt. Das Gemisch wird 4½ Stunden bei 2 bis 4°C gerührt und sodann 2 mal gegen je 300 ml PBS (10 millimolar N₂HPO₄, 0,15 m NaCl, pH-Wert 7,0) im Kälteraum dialysiert. Der Dialyse rückstand wird mit einer Collodiumbeutel-Vorrichtung (Molekular gewichts-Auschlußgrenze 25 000) im Kälteraum weiter auf ein Volumen von etwa 1 ml eingeengt und sodann im Kälteraum 2 Minuten mit einer Brinkman-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird an einer mit Sephadex G-200 gepackten Säule (Gel in PBS) chromatographiert. Zur Elution wird der vorgenannte PBS-Puffer verwendet. Die Strömungs geschwindigkeit beträgt 1 Tropfen pro 30 Sekunden. Es werden Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen. Der Arbeits druck beträgt 15 cm. Die Chromatographie wird bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die verschiedenen Fraktionen werden spectrophotometrisch analysiert. Ferner wird ihre enzymatische Aktivität bestimmt. Die Fraktion 48 enthält 1,65 × 10^-6 HRP und 1,32 × 10^-6 hIgG, entsprechend einem Verhältnis von hIgG zu HRP von 0,80. Der Enzymtest wird weiter unten erläutert.

Beispiel 4 Konjugation von hIgG an G-6-PDH

Ein mit Eis gekühlter Reaktionskolben wird mit 0,42 µMol [¹⁴C]-hIgG in 0,5 m NaHCO₃-Puffer vom pH-Wert 10 versetzt. Anschließend werden 0,52 g (4,2 × 10^-3 m) Ethylacetimidat in 3 ml entionisiertem Wasser, das mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 10 eingestellt ist, zugegeben. Nach 5-minütigem Rühren bei 4°C wird das Gemisch 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Eine zweite Zugabe der gleichen Menge an Ethyl acetimidat wird unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Zugabe vorgenommen. Sodann wird die Reaktionslösung in einen Dialysebeutel übertragen und 3 mal bei 2°C gegen je 1400 ml 0,5 m K₂HPO₄ dialysiert. Nach dem Einstellen des pH-Werts mit konzentrierter Salzsäure auf 7,8 wird die Lösung im Beutel in zwei Teile geteilt und 30 Minuten bei 12 K und 2°C in einer Sorval-Zentrifuge zentrifugiert. Die Lösung wird sodann in einer Collodiumbeutel-Apparatur gegen PBS vom pH-Wert 7,8 eingeengt.

Durch 9-stündige Behandlung auf einem siedenden Wasserbad wird Sephadex G-200 gequollen. Mit dem gequollenen Sephadex G-200 wird eine Säule der Abmessungen 2 × 89 cm in PBS vom pH-Wert 6,7 geschüttet. Ein Teil der vorgenannten Lösung wird auf die Säule aufgesetzt. Die Fraktionen werden mit PBS vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,02 Prozent NaN₃ eluiert. Die mit dem ungleichmäßig arbeitenden Fraktions sammler erhaltenen Fraktionen 113 bis 145 werden vereinigt und gegen 100 millimolaren Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 dialysiert, wobei 1 mal gegen 1200 ml und 2 mal gegen 1000 ml Puffer dialysiert wird. Das ursprüngliche Volumen beträgt 38 ml und das Endvolumen 35 ml. Die Lösung wird sodann mit einer Collodiumbeutel-Vorrichtung auf ein Volumen von 6,2 ml mit einem Gehalt an 2,36 mg/ml hIgG eingeengt.

B. 1 ml der vorgenannten Lösung (1,48 × 10^-8 Mol hIgG) wird mit 1 ml 0,06 m Natriumperjodat (6 × 10^-5 Mol) in Wasser vom pH-Wert 8,1 versetzt. Das Gemisch wird 3½ Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Gemisch mit 1 ml 0,16 m wäßrigem Ethylenglykol versetzt. Das Gemisch wird 1½ Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in einen Dialysebeutel gegeben und 3 mal gegen 500 ml 50 millimolaren NaHCO₃-Puffer vom pH-Wert 9 und anschließend gegen 500 ml 200 millimolaren NaHCO₃- Puffer vom pH-Wert 8,8 dialysiert.

C. Etwa 3,5 ml G-6-PDH (L. mesenteroides, Chargen Nr. 6A053-402) werden gründlich gegen 200 ml 200 millimolaren NaHCO₃-Puffer vom pH-Wert 8,8 dialysiert.

Die Lösungen von hIgG (2,27 mg 1,42 × 10^-8 Mol) und G-6-PDH (8,82 mg, 8,84 × 10^-8 Mol) werden vereinigt, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 6,6 ml ergibt. Diese Lösung wird gerührt und mit einem Eisbad gekühlt. Anschließend wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 4 Stunden gerührt.

Nach dem Abkühlen des Gemisches in einem Eis/Wasserbad werden 5 mg NaBH₄ zugesetzt. Das Gemisch wird 3½ Stunden in einem Eisbad stehengelassen. Anschließend wird die Lösung in einen Dialysebeutel gegeben und gründlich bei 2 bis 4°C gegen 10 millimolaren K₂HPO₄-Puffer mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl vom pH-Wert 9 dialysiert. Hierauf wird das Reaktionsgemisch in einer Collodiumbeutel-Vorrichtung gegen PBS vom pH-Wert 7,0 auf ein Volumen von 2,4 ml eingeengt.

Eine Säule der Abmessungen 2 × 84 cm wird mit Sephadex G-200 in PBS vom pH-Wert 7,0 geschüttet. Das Reaktionsgemisch wird auf die Säule aufgesetzt und mit PBS vom pH-Wert 7,0 bei Raum temperatur eluiert, wobei Fraktionen mit 40 Tropfen aufgefangen werden. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 5 Tropfen/ min, wobei ein Druckknopf von etwa 18 cm verwendet wird. Die Fraktionen werden auf ihre enzymatische Aktivität und auf ihre Radioaktivität untersucht. Der Enzymtest ist weiter unten erläutert.

Beispiel 5 Konjugation von o-Dianisidin an Dextran 10

Eine Lösung von 0,5 g Dextran 10 in 2 ml Wasser wird auf 4°C gekühlt und mit 250 µl einer Lösung von 100 mg/ml CNBr in Wasser von 4°C versetzt. Der pH-Wert wird durch kontinuierliche Zugabe von 1 n NaOH auf 11 gehalten. Nach 5 Minuten wird ein 200 µl-Aliquotanteil entnommen und mit Aceton versetzt. Die Lösung wird 5 Minuten bei 4°C und 10 K zentrifugiert. Der Zentrifugenrückstand wird isoliert und in einem Gemisch aus DMF/0,1 m Hydrogencarbonatpuffer vom pH-Wert 9 gelöst. Eine Lösung von 20 mg o-Dianisidin pro 1 ml im gleichen Gemisch wird zugesetzt, wobei sich ein Molverhältnis von Dextran 10 zu o-Dianisidin von 1 : 10 ergibt. Der pH-Wert wird auf 9 eingestellt. Sodann wird das Reaktionsgemisch über Nacht im Dunklen unter leichtem Rühren stehengelassen. Anschließend wird das Gemisch mit 100 µl 1 m wäßrigem 1-Amino-2- propanol versetzt. Der pH-Wert wird mit 1 n HCl auf 9 eingestellt. Anschließend wird das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen stehengelassen. Sodann wird der pH-Wert auf 7 eingestellt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 4°C und 10 K wird der Überstand isoliert.

Eine mit Sephadex G-25 gepackte Säule der Abmessungen 2 × 40 cm in 0,01 m PO₄-Puffer mit einem Gehalt an 0,2 m NaCl vom pH-Wert 7 wird mit dem vorstehenden Überstand versetzt. Das Produkt wird mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 35 ml/Std. eluiert. Es werden Fraktionen von 80 Tropfen aufgefangen, wobei die Säule im Dunklen gehalten wird. Die Fraktionen 21 bis 25 werden vereinigt.

Beispiel 6 Konjugation von Rettich-Peroxidase (HRP) an anti-(hIgG)

In einen Dialysebeutel werden 4 ml anti-(hIgG) (F_c-spezifisch; Dako Chargen Nr. 015, Titer 600 µg/ml) mit einem Gehalt an 8,5 mg/ml gegeben. Sodann wird 3 mal gegen je 350 ml 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 bei 2 bis 4°C in einem Kälteraum dialysiert. Der Rückstand wird mit 5,1 ml Dialysat verdünnt und 10 Minuten bei 2 bis 4°C und 15 000 U/min zentrifugiert.

Ein 10 ml fassender Rundkolben wird mit 5 ml (32,3 mg) der vorstehend erhaltenen anti-(hIgG)-Lösung mit einem Gehalt an 6,45 mg/ml versetzt. Unter Kühlung in einem Eisbad und unter Rühren werden 15 µl einer 1,5 × 10^-2 m Lösung von [¹⁴C]-Essigsäureanhydrid in Benzol zugegeben. Nach 2¾ Stunden wird die Reaktion durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von 2 m Hydroxylamin und 2 m NaCl gestoppt. Nach dem Entfernen des Eisbades wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Dialyse gegen 350 ml 0,1 m Natriumphosphat lösung mit einem Gehalt an 0,1 m Natriumsulfat vom pH-Wert 7,1 wird der Rückstand an G-25 M-Gel, das mit dem vorge nannten Dialysepuffer gequollen ist, in einer Säule der Abmessungen 2 × 44 cm chromatographiert. Die Elution wird mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Die Strömungsge schwindigkeit beträgt 10 Tropfen/min (36 ml/Std.). Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 2,4 ml aufgefangen. Die die Radioaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Es ergibt sich ein Gesamtvolumen von 23 ml mit einem Gehalt an 31,5 mg anti-(hIgG). Ein Anteil von 22,5 ml (30,8 mg) des anti-(hIgG) werden in einen Dialysebeutel gegeben und 3-mal gegen 1 Liter eiskalte, zu 90 Prozent gesättigte Ammoniumsulfatlösung im Kälteraum dialysiert.

Rettich-Peroxidase (Sigma VI, Chargen Nr. 65C-9530) werden in gesättigter Ammoniumsulfatlösung gelöst. Man erhält eine Lösung mit einem Gehalt an 6,5 mg/ml. Ein 1 ml-Aliquotanteil wird 4 Minuten im Kälteraum zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Zentrifugationsrückstand wird in 5 ml eiskalter 0,3 m Natriumhydrogencarbonatlösung vom pH-Wert 8,5 gelöst und 3 mal gegen je 400 ml 0,3 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom pH-Wert 8,5 im Kälteraum dialysiert.

Das dialysierte anti-(hIgG) wird mit Dialysat auf 17 ml verdünnt, wodurch sich eine Konzentration von 1,81 mg/ml ergibt. Ein 3 ml-Aliquotanteil (5,4 mg) dieser Lösung bei 50-prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat wird 5 Minuten bei 2 bis 4°C und 10 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 0,5 ml 10 millimolarer Natrium hydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffer vom pH-Wert 9,5 gelöst. Die Lösung wird 3 mal gegen je 350 ml des gleichen Puffers dialysiert. Der aus Rettich-Peroxidase bestehende Rückstand wird mit dem Dialysat auf1,1 ml verdünnt. Die UV- Analyse eines Aliquotanteils ergibt eine Konzentration von 6,31 mg/ml.

0,8 ml der vorstehenden HRP-Lösung werden zu 0,2 ml Natrium hydrogencarbonatpuffer gegeben, wobei sich ein Gesamtvolumen von 1 ml ergibt. Unter Rühren werden 100 µl einer 1-prozentigen Lösung von 2,4-Dinitrofluorbenzol in 95-prozentigem Ethanol zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und dabei gegen Licht geschützt. Anschließend wird das Gemisch tropfenweise mit 1 ml einer wäßrigen 30,2 millimolaren Natriumperjodadlösung versetzt. Das Gemisch wird ½ Stunde gerührt und dabei gegen Licht geschützt. Hierauf wird 1 ml einer wäßrigen 0,34 m Ethylen glykollösung zugesetzt. Das Gemisch wird eine ¾ Stunde gerührt und anschließend 2mal gegen je 350 ml eines eiskalten 10 millimolaren Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat- Puffers vom pH-Wert 9,5 dialysiert.

Ein Reaktionskolben wird mit 1 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 4,5 mg/ml anti-(hIgG) iM Natriumhydrogencarbonat/ Natriumcarbonat-Puffer versetzt. Anschließend wird die Lösung des Reaktionsprodukts aus Rettich-Peroxidase und Perjodad zugesetzt. Das HRP/anti-(hIgG)M-Verhältnis beträgt 4,2. Nach 30-minütigem Rühren werden 5,05 mg Natriumborhydrid zugesetzt. Sodann wird das Gemisch 5½ Stunden bei Eisbad temperatur gerührt. Anschließend wird gegen 350 ml einer 0,1 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 7,1 mit einem Gehalt an 0,1 m Natriumsulfat und hierauf gegen wäßriges gesättigtes Ammoniumsulfat dialysiert. Der Rückstand wird 4 Minuten bei 2 bis 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Rückstand wird in 0,4 ml Phosphat-Sulfat- Puffer gelöst. Die Lösung wird an einer mit Sephadex G-200- Säule (Gel im gleichen Puffer gequollen) der Abmessungen 1,5 × 88 cm chromatographiert. Die Elution wird mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 Tropfen/min. Es werden Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen. Die Fraktionen mit einer Absorption im UV-Bereich bei 403 nm und 280 nm werden vereinigt und gegen gesättigte Ammonium sulfatlösung dialysiert. Der Rückstand wird 5 Minuten bei 2 bis 4°C und 15 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 0,4 ml des Phosphat- Sulfat-Puffers gelöst. Die Lösung wird an einer mit Sephadex G-200 (mit dem gleichen Puffer gequollen) gepackten Säule der Abmessungen 1,5 × 88 cm chromatographiert. Die Elution wird mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 Tropfen/min. Es werden Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen. Fraktionen, deren UV- Absorption auf die Anwesenheit des gewünschten Konjugats hindeutet, werden zu 3 Fraktionen vereinigt und auf HRP getestet. Zur Stabilisierung des Proteins werden alle Fraktionen auf eine Konzentration von 1 Prozent Hühnereialbumin gebracht. Die Fraktion I enthält 4,18 × 10^-7 m anti-(hIgG) und 5,25 × 10^-7 m HRP und weist eine spezifische Aktivität von 119 IU/mg auf. Die Fraktion II enthält 1,08 × 10^-6 m anti-(hIgG) und 4,6 × 10^-7 m HRP und weist eine spezifische Aktivität von 309 IU/mg auf. Die Fraktion III enthält 5,1 × 10^-7 m anti- (hIgG) und 7,56 × 10^-7 m HRP und weist eine spezifische Aktivität von 684 IU/mg auf.

Nachstehend sind erfindungsgemäße Tests erläutert.

Im ersten Test wird das T-3-Konjugat an Glucose-6-phosphat- dehydrogenase verwendet. 5 µl einer 1 : 10-Verdünnung des Produkts von Beispiel 1 in 50 millimolarem Tris-HCl mit einem Gehalt von 0,1 Prozent RSA vom pH-Wert 7,9 werden mit folgenden Bestandteilen versetzt: 1,8 ml einer wäßrigen, 50 millimolaren Tris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an 0,1 Prozent RSA vom pH-Wert 7,9, 50 µl 0,1 m β-NAD vom pH-Wert 5,0 und 25 µl anti-T-3-Serum. Die Lösung wird 20 Minuten bei 30°C inkubiert und sodann mit 100 µl 0,066 m G-6-P im Testpuffer ohne RSA und mit 2 µl anti-G-6-PDH in 25 µl Puffer in der angegebenen Reihenfolge versetzt. Der Test wird bei 340 nm bei 30°C abgelesen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird 4 Minuten lang verfolgt. Der Test wiederholt, mit der Abänderung, daß 25 µl Puffer durch 25 µl anti-T-3 ersetzt werden. Nach 4 Minuten beträgt die Absorption bei 340 nm in Abwesenheit von anti-T-3 0,012 und in Anwesenheit von anti-T-3- 0,020. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß man die Menge eines Antiliganden, in diesem Fall anti-T-3, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmen kann. Ferner ist festzustellen, daß man das Enzymkonjugat nur 5,7 Prozent der ursprünglichen enzymatischen Aktivität aufweist und eine Haptenzahl von etwa 16 hat. Die Gegenwart der großen Anzahl von Haptenen pro Enzym sowie die geringe Aktivität haben die Wirkung, daß die Empfindlichkeit des Tests wesentlich vermindert wird.

Im nächsten Test zur Bestimmung von Digoxin wird das Produkt von Beispiel 2 verwendet. 5,57 × 10^-3 g (7,13 × 10^-6 Mol) Digoxin werden in 10 ml wasserfreiem DMF gelöst. Eine Reihe von Verdünnungen wird mit Aliquotanteilen der DMF-Lösung durchgeführt. Der Test wird ausgeführt, indem man 25 µl des Digoxin-G-6-PDH-Konjugats mit 1 ml Puffer verdünnt. Der Puffer ist hergestellt worden, indem man 0,25 g Hühnereialbumin in 250 ml einer wäßrigen 50 millimolaren Tris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an 1 millimolar NaN₃ vom pH-Wert 7,8 löst, wodurch sich eine 0,1-prozentige Hühnereialbuminlösung vom pH-Wert 7,8 ergibt. Die Lösung wird sodann mit einem vor inkubierten Gemisch von 25 µl Antidigoxin ( µl Antidigoxin verdünnt mit Puffer), 1 ml Testpuffer und 2 µl Digoxinlösung versetzt. Nach 10-minütiger Inkubation bei 30°C werden 50 µl 80 millimolares β-NAD vom pH-Wert 5,1 bei 30°C zugesetzt. Das Gemisch wird ½ Minute bei 340 nm bei 30°C getestet. Anschließend werden 5 µl anti-G-6-PDH zugesetzt. Der Test wird 5½ Minuten bei 30°C bei 340 nm abgelesen. In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengestellt.

Tabelle II

Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte von zwei Ablesungen dar und sind entsprechend korrigiert.

*) Konzentration in der Testlösung:

Digoxin-G-6-PDH-Konjugat4,3 × 10^-10 m Anti-(digoxin)4,0 × 10^-8 m.

Die Ergebnisse von v² zeigen, daß die Digoxinkonzentration über einen 10⁴-Bereich bei sehr niedrigen Konzentrationen wie etwa 10^-8 bis 10^-9 m Digoxin bestimmt werden kann.

Der nächste Test erläutert die Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Antigenen im Vergleich zu den vorstehend aufgeführten Haptenen. Dabei werden 2 µl HRP-hIgG- Konjugat mit 200 µl Puffer, der mit 20 µl hIgG und 2 µl anti-hIgG versetzt ist, verdünnt. Das Gemisch wird ½ Stunde bei 30°C inkubiert. Anschließend werden 4 µl anti-HRP zugesetzt, wonach eine weitere Inkubationszeit von ½ Stunde folgt. Das Gemisch wird sodann mit 1,8 ml Puffer mit einem Gehalt an 0,22 millimolar o-Dianisidin und 10 ml 22 milli molarem Wasserstoffperoxid versetzt. Die Absorptionsänderung bei 460 nm 30°C innerhalb von 1 Minute wird von Beginn der Reaktion an ermittelt. Die Endkonzentrationen betragen 1,3 × 10^-9 m für das HRP-hIgG-Konjugat, 3,7 × 10^-8 m für anti-hIgG und 4,6 × 10^-8 m für anti-HRP. Der verwendete Puffer enthält 0,01 m Natriumphosphat, 0,05 m Natriumsulfat, 0,1 Prozent Hühnereialbumin und 4,0 Prozent Polyethylenglykol 600 vom pH-Wert 7,0.

In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse bei verschiedenen hIgG-Konzentrationen angegeben.

Tabelle III

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß erfindungsgemäß ein empfindlicher Test zur Bestimmung von menschlichem γ-Globulin zur Verfügung gestellt wird, wobei Konzentrationen bei herunter zu 10^-10 m nachgewiesen werden können. Ferner hat die Bestimmung den Vorteil, daß sie nach einigen einfachen Zugaben und Inkubationsschritten, für die insgesamt etwa ½ Stunde erforderlich ist, rasch durchgeführt werden kann. Es wird eine einfache spektrophotometrische Ausrüstung verwendet, wobei die Ablesung im sichtbaren Bereich erfolgt.

Beim nächsten Test wird hIgG unter Verwendung des Konjugats von Beispiel 4 und des Enzyms G-6-PDH bestimmt. Die Fraktion 42 des genannten Präparats wird verwendet. Der Test wird durchgeführt, indem man ein Gemisch aus 0,2 ml der Fraktion 42 in 0,2 ml einer 3,68×10^-5 m Lösung von anti-hIgG in Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Natriumphosphat und 50 millimolar Natriumsulfat vom pH-Wert 7,48 hergestellt. Die Konzentration des hIgG in der Fraktion 42 beträgt 2,54 × 10^-2 mg/ml und die Konzentration von G-6-PDH beträgt 1,58 × 10^-2 mg/ml. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Sodann wird eine Lösung von 1,6 ml Puffer, 0,05 ml G-6-P und 0,05 ml NAD hergestellt und 3 Minuten in einer Küvette bei 30° inkubiert. Als Puffer wird 50 millimolarer Tris-HCl-Puffer mit einem Gehalt an 0,1 Prozent RSA und 1 millimolar NaN₃ vom pH-Wert 7,8 verwendet. Die G-6-P-Lösung weist eine Konzentration von 140 millimolar im Puffer ohne RSA und die NAD-Lösung eine Konzentration von 80 millimolar in entionisiertem Wasser vom pH-Wert 5 auf. Die Küvette wird sodann mit 0,05 ml des vereinigten Produkts aus Konjugat und anti- hIgG, das vorinkubiert worden ist, versetzt. Die Lösungen werden durch Umdrehen der Küvette vermischt. Die Ablesung wird 2½ Minuten bei 340 nm vorgenommen. Sodann wird die Ablesung unterbrochen. 1 µl anti-G-6-PHD werden zugesetzt, wodurch sich ein Überschuß an anti-G-6-PDH im Testmedium ergibt. Die Lösung wird durch Umdrehen vermischt. Die Ablesung wird 5 Minuten bei 340 nm vorgenommen.

Das Verfahren wird mit der Abänderung wiederholt, daß anstelle der 0,2 ml anti-hIgG 0,2 ml PBS vom pH-Wert 7 verwendet werden.

Die Geschwindigkeit zwischen der ersten und zweiten Minute, angegeben in Milliabsorptionseinheiten/min beträgt in Ab wesenheit von anti-G-6-PDH 51,8 und zwischen der fünften und vierten Minute der 5-Minuten-Periode 22,2 in Gegenwart von anti-G-6-PDH, wenn anti-(hIgG) vorhanden ist. In Ab wesenheit von anti-(hIgG) ergeben sich Werte von 52,4 bzw. 2,3.

Aus den vorstehenden Ergebnissen zeigt sich, daß man die Anwesenheit von anti-hIgG bei äußerst geringen Konzentrationen feststellen kann. Ferner läßt sich hIgG bestimmen, da die Anwesenheit von hIgG im Testmedium die Wirkung hat, daß die Menge des hIgG, das für eine Bindung an das hIgG- G-6-PDH-Konjugat zugänglich ist, verringert wird.

Beim nachstehend erläuterten letzten Test wird ebenfalls hIgG als Beispiel für Antigene verwendet. Dabei wird die Wirkung von zugesetztem Antikörper bzw. einer Kombination von Antikörper und Antigen gezeigt. Der Test zeigt auch die Verwendung eines Enzyminhibitor-Substrats, das das Enzym inaktiviert, so daß innerhalb einer kurzen Zeit nach Zugabe aller Reagentien ein stabiler Wert beobachtet wird.

Zur Durchführung dieses Tests werden 0,5 ml gemäß Beispiel 5 hergestelltes Dextran-10-o-dianisidin im Verhältnis 1 : 1 mit dem vorstehend für HRP-angegebenem Puffer verdünnt. Eine ausreichende Menge HRP-hIgG-Konjugat wird zugesetzt, so daß sich eine Endkonzentration von 1,4 × 10^-8 m ergibt. Ferner werden gegebenenfalls 20 µl wäßriges anti-hIgG (Miles Labs, Charge Nr. 20, 9,6 mg/ml) und hIgG (Endkonzen tration 10^-6) zugesetzt. Es folgt eine 20minütige Inku bationszeit bei Raumtemperatur. Das Gemisch wird sodann mit 5 µl und 22 millimolarem H₂O₂ versetzt. Die Absorptionsänderung innerhalb 1 Minute bei 460 nm wird bei 30°C bestimmt. Eine zweite Ablesung wird nach 10 Minuten vorgenommen, wobei sich keine weitere signifikante Absorptionsänderung feststellen läßt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle IV

Der Zusatz von anti-(hIgG) verringert wesentlich die Menge an o-Dianisidin, die in einer bestimmten Zeit umgesetzt wird. Die Zugabe von anti-(hIgG) und hIgG verringert die Menge an anti-(hIgG) die zur Bindung an das Enzymkonjugat zur Verfügung steht, und erlaubt eine schnellere Umwandlung, bevor das zugängliche Enzym im wesentlichen inaktiviert ist. Bei Anwendung dieser Verfahrensweise entfällt die Notwendigkeit, die Ablesungen der Absorption genau in einer bestimmten Zeit vorzunehmen, da nach einigen Minuten die Ablesung relativ lang gut konstant bleibt.

Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich, daß erfindungsgemäß ein empfindliches und genaues Verfahren zur Bestimmung von äußerst geringen Ligandenkonzentrationen unter Einschluß von Hapten- und Antigenliganden, zur Verfügung gestellt wird. Ferner hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß Enzyme leicht markiert werden können, wobei sie einen wesentlichen Anteil ihrer ursprünglichen Aktivität sowohl nach Konjugation als auch nach Bindung von Anti liganden an das Konjugat beibehalten. Ferner wird zufällig anwesendes natives Enzym gehemmt, so daß die Notwendigkeit, die Aktivität des Enzyms in der Probe zu bestimmen, entfällt. Die Verfahrensweise zur Durchführung des erfindungsgemäßen Tests ist einfach. Es können überall zur Verfügung stehende Spectrophotometer verwendet werden. Ferner läuft der erfindungsgemäße Test auf eine Enzymbestimmung hinaus, eine Technik, die dem Personal weitgehend vertraut ist.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines zu analysierenden Bestand teils (Analyt) in einer Probe, der ein Bestandteil eines immunologischen Paars ist, das aus den reziproken Bestand teilen Ligand und Ligandenrezeptor besteht, wobei in einem wäßrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt werden:

(A) die Probe,
(B) ein Enzymkonjugat, wobei das Enzym an einen der Bestandteile des immunologischen Paars gebunden (konjugiert) ist und das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält, wenn das Enzym konjugat an den reziproken Bestandteil des immuno logischen Paars unter Bildung eines Komplexes gebunden ist, und
(C) wenn es sich beim Enzymkonjugat und dem Analyten um den gleichen Bestandteil des immunologischen Paars handelt, der reziproke Bestandteile des immunologi schen Paars,

mit der Maßgabe, daß, wenn es sich um einen monoepitopen Liganden handelt und das Enzym mit dem Antiliganden kon jugiert ist, ein Poly- (ligandenanaloges) im Testmedium enthalten ist, und
die enzymatische Aktivität im Medium im Vergleich zur enzymatischen Aktivität eines Mediums mit einer bekannten Analytenmenge bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man dem wäßrigen Medium zusätzlich

(D) einen Enzyminhibitor zusetzt, wobei der Inhibitor an einer Hemmung des Enzyms gehindert wird, wenn das Enzym im Komplex vorliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Medium mit einem pH-Bereich von 5 bis 10 und einem Temperaturbereich von 10 bis 50°C verwendet und den Enzyminhibitor nach Ver einigung der Reagentien (A), (B) und (D) zusetzt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzyminhibitor Antienzym verwendet.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzyminhibitor einen irreversiblen Inhibitor verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzyminhibitor einen reversiblen Inhibitor verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bestandteil (B) einen enzymgebundenen Liganden einsetzt.

7. Verwendung eines aus einem Enzymkonjugat, dem reziproken Bestandteil des immunologischen Paars, wenn es sich beim Analyten und dem Enzymkonjugat um den gleichen Bestandteil des immunologischen Paars handelt, und einem Enzyminhibitor bestehenden Reagentien-Satzes zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6.