JPS6236368A - レゾルフイン−誘導体並びにその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、螢光初識された低−又は高分子化合物として
様々に適用され得るレゾルフイン−誘導体、並びｋその
製法に関する。

螢光性化合やは、励起により一定の波長の光を放射する
というその能力に基づき、標識化合物゛として、化学的
及び生物学的方法で、例えば臨床的分析学において、し
かし更にもつと新しい分野で床机に使用される。生化学
においては螢光色素が高感度の標識として増々使用され
ている。この際低分子並びに高分子の物質と螢光色素よ
シなる化合物が使用される。かかる螢光複合体の広い使
用範囲についての例としては次のことが挙げられる：ハ
シテン、抗原又は特異的抗体が螢光色素で標識されて使
用される螢光免疫検定。ハシテン又は抗原に抗体が特異
的に結合することによってこれらの物質又は抗体の濃度
’（＋−稙々の方法で測定することができる。

免疫螢光−顕微鏡検査においては、抗原、例えば全細胞
又は蛋白質は螢光標識された抗体により顕微鏡下で可視
にすることができる（クオング（Ｗａｎｇ　）等著、メ
ソツズ　イン　エンチ％ｅｌシイ（Ｍｏｔｈ、　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　）　８５巻、５１４頁以降）。

同様に、細胞中のハプテン又は抗原の分配は、当該化付
物を螢光標識して細胞中に入れ、かつ顕微鏡下で追跡す
れは、直接観察することができる。

螢光標識したラテックス粒子は１フルオレスセント・ア
クチヴエイテット・セル・ツルター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　８ｏｒｔｅｒ
　）”（ＦＡＣ８）中での細胞の選別の際に使用されム
もちろん、酵素の活性の決定及び測定のために螢光標識
を担持する基質が使用される。

競争的免疫検定（Ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓｙｓ）は、試料中の決定すべき配位子と標識さ
れた既の 知濃度で存在する配位子との間−ｔ”ｋ体上の配位子結
合位置の既知の、しかし限定された数の競争に基づいて
おり、この抗体は確定すべき配位子並びに標識された配
位子に対しても特異的である。この試料中の確定すべき
配位子の濃度は、標識された配位子分子が抗体にどれく
らい結合されるかに対して決定的である。抗体及び螢光
標識された配位子よシ成る複合体の濃度は、分光法で検
査され得る。これは試料中における確定すべき配位子濃
度に逆比例する。確定すべき配位子と共に既知の濃度で
試料に添加されるＳ識配位子としては、最初は主に放射
性同位元素で標識された配位子が使用された。放射性同
位元素標識の公知の欠点のために、螢光性化合物での標
識が更にずつと］Ｌ要になっている。この際、螢光性化
合物は確定すべき物質の分子に結合される。更にこの複
合体は原則的に、極めて種々の螢光免疫検定、例、えは
螢光偏光−免疫検定、螢光−消光（Ｆ’１ｕｏｒｅｓｚ
ｎｚ　−Ａｕｅｎｃｈｉｎｇ）−免疫検定又は螢光−増
大（Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚ　−ＥｎｈａｎＣｅｍｅｎ
ｔ　）−免疫検定のために使用される標識付けとしては
、試験条件下で大きな消光係数及び高い量子収率並びに
十分な安定性を有する原則的に全ての螢光色素が適当で
ある。従って従来は通例フルオレセイン又はフルオレセ
イン誘導体を使用した〔ラントン（Ｊ、　Ｌａｎｄｏｎ
）及びカメル（Ｒ，８，Ｋａｍｅｌ　）著、１イムノア
ツセイス（Ｉｍｍｕｎｏａａａａｙｓ　）　８０　ａ　
５ｔＪｎｉｖ、　Ｐａｒｋｐｒｅｓｓ、パルチモア（Ｂ
ａｌｔｉｍｏｒｓ　）、メト（Ｍａｄ、　）　１９８０
、第９１〜１１２頁〕。しかしながらフルオレセイン又
はその紡導体で標識した高−又は低分子化合物は欠点ｔ
ｉする。フルオレセイン−標識物質の吸光−及び発光最
大値は４９０〜５２０　ｎｍの波長範囲にある。分析法
、と９わけ螢光免疫検定法のほとんどが体液、例えば血
清中で実施されるので、前記のスペクトル範囲では試料
中の生物学的物質の自己螢光による障害が生じる。これ
は、同様に５゜Ｑ　ｎｍ付近の範囲で光を吸収し、かつ
螢光を放つビリルビンのせいである。

多くの測定装置は出来るだけ大きなストークス−シフト
（８ｔｏｋｅｓ　−５ｈｉｆｔ　）　ｔ−有する標識−
物質（Ｍａｒｋｅｒ　−５ｕｂｓｔａｎｚ　）を必セと
する。

フルオレセイン誘導体の場合にはこのシフトは最大３０
　ｎｍである。これは螢光測定の感度を損なう光の散乱
問題となる。かかる場合には、フルオレセイン誘導体の
それよりも大きなストークス−シフトを有する化合物が
望ましい。

発明が解決しようとする問題点 本出願の課題は、これらの欠点をもはや示さない化合物
を提供することであった。この課題は本発明によるレゾ
ルフイン−ｖｊ４体によって解明される。

問題点を解決するための手段 従って本発明の目的物は、一般式Ｉａ及びＩｂ　： Ｃ式中Ｒ１，Ｒ”％　Ｒ”、Ｒ’及ヒＲｂＨ、ソレソれ
同じか又は異なっていてよく、水素原子、７１０ｒン原
子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシ
カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、それぞれカルボキ
シ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボニル基
、シ・アノ基又はニトロ基により置換されていてよい低
級ア′ルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、この際
Ｒ４及びＨＩＳは一緒に隣接の芳香族基であってよく、
ｚは架橋員を表わし、Ａは配位子の基を表わし、かつｎ
は１〜２００の整数全表わす〕のレゾルフイン−誘導体
である。

Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６の定義中の低級アルキ
ル基もしくは低級アルコキシ基は１〜５、殊に１〜３個
の炭素原子を有する炭化水素基金包含する。メチル基及
びエチル基もしくはメトキシ基及びエトキシ基が特に有
利である。

Ｒ１，ＲＦ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の定義中のハロダン原
子は弗素原子、塩素原子、臭素原子又は沃素原子を表わ
す。塩素原子及び臭素原子が特に有利である。

置換基Ｒ４及びＲδによって場合によシ形成される隣接
芳香族基は殊にペンゾール基又はナフタリン基である。

ペンゾール基が特に有利である。前記の芳香族基は非重
換であるか、又は基８０３Ｈ％Ｃ０２Ｈ又はＣ１〜Ｃδ
−アルコキシ基択される、そのつど１個又はそれ以上の
置換基を有して良い。

架橋員２は、レゾルフイン−基本骨格の反応性置換基Ｘ
ｉと、配位子もしくは配位子類似体の反応性基Ｘ２との
間の通常の付加−もしくは縮合反応により、場合にｈ二
官−化合物Ｘ１５−Ｍ−Ｘ’の中間結合下に（式中Ｘ３
及びｘ４は反応性基及びＭは残余分子部分である）形成
される次の表１に、かかる反応性置換基Ｘ’及びｘ２並
びに変換の際に得られる架橋員２のための若干の可能な
ものを例として挙げである。

表１：反応性基Ｘ１％ｘ２及びそれから得られる架橋員
ＺＫ関する若干のもの ）（ｌ　　　　　　　　ｘ”　　　　ｚ−ＣＯＯＨ−Ｎ
Ｒ２−ＣＯＮＨ− −ｃｏｏ’ｒ＊　　　　　　　−ＮＲ２−ＣＯＮ）ｉ−
−ＣＯＯＣＯ，Ｔｌ＊＊　　　　−ＮＲ２−ＣＯＮＨ−
−ＮＣＯ−ＮＨ，−ＮＨＣＯＮＨ− −ＮＣ８−ＮＨ，−ＮＨＣ８ＮＨ− −ＨＣ−ＣＨ−Ｃ０−−８Ｈ−８−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＯ
−−ＣＨＯ−ＮＨ，−ＣＨ−Ｎ− −８０ＩｉＣ１−ＮＲ２−８Ｏ２ＮＨ−−ＣＯＣＨＩ−
／’Ｃ１ｒ７　　　　　−８Ｈ−ＣＯＣＨ２−８−−Ｃ
ＯＣＨ２−１”Ｏ’ｌ’７　　　　　−ＯＨ−ＣＯＣＨ
２−０−−（ＣＨｓ）ｍ−ＮＨｚ””　　　−ＣＯＯＨ
−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−＊　Ｔは１〜５個の炭素
原子を有するアルキル基又は電気陰性的に活性するエス
テル基、例えはＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
基金表わす。

＊＊　　Ｔｌは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基
を表わす。

＃＊ｍは０〜３の整数を表わす。

表１中に挙げられた様な一級アミンの代シに、反応性基
ｚＬ又はＸ２として同様に二級アミンも相応の生成物の
形成下に使用することができる。

二官能化合物Ｘ３−Ｍ−Ｘ’としては、ジアミン、ジカ
ルボン酸並びにその誘導体、ジアルデヒド、アミノカル
ボン酸及びこの種の結合物の製造のために通常使用され
るその他の化合物が有利である。かかる物質のための例
は、ピペラジン、１．２−エチレン−ジアミン、コハク
酸、クルタールジアルデヒド、グリシン、サルコシン、
β−アラニン及びピペリジン−４−カルボン酸が挙げら
れる。

Ａの定義中の配位子とは、ハプテン、抗原、抗体、；４
負並びに担体及びそれらから誘導される化合物が解され
る。

ハプテンとは、本発明によれば、一般には単独で抗体を
生成することは出来ない低分子量の物質と解すべきであ
る。低分子量の物質としては約１００〜約２０００の分
子量を有する化合物が示される。かかる物質の例は、哺
乳動物又はヒトの有機体中に存在する生理学的に活性の
物質並びにその代謝物又は動物又はヒトに投与される薬
剤並びにその代謝物である。しかしながらハシテンの概
念には、前記の範囲にある分子量のみを有する限シ、全
てのその他の低分子化合物も解され得る。可能なバッテ
ンの例はアミン、ステロイド、ホルモン、炭水化物、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、それらの組合せ物である
。

抗原は＾分子化合物である。これは、これで処理した有
機体中に抗体を生成させることができる。高分子化合物
は本発明により、少なくとも約２０００の分子−１ｔ−
ｉするもの、しかし殊に少なくとも約５０００の分子ｉ
ｔｔ有するものである。かかる化合物の分子量は’０＋
ｊ記により限定されることはない。２０百万までの値を
有してよいが、それ上越してもよい。一般式Ｉａ／ｌｂ
の化合物中に配位子として存在し得る抗原は、例えは蛋
白質、核酸、多糖類、それらの組合せ物又はその他の高
分子物質である。本発明により抗原の概念に杜、最小分
子量約２０００を有する全ての高分子化合物が解される
。

抗体は、抗原又はハプテン並ｄにそれから誘導される化
合物と特異的に反応し、かつ複合体を形成する全ての蛋
白質又は抛蛋白質である。

本発明により一般式１　ａ　／　Ｉ　ｂの化合物中の配
位子として完全な抗体又はその断片も使用することがで
きる。この断片は本発明により、抗原１ハプテン並びに
それから誘導される化合物を結合することができる限ル
、抗体として示すこともできる。

基質とは、化学反応で実証可能な変換を受ける化合物が
解される。例えば酵素が作用を及ぼす下記の全ての化合
物又はそれから誘導される物質、例えはアミノ酸、ペプ
チド、蛋白質、配糖体、少−又は多糖類、ヌクレオチド
、核酸、それらの組付せ物又はその他の酵素的に変換可
能な物質が解される。

担体は定形又は無定形の天然に存在する、又は合成の、
網状化の、又は非網状化の物質であってよい。下記の個
々の化合物又は化合物の混合物が解される。担体として
は、化合物又は化合物の混合物、例えば多糖類、核酸、
ペプチド、蛋白質、それらの組合せ物又は同様にゴム、
リグニン、ガラス、木炭、合成の付加−又は縮合ポリマ
ー、例えばポリスチロール、ポリアクリル、ビニル化合
物、ポリエステル、ポリエーテル及びポリアミド又は同
様に複合体形成物、例えばラテックス粒子、小胞（Ｖｉ
ｓｉｋｅｌ　）　、！Ｊポソーム、細胞壁部分又はむし
ろ全細胞を使用することができる。

一定の配位子から誘導される化合物は、配位子類似体と
して表わされる。配位子類似体とは、相応の配位子と構
造的に僅かに異なるが、その特性に関しては本質的な違
異を示さない物質が解される。その違異は、例えば付加
的な置換基又は欠損した分子部分に依る。

原則的に、遊離のアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒ
ドリル基又はカルボキシル基ｗｌｌＦ（これらの基を介
して配位子はレゾルフィン基本体と場合により架橋員の
中間結合下に結合することができる）を有する全ての配
位子は、本発明の化合物Ｉａ又は１ｔ１１の形成のため
に使用できる。遊離のアミノ基又はカルボキシル基が特
に有利である。遊離のアミノ基とは一級並びに二級アミ
ノ基が解される。配位子が、適当な基を有していない場
合には、曾成的な方法でかかる基、例えばアミノ基又は
カルボキシ基を導入しなければならない。更に、かかる
配位子の場合によシ存在する非反応性の官能基を化学的
に活性化することも可能である。そうして生成した物Ｉ
Ｘはもはや完全には本来の化合物と同一ではないので、
配位子類似体と云う。

数ｎは、何個のレゾルフィン分子が１個の配位子又は配
位子類似体に結合しているかを示す。この数は相応する
配位子又は配位子類似体中の反応性の基の数に依る。配
位子又は配位子類似体の反応性の基が多けれは多い程、
レゾルフィン分子は更にもつと結合され得る。数ｎは通
常１〜２００、特に有利に１〜１００である。

本発明のもう１つの目的は本発明による一般式Ｉａ及び
ｉｔ）の化合物の製法である。この方法は、自体公知の
方法で、一般式［ａ及びｉｂ〔式中、Ｒ１，ＲＫ、Ｒ３
、Ｒ４及びＲ５は一般式Ｉａ及び１ｍ）中に挙げたもの
であり、かつＸｉは反応性の基である〕の化合物を、 ａ）一般式ｌ： Ｘ”　−Ａ　　　　　　　（１） 〔式中ｘ２は反応性の基であり、かつＡは配位子の基で
ある〕の配位子と、又は ｂ）一般式■： ｘ３−　Ｍ　−Ｘ４　　　　　　　（Ｎ）〔式中Ｘ３及
びＸ４は反応性の基を表わし、かつＭは二官能化合物の
基を表わす〕の二官能化合物及び一般式ｌ： ２−　Ａ 〔式中Ｘに及びＡは前記のものである〕の配位子と反応
させ、この際場合により１反応工程で保岐基を導入し、
かつ次いで再び離脱させ、並びに１個の反応性の基Ｘｉ
　、　Ｘ２、ｘ３及びＸ４　ｉ。

その他の反応性の基に変えることができることｔ％徴と
する。

Ｘｉ％Ｘに、Ｘ３及びＸ４の定義における反応性の基と
は原則的に全ての通常の反応性の官能基が解され得る。

官能基としては、酸基、例えばカルボン酸基又はスルホ
ン酸基基ひにそれから誘導される基、例えばエステル、
アミド、無水物、酸ハロデニド又は−級又は二級アミン
、シアネート基、インシアネート基、チオシアネート基
、イソチオシアネート基、アルデヒド基、スルフヒドリ
ル基、ヒドロキシ基、α−ケトハロｆ＝ド基のような基
等が特に有利である。反応性の基のための例は表１中Ｘ
ム及びｘ２の下に例として挙げられている。これらの基
線当然相互に交換することができ、かつ反応性の基ｘ３
及びｘ４ヲ表わすこともできる。

二官能化合物ＩＶの基Ｍとは、原則的にあらゆる有機又
はＳ機の基が解されてよい。しかし、Ｍが直鎖又は分枝
鎖の脂肪族、環状脂肪族又は芳香族の基を表わし、又は
それらの基の組合せであるような基が有利である。１〜
１０、殊に１〜７個の炭素原子よりなる脂肪族基又は２
個の反応性基ｘ３／ｘ４の両方又は１個のみが環状脂肪
族基中に共に含まれているような基が極めて特に有利で
ある。

一般式１Ｉａ及びｉｂの化合物は有利な方法で、一般式
■： Ｒ５ 〔式中Ｒ３、Ｒ番及びＲ５は一般式Ｉａ及びＩｂに挙げ
たものである〕のニトロソレゾルシン誘導体と、一般式
■： Ｉ 〔式中Ｒ１及びＲ２は一般式Ｉａ及びＩｂ中に挙げたも
のであり、かつＸ”は反応性の基である〕のレゾルシン
−誘導体とから得られる。

一般式■の化合物と一般式■の誘導体との反応は有利に
温石（Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ　）及びｍｅの存在で低温
で行なわれる。この際先ずレスアズリン−誘導体が生成
し、これは一般式■ａ及び■ｂのレゾルフイン−誘導体
に容易に変換することができる。

一般式■の化合物と一般式■の化合物との反応は常法で
−１０〜５０°Ｃ１殊に０〜３０℃の温度で実施される
。一般式■及び一般式ｖ１の物質を約０℃で混合し、か
つ反応混合物を引続き室温まで加熱する場合に、反応は
特に穏やかに進行する。温石の濃度は有利に０．５〜５
、殊に１〜２モル／ｌでなければならない。硫酸濃度は
０．５〜５、殊に１〜６モル／ｌであるべきである。

先ず生成するレスアズリン−誘導体を一般式Ｄａ及びｌ
ｂのレゾルフィンに還元することは殊にアンモニア溶液
中で亜鉛末を用いて実施される〔ニエツキ（Ｎ１ｅｔｚ
ｋｉ　）等著、ベリツヒテデア　ドイチェン　ヒエミツ
ジエン　ｒゼルシャフト（Ｂｅｒ、　Ｄｔｓｃｈ、　Ｃ
ｈｅｍ、　Ｇｅｓ、　）　２２巻、３０２０（１８８９
）参照〕か、又は水素化硼素ナトリウムを用いて行なわ
れる。溶剤としては有利に水−アルコール−混合物、特
に水１部とメタノール０〜４部よりなる混合物を使用す
る。還元する物質１モル当シ亜鉛末もしく扛水素化硼素
ナトリウム１〜２０、殊に１〜５モル？！−株加する。

この際反応溶液の温度は一１０〜＋６５℃、殊に＋５〜
＋１０℃で保たれる。温度範囲を正確に守ることは、一
義的な反応経過のために必要であると実証された。冷却
しないと、発熱反応が起り、分離が困難な副産物が生成
■の物質の間の反応は一義的に、かつ良好な収率で経過
する。選択された合成方法は変更可能である。このこと
は、特に非対称的に置換されたレゾルフイン−誘導体の
製造に関して多数の合成可能性を示す。この極めて変更
可能な製法に依り１、多数のレゾルフィン標識した化合
物が得られ、これらの化合物は発色団中の種々の位ムの
その種々の置換基によシ広い色範囲を示す。

一般式Ｈａ及び［１）のし・戸ルフィンー訪導体と、一
般式ｌの化合物との、もしくは一般式■及び■の化合物
との反応の前に、そのレゾルフイン−誘導体を有利に一
般式■： 〔式中ＲＡ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒδ及びＸｉは一般式
Ｉａ及びｉｔ）に挙けたものであシ、かっＲ６は低級ア
ルキル基、アリール基又はアルアルキル基である〕のト
リアジルジヒドロレゾルフイン−誘導体に変える。

Ｒ６の定義における低級アルキル基は１〜５、殊に１〜
３個の炭素原子１＋するアルキル基を表わす。メチル基
及びエチル基が特に有利である。アリール基としてはフ
ェニル基が特に１利である。アルアルキル基は殊にアリ
ール部分としてフェニル＆ｆ含有し、アルキル部分は１
〜５、殊に１〜３個の炭素原子を有する。アルアルキル
基としてはベンジル基が特に極めて有利である。

一般式■のトリアジル誘導体の製造のために、相応の一
般式Ｈａ及び■ｂのレゾルフイン−誘導体を先ず強力な
還元剤、例えば塩化錫（ｎ）又は酢酸クロム（ＩＩ）　
ｅ用いて、又は電気化学的に還元する。還元のために、
レゾルフイン−誘導体を１０分間〜１時間適当な溶剤中
で還元剤２〜１０、有利に２〜６当量、殊に５〜３５チ
の水性塩酸中の塩化錫（Ｉｔ）と共に加熱する。冷却の
際にジヒドロ化合物が沈殿する。アシル化は常法で適当
なアシル化剤、例えば無水酢酸、塩化ベンゾイル等を用
いて行なわれる。一般式■の化合物はレゾルフイン−誘
導体ｎａ及び■ｂの還元的アシル化によりワンショット
法（Ｅｉｎｔｏｐｆ−ｖｅｒｆａｈｒｅｎ　）で有利に
製造される。このために相応のレゾルフイン−誘導体は
還元剤２〜６当量と共に５分間〜３時間アシル化剤の存
在で′適当な溶剤中で還流加熱されるか、又は室温で４
〜１６時間攪拌される。

そうして得られるトリアジル−ジヒドロレゾルフイン−
誘導体■中で反応性の基ｘｌヲそれ以上の反応の前に場
合により別の反応性の基に変換することができる。特に
Ｘｉがカルボキシル基を表わす場合には、これをカルボ
ン酸クロリド−１無水カルボン酸−又は反応性のエステ
ル官能基に変える、ことが有利である。これは極めて檜
々の方法で、すなわち、例゛えはカルボジイミド、アル
コール、ハロｒニド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド等
を用いて行なわれてよい。当業者には多数の文献で公知
の方法が活用される。カルボン酸官能基をカルボン酸ク
ロリドに、例えば塩化チオニル／ジメチルホルムアミド
又は塩化オキザリル／ジメチルホルムアミドを用いて、
並びに活性化エステル、例えはＮ−ヒドロキシサクシン
イミドエステルに変換することが特に有利である。

配位子又は配位子類似体が遊離のアミノ基、ヒドロキシ
ル基又はスルフヒドリル基を有する場合には、これらの
基は反応性の基Ｘ２として反応する。次いで配位子もし
くは配位子類似体Ｘ”Ａは、場合により前もってトリア
□シルージヒＹロレゾルフインー誘導体へ変換した後に
、又は／及び基）（１ｔ−活性化した後に、アミド−、
エステル−又はトリオエステ゛ル結合の形成下に、化合
物Ｈａ及びｌｌ）と直接反応させることができる。少な
くとも１個のアミド結合の形成はその安定性に基づき特
に有利であシ、その際その形成のために殊に式中父ｌが
カルボン酸六口ｒニドである一般式１　ａ　／　Ｑ　ｂ
もしくは■の化合物から出発する。アミノ基含有の配位
子もしくは配位子類似体とのその反応は常゛法で、例え
は有機溶剤、例えはジクロルメタン中で、塩基として三
級アミン、例えはトリエチルアミンの添加下に行なわれ
る。配位子もしくは配位子類似体の大きさ及びそれと関
係するその遊離アミノ基の数及び化合物Ｉａ／ｌｂの使
用量に依り、配位子もしくは配位子類似体１分子当シ数
個の発色団を結合すること゛ができる。

本発明に依る一般式Ｉａ及びＩｂの化合物の製造のため
に、一般式■のトリアジル−誘導体を使用する場合□に
は、反応後に保護基として使用したジヒ良ロ゛ルゾ□ル
フィン部分のアシル基を選゛・択的・に離脱させ、゛か
つ得られるロイコ−色素基を化合物Ｉａ／Ｉｂの発色団
に酸イヒしなければならない。

ジヒドロレゾルフィン部分の０−アシル基ハ、水及び水
溶性の溶剤、例えば１．４−ジオキサン、メタノール又
はエタノールよシなる混合物□、有利に水／１．４−ジ
オキサン（１：１）中で、亜硫酸ナトリウム２〜１０モ
ル、有利に　　　　′２〜４−Ｅニルとの反′応に、よ
り、特に有利に離脱される。反応□温度は２′０〜１０
０℃、有利に８０　　　　　′〜１００℃である。この
反応条件下で、Ｎ−アシルジヒドロレψルフィン誘導体
が高収率で製造される。

ジヒドロレゾルフィン部分を一般式Ｉａ及びＩｂの化合
物に酸化することは、中庸の酸化剤を用いて実施されて
′良い。ヘキサシアノ鉄酸（１）カリウムが有利であり
、これ會ロイコ色素に対して２〜６倍のモル過剰量で、
特に有利に２〜４倍のモル過剰量で、水及び水溶性の溶
剤、例えば、１．４−ジオキサン、メタノール又はエタ
ノールよシなる混合物、有利に水／メタノール（３：１
）中で使用する。殊にこの反応は補助塩基、例えば炭酸
水素す）　ＩＪウム又は炭酸ナトリウムの存在で行なわ
れる。反応温度は１０〜４０８Ｃであり、室温が有利で
ある。

Ｎ−アシル保護基の選択的離脱及びジヒドロレゾルフィ
ン部分の酸化はワンショット反応で特に有利に行なわれ
得る。このために水／メタノール（３：１）中のＮ−ア
シル化ジヒドロレゾルフィン訪導体に、先ず炭酸水素ナ
トリウム２〜４モル及び１Ｎ苛性ソーダ溶液１当量を、
かつ引続いてヘキサシアノ鉄ｒ！Ｒ（１）カリウムの２
〜４倍のモル過剰量を加える。室温で約１０分間〜２時
間、有利に０．５時間後に反応は終了する。

多くの場合に、化合物１Ｉａ／ｌ１ｂｔ−配位もしくは
配位子類似体ｌと直接ではなくて、むしろスペーサー基
Ｘ３−Ｍ−Ｘ’の中間結合Ｆに結合することが有利であ
る。スペーサーとしては、常法でかかる目的のために使
用される少なくとも２個の反応性の基を有する全ての化
合物を使用して良い。ジアミン又はアミノカルボン酸が
特に有利である。この際その選択は、スペーサーと結合
されるべき官能ｉｊ＃ｘ１及びＸ２の種類に依る一般式
Ｈａ／ｕｂのレゾルフィン誘導体と一般式バの二官能化
合物との反応によシ１工程又は数工程で、例えば一般式
■の化合物を経て得られる化合物は、一般式■ａ及びｖ
ｍｂ：ｊｌ　ａ 〔式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は一般式Ｉａ及
びＩｔ）中に挙げられたものであり、Ｍ及びＸ４は一般
式■中に挙げられたものであシ、かつＸ１３はＸｉ及び
Ｘ３の反応によって生成する官能基である〕によって表
わされてよい。

官能基）（１３は、Ｘｉ及びＸ３の定義中に挙げた反応
性の基の反応によって一緒に生成される可能な限シの全
ての基であってよい。有利な基Ｘ１３はアミド−、チオ
エーテル−、エーテル−１二級又は三級アミン−１尿素
−又はチオ尿素基等である。

一般式１Ｉａ／Ｉｌｂもしくは■中のＸｉがカルボン酸
官能基もしくはそれから誘導される反応基を表わし、か
つ配位子もしくは配位子類似体の反応性の基Ｘ２がアミ
ノ−、ヒドロキシル−又はスルフヒドリル基を表わす場
合には　Ｘ３がアミノ基を表わし、かつＸ４がカルボン
酸官能基もしくはそれの反応性誘導体を表わすスペーサ
ーＸ３−Ｍ−Ｘ４　を有利に選択する。そのアミン末端
は物質１Ｉａ／ｌｂもしく娘■のカルボン酸官能基に結
合し、カルボキシル末端は配位子又は配位子類似体Ｘ２
−Ａに結合してよい。しかし表がらＸｉ並びにｘ２もそ
のつどカルボン酸官能基もしくはそれから誘導される活
性誘導体を表わす場合には、スペーサーとしてジアミン
が実証された。

一般式■ａ及びｎｂのレゾルフイン−誘導体と、二官能
性のスペーサー基ＩＶ及び配位子もしくは配位子類似体
ｌとの反応は、有利に２段階で行なわれる。先ず、化合
物ｎ　ａ　／　ＩＩ　ｂｋ　、場合により前もって活性
化合物鴇への変換後に、スペーサー■と結合させてよい
。それから得られる誘導体を次いで第２工程で配位子も
しくは配位子類似体ｌと反応させてよい。当然逆の進行
方法も可能であり、第１の工程でスペーサーＩＶ　ｔ−
配位子もしくは配位子類似体Ｉに結合させ、かつ得られ
る生成物を第２工程でレゾルフイン−誘導体１Ｉａ／Ｉ
ｌｂもしくは活性化化合物■と反応させることができる
。

アミノカルボン酸としては有利にアミノカルボンａｌｔ
−使用する。グリシン、アラニン、デルコシン及びピペ
リジン−４−カルボン酸が特に有利であると実証された
。一般式ｕａ／Ｉｌｂもしくは独のレゾルフィン誘導体
と、アミノカルボン酸とのカップリングは、アミド結合
の形成下に、各当業者に良く知られた方法によシ行なわ
れる。このために相応のアミノ酸のメチル−又はｔ−ブ
チルエステルの使用が特に極めて有利である。アミド形
成が行なわれｆｃ後に、場合によって前もって導入され
た保護基を常法によシ違択的に離脱させる。例えは、活
性化された誘導体■ｔ１カルボキシ保護されたアミノカ
ルボン酸と反応させる場合には、ジヒドロレゾルフィン
骨格の〇−及びＮ−アシル基を選択的に加水分解し、ロ
イコ色素１再びレゾルフィン系に酸化し、かつ最後に、
結合したアミノカルざン酸のカルボキシル基を通常の条
件下で、有利にトリフルオル酢酸を用いて離脱させるこ
とが必要である。次いで遊離のカルボキシル基は、配位
子又は配位子類似体ｌの複合のために、例えは一般式１
Ｉａ及びｉｔ）のレゾルフィン誘導体のために記載され
た相応の方法で、活性化されて良い。複合（Ｋｏｎｊｕ
ｇａｔｉｏｎ　）自体の実施も、例えば一般式Ｉａ及び
ｎｂのレゾルフィン誘導体への配位子又は配位子類似体
の直接複合のために実施されるのと一様に行なわれる。

カルボキシル基含有の配位子又は配位子類似体の場合に
は、一般式ｆｌａ／［ｌ’ｂもしくはＶＩＩのレゾルフ
ィン篩導体ｔアミノ基含有の化合物に変えることが有利
であシ、次いでこれをカルざキシル基含有の配位子もし
くは配位子類似体と、アミド結合形成下に、反応させる
。このためには、化合物１Ｉａ／Ｊｉｂもしくは■とジ
アミン（）（３及びＸ４アミノ基金有する式■）との反
応が特に簡単で有利であると実証された。この意におけ
る有利なジアミンは、例えばピペラジン、１．２−ジア
ミノエタン又は１．３−ジアミノプロパンである。

ジアミンを用いて一般式１　ａ　／　Ｉｆ　ｂもしくは
れている方法によって行なわれる。１置換のジアミンの
特に高い収率を達成するために、反応性の基１個のみを
有し、かつその第２の官能基は保１基によって遮断され
ているジアミンを有利に反応させる。原則的に、アミド
結合の妨害なしに再び離脱され得る全ての通常のアミノ
保護基が使用可能である。ｔ−デトキシカルｅ＝ルーも
しくはベンゾイル−オキシ−カルボニル−保護基の使用
が特に有利であると実証された１保映されたジアミンと
一般式ＩＩ　ａ　／　Ｉｌ　ｂもしくはＶ紅のレゾルフ
ィン誘導体との反応後に、場合によシ導入された保護基
を再び離脱させ、かつ場合によシ中間段階として生成す
るロイコ色素をレゾルフィン系に酸化する。結合したジ
アミンのアミノ保護基の離脱はこの際通常の条件下で、
有利にトリフルオル酢酸を用いて行なわれる。

そうして得られるアミノ基含有のレゾルフィン誘導体を
１常法で、反応性の基ｘ＋ｉＩとしてカルざキシル基ｔ
Ｖする配位子又は配位子類似体Ｉと、複合することがで
きる。有利にこのカルボキシル基は活性化されていなけ
れはならない。これは前記の方法で行なわれて良い。式
中ｘ２が活性化褌れたエステル基を表わす一般式ｌの配
位子又は配位子類似体の使用が有利である。特にＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステルが特に有利であると実
証°された。複合自体の実施は原則的には、レゾルフィ
ン誘導体と配位子又は配位子類似体との直接複合のため
に前記した方法と同様にして官能基の交換の役割を考慮
して行なわれる。

殊にレゾルフィン誘導体ｎ　ａ　／　ｎ　ｂもしくは■
と式■の中間員Ｘ３−Ｍ−Ｘ’との結合後に得られる生
成物と、低分子の配位子Ｘ２−Ａ％例えばノーブテンと
のその他の反応は、水又は緩衝液及び水浴性の溶剤、例
えば１．４−ジオキサン、メタノール又はエタノールよ
シ成る混合物中で行なわれる。０．１Ｍ燐酸カリウム緩
衝液、−８，５／１．４−ジオキサン（割合１：１）の
混合物が有利である。反応経過を薄層クロマトグラフィ
ーにより行なうことが可能である。反応時間は１〜２４
時間であって良く、殆んど反応は１〜１８時間後にすで
に完全に終了する。

し・戸ルフィン誘導体１Ｉａ／ＩＩｂもしくは■又はＶ
ｉｌｌａ／■ｂと、一般式Ｉの高分子の配位子との反応
のために、Ｎ−ヒドロキシーサクシンイミドエステルが
特に有利であると実証された。

すなわち、例えは家兎−ＩＥＧへのカップリング（Ｋｕ
ｐｐｌｕｎｇ　）の場合には、工ｇ０１モル当タレゾル
フィン３分子の標識度を達成するためには％　　Ｉｇｏ
　１モル当りすでにレゾルフィン誘導体６そルとなる。

最大吸収波長λｍａｗ　＞　４７　ＯｎＩｎを示す従来
このために通常の螢光色素は、反応性の基としてイソチ
オシアネート−又はスルホン酸クロリド−基、例えはフ
ルオレセインインチオシアネート又はテキサス赤（Ｔｅ
ｘａｓ　Ｒｏｔ　）　ｙｉ金含有る。この場合には、同
じ標識度を達成するために、家兎ＩｇＧへのカップリン
グのために実際によシ多い色素過剰１１ｔ−使用しなけ
ればならない。

一般式ｌの為分子化合物、例えば蛋白質の複合は、反応
性の基Ｘｌ又はＸにがＮ−ヒドロキシサクシンイミドエ
ステルである場合には、殊に緩衝液中、特に有利に、０
．１　Ｍ燐酸カリウム緩衝液中で、ＰＨ８，０〜９．０
で行なわれる。反応温度はそれぞれ１０〜３５℃であっ
てよい。反応は室温で有利に実施される。

本発明のもう１つの目的は、その特に有利なスペクトル
特性に依り、本発明による一般式■ａ及び■ｂの化合物
を分析法で使用することであシ、この分析法では一般式
Ｉａ／Ｉｂの化合物もしくは方法条件下で生成した変換
生成物の螢光特性が測定される。

異徨免疫検定（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ　Ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ　）においては、遊離の、又は結合した配位子の
濃度を決定する前に、適当な物質との沈殿により、又は
固体の担体に結合した抗体の使用により、抗体に結合し
た配位子及び遊離の配位子の分離が必要である。同種免
疫検定（ｈｏｍｏｇｅｎ　Ｉｍｍｕ−ｎｏａｓｓａｙ　
）においては、かかる分離なしに試料中の抗体−配位子
−複合体形成の検査が行なわれる。同種免疫検定法には
、例えば螢光−消光法、螢光−増大法及び螢光偏光法が
挙げられ、これらの場合には螢光物質は標識剤として使
用される。特に最後に挙げた方法は従来は導入部ですで
に挙げた常用の螢光標識体の欠点を受けてきた。本発明
による一般式Ｉａ又は■ｂの化合物は、体液中でその自
己の螢光によって妨害する生物学的物質のすつと外側に
ある吸収−及び放射最大を有するので、これらはｊ特に
螢光偏光−免疫検定（ＦＰＩＡ　）中の使用に適当であ
る。

本発明による化合物のもう１つの利点は、これが適当な
置換の際に約７０　ｎｍまでの特に高いストーク−シフ
トを示すことにある。

ＦＰＩＡ法は基本的には通常の螢光免疫検定の原則に基
づく。

直線偏光を有する適当な螢光標識配位子を螢光に励起す
る場合に、励起及び放射の間の僅かな時間的な遅れに依
り、それが放射線を放出する前に、分子は回転する。従
って、直線偏光の平面は同様に一定の角度で回転される
。分子の多数はこの短かい時空間内で回転散乱により螢
光放射の一定の偏光解消となる。放射螢光の偏光につい
ては、分子が大きくなり、かつその為に回転が遅くなれ
はなる程、偏光は大きくなることがあてはまる。この関
係を抗体への配位子の結合の測定に役立てることができ
、それは遊離の標識された配位子が、抗体に結合し標識
された配位子よりなる複合体よりも小さい分子容を有す
るからである。偏光は試料中に存在する決定すべき配位
子濃度に反比例する。

標識された配位子又は配位子類似体の濃度及びかかる免
疫学的方法に必要な抗体の濃度は、使用される測定装置
に、並びに使用される標識配位子又は配位子類似体及び
抗体自体のそのつどの特有の性質に従う。基本的にはこ
れらの濃度は轟然決定すべき配位子の濃度にも依存し、
従って経験“的に決定しなければならない。この決定は
各当業者によって簡単に最適にすることによって行なわ
れ得る。

決定されるべき配位子濃度は一般に約１０−２〜約１０
−１３モルで変動する。測定のためには配位子濃度を決
定すべき試料中で約１０−５〜約１Ｑ−１２モル、特に
有利に約１０″″４〜約１Ｑ−１０モルに鯛整すること
が有利である。より高い配位子濃度は本来の試料の希釈
により測定され得る。

この測定は約６から１２までに達してよい一定の両値で
行なわれる。通例それは約５〜約１０の範囲に、殊に約
６〜約９の一範囲にある。

測定中の一儀の達成及び保持のために、種々の緩衝液、
例えば硼酸塩−１燐酸塩−１炭酸塩−又はトリス−緩衝
液を使用することができる。

いかなる緩衝液を使用するかは、本発明には決定的では
ない。その選択は第１に使用した抗体、決定されるべき
配位子、並ひに使用される螢光標識体に依る。

殊にＦＰＩＡ法は一定の温度で実施される。通常は約０
〜５０℃の範囲、殊に約１０〜約４０℃の範囲で選択さ
れうる。

決定すべき配位子又は配位子類似体の偏光及び濃度の間
の正確な関係は、そのつど較正曲線から読み取れる。こ
れは、相応する物質の異なった、しかし既知の濃度の溶
液の偏光値を測定することによって得られる。次いで検
査すべき試料の未知の配位子濃度を偏光が判明した際に
かかる較正曲線から調べることができる。

本発明に依る一般式Ｉａ及びｌｂの化合物の広い使用範
囲は、螢光標識体としてのその一般的適用性に認められ
る。すなわち例えは免疫螢光−顕□微゛鏡検査において
抗原として蛋白質又は全細胞を螢光標識した抗体により
可視性にすることができる。相応する方法で細胞中のハ
フテン又は抗原の分配を直接観察することもでき、゛そ
の場合は当該化合物を螢光標識しそ細胞中に導入し、か
つ例えば顕微鏡下で追跡する。この際、前記の同種螢光
免疫検定に対照的に、し゛ゾルフィン紡導体の螢光特性
は変ら□ない。　　゛従来螢光標識体として使用され是
公知□の色・素は例えはフルオレセイン、例えはフルオ
レセ□インインチオシアネート又はローダミン色素、例
えばテキサス赤である。しかしながらすでに前記した如
く、フルオレセインは比較的に低い波長で螢光を放つと
いう欠点含有する。更にそのつど゛の担体のカップリン
グ反応の収率は経験上火殆は低く、かつ付加的にカッ−
シリング生成物の色安定性は想い。同様のことはローダ
ミン色素についてもあてはまる。

これらの点に関して正に、不発°明による一般式Ｉａ及
びＩｂの化合物は、公知技術水準において公知の螢光標
識体に比べて明らかな利点を示す。本化合″物は艮好な
色安定性で長波で螢光□を放ち、かつ一般式１Ｉａ又は
ｎｂの化合物及び相″応のカップリング成分から良好な
収率で製造可能である。

本発明による一般式Ｈａ又はＩｂの化合物は当然前記以
外の螢光免疫学的方法において物質の標識のためにも使
用することができる。すカわちこの反応性のレゾルフィ
ン化合物を用いてその他の複合体形成系のパートナ−の
標識も可能である。この際複合体形成系とは、特異的な
相互作用効力に基づき複合体を形成することができる物
質の全ての複合体が解される。公知の被合体は例えばホ
ルそン／特異的受容体、ビオチン／アビジン、炭水化物
誘導体／レクチン等である。例えばビオチンで標識され
た蛋白質は、アビジン及び本発明による一般式１Ｉａ又
はｎｂの反応性化合物よりなる納会生成物に依シ決定さ
れ得る。本゛発明による一般式Ｉａ及び１ｂの化合物の
も５１つの有利な適用可能性は、レクチン／炭水化物誘
導体系のパートナ−の決定において示される。

６フルオレスセント　アクチヴエイテットセル　ソータ
ー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅ
ｌｌ　５Ｏｒｔｅｒ　）”における細胞の選別のために
、螢光標識したラテックス粒子を使用する。かかる粒子
は同様に極めて良好に、例えはヒドロキシル−スル７ヒ
ドリルー、アミノ−又は同様にカルざキシル−又はスル
ホン酸基含有のラテックス粒子と、一般式１Ｉａ又はＩ
ｂの反応性のレゾルフィン化合物との反応によって螢光
標識され得る。

一般式Ｉａ及びＩｂの化合物は同様に有利に酵素の決定
のために使用することができる。このために一般式１Ｉ
ａ又はＩｌｂのレゾルフィン誘導体を、決定すべき酵素
によって分解可能である基質に結合することができる。

この顕色生成物も本発明による一般式Ｉａ及びＩｂの化
合物である。レゾルフィン標識した基質と酵素との反応
及び分解生成物及び未反応の基質の分離後に、酵素の活
性を決定することができる。例えば一般式１Ｉａ又は［
ｌｂの反応性のレゾルフィン誘導体をグリコペゾチドに
結合させ、かつそれによって得られるカップリング生成
物全基質としてエンドグルコシダーゼ−活性の検出に使
用することができる。エンドグルコシダーゼの決定のた
めに、ダンジル化合物での標識は公知である（イヮセ（
Ｉｗａｓｅ　）等著、アナリテイカル・ビオケミストリ
イ（Ａｎａｌ阻ｏｃｈｅｍ、　１１３巻、９３〜９５（
１９８１年〕）。レゾルフィン誘導体はかかる化合物と
比較して特にそのよシ高い感度により優れている。

本発明を次の実施例につき説明する。これらの実施例は
低−又は高分子化合物の標識の基本的な可能性及びその
適用を示す。

実施例 例ル ゾルフィン−４−カルボン酸−［３−（１−ソフエニル
ヒダントイニル）エチル−カルボニル〕−ビペラジド ａ）　　レゾルフイン−４−カルボン酸ニトロソレゾル
シン１６ｇ、２．６−シヒドロキシ安息香酸１５．５　
、ｌｉ’および温石８．６ｇをメタノール２００Ｍに懸
濁し、０℃に冷却する。

これに改硫酸１０．６＃Ｉｌを滴下し、その後室温で２
時間攪拌する。沈殿した赤色レサズリンー４−カルボン
酸を濾別し、メタノールで洗浄し、乾燥する。

レサズリン誘導体を水２００Ｍおよび２５％アンモニア
５０１ｄにとり、濾過する。宵色の濾液に水冷下に亜鉛
粉末５０＆を夕飯ずつ与え、室温に加熱する。還元経過
は容易に薄層クロマトグラフィーで追跡できる（展開剤
：メタノール／酢酸エステル１：１；シリカゾル、ＤＣ
−板）。反応浴ｇ、を濾過し、その後濾液を氷酢酸およ
び少量の濃塩酸で酸性にする。沈殿したレゾルフイン−
４−カルボン酸を濾別し、五酸化リン上真空中で乾燥す
る。

収ｆｆｉ　：　１６．３３　＆ Ｒｆ　（シリカゾル、　展開剤二〇−ブタノール／氷酢
酸／水４：１：１）＝０．４ ｂ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）！ｊアセテルゾヒドロレゾルフイン
−４−カルボン酸 レゾルフイン−４−カルボン＆１２．９ｇ？ｒ氷酢＠３
０酩および無水酢酸６０継にとり、塩化スズ（ＩＩ）　
２７．６　ｇを加え、８０°Ｃで１時間攪拌する。氷水
６０ＯＮに与え、１＃Ｒｆ間撹拌し、沈殿を濾別する。

乾燥後、固形物をアセトン５０ＯＮ中に入れる。吸引濾
過し、濾液を蒸発し、乾燥後生成物１１．３．９を得る
。

ｌＨ−ＮＭＲ（［Ｄ、］−ｐＭｓｏ）：ａ＝２．２４　
、２．２６　ｕｎｄ　２．２９（各々ｓ　、　９Ｈ）　
：６．９４（ｄｄ、　Ｊ　＝８．５および２．２　Ｈｚ
。

ＩＨ）；６−９８（ｄ、Ｊ＝２．２　Ｈｚ、　ＩＨ）；
７．０４（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、　ＩＨ）ｐ　７．６Ｈａ、
　Ｊ＝８．５　Ｈｚ−１Ｈ）；７．６７１）ｐｍ（ａ、
　Ｊ＝９　Ｈｚ、　ＩＨ）− Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．４
６ｃ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフイン
−４−カルボン酸クロリド 例１ｂ）に記載されたトリアセテート３８．５９に塩化
オキサリル５４ｄを加え、０℃に冷却する。これにジメ
チルホルムアミドを滴下し、室温に加熱する。抽出物は
その際がス発生−トに俗解する。真空中で蒸発乾個し、
乾燥塩化メチレン２００ＩＩＬｌで各々３回採収し、杏
ひ蒸発乾個する。

収１！ｉ：：　４１　＆。

ｄ）Ｎ−ＢＯＣ−ピペラジン Ｎ−ベンズヒドリルビペラシン（腹臥−Ｃｈｅｍｉｅ　
）　　１２．６１１１を１．４−ジオキサン／水３：１
　１００１１１を中に入れる。これに１，４−ジオキサ
ン５０１１１ｔＫ鹸解された、ジーｔ−プチルゾカルボ
ネート１２．０．１９１Ｍ１下する。ｂ時間攪拌した後
、水５０１１ｔを温顔し、濾過し、沈殿を乾燥する。

収ｊｔ：　Ｎ　−ＢＯＣ−Ｎ’−ベンズヒドリルピペラ
ジン１６．２１１゜ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．９
２゜Ｎ　−ＢＯＣ−Ｎ’−ベンズヒドリルｔペラジン７
９ｆｔ酢酸エステル１００成および氷酢酸５　ａｔにと
る。活性炭上パラジウム０．３　ＩＩを用いて水素化し
、その後触媒からｌＩＩ！遇し、蒸発する。浅漬に水１
００Ｎおよび１ＮＨｃｊ２Ｑ就を加え諸過する。總１＆
會酢酸エステルで２回抽出し、その後水相を力性ソーダ
浴液で塩基性にする。油状の沈殿した生成物をジクロル
メタンで抽出する。

ａｍナトリウムを用いる乾燥および蒸発後、油状物とし
てＮ　−ＢＯＣ−ピペラジン３．２　Ｉｉが得られ、こ
れは数日後完全に結晶する。

Ｒｆ　　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢＃Ｒ９：１：０．１）：０．０５、ニンヒド
リンで青色になる０ ｅ）Ｎｅｏ、Ｏ−）リアセチルジヒドロレゾルフイン−
４−カルボン酸−（Ｎ’　−ＢＯＣ−ビペラジド） ジクロルメタン４５０−中の例１　ｃ）に記載された酸
塩化物２５，９およびトリエチルアミン１７．３ｄに、
０℃でジクロルメタン５０＃ｌｊ中のＮ　−ＢＯＣ−ピ
ペラジン１３．８１Ｆ）浴液を滴下する。さらに１時間
冷却なしに攪拌し、３回水と十分に振とうし、有機相を
蒸発する。

収１ｉｔ：３６．ＯＩＩ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展＠４剤：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．
６４゜ｆ）　　Ｎ−アセチルジヒドロレゾルフイン−４
−カルボン酸−（Ｎ’−ＢＯＣ−ビペラジド）例１ｅ）
に記載されたトリアセテ−）　３４．５９および亜硫酸
ナトリウム１７．１　Ｉｉを６０℃で１時間１，４−ジ
オキサン／水１１　５００戯中で攪拌する。引続き蒸発
し、酢酸エステル中に入れ、不治の塩から濾過し、シリ
カゲル２１でクロマドグ２フイーにかける（俗離ａ：ｅ
酸エステル／ゾクロルメタン４：１、生成物が溶離する
やいなや、純粋な酢酸エステルに転換する）。

収Ｊｔ：　１４９゜ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：酢酸エステル／ジクロル
メタン　４　：　１　）　：　０．２８゜ｉ）レゾルフ
イン−４−カルボン酸−（Ｎ’−ＢＯＣ−２ペラシト） 例１　ｆ）に記載されたＮ−アセチル化合物５ｇを、メ
タノール２００ａおよび水６００１！１１ｇに俗解する
。炭酸水素ナトリウム１．８９および１ＮＮａＯＨ１０
−７”ｌ　Ｎその後カリクムヘキサシアノフエレート（
鳳）１４ｇを添加する。呈温で匈時間の攪拌後、Ｐｌ′
ｉを５にｐＡ節する。生成物が沈殿し、吸引濾過する。

収址：　２．７２．９゜ Ｒｆ（シＩＪ力ｒル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．２
８゜ｈ）レゾルフイン−４−カルボン酸ピペラジトート
リフルオロアセテート 例１　ｇ）に記載されｆ、−ＢＯＣ−ＩＩ　４体１９ｔ
−トリフルオセ酢酸２０ＩＲｔ中で１５分間放置する。

蒸発し、エーテルで浸漬し、生成物を濾別する。

収ｆｋ：０．９６！ｌ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．０
２゜１）レゾルフイン−４−カルボン酸ビペラジドの、
３−（１−ジフェニルヒダントイニル）−プロビオンｆ
ｉ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのカップ
リング 例１　ｈ）に記載されたピペラジトートリフルオロアセ
テート１９１〜および６−（１−シフェニルヒダントイ
ニル）ｆ四ｔオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル〔ジフェニルヒダントイン−ナトリウム塩および
６−ブロムプロピオン酸エチルエステルから、タック（
Ｃｏｏｋ　）その他、Ｒｅｓ、コミュニケーションスイ
ン　ケミカル　パンロジー　アンド　７アーマコロジー
（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｚｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＰａｚｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ　　）　　５　　（１９７３年）、第７６７ペー
ジと同様に製造〕を１５時間、ジオキサン２０ＩＩＬｌ
および０．１Ｍリン酸カリウム緩＠液Ｐｌ″１８．５．
２０ｍ６中で攪拌する。沈殿した生成物から濾別し、濾
液を蒸発し、シリカゲルＲＰ１８（溶離液：インプロバ
ノール）でクロマトグラフィーにかけ、その際付加的に
生成物が得られる。酢酸エステル／メタノールから結晶
し、カップリング生成物あわせて２５０１Ｒ９が得られ
る。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．６
１゜Ｉ　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ６］　−ＤＭＳＯ）　ｐ　’
　＝２−６−２−８　（ｍ　、２Ｂ　）　；３−０−３
．８（ｍ、　１０Ｈ）；　６，７４（ａ、、ｒ＝２．２
　）１ｚ、　ＩＨ）；６．８２（ｄ−Ｊ＝９．５　Ｈｚ
、　ＩＨ）ｔ　６，９Ｈｄｄ、Ｊ＝９．５および２．２
１（ｚ）；　７．２５−７．３３（ｍ、　１０Ｈ）；　
７．５５および７．６６ｐｐｍ（谷々ｄ、Ｊ＝９．５　
Ｈｚｊ２Ｈ）。

ＵＶ／ＶＩＳ　ＣＯ，Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩Ｉａｐｉ
−１７，５）：λｍａｘ　＝５７６．８　ｎｍ ケイ光放射：λｍａｘ　”　５９２　ｎｍ　０例２ レゾルフイン−４−カルボン酸ｔペラシトの３−（１−
ジフェニルヒダントイニル）Ｄｍ−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルとのカップリング 例１１）と同様に、レゾルフイン−４−カルボン酸ピペ
ラジトートリフルオロアセテート３６５１ｎ？および６
−（１−ジフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル６６９９から所望の生成物
２１０１Ｒ９が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸
／水　４：１：１）：０．８２゜ ＩＨ−ＮＭＲ（［Ｄ６］−ＤＭＳＯ：ａ＝３−２−４−
５（ｍ、　１０Ｈ）ｙ　６−６０（ｄ　、Ｊ＝２−４Ｈ
ｚ　−Ｉ　Ｈ）　ｐ６．７１　（ｄ、Ｊ＝９．５　Ｈｚ
−ＩＨ）ｙ　６．８０（ｄｄ、Ｊ＝９、ｐ５および２−
４　Ｈｚ、ＩＨ）； ７．６９じＳ”、　１０Ｈ）；　７．５２（ｄ、Ｊ＝９
．５　Ｈｚ、　１）１）；７．６１　（ｄ、Ｊ−９，０
Ｈｚ、　ＩＨ）；９．６５ｐｐｍ（ｓ、　ＩＨ）− ＵＶ／ＶＩＳ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩ＷＩ准、−
８，０：λｍａｘ＝　５７５．４　ｎｍ　０ケイ光放射
：λ。ａｘ　＝５９２　ｎｍ　０例６ レゾルフインー４−カルざン酸ｔペラシトのＮ　−ＢＯ
Ｃ−Ｌ−チロキシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルとのカップリング例１１）と同様に、レゾルフイ
ン−４−カルボン酸ピペラジトートリフルオロアセテー
ト２１２■およびＮ　−ＢＯＣ−Ｌ−チロキシン−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル４１９〜から生成物
６２０〜が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．５
８゜Ｎ　−ＢＯＣ−Ｌ−チロキシン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを次の方法で得る。

ａ−）　　Ｎ　−ＢＯＣ−チロキシン ジオキサン／水＝２／１　３００ｄおよび１Ｎ力性ソー
ダ浴液１５Ｎから成る混合物中のＬ−チロキシン−ＮＡ
−塩・Ｈ２Ｏ１０１１（１２，５ｍ−１ニル）の浴液に
シーｔ、−プチルージカルざネ）　（ＢＯＣ）２０　３
　＆　（１３，７５ｍモルル加え、光排除下に室温で２
時間攪拌する。

２　Ｍ　ＫＩＳＯ，−％液で−２に設定し、酢酸エステ
ルで抽出し、酢酸エステル−抽出物を水で洗浄し、硫酸
ナトリウム上で乾燥し、蒸発する。固形残渣を石油エー
テルと擦し、吸引ｍ過し、乾燥話中で乾燥する。

収ｊｉ：９．４５ｇ＝理論値の８６％。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：　ＣＨＣｆ３／リグロイ
ン／酢酸＝６：３：１）：＝０．６゜ １：＋）Ｎ−ＢＯＣ−チロキシン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル エチレングリコールジメチルエーテル２００ｍ１中のＬ
　−ＢＯＣ−チロキシン゛８．８ｇの浴液に、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド１．２．！ｉ’（９，５ｚモル）
を与える。浴液を１０℃に冷却し、エチレングリコール
ジメチルエーテル４０−中のジシクロへキシルカルボジ
イミド２−５９　（９，９ｍモル）の浴液を温顔する。

室温で２時間攪拌した後、沈殿したジシクロヘキシル尿
素を吸引濾過し、濾液を真空中４０℃で蒸発する。残渣
をイソプロパツールと擦し、吸引濾過する。乾燥話中室
温で乾燥する。

収ｊｆＬ：９．１９ｇ＝理論値の９４％（チロキシンに
対する総収率＝８１％・） Ｒｆ　（ＨＰＴＬＣ−ＲＰ　１８　；展開剤：ニトロメ
タン／エタノール＝９：１）：０．８；または（ＨＰＴ
ＬＣ−ＲＰ　１８　；展開剤ニアセトニトリル／Ｈ２０
＝８　：　２　）　：　０．６”Ｈ−ＮＭＲ（［Ｄ６１
ＤＭＳＯ）：Ｊ＝１．３６（ｓ、　９Ｈ）；　２．８１
　（ｓ。

４Ｈ）；　２．９−３．２（ｍ、　２Ｈ）；　４．５−
４．９（ｍ、　ＩＨ）；７−０３（ａ−２Ｈ）ｔ　７−
６３（ｄ、ｊ＝９　Ｈｚ−ＩＨ）ｐ　７−９０（ｓ、　
２Ｈ）；９．２（ｓ、　ＩＨ）；例４ レゾルフイン−４−カルボン酸ビベラジドの３−０−［
３−（Ｎ−スクシンイミドオキシカルボニル）プロピル
］エストラジオールとのカップリング 例１１）と同様に、レゾルフイン−４−カルボン酸ビペ
ラゾドートリフルオロアセテート２１２■および５−０
’−［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）
プロピル〕エストラジオール２２０■から生成物２９５
＋１１！／が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノ、
−ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．
５８３−Ｏ−（３−（Ｎ−スクシンイミドオキシカルボ
ニル）プロピル〕エストラジオールが常法で、６−０−
カルボキシプロピル−エストラジオール〔エストラジオ
ールおよびブロム酪酸から、リエグケ（Ｌｉ１ｂｋｅ　
）その他、イムノロギツシュ　テステ　フェア　ニーダ
ーモレキエラーレ　ビルクシュトツフエ（Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉａｃｈｅＴｅｓｉｅ　Ｆｉｉｒ　Ｎｉｅｄｅｒ
ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　Ｗｉｒｋｓｔｏｆｆｅ　）、Ｇ
、チーメ　フエアラーク（Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ
　）、シュトッドがル）、第９４ページにおけると同様
に〕およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから、ジシク
ロヘキシルカルボジイミドの存在で得られる。

例５ レゾルフイン−４−カルボン酸ビペラゾドのＮ−（３−
（Ｎ−スクシンイミドオキシカルざニル）プロｔル〕フ
エノバルビタールとのカップリング 例１１）と同様にレゾルフイン−４−カルざン酸ぎペラ
シト−トリフルオロ酢酸２１２■およびＮ−（３−（Ｎ
−スクシンイミドオキシカルボニ＃　）　ｆ　ｏ　ｅル
〕フエノバルビタール２０５■から、生成物２２０■が
得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．４
５゜Ｎ−（３−（Ｎ−スクシンイミドオキシカルボニル
）ｆ口ぎル〕−フェノバルビタールハ常法でフェノパル
ビタールー１−１？＆［Ｔ、ニジカワ（ＮｉＮ１５ｈｉ
ｋａ　）その他、クリエカ　キミカアクタ（Ｃ１１ｎ、
　Ｃｈｉ＋ｕ、　Ａｃｚａ　）　　９１　（１９７９・
＠）第５９ページ〕およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドからジシクロへキシルカルボジイミドの存在で得られ
る。

例６ レゾルフイ・ノー４−カルボン酸ざペラシトのテオフィ
リン−７−ブロビオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルとのカップリングレゾルフイン−４−カルボ
ン酸ピペラジトートリフルオロアセテート２１２ｒｎ９
およびテオフィリン−７−７’ロビオン［−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル１７５■から例１　ｉ）と
同様に生成物２００〜が得られる。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．４
４゜テオフィリン−７−ブロビオーン［−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルは、常法でテオフィリン−７
−７″ロビオン酸［Ｔ、ニジカワ（ＮｉＮ１５ｚｉｋａ
　）その他、ケミカル　アンド　ファーマソイテイカル
　プルティン　（Ｃｈｅｍ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　）　　２７　（１９７９年
）第８９６ベーゾ〕およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドからジシクロヘキシルカルボジイミドの存在で得られ
る。

例７ Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サルコシン−Ｎ
′−ヒドロキシスクシンイミドエステルの、１−（２−
アミノエテル）ジフェニル−ヒダントインとのカップリ
ング ａ）　　Ｎ　Ｉ　ＯＩ　Ｏ−）リアセチルジヒドロレゾ
ルフイン−４−カルボン酸（Ｃ，−ブトキシカルビニル
メチル）メチルアミド 例１　ｃ）に記載された酪塩化物１０９を例１ｅ）と同
様に、サルコシン−１，−ブチルエステルと反応させる
。

我輩ニア、５．９゜ Ｆｔｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．
７７゜ｂ）　　Ｎ−アセチルジヒドロレゾルフイン−４
−カルボン酸（ｔ、−ブトキシカルボニル−メチル）メ
チルアミド 例７　ａ）に記載された生成物７．５　！ｌを例１　ｆ
）と同様に脱アセチル化する。

収ｉｔ　：　５．２　ｇ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．５
６゜Ｃ）レゾルフイン−４−カルボン酸（ｔ、−ブトキ
シカルボニルメチル）メチルアミド 例７　ｂ）に記載された生成物４．５ｇを例１　ｇ）と
同様に反応させる。

収量＝２゜６ｇ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．６
４゜ｄ）　　レゾルフイン−４−カルメン酸（カルボキ
ンメチル）メチルアミド 例７　ｃ）に記載された生成物０．５５．９を室温で１
時間トリフルオロ酢酸６Ｍ中で放置する。

蒸発乾個し、エーテルと擦し、濾過する。

収量：０．４！Ｍ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．１
１゜ｅ）Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サルコ
シン−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミドエステル 例７　ｄ）からの生成物２００■をＮ−ヒドロキシスク
シンイミド７２〜およびジシクロヘキシルカルボジイミ
ド１６８■と１４時間、テトラヒドロフラン４０Ｍ中で
撹拌する。沈殿した尿素から濾過し、蒸発しおよびシリ
カゲルＲＰ１８でクロマトグラフィーにかける（溶離′
ｅ、：エトロメタン／エタノール　４：１）。

収ｊ！ｔ：１５０！ｎ９゜ Ｒｆ　（シリカゲルＲＰ−１８、展開剤二ニトロメタン
／エタノール　４　：　１　）　：　０．７９゜ｆ）Ｎ
−（４−レゾルフィニルカルボニル）−サルコシ７−Ｎ
’−ヒドロキシスクシンイミドエステルの、１−（２−
アミノエチル）ジフェニルヒダントインとのカップリン
グ 例７　ｅ）からのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル１２５１＃’にジオキサン／リン酸カリウム緩衝液ｐ
ｉ−１８，５，１：　１　４Ｑａｇ中で、１−（２−ア
ミノエチル）ジフェニルヒダントイン９０■と１時間撹
拌する。ジオキサンを蒸発し完全に色が転換するまでア
ンモニアｔ−添加し、濾過し、生成物をＨ（Ｊを用いて
總叡から生じる。

収量：１１０〜 Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤；ｎ−シタノール／氷酢酸
／水　４：１：１）：０．７８゜ＵＶ／ＶＩ８　（０，
１Ｍリン酸カリウム緩衝液、−８，０）　：λｍａｘ　
＝　５７５　ｎｍケイ光放出：λｍａｗ　＝　５９２　
ｎｍｍｅ レゾルフイン−４−カルボン１１２−２（１−ジフェニ
ルヒダントイニル）エチルアミドａ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリ
アセチルジヒドロレゾルフイン−４−カルざンＩ！−２
（１−ジフェニルヒダントイニル）エチルアミド Ｎ１ｅ）と同様に、１−（２−７ミノエチル）ジフェニ
ルヒダントイン１．３７＆ｔ’Ｎ、０．０−トリアセチ
ルジヒドロレゾルフィンカルボン酸クロリド１．２ＩＩ
と反応させる。軽く看色された泡状物として生成物１．
９Ｉが得られる。

ｂ）　　レゾルフイン−４−カルボン酸−２（１−ジフ
ェニルヒダントイニル）エチルアミド例Ｂ　りで得られ
た生成物を例１　ｆ）および１ｇ）と一様に酸化的に、
脱アセチル化する。抽出物１．９９から生成物６００１
１１ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．６
８゜ｌ）Ｉ−ＮＭＲ（（Ｄ、］−ＤＭＳＯ）：　ａ”１
−１−２−３−６（４Ｈ）；　６．７３（ｄ、Ｊ＝２−
２　Ｈｚ−ＩＨ）； ６．８４（ａ、、ｙ＝９．５　Ｈｚ、　ＩＨ）ｔ　６−
８６（ｄｄ、Ｊ＝９．５および２−２　ａｚ＊Ｉａ）ｔ ７−２−７−４（ｍｅ　１０Ｈ）；　７．６２および７
．６６Ｃ各々ｄ。

Ｊ＝９．５　Ｈｚ−２Ｈ）ｐ ８．６６（ｚ、広幅ａＪ＝５　Ｈｚ−ＩＨＬ　９−５８
ｐｐｍ（ａ９−５８ｐｐ／ＶＩ８　（０，Ｉ　Ｍリン酸
カリウＡｆｆｌｌｌｋｉＱ、め８．０）λｍａｗ　＝　
５７５　ｎｍ　０クイ光放射°：λｍａｘ　＝　５９１
　ｎｍ　０例９ ６−メチルレゾルフイン−４−カルボン酸−ビペラシト
の、［２−（１−ゾフェニルヒダントイニル）酢［−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのカップリング ａ）２−メチル−４−ニトロソレゾルシン２−メチルレ
ゾルシン１９．８ｇおよび水酸化カリウム１３．４．９
　ｔ−エタノール１２０Ｍに浜解し、５℃に冷却する。

これにインペンチルニドリット２１１４を滴下し、３時
間攪拌し、沈殿を吸引濾過する。黄色の固形物を５Ｎ硫
酸２００ａに攪拌混入する。その際明黄色の生成物が沈
殿する。

収量：２２ｇ。

Ｒｆ　（Ｖ　９１ｙｉｐ’ル、Ｈ開削：クロロホルム／
メタノール／氷酢酸　９　：　１　：　０，１　）　：
　０．５３゜ｂ）　　６−メテルレサズリンー４−カル
ざン酸２−メチルー４−ニトロソレゾルシン１５．３＃
、２．６−ジヒドロキシ安息香酸１５．１’。

温石８．８１Ｉおよび媛硫酸１１１Ｌｌを例１　ａ）と
同様に反応させる。

収量：　２８．７　ｇ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．１
５゜ｃ）Ｎ、０．０−トリアセチル−６−メチルジヒド
ロレゾルフィンー４−カルざン酸 ６−メチルレスアズリンー４−カルがン酸１０．９、塩
化スズ（１）　１９．８　＆　、無水酢ＩＩ！２０Ｍお
よび氷酢酸１５０ａから例１　ｂ）と同様に直接トリア
セチル化されたロイコ化合物が得られる。粗生成物をア
セトンを用いて十分に沸騰することによりＩｎＩｍする
。

収量ニア、３，９゜ Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．５
１゜”Ｈ−ＮＭＲ（［Ｄ］ａ−ＤＭＳＯ）：ａ＝２．１
０，２．２５−２−２９−２、！１３（各々ａ−１２Ｈ
）； ７．００．７．０９．７．５０および７．７４ｐｐｍ（
各々ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、　４Ｈ） ｄ）Ｎ、０．０−）リアセチル−６−メチルジヒドロレ
ゾルフィンー４−カルボン’ａｔｔｔ　−ＮＰ−ＢＯＣ
−ぎペラシト 例１　ｄ）から１　ｅ）と同様に、Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリア
セチル−６−メチルシヒドロレゾルフインー４−カルボ
ンＴＲ５９、塩化オキサリル１０．７ｇおよびＮ　−Ｂ
ＯＣ−ビペ２シン２ＩＩから、生地物３ＩＩが得られる
。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：酢酸エステル）＝０．５
７ ｅ）６−メチルレゾルフイン−４−カルボン酸ぜペラシ
ト−トリフルオロアセテート 例９　ｄ）に記載されたトリアセチル誘導体１ｇを例１
　ｇ）〜１　ｈ）と同様に反応させる。

収量：　０．４３　ｇ ｆ）６−メテルレゾルフインー４−カルボン酸ぎペラシ
トの、２−（１−ジフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのカップリング 例９　ｅ）で得られた化合物２２２〜を２−（１−ゾフ
ェニルヒダントイニル）［１−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル２００１ｎ９と反応させる。

我輩：２５０■。

ＵＶ＼ＶＩＳ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液、−８
，０）　：λｍａ工＝　５８４　ｎｍ　０クイ党放出：
λｍａｗ　＝　６００　ｎｍ。

例１０ ９−ヒドロキシ−５−ベンゾ［８３フェノキサシン−８
−カルボン酸ビペラジドの、〔２−（１−ジフェニルヒ
ダントイニル）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルとのカップリング ａ）９−ヒドロキシ−５−ベンゾ〔ａ〕フェノキサシン
−８−カルメン酸−１２−オキシド１．６−シヒドロキ
シー４−ニトロソナフタリン２．８１＋、２．６−シヒ
ドロキシ安息査酸２．３１　ｇ、温石１．２９ｇおよび
濃硫酸１．６Ｎを例１　ａ）と同様に反応させる。

収＆　：　２．８　ＩＩ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸
／水　４　：　１　：　１　）　：　０．６３゜ｂ）１
２−アセチル−５，９−ジアセトキシベンゾ［ａ］フェ
ノキサシン−８−カルボン酸例９　ｃ）と同様に、９−
ヒドロキシ−５−ベンゾ〔ａ〕フェノキサシン−８−カ
ルボン酸−１２−オキシド２．４ｇからトリアセチル化
されたジヒＶ口化合物１．８ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤；クロロホルム／メタノー
ル／氷酢ｉ１１　９：１：０．１）：０．３１Ｃ）１２
−アセチル−５，９−ジアセトキシベンゾ（ａ）フェノ
キサジン−８−カルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−２ペラシト 例１０ｂ）に記載されたトリアセチル化合物１．６９を
例９ｄ）と同様に、塩化オキサリルおよびＮ　−ＢＯＣ
−ピペラジンと反応させる。

収量：１．２ｇ 工Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：Ｊ＝１−４９（１９Ｈ）
；　２．１２；　２．２７；２．４６（各々ａ＝　１２
Ｈ）； ３３−０−３−９（，８Ｈ）ｔ　７．０３（ａ、、ｙ＝
９　Ｈｚ−ＩＨ）ニア、１６−７．９４　ｐｐｍ（ｍ、
　６Ｈ）ｄ）９−ヒドロキシ−５−べ″ンゾ［ａ］フェ
ノキサシン−８−カルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−ぎペラシ
ト 例１　ｆ）と同様に、例１０Ｃ）のトリアセチル化合物
０．９３９から生成物０．５１９が得られる。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．６
９ｅ）９−ヒドロキシ−５−ベンゾ〔ａ〕フェノキサシ
ン−８−カルボン酸ピペラジトートリフルオロアセテー
ト 例１０ｄ）に記載されたＢＯＣ−保論化合物０．５９か
ら例１　ｈ）と同様に、生成物０．５ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．０
２ｆ）　　９−ヒドロキシ−５−ベンゾ〔ａ〕−フェノ
キサシン−８−カルボンＷｌｔペラシトの、２−（１−
ジフェニルヒダントイニル）酢ｍ−Ｎ−ヒドロキシ−ス
クシンイミドニステルトのカップリング 例１０ｅ）により製造したビペラゾド５０ｒｎ９および
２−−（、１−ジフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ−
ヒドロヤシスクシンイミドエステル１５０■から、例１
　ｉ）と同様に生成物７０〜が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メ１／−
に／米酢＠　　９：１：０．１）：０．５７ＵＶ／ＶＩ
Ｓ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩１ｋｉｇｐ）１８．０
）：λｍａｘ　”　５６０　ｎｍ クイ光放射：λｍ＆、＝、６１５ｎｍ０ＩＨ→Ｊ１４Ｒ
（［Ｄ］６−ＤＭＳＯ）：ａ＝３−０−４−５（ｍ、１
０Ｈ）ｐ　　６−３７（ｓ、ＩＨ）：　　６．８０（ｄ
、Ｊ＝８　Ｈｚ、１）１）；７．２−７．３５（ｍ、１
０Ｈ）；　　７．３５−８．０（ｍ、３Ｈ）；８．１０
（ａａ、、ｙ＝８および２　Ｈｚ−ＩＨ）；８−５６（
ｄｄ、Ｊ＝８および２　Ｈｚ＝　ＩＢ）；９．６０　ｐ
ｐｍ（ｓ、ＩＨ）例１１ ８−エチルレゾルフイン−４−カルボン酸（１−ジフェ
ニルヒダントイニルメチルカルポニル）ビペラジド ａ）　　６−エチル−４−ｉトロツレゾルフフ例９ａ）
と同様に、４−エチルレゾルシン７．５１ｉ、水酸化カ
リウム４．５ｇおよびイソペンチルニド、リットＢｍｓ
から、黄色の固形物として６−エチル−う−ニトロソレ
ゾルシンカ得ラレる。

収ｊｉ　：　７．５　、！？ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム７７例１　
ａ）と同様に、６−エチル−４−ニトロソレゾルシン７
．４ｇ、２．６−ジヒドロキシ安息’ｉ酸６．８！ｉ、
二酸化マンガン６．９ｇおよび濃硫酸５ＩＩＬｔから亜
鉛粉末８ｇを用いる還元により生成物９．５９が得られ
る。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９：１：０．１）：０．０５゜ｃ）　　Ｎ
　ａ　Ｏ＃　Ｏ−）リアセチル−８−エチルジヒドロレ
ゾルフイン−４−カルボンｌｌｉ　−Ｎ’　−ＢＯＣ−
ビベラジド 例１　ｂ）と同様に、８−エチルレゾルフイン−４−カ
ルボン酸７．７＆、塩化スズ（…）　１５．４．９、氷
酢＠３０１１および無水酢酸１５．３＃ＩＪからＮ。

０．０−）リアセチル−８−エチルレゾルフイン−４−
カルボン酸が得られ、これは粗生成物として例１　ｃ）
と同様に、直接酸塩化物におよび例１　ｅ）と同様にＢ
ＯＣ−ピペラジドにさらに加工される。

収量：４ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）＝０．８６ｄ
）　　８−エチルレゾルフイン−４−カルボン酸−Ｎ’
　−ＢＯＣ−ビペラジド Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−８−エチルジヒドロレゾル
フイン−４−カルボン酸−Ｎ’　−ＢＯＣぎペラシト４
ｇから例１　ｆ）および１　ｇ）と同様に、相轟するカ
ルボン酸−Ｎ’　−ＢＯＣ−ビペラゾドが得られる〇 収量：　Ｏ，Ｓ　ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル　４：１）＝０．６７ ｅ）８−エチルレゾルフイン−４−カルボン酸ビペラジ
ドトリフルオロアセテート 相当するＢＯＣ−ピペラジドロ６０吋を１．５時間、ジ
クロルメタン／トリフルオロ酢酸６：１３５ｍＪ中放置
する装蒸発後エーテルで投機し、吸引濾過し、乾燥する
。

収量＝３５０９ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ブタノール／氷酢酸／水
　４　：　１　：　１　）＝０．３３ｆ）２−（１−ジ
フェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルとの反応 例１１）と同様に８−エチルレゾルフイン−４−カルボ
ン散ｔペラシトートリフルオロアセテート６２５■、お
よび２−（１−ジフェニルヒタントイニル）酢ｉ１！−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル４３５〜から生
成物１２０〜が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９：１：０．１）＝０．４３１Ｈ−ＮＭＲ
（［Ｄ］ａ−ＤＭＳＯ）：　＃＝１．１５（ｔ、Ｊ＝７
．２　Ｈｚ、　３Ｈ）；　２．５２（ｑ、Ｊ＝７．２　
Ｈｚ、　２Ｈ）；６．ｌ−４，０（ｍ、　８Ｈ）；　４
．２５−４．４５（ｍ、　２Ｈ）；　６．４２（Ｂ、広
幅、　１Ｂ）；６．９４（ｄ、Ｊ＝９．０　Ｈｚ−ＩＨ
）＊　７．３−７．５（ｍ、１１Ｈ）ニア−６８（ｄ、
Ｊ＝９．０　Ｈｚ−ＩＨ）ｙ　９−５４（ｓ−ＩＨ）ｙ
ｌｌ　、２　ｐｐｍ（ｓ、広幅、１Ｈ）ＵＶ／ＶＩＳ　
（０，１Ｍリン酸カリウム＃ｔｒ１ｆ１液　−８，０）
　：λｍａｘ　５７５　ｎｍ ケイ元放射：λｍａｘ　”　５９８　ｎｍ例１２ ８−クロルレゾルフイン−４−カルボン酸−（１−ジフ
ェニルヒダントイ二ルメチルカルボニル）ビペラジド ａ）８−クロルレサズリンー４−カルボン酸４−１０ル
ー６−ニトロソレゾルシンＣｆ５ムビン（Ｐｌａｍｐｉ
ｎ　）およびケイン（Ｃａ１ｎ　）、ジャーナル　オン
　メデイシナル　クミストリ−（Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈ
ｅｍ、　）　６．２４７（１９６３年）〕１７．３．９
．２　、６−ジヒドロキシ安息香酸１５．４ｇ、横行８
．６ｇおよび課硫酸１０．７Ｍから例１　ａ）と同様に
８−クロルレサズリンー４−カルボン酸が得られる。

収量：　１７．１．９ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ブタノール／氷酢酸／水
　４　：　１　：　１　）＝０．５８ｂ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−
トリアセチル−８−クロルジヒドロレゾルフィンカルホ
ン酸 ８−クロルレサズリンー４−、’Ｆルホス酸１６．３ｇ
および塩化スズ（ＩＩ）　１８．９９を癩時間、氷酢酸
／無水酢酸１：１　１００成中で８０℃に加熱し、その
後氷水５０ＯＮに与える。

２時間攪拌し、沈殿物を濾過し、シフペント（５ｉｃａ
ｐｅｎｚ　）Ｒ上で乾燥する。固形物をアセトン５００
＃ｌＪにとり、不治の残渣を濾過する。濾液を蒸発し、
乾燥後生成物１２．３１ｊが得られる。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）＝０．３９゜
１Ｈ−ＮＭＲ（［Ｉ）〕〕６−ＤＭＳＯ：δ＝２．２５
（ｓ、　３Ｈ）；　２．３３じｓ”、６Ｈ）ｐ　７−１
６（ｄ、Ｊ＝８．８　Ｈｚ、ＩＨ）ｔ　７−３０（ｓ＝
　ＩＨ）；　７−７６（ｄ、Ｊ＝８．８　Ｈｚ、　ＩＨ
）ｓ　７−９０　ｐｐｍ（８，ＩＨ）。

ｃ）８−クロルレゾルフイン−４−カルボン酸−Ｎ’　
−ＢＯＣビペラジド 例１ｂ）、Ｃ）およびｅ）〜ｇ）と同様に、Ｎ。

ｏ、ｏ−トリアセチル−８−クロルジヒドロレゾルフイ
ン−４−カルボ／酸５ｇから生成物０．８ｇが得られる
。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル−氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）＝０．７ｄ）
８−クロルレゾルフイン−４−カルボン酸ｔペラシトト
リフルオロアセテート 例１２Ｃ）からのＢＯＣ−保護化合物０．８９から例１
　ｈ）と同様に生成物ｏ、ｅ　ｉ　ｙが得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：０．１　）＝０．０７８）
８−クロルレゾルフイン−４−カルボン酸ビペラジドの
、２−（１−シフェニルヒダントイニル）酸２−Ｎ−ヒ
ドロキシ−スクシンイミドエステルとのカップリング 例１　ｉ）と同様に、８−クロルレゾルフイン−４−カ
ルボン酸ピペラジトートリフルオロアセテ−）　４００
ｍｐおよび２−（１−ジフェニルヒダントイニル）−酢
酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル４１０■
から所望の生成物が得られる。

収！＊：１５１１ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　＝０．３８　）
ＵＶ／ＶＩＳ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液　…８
．０　）　　’　　、２ｍａｘ　＝　５８１　　ｎｍケ
イ光放射：λｍａｘ　＝５９７　ｎｍ例１６ ８−クロロレゾルフイン−１−カルボン酸−ビペラシト
の、テオフィリン−７−ｆロビオン酸−（２−アミノエ
チル）アミドとのカップリング ａ）８−クロロレゾルフイン−１−カルボン酸４−クロ
ル−６−ニトロソレゾルシン８．７９および３．５−ジ
ヒドロキシ安息香酸７．７１　ｇをメタノール２００＃
ＶＩＣ％解し、０℃で横行４．８ｇおよび少歓宛に纜硫
酸５．６Ｍを添加する。

室温で２時間攪拌し、麹過し、青色に色が変わるまでア
ンモニアおよび水２００成を添加する。

鹸液をｆＭ、過し、認叡に酸アンモニア２５継および亜
鉛粉末２０．９を水冷で加え、その後さらに冷却するこ
となしに約１５分間攪拌する。活性炭２００〜を添加し
、濾過し、Ｐ）′Ｉ２に酸性化し沈殿したレゾルフィン
誘導体を遠心分離する。

収Ｍ　：　３．９　ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸
／水　４：１：１）：０．８８ ｂ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチル−８−クロルジヒドロレ
ゾルフイン−１−カルボン酸 ８−／ロロレゾルフィンー１−カルボン酸３．５９から
例１ｂ）と同様に、生成物６．２ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．４
３Ｃ）　　８−クロロレゾルフイン−１−カルボン鈑ピ
ペラジトートリフルオロアセテート 例１１ｂ）で製造したトリア“セチル化合物６９から例
１　ｃ）〜１　ｈ）と同様に生成物１．４ｇが得られる
。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢識　９：１：０．１）：０．０８ａ）８−／ロ
ロレゾルフインー１−カルざン酸ビペラジドの、テオフ
ィリン−７−グロビオン酸−（２−アミノエチル）アミ
ドとのカップリング 例８と同様にＮ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−８−クロル−
ジヒドロレゾルフイン−１−カルボン酸ぎペラシト４２
０■およびテオフィリン−７−７′″ロビオン酸（２−
アミノエチル）アミド６００即から生成物１９０９が得
られる。

例１４ Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サル：ｓシｙ−
Ｎ’−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるイム
ノグロブＩ）７Ｇの標識付はヒト−ＩｇＧ１００１Ｒ９
ｔ−０，１Ｍリン酸カリウム１１１ＩａｐＨ８，０１０
５１４に溶解し、　Ｎ−（４−Ｌ’ゾルフィニルカルボ
ニル）サルコシン−Ｎ′−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル（ｌＩｇ　７　ｅ）参照）５〜を加える。室温
で１２＃ｆ間放直し、その後つ〃トロデル（Ｕｌｚｒｏ
ｇｅｌ　）　ＡＣＡ　２０２（ＬＫＢ）でクロマトグラ
フィーにかける。標識付けされたタンパク質をその際遊
離低分子レゾルフィンより前にｆＩ４雌する。１ｍ繊度
を吸光測定により測定する。これは６であり、即ちＩｇ
Ｇ分子１モル毎にレゾルフィン誘導体３分子が結合され
ている。

例１５ Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）１１′ベリジン
−４−カルざン酸−Ｗ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルを用いる、イムノグロブリンＯｅ）標識付け ａ）Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）ピペリジン
−４−カルボン酸 例１　ｃ）に記載されたＮ、０．０−トリ、アセチルジ
ヒドロレゾルフイン−４−カルざン酸クロリド２．０　
＃　ｔ−例１　ｅ）と同様に、？ベリジンー４−カルボ
ン酸メチルエステル−塩酸塩０．９ｇと反応させ、例１
　ｆ）および１　ｇ）と同様に脱アセチル化し、酸化し
、カ性ソーダ皺敵を用いてＮ−（４−レゾルフィニルカ
ルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸にケン化する。

収量：０．９９ Ｒｆ　（シリカゾルＲＰ−１８、展開剤：ニトロメタン
／エタノール　４：１）〜０．４４−ＵＶ／ＶＩ８　（
０，Ｉ　Ｍリン酸カリクＡｌ＆＠＆ｐｔｉ８．５）：　
λｗａｘ　＝　５７６．２　ｎｍ ｔ））Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）ピペリジ
ン−４−カルボン酸−「−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル Ｎ−（４−１／！／’ルフイニルカルボニル）ピペリジ
ン−４−カルボン酸２００Ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド２４０■およびジシクロヘヤシルカルボジイミ
ド２４０１ｖから例７　ｅ）と同様に生成物１９０９が
得られる。

Ｒｆ　（シリカゲルＢＰ−１８、展開剤二ニトロメタン
／エタノール　４：１）〜０．７ ＩＲ（ＫＢｒ−圧縮物）　：　３４１５（ｍ、広幅）、
１８１４（ｗ）、１７７３（ｍ）　、１７３４（ａ）　
、１６２６（ｍ）　、１２１４（ｍ）　ａｍ−１Ｏ）Ｎ
−（４−レゾルフィニルカルボニル）−ピペリジン−４
−カルボン酸−「−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を用いるイエウサギ−ＩｇＧの標識付け ０８１Ｍリン酸カリウム緩衝液−８，５、ｌＩｇに溶解
されたイエウサギ−ＩｇＧ１０１１９に１，４−ジオキ
サン１Ｍ中のＮ−（４−レゾルフイニルカルボニル）ｔ
ベリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル１００μｊを加え、室温で２時間放置する
。こねはレゾルフィン誘導体６．４モル対イエウサギー
ＩｇＧ１モルの比に相当する。

ＡＣＡ　２０２　を用いるクロマトグラフィー（＃離液
：　０．　Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝＆ＰＨ８，５）の
＆　Ｉｇ（：）　１モル幽りレゾルフィン６．４モルの
負荷度に相当する、吸着比Ａ３７８／Ａ２８０　＝　０
．９７を有する、ｊ１／バク質画分が得られる。

同様の試験でイエウサギ−ＩｇＧ１０１１１＆に活性化
レゾルフィンの浴液２０μノを加え、１ｇＧ１モル当り
提供された染料１．０５モルで０．８の負荷度が得られ
る。

レゾルフィン標識付けされた工ｇＧの吸着最高値は５７
８　ｎｍである。浴液は明赤色で強くケイ光する。

レゾルフィン標誠付けされたＩｇ（）の俗歌を１ケ月間
日光にさらすと、ケイ光強さは元の値の５９％に低下し
、一方同様に装造された、フルオレセインインチオシア
ネートで標識付けされたＩｇ（）は１６％におよびテキ
サス　ロート（Ｔｅｘａｓ　Ｒｏｔ　）で標識付けされ
たＨｇＧは１２％に低下する。

例１６ ＦＰＩＡを用いる、ヒト血清でのジフェニルヒダントイ
ン−確定 ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩＠准（Ｐｉ−１７，８）１
９５０μｄに試料（ｔ＋　ｓ　μｉ１抗Ｋｌ’！４［ｋ
”’２５μ！およびジフェニルヒダントイン−レゾルフ
ィン浴液（３）２５μｌを加える。３７℃で５分間のイ
ンキュ°ベーション後、ケイ光−光ヲ測足す（Ｈｉｚｏ
ｃｈｉ　）。

１）　　Ｅ料：公知の皺でジフェニルヒダントインで増
加された提供者血清。較正曲線の作成のために ａ）　　２．５μｍ１７１１１ ｂ）　　　５〜／ＩＩＬｔ Ｃ）１０μｍ１７ＩＩＬＩ ｄ）２０μＥｌ／ｍ１ ｅ）　　４０　μＩＩ／ａｔ の濃度でジフェニルヒダントインを、含有する、ヒトの
提供者血清を使用する。

２）抗体浴＊：抗体４５０μＩ／酩０．１Ｍリン酸−ナ
トリウム緩衝１（ｐ）１７．８） 抗体は牛血清アルブミンと結合されている、ジフェニル
ヒダントインを用いる、ヒツジの免疫化により、常法に
より得られる。

抗血清は（ＩＩｌＣ酸アンモニウム沈殿およびＤＫＡＥ
−セルロースでのクロマトグラフィーを介して精製され
る。

３）ゾフェニルヒダントインレゾルフィン＃ｒ液（１０
−６Ｍ　）　：　０．Ｉ　Ｍリン酸ナトリウム−緩両液
（−７，８）中の、例１１）からのジフェニルヒダント
イン−レゾルフィン複合体 ジフェニルヒダントイ７−　＠　＊　Ｉａ）、１ｂ）、
１Ｃ）、１ｄ）およびＩｅ）を用いて得られる測定結果
が第１図に示されている。そこでは、測定された極性値
（ｍｐ）に対する試料のジフェニルヒダントイン濃度（
μｍ１／ＩＲ１＞が挙げられている。

このような較正曲線を用いて、公知でないジフェニルヒ
ダントイン含量を有する、試料中のジフェニルヒダント
イン−濃度も確定できる。

例１１）からの上記で使用されたジフェニル”ヒダント
イン複合体の代わりに例２）、７）、８）または１０ｆ
）からのジフェニルヒダントイン複合体を使用する場合
も、比較可能な較正曲線が得られる。

例１７ レゾルフインーハイマンノースーグリコベグチドを用い
るエンドグリコシターゼ活性の確定ａ）Ｎ−（４−レゾ
ルフィニルカルがニル）サルコシン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルヲ用いるハイマンノースグリコペ
プチドのＩ！Ｉ臓付は ハイマンノースグリコペプチド（Ｈｌｇｈｍａｎ−ｎｏ
ｓｅｇｌｙｃｏｐｅｐｚｉｄ　；　７アング（Ｈｕａｎ
ｇ　）その他カルがヒトレート　レス（Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｚｅ　Ｒｅｓ、）１３．１２７〜１３７（１９７
０年）により製造）５０■に０．１Ｍリン酸カリウム緩
衝液−８，０１０１１４’を加える。溶液を８．０の−
に後調節する。ジオキサン３１１Ｌ −レゾルフイニルカルポニル）サルコシン−「ーヒドロ
キシスクシンイミドエステル２５〜を添加し、１時間後
、さらにジオキサン３紅中の固形−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルの開蓋を添加する。Ｎ温で１４時間
攪拌し、その後真空中でジオキサンを蒸発し、水で７０
紅に希釈し、その後緩＠液Ａ（＝０．０２Ｍ）リスーＨ
Ｃｊ，２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化マンガン（
ＩＩ）、２ｍＭ塩化カルシウム、Ｐ”　７．２　）で１
４０ａに希釈する。−を水性アンモニアで７、２に後調
節する。その際形成された沈殿を遠心分離除去する。残
＃Ｌｔ−Ｃｏｎ　Ａ−セファロースカラム（　８ｅｐｈ
ａｓｏｓｅａＫｕｌｅ　）　（　１　ｘ　１　５　ａｎ
　）に与える。緩衝数人で遊離色素を十分に洗浄する。

還流液がもはや赤色でなくなるとすぐに、画分ルゾルフ
インーハイマンノースグリコベプチドを溶離液として緩
衝液Ａ中の２％メチルモノシト（約１００１ＩＬｌ）で
俗離する。

その後画分２を２％水性メチルマンノシドで＃離する。

双方の画分を水に対して透析し、凍結転線し、双方の画
分は下記ｂ）に記載された、エンドグリコシダーゼ活性
の確定のために好適である。

ｂ）エンドグリコシダーゼ活性の確定 レゾルフイン−ハイマンノースグリコペプチドを好適な
緩衝液中エンドグリコシダーゼでインキエベートし、こ
れらはたとえはエンドグリコシダーゼＨおよびクエン酸
塩−緩Ｔｈ叡ｐｔｉ５．５である（＝試料１）。これと
平行して、エンドグリコシダーゼを含有しない以外は同
一の試料を共に埠＜（＝試料２）。レゾルフイン−ハイ
マンノースグリコペプチドを形成するために、インキュ
ヘーション後双方の試料にＣｏｎＡ−セファロースを加
え、振とうする。糖分の＃累活性により分離される、レ
ゾルフィン標識付けされたペプチドは結合しない６１５
分後、ＣｏｎＡ−セファロースを遠心分離により除去し
、残渣をｐＨ７．５にし、クイ光を測定する（励起はた
とえば５５０ｎｍ，放射λｍａｘ５　９　５　ｎｍ　）
。

試料１および９値（＝試料２）の相違は分離されたレゾ
ルフイン−ハイマンノースの量に示され、それにより＃
素活性の基準である。

【図面の簡単な説明】

第１図は試料中のＤＰＩ（−磯度と極性値との関係を示
す較正曲融である。 手続補正書ω鋤 昭和６１年９　月５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ａ及び I ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ）■▲数式
   、化学式、表等があります▼（ I ｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか、又は異なっていてよく、水素原子、ハロ
   ゲン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アル
   コキシカルボニル基、シアノ基、又はニトロ基、それぞ
   れカルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカ
   ルボニル基、シアノ基又はニトロ基によって置換されて
   いて良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし
   、この際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接した芳香族基で
   あってよく、Ｚは架橋員を表わし、Ａは配位子の基を表
   わし、かつｎは１〜２００の整数を表わす〕 のレゾルフイン−誘導体。 ２、基Ａはハプテン、抗原、抗体、基質又は担体を表わ
   す特許請求の範囲第１項記載のレゾルフイン−誘導体。 ３、一般式 I ａ及び I ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ）■▲数式
   、化学式、表等があります▼（ I ｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロゲ
   ン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコ
   キシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれカ
   ルボニル基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボ
   ニル基、シアノ基又はニトロ基によって置換されていて
   よい低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接芳香族基であってよ
   く、Ｚは架橋員を表わし、Ａは配位子の基を表わし、か
   つｎは１〜２００の整数を表わす〕のレゾルフイン−誘
   導体を製造するために、自体公知の方法で、一般式IIａ
   及びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は前
   記のものであり、かつＸ＾１は反応性の基である〕の化
   合物を、一般式III： Ｘ＾２−Ａ（III） 〔式中Ｘ＾２は反応性の基であり、かつＡは配位子の基
   である〕の配位子と反応させ、この際場合により１回の
   方法過程で保護基を導入し、かつその後に再び離脱させ
   、並びに１個の反応性の基Ｘ＾１、Ｘ＾２、Ｘ＾３及び
   Ｘ＾４を他の反応性の基に変えることを特徴とするレゾ
   ルフイン−誘導体の製法。 ４、一般式 I ａ及び I ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ）■▲数式
   、化学式、表等があります▼（ I ｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロゲ
   ン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコ
   キシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、そのつどカ
   ルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボ
   ニル基、シアノ基又はニトロ基により置換されていてよ
   い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、この
   際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接芳香族基であってよく
   、Ｚは架橋員を表わし、Ａは配位子の基を表わし、かつ
   ｎは１〜２００の整数を表わす〕のレゾルフイン−誘導
   体を製造するために、自体公知の方法で、一般式IIａ及
   びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は前
   記のものであり、かつＸ＾１は反応性の基である〕の化
   合物を、一般式IV： Ｘ＾３−Ｍ−Ｘ＾４（IV） 〔式中Ｘ＾３及びＸ＾４は反応性の基を表わし、かつＭ
   は二官能化合物の基を表わす〕の二官能化合物及び一般
   式III： Ｘ＾２−Ａ 〔式中Ｘ＾２は反応性の基であり、かつＡは配位子の基
   である〕の配位子と反応させ、この際場合により１回の
   方法過程で保護基を導入し、かつその後に再び離脱させ
   、並びに１個の反応性の基Ｘ＾１、Ｘ＾２、Ｘ＾３及び
   Ｘ＾４をその他の反応性の基に変えることを特徴とする
   レゾルフイン−誘導体の製法。 ５、二官能化合物Ｘ＾３−Ｍ−Ｘ＾４として、ジアミン
   、ジカルボン酸又はその誘導体、ジアルデヒド又はアミ
   ノカルボン酸を使用する特許請求の範囲第４項に記載の
   方法。 ６、二官能化合物として、ピペラジン、１，２−エチレ
   ンジアミン、グリシン、サルコシン、β−アラニン又は
   ピペリジン−４−カルボン酸を使用する特許請求の範囲
   第５項記載の方法。 ７、一般式IIａ及びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は、
   それぞれ同じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロ
   ゲン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アル
   コキシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれ
   カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカル
   ボニル基、シアノ基又はニトロ基により置換されていて
   良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接芳香族基であってよ
   く、かつＸ＾１は反応性の基である〕のレゾルフイン−
   誘導体。 ８、一般式VIIIａ及びVIIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（VIIIａ）■▲数式
   、化学式、表等があります▼（VIIIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロゲ
   ン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコ
   キシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれカ
   ルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボ
   ニル基、シアノ基又はニトロ基によって置換されていて
   良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接芳香族基であってよ
   く、Ｍは二官能化合物の基を表わし、Ｘ＾４は反応性の
   基を表わし、かつＸ＾１＾３はＸ＾１及びＸ＾３の反応
   によって生じる官能性の基であり、この際Ｘ＾１及びＸ
   ＾３は反応性の基である〕のレゾルフイン−誘導体。 ９、一般式IIａ及びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は、
   それぞれ同じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロ
   ゲン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アル
   コキシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれ
   カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカル
   ボニル基、シアノ基又はニトロ基により置換されていて
   良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接芳香族基であってよ
   く、かつＸ＾１は反応性の基である〕のレゾルフイン−
   誘導体を製造するため一般式Ｖ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） 〔式中Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は前記のものを表わす
   〕のニトロソレゾルシン誘導体と一般式VI：▲数式、化
   学式、表等があります▼（VI） 〔式中Ｒ＾１及びＲ＾２は前記のものを表わし、Ｘ＾１
   は反応性基を表わす〕のレゾルシン誘導体とを、酸化剤
   の存在で、低温で反応させ、次いで差当り生じるレスア
   ズリン誘導体を還元することを特徴とするレゾルフイン
   誘導体の製法。 １０、一般式VIIIａ及びVIIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（VIIIａ）■▲数式
   、化学式、表等があります▼（VIIIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロゲ
   ン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコ
   キシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれカ
   ルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボ
   ニル基、シアノ基又はニトロ基によって置換されていて
   良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒に隣接芳香族基であってよ
   く、Ｍは二官能化合物の基を表わし、Ｘ＾４は反応性の
   基を表わし、かつＸ＾１＾３はＸ＾１及びＸ＾３の反応
   によって生じる官能性の基であり、この際Ｘ＾１及びＸ
   ＾３は反応性の基である〕のレゾルフイン−誘導体を製
   造するため一般式IIａ及びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は前
   記のものを表わし、Ｘ＾１は反応性基を表わす〕のレゾ
   ルフイン誘導体を一般式IV： Ｘ＾３−Ｍ−Ｘ＾４（IV） 〔式中Ｘ＾３及びＸ＾４は反応性基を表わし、Ｍは２官
   能性化合物の基を表わす〕の２官能性化合物と反応させ
   ることを特徴とする、レゾルフイン誘導体の製法。