JPS62174067A - レゾルフイン誘導体並びにその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、蛍光標識された低−又は高分子化合物として
様々に適用され得るレゾルフィン一時導体、差びにその
製法に関する。

蛍光性化合物は、励起により一定の波長の光を放射する
というその能力に基づき、標識化合物として、化学的及
び生物学的方法で、例えば臨床的分析学において、しか
し更にもつと新しい分野で広汎に使用される。生化学に
おいては蛍光色素が市感度の標識として増々使用されて
いる。この際低分子盃びに島分子の物質と蛍光色素より
なる化合物が使用される。かかる蛍光泳会体の広い便用
範囲についての例きしては次のことが挙げられる：ハプ
テン、抗原又は特異的（５′Ｃ坏が蛍光色素で標記され
て使用される蛍光免役検定。へブテン又は抗原に抗体が
特異的に結合することによってこれらの物質又は抗体の
濃度を棟々の方法で測定することができる。

免疫蛍光−顕微鏡検査においては、抗原、例えば全細胞
又は蛋白質は蛍光標識された抗体により顕微跳下で可視
にすることができる（ウオング（Ｗａｎｇ　）等著、メ
ンツズ　イン　エンチモロジイ（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　）　８５巻、５１４頁以降）。

同様に、細胞中のハプテン又は抗原の分配く尚該化合物
を蛍光標識して細胞中に入れ、かつ緬微跳下で追跡すれ
ば、直接観察することができる。

蛍光標識したラテックス粒子は“フルオレスセント・ア
クチヴエイテット・セル・ツルター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｓ１ｌ　８ｏｒｔｅｒ
　　）’ＣＦＡＣ８）中での細胞の選別の際に使用され
る。

も）ろん、酵素の活性の決定及び測定のために蛍光標識
を担持する基質が使用される。

競争的免役検定（Ｋｏｍｐ８ｔｉｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓｙｇ）は、試料中の決定すべき配位子と標識さ
れた既知濃度で存在する配位子との間での抗体、上の配
位子結合位置の既知の、しかし限定された数の競争に基
づいており、この抗体は確定すべき配位子湛びに標識さ
れた配位子に対しても特異的である。この試料中の確定
すべき配位子の濃度は、標識された配位子分子が抗体に
どれぐらい結合されるかに対して決定的である。抗体及
び蛍光標識された配位子より成る複合体の濃度は、分光
法で検査され得る。これは試料中における確定すべき配
位子濃度に逆比例する。確定すべき配位子と共に既知の
濃度で試料に添加される標識配位子としては、最初は主
に放射性同位元素で標識された配位子が使用された。放
射性同位元素標識の公知の欠点のために、蛍光性化合物
での標識が、更にずっとＮ要になっている。この際、蛍
光性化置物は確定すべき物質の分子に結合される。更に
この複合体は原則的に、他めて棟々の蛍光免疫検定、例
えば蛍光授光−免疫検定、蛍光−消光（Ｆｌｕｏｒ８ｓ
ｚｎｚ　−Ｑｕｓｎｃｈｉｎｇ　）−免役検定又は蛍光
−増大（Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚ　−Ｅｎｈａｎｃ８ｍ
ｅｎｔ　）−免疫検定のために使用される。

標識付けとしては、試験采件下で大きな消光係数及び高
い量子収率並ひに十分な安定性を有する原則的に全ての
蛍光色素が適尚である。従って従来は通例フルオレセイ
ン又はフルオレセイン誘導体を使用した〔ランタン（Ｊ
、　Ｌａｎｄｏｎ）及びカメル（Ｒ，Ｓ、　Ｋａｍｓｌ
　）著、“イムノアツセイス（ＩｍｍｕｎｏａＳｓａｙ
ｓ　）　８［１ｓ　ＸＵｎｉｖ、Ｐａｒｋｐｒｅｓｓ　
、バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｓ　）、メト（Ｍｅｄ
、）　１９８０、第９１〜１１２頁〕ｏしかしながらフ
ルオレセイン又はその紡導体で標識した高−又は低分子
化合物は欠点を有する。フルオレセイ／−標識物質の吸
光−及び発光最大値は４９０〜５２０　ｎｍの波長範囲
にある。分析法、と９わけ蛍光免疫検定法のほとんどが
体液、例えば血清中で実施されるので、前記のスペクト
ル範囲では試料中の生物学的物質の自己蛍光による障害
が生じる。これは、同様に５０Ｑ　ｎｍ付近の範囲で光
を吸収し、かつ蛍光を放つビリルビンのせいである。

多くの測定装置は出来るだけ大きなストークス−シフト
（５ｔｏｋｅｓ　−５ｈｉｆｔ　）を有する標識−物質
（Ｍａｒｋｅｒ　−Ｓｕｂ、５ｔａｎｚ　）を必要とす
る。

フルオレセイン誘導体の場合にはこのシフトは最大３０
　ｎｍである。これは蛍光測定の感度を損な５光の散乱
問題となる。かかる場合には、フルオレセイン＃導体の
それよ夕も大きなストークス−シフトを有する化合物が
望ましい。

発明全達成１“るための手段 本発明は、一般式Ｖｌｉｌ　ａ及びＷｌｌ　ｂ　：し式
中Ｒ１、Ｒ″、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ同じか
又は異なっていてよく、水素原子、へ〇デン原子、カル
ボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボニ
ル基、シアノ基、ニトロ基、それぞれカルボキシ基、カ
ルボキサミド基、１＃：級アルコキシカルボニル基、シ
アン基又はニトロ基により置換されていてよい低級アル
キル基又は低級アルコキシ基を表わし、この際Ｒ４及び
Ｒ５は一緒になって隣接芳香族基であってよく、ＸＬ３
はＸ五及びＸ４のレゾルフィンーー導体である。

Ｒ１、Ｒに　Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の定義中の低級アルキ
ル基もしくは低級アル；キシ基は１〜５、殊に１〜６個
の炭素原子を有する炭化水素基を包含する。メチル基及
びエチル基もしくはメトキシ基及びエトキシ基が特に有
利である。

Ｒ”　、Ｒに　Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の冗義中のハロゲン
原子は弗素原子、塩素原子、臭素原子又は沃素原子を表
わす。塩素原子及び臭素原子が特に有利である。

置換基Ｒ′及びＲ５によって場合により形成される隣接
芳香族基は殊にペンゾール基又はナフタリン基である。

ペンゾール基が特に有利である。前記の芳香族基は非置
換であるか、又は基５ｏ３Ｈ、Ｃ’０２Ｈ又ＵＣ，〜Ｃ
５−アルコキシから選択される、そのつど１個又はそれ
以上の置換基を有していてよい。

本発明の一般式Ｖｌｌｌ　ａ及びＶｌｌｌｂの化合物は
、一般式ｆｆａ及びｌｂ： （、［ｌａ）　　　　　　　　　　　　　　（Ｉｌｂ）
〔式中、Ｒ”　、Ｒに、Ｒ３、Ｒ４及びＨｌｊは一般式
１ａ及びＩｂ中に挙げたものであり、力）つＸｌは反応
性の基である〕の化合物を、 一般式バ： Ｘ３−　Ｍ　−Ｘ’　　　　　　　（ＩＶ）〔式中Ｘ３
及びＸ′は反応性の基を表わし、かつＭは二官能化合物
の基を表わす〕の二官能化合物と反応させぬことにより
製造される。

更にこれに一般式ｌ： Ｘ”−Ａ 〔式中ｘ″及びＡは前記のものである〕の配位子を反応
させ、この際場合により１反応工程で保膿基を導入し、
かつ次いで再び離脱させ、蛋びに１個の反応性の基ｘ”
　、ｘ２、ｘ’及びＸ′をその他の反応性の基に変える
ことにより、一般式１式％： 〔式中Ｒ１、Ｒ″、Ｒ″、Ｒ′及びＲ５は、それぞれ同
じか又は異なっていてよく、水素原子、ハロゲン原子、
カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカル
ボニル基、シアン基、ニトロ基、それぞれカルボキシ基
、カルボキサミド基、低級アルフキジカルボニル基、シ
アン基又ハニトロ基により置換されていてよい低級アを
有して良い。

架橋員２は、レゾルフィン−基本骨格の反応性置換基Ｘ
ｌと、配位子もしくは配位子類似体の反応性基Ｘχとの
間の通常の付加−もしくは相合反応により、場合により
二官能化合物Ｘ５−Ｍ−Ｘ’の中間納会下に（式中Ｘ５
及びＸ４は反応性基及びＭは残余分子部分である）形成
される。

次の表１に、かかる反応性置換基Ｘｌ及びＸに並びに変
換の際に得られる架ｍ員２のための若干の可能なものを
例として誉げである。

表１：反応性基Ｘｌ　、　ｘ７４及びそれから得られる
架橋員２に関する若干のもの −Ｃ００Ｈ−ＭＨ２−Ｃ０ＮＨ− −ＣＯＯＴ”−ＭＨ２−ＣＯＮＨ− −ＣＯＯＣＯ２Ｔ”　”−ＭＨ２−ＣＯＮＨ−−ＮＣＯ
−ＭＨ２−ＮＨＣＯＮＨ− −ＮＣ８−ＭＨ２−ＮＨＣＦ３ＮＨ− −ＨＣ−ＣＨ−Ｃ０−−８Ｈ−３−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＯ
−−ＣＨＯ−ＭＨ２−Ｃミボー −５ｏ２ｃｚ　　　　　　　　　−ＭＨ２−３Ｏ２ＮＨ
−−ＣＯＣＨ２−ハロゲン　　　　−ＢＨ−ＣＯＣＨ２
−８−−ＣＯＣＩ（２−ハロゲン　　　　−ＯＨ−ＣＯ
ＣＨ２−０−−（ＣＨ２）−ＭＨ２””　　　−ＣＯＯ
Ｈ−（ＣＨ２）　−ＭＨ−ＣＯ−ｍ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍ脣　Ｔ
は１〜５個の炭素原子を有するアルキルの 基又は電気陰性的に活性美へエステル基、例えＧ’ｆＮ
−ヒｒロキシサクシンイミドエステル基を表わす。

■Ｔ上は１〜５個の炭素原子ｒ有するアルキル基を表わ
す。

髄餐山は０〜６の整数を表わす。

族１中に挙げられた様な一級アミンの代りに反応性基χ
↓又はＸ２として同僚に二級アミンも相応の生成物の形
成下に使用することができる。

二′キ能化＠−物Ｘ３−Ｍ−Ｘ’としては、ジアミン、
ジカルボン酸並びにその防専体、ジアルデヒド、アミ７
カルポ゛ン酸及びこの糧の精合物の製造のために通常使
用されるその他の化合物が有利である。かかる物質のた
めの例は、ぎペラジン、１．２−エチレン−ジアミン、
コハク酸、ゲルタールジアルデヒド、グリシン、サルコ
シン、β−ア２ニン及びピペリジン−４−カルボン酸が
挙げられる。

Ａの定義中の配位子とは、・・ブテン、抗原、抗体、基
質並びに担体及びそれらから誘導される化合物が解され
る。

ハプテンとは、本発明によれば、一般には単独で抗体を
生成することは出来ない低分子量の物質と解すべきであ
る。低分子量の物質としては約１００〜約２０００の分
子量を有する化合物が示される。力）かる物質の例は、
哺乳動物又はヒトの南機体中に存在する生理学的に活性
の物質遍びにその代随物又は動物又はヒトに投与される
楽剤並びにその代鍾物である。しかしながらへブテンの
概念釦は、前記の範囲にある分子量のみを有する限り、
全てのその他の低分子化合物も解され得る。可能なハプ
テンの例はアミン、ステロイド、ホルモン、炭水化物、
ペプチド、オリゴヌクレオチド、それらの組合せ物であ
る。

抗原は高分子化合物である。これは、これで処理した有
機体中に抗体を生成させることができる。高分子化合物
は本発明により、少なくとも約２０００の分子量を有す
るもの、しかし殊に少なくとも約５０００の分子量を有
するものてよいが、それを越してもよい。一般式Ｉａ／
１ｂｖＥ化合物中に配位子として存在し得る抗原は、例
えば蛋白質、核酸、多糖類、そｎらの組合せ物又はその
他の高分子物質である。本発明により抗原の概念には、
最小分子量約２０００を有する全ての高分子化合物が解
される。

抗体は、抗原又はハプテン並びにそれから誘導される化
合物と特異的に反応し、かつ複合体を形成する全ての蛋
白質又は糖蛋白質である。本発明により一般式Ｉ＆／Ｉ
ｂの化合物中の配位子として完全な抗体又はその断片も
使用することができる。この断片は本発明によシ、抗原
、ハプテン並びにそれから誘導される化合物を結合する
ことができる限り、抗体として示すこともできる。

基質とは、化学反応で実証可能な変換を受ける化合物が
解される。例えば酵素が作用を及ぼす下記の全ての化合
物又はそれから誘導される物質、例えばアミノ酸、ペプ
チド、蛋白質、配糖体、少−又は多糖類、ヌクレオチド
、核酸、それらの組合せ物又はその他の酵素的に変換可
能な物質が解される。

担体は定形又は無定形の天然に存在する、又は合成の、
網状化の、又は非網状化の物質であってよい。下記の個
々の化合物又は化合物の混（１６つ 金物が解される。担体としては、化合物又は化合物の混
合物、例えば多糖類、核酸、ペプチド、蛋白質、それら
の組合せ物又は同様にゴム、リグニン、ガラス、木炭、
合成の付加−又は縮合ポリマー、例えばポリスチロール
、ポリアクリル、ビニル化合物、ポリエステル、ポリエ
ーテル及びポリアミド又は同様に複合体形成物、例えば
ラテックス粒子、小胞（Ｖｉｓｉｋｓｌ　）　、リポソ
ーム、細胞壁部分又はむしろ全細胞を使用することがで
きる。

一定の配位子から誘導される化合物は、配位子類似体と
して表わされる。配位子類似体とは、相応の配位子と構
造的に僅かに異なるが、その物性に関しては本質的な違
異を示さない物質が解される。その違異は、例えば付加
的な置換基又は欠損した分子部分に依る。

原則的に、遊離のアミン基、ヒドロキシル基、スルフヒ
ドリル基又はカルボキシル基（これらの基を介して配位
子はレゾルフィン基本体と場合によジ架橋員の中間結合
下に結合することができる）を有する全ての配位子は、
本発明の化合物１ａ又はＩｂの形成のために使用できる
。

逝醍のアミノ基又はカルボキシル基が特に有オリである
。遊離の７ミノ基とは一級遥びに二級アミノ基が解され
る。配位子が、適癌な基を廂していない場合には、合成
的な方法でかかる基、例えはアミノ基又はカルボキシ基
を尋人しなければならない。更に、かかる配位子の場合
によｐ存在する非反応性の官能基を化学的に活性化する
ことも可能である。そうして生成した物質はもはや完全
には本来の化合物と同一ではないので、配位子類似体と
云５゜ 数ｎは、何個のレゾルフィン分子が１個の配位子又は配
位子類似体に結合しているかを示す。

この数／ｉ相応する配位モスは配位子Ｍ似体中の反応性
の基の数に依る。配位子又は配位子類似体の反応性の基
が多ければ多い程、レゾルフィン分子は丈にもつと結合
され得る。数ｎは通常１〜２ｏｏ、ｗに有利に１〜１０
０である。

ｘ”　、　ｘに、Ｘ３及びＸ４の定義における反応性の
基と？−ｉ原則的に全ての通常の反応性の官能基が解さ
れ得る。官能基としては、酸基、例えばカルボン数基又
はスルホン酸基蛋びにそれから帥導される基、例えばエ
ステル、アミド、無水物、酸へ四デニド又は−級又は二
級アミン、シアネート基、インシアネート基、チオシア
ネート基、イソチオシアネート基、アルデヒド基、スル
フヒドリル基、ヒげロキシ基、α−ケ）／％Ｑデニド基
のような基等が特に有利である。反応性の基のための例
は表１中Ｘｉ及びＸにの下に例として挙げられている。

これらの基は自然相互に交換することができ、かつ反応
性の基Ｘ３及びＸ４を表わすこともできる。

二官能化合物■の基Ｍとは、原則的にあらゆる有機又は
無機の基が解されてよい。しかし、Ｍが直鎖又は分枝鎖
の脂肪族、環状脂肪族又は芳香族の基を表わし、又はそ
れらの基の組合せであるような基が有利である。１〜１
０、殊に１〜７個の炭素原子よりなる脂肪族基又は２個
の反応性基Ｘ　３／Ｘ’の両方又は１個のみが壇状脂肪
訣基中に共に含まれているような基が極めて特に有利で
ある。

一般式１１ａ及びｎｂの化合物は有オリな方法で、一般
式Ｖ： 〔式中Ｒ３、計及びＲ５は一般式）ａ及びＩｂに皐げた
ものである〕のニトロンレゾルシン誘導体と、一般式ｖ
Ｉ： Ｒ′ 〔式中Ｈ１及びＲ２／／ｉ一般式Ｉａ及びＩｂ＃３に挙
けたものであり、かつＸＩは反応性の基である〕のレゾ
ルシン−誘導体とから得られる。

一般式■の化合物と一般式ｖ１の誘導体との反応は有オ
υに横方（Ｂｒａｕｎｓｔｓｉｎ　）及び硫酸の存在で
低温で行なわれる。この際先ずレスアズリン−＃導体が
生成し、これは一般式１ａ及びＨｂのレゾルフィン−防
専体に容易に変換することができる。

一般式Ｖの化合物と一般式Ｖｌの化合物との反応は常法
で一１０〜５０℃、殊に０〜６０℃の温度で芙施される
。一般式Ｖ及び一般式ｖ１の物質を約０℃で混合し、か
つ反応混合物を引続き室温まで加熱する場合に、反応は
特に徳やかに進行する。横方の濃度は有利に０．５〜５
、殊に１〜２モル／−ｅでなければならない。硫酸濃度
は０．５〜５、殊に１〜３モル／−ｅであるべきである
。

先ず生成するレスアズリン−誘導体を一般式１１ａ及び
ｎｂのレゾルフィンに還元することは殊にアンモニア溶
液中で亜鉛末を用いて実施される〔ニエッキ（Ｎ１ｅｔ
ｚｋｉ　）　％著、ベリッヒテデア　ドイチェン　ヒエ
ミツジエン　ｒゼルシャフト（Ｂｅｒ、　Ｄｔｓｃｈ、
　Ｃｈｅｍ、　Ｇｏｓ、　）　２２巻、６０２０（１８
８９）参照〕か、又は水素化硼素ナトリウムを用いて行
なわれる。溶剤としては有利に水−アルコール−混合物
、臀に水１部とメタノール０〜４部よジなる混合物を使
用する。還元する物質１モル自り亜鉛末もしくは水系化
硼素ナトリウム１〜２０、殊に１〜５モルを添加する。

この際反応溶液の温度は−１０〜＋６５°０１殊に＋５
〜＋１０℃で保たれる。温度範囲を正確に守ることは、
一義的な反応経過のために必要であると実証された。冷
却しないと、発熱反応が起９１分廃が困難な副産物が生
じる。

選択された過度の条件下で、一般式Ｖ及び一般式Ｖｌの
物質の間の反応は一義的に、かつ艮好な収率で経過する
。選択された合成方−法は変更可能である。このことは
、特に非対称的に置換されたレゾルフィン−誘導体の製
造に関して多数の合成可能性を示す。この極めて変更可
能な製法に依り、多数のレゾルフィン標識した化合物が
得られ、これらの化合物は発色団中の種々Ｑ位置のその
櫨々の置換基により広い色範囲を示す。

一般式１１ａ及びｎｂのレゾルフィン−誘導体と、一般
式蓄の化分物上の、もしくは一般式ＩＶ及びＩの化合物
との反応の前に、そのレゾルフィン−誘導体を有利に一
般式司： 〔式中Ｒ１，Ｒ”　、Ｒ３、Ｒ’　、Ｒ５及びＸｌは一
般式Ｕａ及びｎｂに挙げたものであり、かつＲ６は低級
アルキル基、アリール基又はアルアルキル基である〕の
トリアジルジヒドロレゾルフィン−誘導体に変えること
ができる。

Ｒ６の定義における低級アルキル基は１〜５、殊に１〜
３個の炭素原子を有するアルキル基を表わす。メチル基
及びエチル基が特に有利′である。アリール基としては
フェニル基が特に有利である。アルアルキル基は妹に７
リ一ル部分きしてフェニル基を含有し、アルキル部分は
１〜５、殊に１〜６個の炭素原子を有する。アルアルキ
ル基としてはペンシル基が特に極めて有利である。

一般式１１ａのトリアジル肪導体の製造のために、相応
の一般式１１ａ及びｎｂのレゾルフィン−誘導体を先ず
強力な還元剤、例えば塩化錫（…）又は酢酸クロム（Ｉ
Ｉ）　ｆｆｉ用いて、又は電気化学的に還元する。還元
のために、レゾルフィン−誘導体を１０分間〜１時間適
箔な溶剤中で還元剤２〜１０、有利に２〜６当量、殊に
５〜６５％の水性塩酸中の塩化錫叩と共に加熱する。冷
却の際にジヒドロ化合物が沈殿する。アシル化は常法で
適当なアシル化剤、例えば無水酢酸、塩化ベンゾイル等
を用いて行なわれる。一般式■の化合物はレゾルフィン
−誘導体…ａ及びｌｂの還元的アシル化によりワンシミ
ツト法（Ｅｉｎｔｏｐｆ−ｖｅｒｆａｈｒｓｎ　）で有
オリに製造される。このために相応のレゾルフィン−誘
導体は還元剤２〜６邑童と共に５分間〜６時間アシル化
剤の存在で適当な溶剤中で還流加熱されるか、又は意温
で４〜１６時間攪拌される。

そうして得られるトリアジル−ジヒドロレゾルフィン−
誘導体■１中で反応性の基Ｘｉをそれ以上の反応の前に
場合によｐ別の反応性の基に変換することができる。特
にＸｉがカルボキシル基を表わす場合には、これをカル
ボン酸クロリド−５無水カルボン酸−又は反応性のエス
テル官能基に変える　ことが有オＵである。これは極め
て種々の方法で、すなわち、例えばカルボジイミド、ア
ルコール、ハロゲニド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
等を用いて行なわれてよい。鮨業者には多数の文献で公
知の方法が活用される。カルボン酸官詫基をカルボン酸
クロリドに、例えば塩化チオニル／ジメチルホルムアミ
ド又は塩化オキゾリル／ジメチルホルムアミドを用いて
、厳びに活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステルに変換することが特に有利である。

配位子又は配位子類似体が遊離のアミノ基、ヒドロキシ
ル基又はスルフヒドリル基を有する場合には、これらの
基は反応性の基Ｘ２として反応する。次いで配位子もし
くは配位子類似体Ｘ”−Ａは、場合により前もってトリ
アジル−ジヒドロレゾルフィン−誘導体へ変換した後に
、又は／及び基Ｘｌヲ活性化した後に、アミド−、エス
テル−又は５ｆｆｌ〜工ステル結合の形成下に、化合物
１１ａ及びｉ＋ｂと直接反応させることができる。少な
くとも１個のアミド結合の形成はその安定性に基づき特
に有オリであり、その際その形成のために殊に式中Ｘ上
がカルボン酸ハロゲニドである一般式Ｕａ／ｌ１ｂ４し
ぐはＶｌｌの化合物から出発する。アミン基含有の配位
子もしくは配位子類似体とのその反応は常法で、例えば
何機浴剤、例えばジクロルメタン中で、塩基として三級
アミン、例えばトリエチルアミンリ添加下に行なわれる
。配位子もしくは配位子類似体の大きさ及びそれと関係
するその遊離アミン基の数及び化合物１ｆａ／Ｉｌｂの
使用量に依り、配位子もしくは配位子類似体１分子幽り
数個の発色団を結合することができる。

一般式１ａ及びＩｂの化合物の製造のために、一般式■
のトリアジル−彷専体を使用する場合には、反応後に保
護基として使用したジヒドロレゾルフィン部分のアシル
基を選択的に離脱させ、かつ得られるロイフ色素基を化
合物１ａ／Ｉｂの発色団に酸化しなければならない。

ジヒドロレゾルフィン部分のＯ−アシル基は、水及び水
溶性の溶剤、例えば１，４−ジオキサン、メタノール又
はエタノールよりなる混合物、有利に水／１，４−ジオ
キサン（’Ｉ：１）中で、亜硫酸ナトリウム２〜１０モ
ル、有利に２〜４モルとの反応により、特に有利に離脱
される。

反応温度は２０〜１００°Ｃ１有利に８０〜１００℃で
ある。この反応条件下で、Ｎ−アシルジヒドロレゾルフ
イ、７誘導体が高収率で製造される。

ジヒドロレゾルフィン部分を一般式１ａ及びｌｂの化合
物に酸化することは、中庸の酸化剤ｒ用いて夾施されて
艮い。ヘキサシアノ鉄酸０１）カリウムが有利であり、
これをロイコｉｇ累に対して２〜６倍のモル過５１１Ｉ
Ｊ量で、特に有利に２〜４倍Ｑモル過剰蓋で、水及び水
溶性の浴剤、例えば、１．４−ジオキサン、メタノール
又はエタノールよりなる混合物、有利に水／メタノール
（，５：１）中で使用する。殊にこの反応は補助塩基、
例えば炭酸水系ナトリウム又は炭酸ナトリウムの存在で
行なわれる。反応温度は１０〜４０　’Ｃであり、呈温
か有；ｖＵである。

Ｎ−アシル保護基の選択的離脱及びジヒドロレゾルフィ
ン部分の酸化はワンショット反応で特に有オリに行なわ
れ得る。このために水／メタノール＜６：１）中のＮ−
アシル化ジヒドロレゾルフィン訪専体に、先ず炭酸水素
ナトリウム２〜４モル及び１Ｎ苛性ンーダ溶液１尚量を
、かつ引続いてヘキサシアノ鉄酸（１）カリウムの２〜
４倍のモル過剰付を加える。室温で約１０分間〜２時間
、有オリに肌５時間後に反応は終了する。

くは配位子類似体１と直接ではなくて、むしろスペーサ
ー基Ｘ３−Ｍ−Ｘ’の中間納会Ｆに結合することが有利
である。スペーサーとしては、常法でかかる目的のため
に使用される少なくとも２個の反応性の基？有する全て
の化合物を使用して良い。ジアミン又はアミノカルボン
酸が特に有利である。この際その選択は、スペーサーと
結合されるべき官能基Ｘｉ及びＸにの檜荊に依る。

一般式…ａ／Ｉｌｂのレゾルフィン誘導体と一般式■の
二官能化合物との反応により１工程又は数工程で、例え
ば一般式■１の化合物を経て得られる化合物は、一般式
Ｖｌｌｌ　ａ及びＶｌｌｌｂ：Ｖｉｌｌａ　　　− Ｖｌｌｌ　ｂ 〔式中Ｈ１、Ｒχ　ＢＦＪ　、Ｒ４及びＲ５は一般式１
ａ及びｌｂ中に挙げられたものであ１７．　Ｍ及びＸ４
は一般式■中に挙げられたものであり、かつＸ１３はＸ
ｌ及びｘ３の反応によって生成する官能基である〕によ
って表わさｎてよい。

官能基Ｘ１３は　Ｘｉ及びＸ３の定義中に挙げた反応性
の基の反応によって一緒に生成される可能な限りの全て
の基であってよい。有利な基Ｘ１３はアミド−、チオエ
ーテル−、エーテル−１二級又は三級アミン−１尿素−
又はチオ尿素基等である。

一般式１１ａ／Ｉｌｂもしくは■中のＸｌがカルボン酸
官能基もしくはそれから防埠される反応基を表わし、か
つ配位子もしくは配位子類似体の反応性の基Ｘにがアミ
ノ−、ヒドロキシル−又はスルフヒドリル基を表わす場
合には　Ｘ’１がアミノ基を表わし、かつＸ′がカルボ
ン酸官能基もしくはそれの反応性防纏体を表わすスペー
サーＸ５−Ｍ−Ｘ”ｌｉ有利に選択する。そのアミノ末
端は物置Ｉｆ　ａ　／　Ｍ　ｂもしくはＶｌｌのカルボ
ン酸官能基に結合し、カルボキシル末端は配位子又は配
位子類似体Ｘ”−Ａ　ｖｃ　ｇ合してよい。しかしなが
らＸｌ並びにＸ′もそのつどカルボン酸官能基もしくは
それから誘導される活性肪導体を表わす場合には、スペ
ーサーとしてジアミンが実証された。

一般式１［ａ及びｌｌｂのレゾルフィン−誘導体と、二
官能性のスペーサー基１Ｖ及び配位子もしくは配位子類
似体■との反応は、有利に２段階で行なわれる。先ず、
化合物ＩＩ　ａ　／　Ｉｌ　ｂを、場合により前もって
油性化合物Ｍｌへの変換後に、スペーサーＩＶとね合さ
せてよい。それから得られる誘導体を次いで第２工程で
配位子もしくは配位子＃ｌｌ鉢体と反応させてよい。自
然逆の進（６１ン 行方法も可能であり、第１の工程でスペーサーｌＶ’を
配位子もしくは配位子類似体ｌに結合させ、かつ得られ
る生成物を第２工程でレゾルフィン−Ｕ導体１１ａ／Ｊ
ｌｂもしくは活性化化合物■と反応させることができる
。

アミノカルボン酸としては有オＵにアミノカルボン酸紫
使用する。グリシ／、アラニン、デルコシン及びピペリ
ジン−４−カルボン酸が特に有利であると実証された。

一般式ｎａ／ｎｂもしくは■１のレゾルフィン誘導体と
、アミノカルボン酸とのカップリンクは、アミド結合の
形成下に、各箔業者に良く知られた方法により行なわれ
る。このために相応のアミノ酸のメチル−又はｔ−ブチ
ルエステルの使用が特に極めて有利である。アミド形成
が行なわれた後に、場合によって前もって導入された保
護基を常法によｆ）選択的に離脱させる。例えば、活性
化されたｖ１誘導Ｗｌτ、カルボキシ保護されたアミノ
カルボン酸と反応させる場合には、ジヒド四レゾルフィ
ン骨格の〇−及びＮ−アシル基を選択的に加水分解し、
ロイ；色紫金再びレゾルフィン系に酸化し、かつ最佐に
、結合したアミノカルボン岐の〃ルボキシ保護基を通常
の栄件下で、有オＵにトリフルオル酢酸を用いて離脱さ
せることが必要である。次いで遊離のカルボキシル基は
、配位子又は配位子類似体１の複合のために、例えば一
般式ｉｌａ及びｎｂのレゾルフィン誘導体のために記載
された相応の方法で、活性化されて良い。複合（Ｋｏｎ
ｊｕｇａｔｉｏｎ　）自体の実施も、例えば一般式１［
ａ及びｌ［ｂのレゾルフィン誘導体への配位子又は配位
子類似体の直接複合のために実施されるのと同様に行な
われる。

カルボキシル基含有の配位子又は配位子類似体の場合に
は、一般式１１ａ／Ｊｌｂもしくは■のレゾルフィン誘
導体をアミノ基含有の化合物に変えることが有利であり
、次いでこれをカルボキシル基含有の配位子もしくは配
位子類似体と、アミド結会形戟下に、反応させる。この
ためには、化合物Ｍ　ａ　／　Ｍ　ｂもしくはＭｌとジ
アミン（Ｘ３及びＸ′アミン基を有する弐■）との反応
が特に簡単で有利であると実証された。この意における
有オリなジアミンは、例えばピペラジン、１．２−ジア
ミノエタン又は１．６−ジアミツプ誼パンである。

ジアミンを用いて一般式１［ａ／Ｕｂもしくは■のレゾ
ルフィン肪４体を遊離のアミン基を有する肪尋体に変え
ることは、各箔栗者に良く知られている方法によって行
なわれる。１置換のジアミンの特に高い収率を連成する
ために、反応性の基１個のみを有し、かつその第２の官
能基は保護基によって遮断さＩ’して。、るジアミンを
有利に反応させる。原則的に、アミド結合の妨害なしに
再び離脱され得る全ての通常のアミン保護基が使用可り
にである。ｔ−ブトキシカルボニル−もしくはベンゾイ
ル−オキシ−カルボニル−保護基の使用が特に有オＵで
あると実証された。

７保護されたシアミ７と一般式１［ａ／Ｕｂもしくは■
のレゾルフィン肪纏体との反応後に、場合により尋人さ
れた保護基を再び離脱させ、かつ場合により中間段階と
して生成するロイコ色素をレゾルフィン系に酸化する。

結合したジアミンのアミン保護基の離脱はこの際通常の
条件下で、有オＵにトリフルオルｒｒｒ：酸を用いて行
なわれる。

そうして得られるアミノ基含有のレゾルフィン鰐専体を
、常法で、反応性の基Ｘ２としてカルボキシル基を有す
る配位子又は配位子類似体１１と、襟付することができ
る。有利にこのカルボキシル基は活性化されていなけれ
ばならない。

これ／／ｉ前記の方法で行なわれて良い。式中Ｘ２が活
性化されたエステル基を表わす一般式ｌの配位子又は配
位子類似体の使用が有利である。

特にＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルが特に有利
であると実証された。複合自体の実施は原則的には、レ
ゾルフィン訪導体と配位子又は配位子類似体との直接複
合のために前記した方法と同様にして官能基の交換の役
割を考慮して行なわれる。

殊にレゾルフィン紡導体ｎ　ａ／Ｉｌ　ｂもしくはＶｌ
ｌと式ＩＶの中間貝Ｘ３−Ｍ−Ｘ’との結会佐に得られ
る生成物と、低分子の配位子Ｘ′−Ａ　、例えばハプテ
ンとのその他の反応は、水又は緩衝液及び水溶性の浴剤
、例えば１，４−ジオキサン、メタノール又はエタノー
ルより成る混合物中で行なわれる。口、Ｉ　Ｍｇ４酸カ
リウム緩衝液、ｐ！−１８，５／１，４−ジオキサン（
割合１：１）の混合物が有利である。反応経過を薄ノー
クロマトグラフィーにより行なうことが可能である。反
応時間は１〜２４時間であって良く、殆んど反応は１〜
１８時間後にすでに完全に終了する。

レゾルフィン肪専体Ｍ　ａ　／　Ｉｌ　ｂもしくは■又
はｖ）Ｎ　ａ　／　Ｗ：ｂと、一般式■の高分子の配位
子との反応のために、Ｎ−ヒドロキシーサクシンイミド
エステルが特に有利であると実証された。

すなわち、例えば家兎−ＩｇＧへのカップリング（Ｋｕ
ｐｐｌｕｎｇ　）の場合には、ＩｇＧ　ｉモル”５リレ
ゾルフィン６分子の標識度を達成するためには、Ｉｇ０
１モル肖りすでにレゾルフィン商専体６モルとなる。最
大吸収波長λｍａｘ　＞　４７０ｎｒｎを示す従来この
ために通常の蛍光色票は、反応性の基としてインチオシ
アネート−又はスルホン酸クロリド−基、例えばフルオ
レセインインチオシアネート又はテキサス赤（Ｔｅｘａ
ｓ　Ｒｏｔ　）　ｆ含有する。この壱会には、同じ＃！
諌度勿運戟するために、板兎１ｇＧへのカップリングの
ために実際により多い色素過剰量を使用しなければなら
ない。

一般式■の高分子化合物、例えば蛋白負の複合は、反応
性の基Ｘ１又はＸ′ｌがＮ−ヒｒロキシサクシンイミＶ
エステルである場合には、殊に緩衝液中、特に有オリに
０．１Ｍｇ４酸カリウム緩衝液中で、ｐ）ｆ８．Ｑ〜９
．０で行なわれる。反応温度はそれぞれ１０〜６５℃で
あってよい。反応は室温で有オリに実施される。

本発明による化合物から得られる一般式１ａ及びｌｂの
化合物をその有利なスペクトル特性に依り分析法で使用
することができ、この分析法では一般式１　ａ　／　Ｉ
　ｂの化合物もしくは方法条件下で生成した変換生属物
の蛍光特性が測定される。

異才ｍｉ＆　検％　　（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ　　）　　においては、遊離の、又は
結合した配位子の濃度を決定する前に、通肖な物質との
沈殿により、又は固体の担体に結合した抗体の使用によ
り、５Ｃｊ＋に粕会した配位子及び遊離の配位子の分離
が必要である。同種免疫検定（ｈｏｍｏｇｓｎ　Ｉｍｍ
ｕ−ｎｏａｓｓａｙ　）においては、かかる分離なしに
試料中の抗体−配位子−複合体形成の検査が行なわれる
。同種免疫倹定法には、例えば蛍光−消光法、蛍光−増
大法及び蛍光偏光法が挙けられ、これらの楊会には蛍光
物質は標識剤として使用される。特に最後に挙けた方法
は従来は導入部ですでに挙げた常用の蛍光標識体の欠点
を受けてきた。本発明による一般式１ａ又はｌｂの化合
物は、体液中でその自己の蛍光によって妨害する生物学
的物置のずっと外ｍＪＫある吸収−及び放射最大を有す
るので、これらは特に蛍光偏光−免疫検定（ＦＰＩＡ　
）中の使用に適当である。

本発明による化合物のもう１つの利点は、こｎが虐尚な
直換のＰｉＡＫ約７０　ｎｍ筐での特に高いストーク−
シフトを示すことにある。

Ｆ’ＰＩＡ法（−１′基本的に′は通常の蛍光免疫検定
の原則に基づく。

直線偏光を有する適当な蛍光標識配位子を蛍光に励起す
る場合に、励起及び放射の間の僅かな時間的な遅れに依
り、それが放射線を放出する前に、分子は回転する。従
って、直線偏光の平ｒＭは同僚に一定の角度で回転され
る。分子の多数はこの短かい時空間内で回転散乱により
蛍光放射の一定の偏光解消となる。放射蛍光の偏光につ
いては、分子が大きくなり、力・つその為に回転が塵〈
なればなる程、偏光は大きくなることがあて（１まる。

この関係を抗体への配位子の結合の測定に役立てること
ができ、それは遊離の標識された配位子が、抗体に結合
し標識された配位子よりなる複奮体よりも小さい分子容
を有するからである。偏光は試料中に存在する決定すべ
き配位子濃度に反比例する。

標識された配位子又は配位子類似体の濃度及びかかる免
役学的方法に必要な抗体の濃度は、使用される測距装置
に、亜びに使用される標識配位子又は配位子類似体及び
抗体目体のそのつどの％肩の性質に従う。基本的にはこ
れらの濃度は尚然決足すべき配位子の濃度にも依存し、
従って経験的に決足しなければならない。この決定は谷
癌業省によって簡単に最適にすることによって行なわれ
得る。

決定されるべき配位子濃度は一般に約１０−２〜約１０
〜１′５モルで変動する。測定のため釦は配位子濃度を
決定すべき試料中で約１０−３〜約ｌ０−１２モル、特
に有利に約１０−４〜約１［１−”’モルに調螢するこ
とが有利である。より＾い配位子濃度は本来の試料の希
釈により測定され得る。

この測定は約６から１２蒼でに達してよい一定の一値で
行なわれる。通例それは約５〜約１０の範囲に、殊に約
６〜約９のｐ）ｌ範囲にある。

測定中のＰＨ値の達成及び保持の７こめに、捕々の椴＃
液、例えは硼酸塩−１燐酸塩−１炭酸塩−又はトリス−
［１ｍｍ合金用することができる。

いかなる緩衝液を使用するかは、本発明には決定的では
ない。その選択は第１に使用した抗体、決定されるべき
配位子、並びに使用される蛍光標識体に依る。

殊にＦＰＩＡ法は一定の温度で実施される。通常は約０
〜５０℃の範囲、殊に約１０〜約４０℃の範囲で選択さ
れつる。

決定すべき配位子又は配位子類似体の偏光及び濃度の間
の正確な関係は、そのつど較正曲線から読み取れる。こ
れは、相応する物質の異なった、しかし既知の濃度の溶
液の偏光値を測定することによって得られる。次いで検
査すべき試料の未知の配位子濃度を偏光が判明した際に
かかる較正曲線から調べることができる。

本発明に依る化合物から得られる一般式１ａ及び１ｂの
化合物の広い使用範囲は、蛍光標識体としてのその一般
的適用性に認められる。すなわ）例えば免疫蛍光−顕微
鏡検査において抗原として蛋白質又は全細胞を蛍光標識
した抗体によリロＪ視性にすることができる。相応する
方法で細胞中のハプテン又は抗原の分配を直接観察する
こともでき、その場合は当咳化合物を蛍光標識して細胞
中に導入し、かつ例えばｗ４倣鏡下で追跡する。この際
、前記の同種蛍光免疫検定に対照的に、レゾルフィン＝
４体の蛍光特性は変らない。

従来蛍光’６８体として使用された公知の色素は例えば
フルオレセイン、例えばフルオレセインインチオシアネ
ート又はローダミン色素、例えばテキサス赤である。し
かしながらすでに前記した如く、フルオレセインは比較
的に低い波長で蛍光を放つという欠点を有する。更にそ
のつどの相体のカップリング反応の収率は経験上火殆は
低く、かつ付加的にカップリング生成物の色安定性は悪
い。同様のことはローダミン色素についてもあてはまる
。

これらの点に関して正に、本発明による化合物から傅ら
れる一般式１ａ及びＩｂの化合物は、公知技術水準にお
いて公知の蛍光標識体に比べて明らかなオリ点を示す。

本化合物は艮好な色安定性で長波で蛍光を放ち、かつ一
般式…ａ又は１ｂの化合物及び相応のカップリング成分
から良好な収率で製造可能である。

不発明による出発化合物一般式１１ａ又はＩｌｂの化付
物は自然前記以外の蛍光免疫学的方法において物質の標
識のためにも使用することができる。すなわちこの反応
性のレゾルフィン化合物を用いてその他の複合体形成系
のパートナ−の標識も可能である。この際複合体形成系
とは、特異的な相互作用効力に基づき複合体を形成する
ことができる物質の全ての複合体が解される。

公知の複合体は例えばホルモン／％異的受容体、ビオチ
ン／アビジン、炭水化物紡導体／レクチン等である。例
えばビオチンで標識され′ｆ？：、蛋白質は、アビジン
及び本発明による一般式ｆｆａ又１ｌ−ｉ′Ｉｌｂの反
応性化合物よすする結合生成物に依り決定され得る。本
発明による一般式１ａ及びｌｂの化合物のもう１つの有
利な適用ｉｒＪ能性は、レクチン／炭水化物紡纏体系の
パートナ−の決足において示される。

１フルオレスセント　アクチヴエイテットセル　ソータ
ー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｓｎｔ　ＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅ
ｌｌ　５ｏｒｔｅｒ　）　’における細胞の選別のため
に１蛍光似繊したラテックス粒子を使用する。

かかる粒子は同様に極めて良好に、例えばヒｒロキシル
ースルフヒドリルー、アミノ−又は同様にカルボキシル
−又はスルホン酸基含有のラテックス粒子と、一般式１
［ａ又はｌｂの反応性のレゾルフィン化合物との反応に
よって蛍光標識され得る。

一般式１ａ及びｒｂの化合物は同様に有利に酵素の決定
のために使用することができる。こ１２）７ｔメに一般
式Ｕ＆又はｎｂのレゾルフィン紡導体全、決定すべき酵
素によって分解可能である基質に結合することができる
。この顕色生成物も本発明による一般式１ａ及びｌｂの
化合物である。レゾルフィン標識した基質と＃紫との反
応及び分解生成物及び未反応の基質の分離後に１酵素の
活性を決定することができる。例えば一般式１１ａ又は
ｎｂの反応性のレゾルフィン誘導体をグリコペプチドに
結合させ、かつそれによって得られるカップリング生成
物を基質としてエンドグルコシダーゼ−活性の検出に使
用することができる。エンドグルコシダーゼの決定のた
めに、ダンジル化合物での標識は公知である（イワセ（
Ｉｗａｓｅ　）　＊　’ＩＥ、アナリテイカル・ビオケ
ミストリイ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ−１１５巻、
９６〜９５［１９８１年〕）。レゾルフィン誘導体はか
かる化合物と比較して特にそのより高い感度により優れ
ている。

本発明を次の実施例につき説明する。これらの実施例は
低−又は高分子化合物の標識の基本的な可能性及びその
適用を示す。

実施例 例　　ル ゾルフイン−４−カルｅ：／１ｉｌｌ−Ｃ５−Ｃ１−ジ
フェニルヒダントイニル）エチル−カルボニル〕−ビペ
ラジド ａ）レゾルフィン−４−カルボン酸 ニド四ツレ、ゾルシン１６ｇ、２　、６−１’ヒドロキ
シ安息合Ｍ１５．５ｇおよび惰行８．６ｇをメタノール
２００ＭＫ懸濁し、０°Ｃに冷却する。

これに濃饋酸１０．６厩を滴下し、その後室温で２時間
攪拌する。沈殿した原色しサズリンー４−カルボン酸全
確別し、メタノールで洗浄し、乾燥する。

レサズリン紡導体を水２００Ｍおよび２５％アンモニア
５ＱｍＪにとり、濾過する。青色の濾液に水冷下に亜鉛
粉末５０ｇを少量ずつ与え、室温に加熱する。還元経過
は容易に薄層クロマトグラフィーで追跡できる（展開剤
：メタノール／１１２エステルｉ：ｉ；シリカケ９ル、
ＤＣ−板）。反応浴液ｆｅ濾過し、その後濾液を氷酢酸
および少量の濃塩酸で酸性にする。沈殿したレゾルフィ
ン−４−カルボン酸を濾別し、五酸化リン上真空中で乾
燥する。

収量：１６．５５ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸
／水４：１：１）＝０．４ ｂ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフィン−
４−カルボン酸 レゾルフィン−４−カルボン酸１２．９　ｇｅ［酢酸６
０縦および無水酢酸３０７ｄにとり、塩化スズ（１１）
　２７．６　ｇを加え、８０℃で１時間攪拌する。氷水
６００縮に与え、１時間攪拌し、沈殿を濾別する。乾燥
後、固形物をアセトン５００Ｍ中に入れる。吸引濾過し
、（１Ｍ液を蒸発し、乾燥後生成物ｉｉ、６ｙを得る。

及び ｌＨ−ＮＭＲ（［Ｄ、’］−ＤＭＳＯ）：　　δ＝　２
．２４．　２．２６４４１４−２．２９　（各々ｓ、９
Ｈ）：　６，９４（（ｉｄ、Ｊ＝８．５および２−２Ｈ
ｚ、１　Ｈ）　ｓ　６．９８　（ｄ、　Ｊ＝２−２Ｈｚ
、Ｉ　　Ｈ）；　　７−０４（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、ＩＨ）
　；　　７．６１　　Ｃ６−、Ｊ＝８．５Ｈ７，ｌ　Ｈ
）　；７．６７　ｐ、［）ｍ　（ｔ５．、　　Ｊ　＝９
　Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸９：１：０゜１）二０．４６、−ｃ）Ｎ、Ｏ
，Ｏ−）！ＪＴセチルジヒドロレゾルフィン−４−カル
ボン酸クロリド 例１ｂ）に記載されたトリアセテ−）　５８．５、ＦＫ
塩化オキサリル５４廐を加え、０℃に冷却する。これに
ジメチルホルムアミドを滴下し、室温に加熱する。抽出
物はその際ガス発生下に溶解する。真空中で蒸発乾個し
、乾燥塩化メチレン２０ＯＮで各々６回採取し、再び蒸
発乾個する。

収量：４１．Ｆ。

ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン Ｎ−ベンズヒドリルピペラジン（ＥＩ７ＫＡ　−Ｃｈｅ
ｍｉｅ　）　１２．６１　ｇを１．４−ジオキサン／水
３ニア　　１００ｍ１中に入れる。これに１．４−ジオ
キサン５０舷に溶解された、ジーｔ−プチルジカルポネ
ー）１２．ＯＦを滴下する。ｋ時間攪拌した俊、水５０
ｍ１３を滴加し、濾過し、沈殿を乾燥する。

収量：　Ｎ　−ＢＯＣ−Ｎ’−ベンズヒドリルピペラジ
ン１６．２ｇ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：りｎロホルム／メタノー
ル／氷酢酸９　：　１　：　０．１　）　：　０．９２
゜Ｎ　−ＢＯＣ−Ｎ’−ベンズヒドリルピペラジン７ｙ
を酢酸エステル１００Ｎおよび氷酢鈑５Ｍにとる。活性
炭上パラジウム０．６ｇを用いて水素化し、その後触媒
から濾過し、蒸発する。残渣に水１００継および１ＮＨ
ｃノ２０Ｍを加え簿遇する。濾液を酢酸エステルで２回
抽出し、その後水相を力性ソーダ浴液で塩基性にする。

油状の沈殿した生成物をジクロルメタンで抽出する。

硫酸ナトリウムを用いる乾燥および蒸発後、油状物とし
てＮ　−ＢＯＣ−ピペラジン６．２ｇが得られ、これは
数日後完全に結晶する。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸９　：　１　：　０．１　）　：口、０５、
ニンヒドリンで青色になる。

ｅ）Ｎ、０．０−１リアセチルジヒドロレゾルフイン−
４−カルボン酸−（Ｎ’　−ＢＯＣ−ピペラジド） ジクロルメタン４５ＯＮ中の例ｉｃ）に記載された酸塩
化物２５．ｆおよびトリエチルアミン１７．５ＴＬｌに
、０℃でジクロルメタ７５０Ｍ中のＮ　−ＢＯＣ−ピペ
ラジン１３．８ｇの溶液を滴下する。さらに１時間冷却
なしに攪拌し、６回水と十分に珈と５し、有機相を蒸発
する。

収量：５６．Ｏｇ。

Ｒｆ　　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール水酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．６
４゜ｆ）　　Ｎ−アセチルジヒドロレゾルフィン−４−
カルボン酸−（Ｎ’　−ＢＯＣ−ビペラジド）例１８ノ
に記載されたトリアセテ−）　３４．６ｇおよび亜硫酸
ナトリウム１７．１　ｇを６０’Ｃで１時間１．４−ジ
オキサン／水１：１　５０ＯＮ中で攪拌する。引続き蒸
発し、酢酸エステル中に入れ、不溶の塩から濾過し、シ
リカゲル２詔でクロマトグラフィーにかける（溶離液：
酢酸エステル／ジクロルメタン４：１、生成物が溶離す
るやいなや、純粋な酢酸エステルに転換する）。

収量：１４ｇ。

Ｒｆ　　（シリカゾル、展開剤：酢酸エステル／ジクロ
ルメタン４：１）：０．２８゜ ｇ）　　レゾルフィン−４−カルボンｍ−（Ｎ’−ＢＯ
Ｃ−ビペラジド） 例１　ｆ）に記載されたＮ−アセチル化合物５ｇをメタ
ノール２００Ｍおよび水６００ｄに溶解する。炭酸水素
ナトリウム１．８ｇおよび１ＮＮａＯＨ１０，７１／Ｌ
ｅ１　その後カリウムへキサシアノフエレー）（１）１
４．Ｆを添加する。型温で１４時間の攪拌後、Ｐ）Ｉを
５に調節する。生成物が沈殿し、吸引濾過する。

収量：　２．７２　ｇ。

Ｒｆ　　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．
２８゜ｈ）　　レゾルフィン−４−カルボン酸ピペラジ
トートリフルオロアセテート 例１　ｇ）に記載されたＥＩＯＣ−誘導体１ｇをトリフ
ルオロ酢酸２０１ｒＬ１３中で１５分間放置する。

蒸発し、エーテルで浸漬し、生成物を濾別する。

収量：０．９６Ｆ０ Ｒｆ　　（シリカゲル、展開剤：り四ロホルム／メタノ
ール／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．
０２゜１）レゾルフィン−４−カルボン酸ビペ２シトの
、５−＜１−ゾフェニルヒダントイニル）−ソロピオン
ｆｉ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのカッ
プリング 例１　ｈ）に記載されたビペラジドートリフルオｐアセ
テ−）１９１１ｎ９および３−（１−ジフェニルヒダン
トイニル）プロピオンＨ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル〔ジフェニルヒダントイン−ナトリウム塩お
よび６−ブロムプロピオン酸エチルエステルから、タッ
ク（Ｃｏｏｋ　）その他、Ｒｓｓ、コミュニケーション
スイン　ケミカル　パソロジー　アンド　ファー７　＝
＋　０ジー（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｂａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｙ　）　５　（１９７５年ン、第７６７
４−ジと同様に製造〕を１５時間、ジオキサン２０ＴＬ
ｌおよび０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液Ｆ！′４８．５
．２０ＷＬｌ中で攪拌する。沈殿した生成物から濾別し
、濾液を蒸発し、シリカゲルＲＰ１８（溶離液：インプ
ロパノール）でりｐマドグラフィーにかけ、その際付加
的に生成物が得られる。酢酸エステル／メタノールから
結晶し、カップリング生成物あわせて２５０〜が得られ
る。

Ｒｆ　（シリカゾル、展囲剤二りロロホルム／メタノー
ル／氷酢＃７Ｒ９：１　二ｏ、１）：　０．６１゜”Ｈ
−ＮＭＲ（（Ｄ、）−ＤＭ８０）；δ＝　２．６−２．
８　（ｍ、　　２Ｈ）；３．０−６．８（ｍ、１０Ｈ）
；６．７４（ｄ。

Ｊ　＝２．２Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）　ｓ　６．８２　（ｄ、　
　Ｊ＝９．５Ｈｚ。

Ｉ　Ｈ）　；６．９１　（ｄｄ、　、Ｔ＝９．５および
２．２Ｈ２）；７．２５−７７−６６（，１０Ｈ）；　
７．５５および７．６６　ｐｐｍ　（各ｋ　ｄｌ　Ｊ＝
９．５Ｈｚ、　２　Ｈ）。

ＵＶ／ＶＩ８　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐｌ−
１７，５）：λｍａｘ　”＝　５７６−８　ｎｍ ケイ光放射：匂ａｘ＝５９２ｎｍ０ 例　　２ レゾルフィン−４−カルボン酸ビベラジドの３−（１−
ジフェニルヒダントイニル）　酢酸−Ｎ−ヒげロキシス
クシンイミドエステルとのカップリング 例１１）と同様に、レゾルフィン−４−カルボン酸ビペ
ラジドートリフルオロアセテート５６５ｍｇおよび５−
（１−ジフェニルヒダントイニル）ｅ敵−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル３３９Ｔｎ９からＰ９ｒ望の
生成物２１０〜が祷られる。

展 Ｒｆ　（シリカゲル、メ開剤＝ｎ−ブタ７−ル／氷昨酸
／水　４：ｉ：１）：０．８２゜’ｇ−ＮＭＲ（ＣＤ、
：］−］ＤＭＳＯ：δ＝３−２−４．５　（ｍ、　　１
０Ｈ）　；　６．６０　（ｉ　　Ｊｚ２．４Ｉ（ｚ、Ｉ
　Ｈ）　；　６．７１（ｄ　＝　Ｊ　＝９．５　Ｈｚ　
−１Ｈ）　ｓ　６．８０　（ｄｄ、Ｊｚ９．０５および
２．４　Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）　ｓ　７−６９　（”ｌ＋”。

１０Ｈ）　；　７．５２　（ｄ、　　Ｊｚ９−５Ｈｚ、
Ｉ　Ｈ）　＝７．６１　（ｄ、Ｊｚ９−０　）Ｊｚ、ｉ
　Ｈ）　ｓ　９．６５　ｐｐｍ（ｓ、　　１Ｈ）。

ＵＶ／ＶＩＳ　（［１，１Ｍリン酸カリウム緩衝液、…
８．０：　λｍａｘ　””　５７５．４　ｎｍ　０ケイ
光放射＝λｍや”’５９２ｎｍ０ ２　Ｍ　ＫＩ（ＳＯ２−溶液でｐＨ２に設定し、酢酸エ
ステルで抽出し、酢酸エステル−抽出物を水で洗浄し、
硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発する。固形残渣を石油
エーテルと擦し、吸引濾過し、転倒３ レゾルフィン−４−カルデン酸ぎペラシトのＮ　−ＢＯ
Ｃ−Ｌ−チロキシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルとのカップリング例１１）と同様に、レゾルフィ
ン−杢−カルゼン酸ピペラジトートリフルオロアセテー
ト２１２７〜およびＮ　−ＢＯＣ−Ｌ−チロキシン−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル４１９ｍ９から生
成物３２０７ｆが得られる。

Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノール
／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　’）　：　０．５
８゜Ｎ　−ＢＯＣ’　−Ｌ−チロキシン−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを次の方法で得る。

ａ）Ｎ−ＢＯＣ−チロキシン ジオキサン／水＝２／１　３００ｍＪおよびＩＮ力性ソ
ーダ溶液１５ｍ１から成る混合物中のＬ−チロキシン−
ＮＡ−塩・Ｈ２Ｃ１０ｇ　（１２，５ｍモル）の溶液に
ジーｔ、−ブチルージカルぜネー）　、（１３ｏｃ）２
０３ｇ（１３，７５ｍモル）を加え、光排除下に室温で
２時間攪拌する。

（５４’） 燥器中で乾燥する。

状景　：９．４５　　ｇ＝理論１直の　８６　チ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：　ＣＨＣ！）３／リグロ
イン／咋酸＝６：３：１）：＝０．６゜ ｂ）Ｎ−ＢＯＣ−チロキシン−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル エチレングリコールジメチルエーテル２０Ｏｄ中のＬ　
−ＢＯＣ−チロキシン８．８ｇの溶液に、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド１．２９　（９，５ｍモル）を与える
。溶液勿１０℃に冷却し、エチレンクリコールジメチル
エーテル４［１Ｍ中のジシクロへキシル〃ルポジイミ）
７２．３Ｊｉ’　（９，９ｍ七ルンの溶液を滴加する。

室温で２時間攪拌した後、沈殿したジシクロヘキシル尿
素を吸引濾過し、濾液を真空中４０℃で蒸発する。残渣
をイングロパノールと擦し、吸引濾過する。乾燥器中室
温で乾燥する。

収量：９．１９．９＝理論値の９４％（チロキシンに対
する総収率＝８１％） Ｒｆ　（ＨＰＴＬＣ−ＲＰ　１８　；展開剤：ニトロメ
タン／エタノール−９二１）：肌８；よたは（ＨＰＴＬ
Ｃ−ＲＰ　１８　；展開剤ニアセトニトリル／　Ｈ２０
＝８：２）：　　０．６ 五Ｈ−ＮＭＲ（［Ｄ６］　　ＤＭＳＯ）：　　　δ　＝
１．５６　　（ｓ、　　　９Ｈ）；２．８１　（８，４
Ｈ）；２．９−３．２（ｍ、２Ｈ）；４．５−４．９Ｃ
ｍ、Ｉ　Ｈ）、’　７．０６　（ｓ、２Ｈ）ニア、６５
　（ｄ＋　　ｊ＝９Ｈ２−ｉ　Ｈ）　ｓ　７−９０　（
８゜２　ａ　＞　ｓ　９．２　＜　Ｓ、　　Ｉ　Ｈ）　
ｙ例　　４ レゾルフィン−４−カルボン酸ビペラジドの３−０−（
，５−（Ｎ−スクシノイミドオキシ力ルホニル）フ９０
ビル〕エストラシ、ｔ−ルトノＦ７ツプリング 例１１）と同様に、レゾルフィン−４−カルざン酸ピペ
２シトートリフルオロアセテート２１２唖および５−０
−〔６−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）プ
ロピル〕エストラジオール２２０〜から生成物２９５〜
が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１：　ｕ、１）　：　Ｌｌ、５　
Ｎ５−０−（５−（Ｎ−スクシンイミドオキシカルボニ
ル）プロピル〕エストラジ万一ルカ常法で、６−〇−力
ルポキシプロビルーエストラジオール〔エストラジオー
ル２よびブロム酪酸から、リュプケ（Ｌ’ｕｂｋｓ　）
その他、イムノロギツシュテステ　フユア　ニーダーモ
レキュラーレ　ビルクシュトツフエ（工ｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｓｃｈｅＴｅｓｔｓ　Ｆ’ｕｒ　Ｎｉｓｄｓｒｍｏ
ｌｅＮ１５ｄｓｒ　Ｗｉｒｋｓｔｏｆｆｅ　）、Ｇ、チ
ーメ　フエアラーク（Ｔｈｉｅｍｓ　Ｖｓｒｌａｇ　）
　％シュトッドガル）、ｆ？！、９４ページにお（ハ）
′ると同様に〕およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドか
ら、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在で得られる
。

例　　５ レゾルフィン−４−カルボン酸ビベラジドのＮ−［３−
（Ｎ−スクシンイミドオキシカルボニル）プロピル〕フ
エノバルビタールとのカップリング 例１１）と同僚にレゾルフィン−４−カルボン敵ピペラ
ジトートリフルオロ酢酸２１２〜およびＮ−（，５−（
Ｎ−スクシンイミドオキシカルボニル）プロピル〕フエ
ノバルビタール２０５〜から、生成物２２０ｍｇが得ら
れる。

Ｒｆ　（シリカゾル、展囲剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９：にＬＪ、１　）　：　０．４５゜Ｎ−
Ｃ５−ＣＮ−スクシンイミドオキシカルボニル）プ四ビ
ル〕−フエノバルビタールは常法でフェノパルビタール
ー１−酪酸〔Ｔ、ニジカワ（ＮｉＮ１５ｈｉｋａ　）そ
の他、クリニカ　キミカアクタ（Ｃ’ｌｉｎ、　Ｃｈｉ
ｍ、　Ａｃｔａ　）　９１　（１９７９年）第５９ペー
ジ〕およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドからジシクロ
へキシルカルボジイミドの存在で得られる。

例　　６ レゾルフインー４−カルボン酸ピペラジトノテオフィリ
ン−７−プロビオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルとのカップリングレゾルフィン−４−カルボン
酸ビペラジドートリフルオ四アセテート２１２〜および
テオフイリン−７−ｆロビオ、ンＨ−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル１７５〜から例１１）と同様に生
成物２００Ｉｎ９が得られる。

Ｒｆ（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９：１：０．１）：０．４４゜テオフィリ
ン−７−プロピオン［−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルは、常法でテオフィリン−７−ｆロビオン酸〔
Ｔ、ニジカワ（ＮｉＮ１５ｔｉｋａ　）その他、ケミカ
ル　アンド　ファーマンイテイカル　プルティン（Ｃｈ
ｅｃｎ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　）　２７　（１９７９年）
第８９５ページ〕あ−よびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドからジシクロヘキシルカルボジイミドの存在で得られ
る。

例　　７ Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サルコシン−Ｎ
′−ヒドロキシスクシンイミドエステルの、１−（２−
アミノエチル）ジフェニル−ヒダントインとのカップリ
ング ａ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチルジヒドロレゾルフィン−
４−カルボン酸（１，−ブトキシカルボニルメチル）メ
チルアミド 例７　ｃ）に記載された節塩化物１０ｇ金例１ｅ）と同
様に、サルコシン−ｔ、−ブチルエステルと反応させる
。

収量ニア、５ｇ。

Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノール
／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．７７
゜ｂ）　　Ｎ−アセチルジヒドロレゾルフィン−４−カ
ルボン酸（１，−ブトキシカルボニル−メチル）メチル
アミド 例７ａ）に記載された生成物７．５ｇを例１　ｆ）と同
僚に脱アセチル化する。

収量：５．２ｇ。

Ｒｆ　（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸　９　：　１　：　ｏ、１）二〇、５６゜
Ｃ）　　レゾルフィン−４−カルボン酸（ｔ、−７”）
キシカルボニルメチル）メチルアミド 例７ｂ）に記載された生成物４．５　ｇｋ例１　ｇ）と
同様に反応させる。

収量：２．６＆０ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷ｒ＝ｖ　　９：１　：ＬＪ、１’）　：０．６４
゜ｄ）レゾルフィン−４−カルボン酸（カルホキジメチ
ルコメチルアミド 例７ｃ）に記載された生成物０．５５　、！Ｉ／を昆温
で１時間トリフルオロ酢酸６Ｍ中で放置する。

蒸発乾洞し、エーテルと擦し、濾過する。

収量：０．４５ｇ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９：１：０．１）：０．１１゜ｅ）Ｎ−（
４−レゾルフィニルカルボニル）サルコシン−Ｎ′−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル 例７６）からの生成物２００〜をＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミＰ７２１ｎ９およびシシクロヘキシル力ルポジイ
ミタ１６８〜と１４時間、テトラヒドロ７２ン４０ｗＬ
ｌ中で攪拌する。沈殿した原木から濾過し、蒸発しおよ
びシリカゲルＲＰ１８でクロマドグ２フイーにかける（
浴離液：ニトロメタン／エタノール４：１）。

枢ｉｉｌ：：１５０〜。

Ｒｆ（シリカゲルＲＰ　−１８、展開剤：ニトロメタン
／エタノール　４：ｉ）：０．７９゜ｆ）Ｎ−（４−レ
ゾルフィニルカルボニル）−サルコシンーＮ′−ヒドロ
キシスクシンイミドｘスフルｏ、１−　（２−アミノエ
チルノシフェニルヒダントインとのカップリング 例７ｅ）カラのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
１２５〜をジオキサン／リン酸カリウムＡｆｌｉ＆ｐ［
Ｎ８．５、’Ｉ：１　４Ｑｍｌｊ中で、１−（２−アミ
ノエチル）ジフェニルヒダントイン９０１ｎｇと１時間
攪拌する。ジオキサンを蒸発し先金に色が転換するまで
アンモニア全添加し、濾過し、生成物′ｔ−Ｈｃノを用
いて濾液から生じる。

収量：１１０ｒｎ９ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸
／水　４：１：１）：０．７８゜ＵＶ／ＶＩＳ　（Ｌｌ
、１　Ｍリン酸カリウム緩衝液、−８，０）：λ　　−
５７５ｎｃ。

ａｘ ケイ光放出；λ　　≧５９２　ｎｍ ａＸ 例　　８ レゾルフィン−４−カルボン酸−２（ｌ−ジフェニルヒ
ダントイニル）エチルアミドａ）Ｎ＃０ＩＯ−）リアセ
チルジヒドロレゾルフィン−４−カルボンＭ−２＜１−
ジフェニルヒダントイニル）エチルアミド Ｎ１ｅ）と同様に、１−（２−アミノエチル）ジフェニ
ルヒダントイン１．３７１をＮ、０．０−ドリアセチル
ジヒドロレゾルフィンカルボン酸り四リド１．２ｇと反
応させる。軽く層色された泡状物として生成物１．９９
が得られる。

ｂ）　　レゾルフィン−４−カルボン＆−２（７−シフ
エニルヒダントイニル）エチルアミド例８　ａ）で得ら
れた生成物を例１ｆ）および１ｇ）と同＠に酸化的に、
脱アセチル化する。抽出物１．９ｇから生成物６００Ｔ
ｎ９が得られる。

Ｒｆ（シリカゾル、展開剤：クロ四ホルム／メタノール
／水昨酸　９　：　１　：　Ｌｌ、１　）　：　０．６
８゜↓Ｈ−ＮＭＲ（［Ｄ、］−ＤＭｆ：ｔｏ）：δ＝　
６．２−６−６　（ｒｎ。

４　Ｈ）　ｓ　６．７３　（ｄ　−Ｊ　＝２．２　Ｈｚ
、Ｉ　Ｈ）　ｚ６．８４　（ｄ、Ｊ＝９．５　Ｈｚ、Ｉ
　Ｉ（）　ｓ　　６−８６　　（ｄｄ。

Ｊ　＝　９．５および２．２Ｈ２，１Ｈ）　；７．２−
７．４　（ｆｆ１．　１０Ｈ）　；　７．６２訃よび７
．６６（各々ｄ、　Ｊ＝９．５Ｈ２，２Ｈ）　；８．６
６（ｔ、広幅、Ｊ＝５ＨＬ　１Ｈ）；９．５８ｐｐｍ　
（ｓｖＩＨ） ＵＶ／ＶＩＳ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液、−８
，０）λｒｎａｘ””　５７５　ｎｍ　。

ケイ光放射：λｍａｘ””’　５９１　ｎｍ。

例　　９ ６−メチルレゾルフィン−４−カルボン酸−ピペラシト
の、Ｃ２−Ｃ１−ジフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのカップリング ａ）２−メチル−４−ニトロソレゾルシン２−メチルレ
ゾルシン１９．８１１および水酸化カリウム１５．４１
１をエタノール１２０酎に溶解し、５℃に冷却する。こ
れにイソペンチルニトリツ）　２４　ｍｌを滴下し、６
時間攪拌し、沈殿を吸引濾過する。黄色り固形物を５Ｎ
硫酸２０ＯＮに攪拌混入する。その際明黄色の生成物が
沈殿する。

収量：２２ｇ。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　ｏ、１）　：　０．５５
゜ｂ）６−メチルレサズリンー４−カルボン酸２−）ｆ
ルー４−ニトロンレゾルシン１５．ＳＣ２，６−ジヒド
ロキシ安息香酸１５．４ｇ、横方８．８ｇおよび濃硫酸
１１威勿例１　ａ）と同様に反応させる。

収量：　２８．７　ｇ。

Ｒｆ　（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メンノ
ール／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．
１５゜ｃ）Ｎ、０．Ｏ−トリアセチル−６−メチルシヒ
ドロレゾルフインー４−カルボン酸 ６−メチルレスアズリン−４−カルボン酸１０ｇ、塩化
スズ（ｆ［）　１９．８　ｇ、無水酢酸２０継および氷
酢酸１５０罰から例１　ｂ）と同様に直接トリアセチル
化されたロイ；化合物が傅られる。粗生成物をア七トン
を用いて十分に那騰することにより；Ｉｌ［する。

収量ニア、５．！ｉ’。

Ｒｆ（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１）　：　０．５１
゜’Ｈ−ＮＭＲ（［Ｄ）　６−ＤＭＳＯ）　：δ＝２．
１０．　２．２５゜２．２９．２．５５　（各々ｓ、ｊ
２Ｈ）ニア、００．７．口９．７．５０および７．７４
　ｐｐｍ−（各々ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ） ｄ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−６−メチルシヒドロレ
ゾルフインー４−カルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−ピペラジ
げ 例１　ｄ）から１８）と同様に、Ｎ、○、〇−トリセア
チルー６−メチルジヒドロレゾルフィン−４−カルボン
酸５ｇ、塩化オキサリル１０．７ｒｎｌおよびＮ　−Ｂ
ＯＣ−ピペラジン２．Ｆから、生成物６９が得られる。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：酢酸エステル）：０．５
７ ｅ）６−メチルレゾルフィン−４−カルボン歌ピペラジ
トートリフルオロアセテート例９ｄ）に画己載されたト
リアセチル誘導体１ｇｔ例１　ｇ）〜１　ｈ）と同僚に
反応させる。

収量：ｔＪ、４５ｇ ｆ）６−）ｆルレゾルフイン−４−刀ルホン酸ビペラジ
ドの、２−（１−ジフェニルヒダントイニル）６２−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステルとのカップリング 例９Ｂ）で得られた化合物２２２〜ｅ２−（１−ジフェ
ニルヒダントイニル）ｅ酸−Ｎ−ヒ）’ロキシスクシン
イミタエステル２００〜と反応させる。

収量：２５０ｍ９゜ Ｕ■ハＩｓ　（［１，ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液、…
８．０　）　：　λ　　＝５８４１１１１ｎ。

ａＸ ケイ光放出：　匂ａＸ”＝　６００　ｎｍ　。

例１０ ９−ヒドロキシ−５−ベンゾ［ａ）フェノキサシン−８
−カルボン酸ビベラジドの、〔２−（１−ジフェニルヒ
ダントイニル）酢酸−Ｎ−（品） ヒドロキシスクシンイミドエステルとの刀ノブリング ａ）９−ヒドロキシ−５−ベンゾ［ａ〕フェノキサシン
−８−カルボン酸−１２−オキシド１．６−シヒドロキ
シー４−二トロンナフタリン２．８４Ｆ、２．６−ジヒ
ドロキシ安Ｍ、ｆ酸２．５１ｇ、横方１．２９ｇおよび
績硫酸１．６Ｍを例１　ａ）と同様に反応させる。

収量：２．８ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸
／水　４　：　ｉ　：　１　）　：　０．６３゜ｂ）１
２−アセチル−５，９−ジアセトキシベンゾ［ａ）フェ
ノキサシン−８−カルボン酸例９ｃ）と同様に、９−ヒ
ドロキシ−５−ベンゾ［ａ）フェノキサシン−８−カル
ボン酸−１２−オキシド２．４　ｇり＞らトリアセチル
化されたジヒドロ化合物１．８ｇが得られる。

Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノール
／氷酢酸　９：１：θ、１　）　：　Ｑ、５１Ｃ）１２
−アセチル−５，９−ジアセトキシベンゾＬａ〕フエイ
キサジ／−８−カルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−ビペラゾｒ 例１ａｂ＞にｈ己載されたトリアセチル化合物１．６　
、＠　’ｌＪ９　ｄ）と同僚に、塩化オキサリルおよび
Ｎ−ＢＯＣ−ピペラジンと反応させる。

ａｔ　　二　１．２．Ｆ 五Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ＠）：　　δ　＝１．４９（８
、９Ｈ）　　ｚ２．１２　；　２．２７　；　２．４６
　（各、４ｒｓ、１２Ｈ）；５、Ｏ−６，９（ｍ、８Ｈ
）ｐ　７．０６（ｄ−Ｊ＝９Ｈｚ　、　Ｉ　Ｈ）　ｚ　
７，１６−７．９４　ｐｐｍ　（ｍ　−６Ｈ）ｄ）９−
ヒドロキシ−５−ベンゾ［ａ）フェノキサイン−８−カ
ルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−ピペラジン 例１　ｆ）と同様に、例１０ｃ）のトリアセチル化合物
０．９５　ｇ７Ｄ）ら生成物０．５１．Ｖが得られる。

Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノール
／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．６９
８）　　９−ヒドロキシ−５−ペンｒ（ａｌフェノキサ
シン−８−ノノルボン酸ピペラジトートリフルオロアセ
テート 例１０ｄ）にＨピ載されたＢＯＣ−保護化合物０．５ｇ
から例１　ｈ、＋と同様に、生成物ＩＪ、５　ｇが侍ら
れる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．０
２ｔ＞　　９−ビトロキシ−５−ベンゾ［ａ）−フェノ
キサシン−８−カルボン酸ピペラジンの、２−（ｉ−ジ
フェニルヒダントイニル＞　６２−Ｎ−ヒドロキシース
クシンイミにエステルとのカップリング 例１０８）により製造したピペラジン５０〜および２−
（１−ゾフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル１５０ｒｎ９から、例１１）
と同様に生成物７０１ｎ９が得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：１　：　０．１　）　：　０．５７
ＵＶ／Ｖ工Ｓ　（０，１Ｍ　！Ｊ　／酸カリウム緩爾液
ｐｆｌ　８．０）：λ　　２５６０ｍｍ ａＸ ケイ光放射：λＩｌｒＩａｘ＝６１５ｎｍ０工Ｊ（−Ｎ
ＭＲ（（Ｄ：）ａ−、ＤＭＳＯノ：　　δ　−５，ｔＪ
−４，５＜ｍ、　　　１　　　［３Ｈ）；６．．５７（
Ｓ、　　１Ｈ）：６．８０（ｄ、　　Ｊ＝８Ｈｚ、ＩＨ
）ｐ　　７．２−　７−５５　　（ｍ、　１　０Ｈ）；
７−５５−８−０　　（（Ｑ、　５Ｈ）ｓ　　８．１０
（ｄｄ、Ｊ＝８２よび２Ｈｚ−ｌ　Ｈ）　ｚ　８−５６
　（ｄｄ−Ｊ　””８および２Ｈｚ、’ＩＨ）；　５’
６０ｐｐｍ（’ｉ＋　ＩＨ）例１１ ８−エチルレゾルフィン−４−カルボン酸（１−ジフェ
ニルヒダントイニルメチルカルポニル）ピペラジン ａ）６−エチル−４−二トロソレゾルシン例９　ａ）　
ト同様Ｋ、４−エチルレゾルシン７．５１１　、水酸化
カリウム４．５ｇおよびインペンチルニトリツ）ＩＩ７
から、黄色の固形物として６−ニチルー４　ニトロソレ
ゾルシンが傅らｎる。

収１ｉｉｒニア、５ｇ Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　ｕ、１）：　０．３７ｂ
）８−エチルレゾルフィン−４−カルボン酸物１ａノ　
　と１司様に、６−エチル−４−ニトロンレゾルシン７
．４ｇ、２．６−ジヒドロキシ安息香＃Ｒ６，８＆　、
二酸化マンガン６．９ｇおよび濃硫酸５祷から亜鉛粉末
８＆を用いる還元により生成物９．５ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）　：　０．０
５゜ｃ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−８−エチルジヒド
ロレゾルフィン−４−カルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−ピペ
ラジン 例１ｂ）と同様に、８−エチルレゾルフィン−４−カル
ボン酸７．７ｇ、塩化スズ（ＩＩ）　１５．４　ｇ、氷
酢酸３０ｄおよび無水酢１１１１５．５　ｍｌからＮ。

０．０−ドリアセチル−８−エチルレゾルフィン−４−
カルボン酸が得られ、これは粗生成物として例ｉ　ｃ）
と同様に、直接酸塩化物におよび例１８）と同様ｉ７１
：ＢＯＣ−ピペラジドにさらに加工される。

収ｆ：　４ｇ Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷畔ｖ　　９　：　１　：　ａ、１）＝ｏ、５６ｄ
）　　８−エチルレゾルフィン−４−カルボン酸−Ｎ’
　−ＢＯＣ−ビペラジド Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−８−エチルジヒドロレゾル
フィン−４−カルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ’ビペラジド４
ｇから例１　ｆ）および１　ｇ）と同様に、相当するカ
ルボン酸−Ｎ’−ＢＯＣ−ビペラシドが得られる。

収量：０．５．９ Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノール
　４：１）＝０．６７ ｅ）８−エチルレゾルフィン−４−カルボン酸ビペラジ
ドトリフルオロアセテート 相当するＢＯＣ−ピペラジドロ６０〜を１．５時間、ジ
クロルメタン／トリフルオ四酢酸６：１６５プ中放置す
る。蒸発後エーテルで浸漬し、吸引濾過し、乾燥する。

収ｉ：３５０Ｉｎ９ Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：ブタ７−ル／氷酢酸／水　
４：１：１）中０．６６ ｆ）２−（１−ジフェニルヒダントイニル）６酸−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応 例１１）と同様に８−エチルレゾルフィン−４−カルボ
ン酸ピペラジトートリフルオロアセテート５２５１ｖお
よび２−（１−ゾフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル４３５ｒｎ９から生
成物１２０■が得られる。

Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノール
／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）＝０．４３”Ｈ
−Ｎ四（（Ｄ）、−ＤＭＳＯ）：δ＝１．１５　（ｔ、
　　、ｒ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）２．５２　（ｑ、Ｊ＝７
．２Ｈｚ、２Ｈ）；６−１−４．０　（ｍ、　　８Ｈ）
　；　４．２５−４．４５　（ｍ。

２Ｈ）；６．４２Ｃｓ、広幅、１Ｈ）；６．９４（ｄ、
　　Ｊ＝９．０Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ’）　；　７．３−７．
５　（ｆｎ−１１Ｈ）ｚ　７−６８　（ｄ−Ｊ＝９−Ｕ
Ｈｚ、　ｉ　Ｈ）　ｓ９．５４（ｓ、ＩＨ）；１１．２
ｐｐｍ（ｓ、広幅。

１Ｈ） ＵＶ／ＶＩＳ　（［１，１Ｍリン酸カリウム緩慟液−８
．０　）　：λｍａｘ　５７５　ｎｍケイ元放射：λ　
　＝　５９８　ｎｍ ａＸ 例　１２ ８−クロルレゾルフィン−４−カルボン酸−（１−ジフ
ェニルヒクントイニルメチル力ルボニル）ビペラジド ａ）８−クロルレサズリンー４−カルボン酸４−クロル
−６−二トロンレゾルシン〔プラムビン（Ｐｌａｍｐｉ
ｎ　）およびケイン（Ｃ’ａｉｎ　）　、ジャーナル　
オプ　メディシナル　ケミストリー（Ｊ、　Ｍｅｄ、　
Ｃｈ８ｍ、）　６−２４７　（１９６６年）〕１７．３
１！、２．６−ジヒドロキシ安息香酸１５．４ｇ、横面
８．６ｇおよび濃饋酸１０．７１１ｔから例１　ａ）と
同様に８−クロルレサズリンー４−カルボン酸が得られ
る。

収量：１７゜１ｇ Ｒｆ　（シリカゲル、展囲剤：ブタノール／氷酢酸／水
　４　：　１　：　１　）＝０．５８ｂ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−
トリアセチル−８−クロルジヒにロレゾルフィンカルボ
ン酸 ン ８−クロルレサズリンー４−カルボ％Ｘ１６．５．！ｉ
／および塩化スズ（Ｉｔ）　１８．９　ｇを４時間、氷
＊ＩＥ　＃　／無水酢酸１：１　１００ｍ１中で８０℃
に加熱し、その後氷水５０ＯＮに与える。

２時間攪拌し、沈殿物を濾過し、シケペント（５ｉｃａ
ｐｅｎｔ　）Ｒ上で乾燥する。固形物勿アセトン５００
σにと９、不溶の残渣を濾過する。濾液を蒸発し、乾燥
俊生放物１２．５ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカゲル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９　：　１　：　０．１　）＝０．５９゜
ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤ）ａ−ＤＭＳＯ＞　：　　　δ　＝
２．２５（ｓ、　　　６　ｓ）：２．６５Ｃ＝ｓ″、　
６Ｈ）　；　７．１６　（ｄ、　　、Ｔ＝８．８Ｈｚ、
ｉＨ）；７．３０（ｓ、ｉＨ）；７．７６（ｃＬＪ　＝
８．８　Ｈ２ｅ　　Ｉ　Ｈ）　；　７．９０　ｐｐｍ（
ｓ　−１”）。

ｃ）８−クロルレゾルフィン−４−カルボン酸−Ｎ’−
ＢＯＣビペラジド 例１ｂ）、Ｃ）およびｅ）〜ｇ）と同様に、Ｎ。

０、〇−ドリアセチルー８−クロルジヒドロレゾルフィ
ン−４−カルボン酸５ｇから生成物０．８Ｉが得られる
。

Ｒｆ　（シリカ左ゞル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール−氷酢酸　９　：　１　：　０．１）〜０．７ｄ）
８−クロルレゾルフィン−４−カルボッ敗ビペラジドト
リフル万ロアセテート 例１２Ｃ）からのＢＯＣ−保島化合物０．８ｙから例１
ｈノと同僚に生成物０．８１　ｇが得られる。

Ｒｆ（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９二１　：　０．１　）　＝［］、０７ｅ
）８−クロルレゾルフィン−４−カルボン酸ビベラジド
の、２−（１−ジフェニルヒダントイニル）酢酸−Ｎ−
ヒドロキシ−スクシンイミドエステルとのカップリング 例１１）と同様に、８−クロルレゾルフィン−４−カル
ボン酸ピペラジトートリフルオロアセテ−）４００■お
よび２−（１−ジフェニルヒダントイニル）−酢酸−Ｎ
−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル４１０ｍｇから
所望の生成物が得られる。

収量：１５０〜 Ｒｆ（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９：　１　：　０．１＝０．．５８）ＵＶ
／Ｖ工８　（０，１Ｍリン酸プノリウム緩爾液　−８，
０）：　λｍａｘ＝　５８７　ｎｍケイ光放射二λ　　
−５９７ｎｍ ａＸ 例１６ ８−クロロレゾルフィン−１−カルボン酸−ビペ２シト
の、テオフィリン−７−ブロビオン酸−（２−アミノエ
チル）アミドとのカップリング ａ）８−クロロレゾルフィン−１−カルボン酸４−クロ
ル−６−ニトロンレゾルシン８．７９および６，５−ジ
ヒドロキシ安息香酸７．７１　ｇをメタノール２００ｍ
１に溶解し、０℃で惰石４．８ｇ訃よび少量宛に濃硫酸
５．６Ｍを添加する。

型温で２時間攪拌し、濾過し、實色に色が変わるまでア
ンモニアおよび水２００ｄを添加する。

浴液全謙過し、痣液に濃アンモニア２５ｍ／および亜鉛
粉末２０．１−水冷で加え、その後さらに冷却すること
なしに約１５分間攪拌する。活性炭２００〜を麻加し、
濾過し、−２に酸性化しく７８ノ 沈殿したレゾシ誘導ン肪専体を遠心分離する。

収蛍：５．９ｇ Ｒｆ（シリカゲル、展開剤：ｎ−ブタノール／氷酢酸／
水　４：１：１）：０．８８ ｂ）Ｎ、ｏ、ｏ−トリアセチル−８−クロルジヒタロレ
ゾルフィンー１−刀ルボン酸 ８−クロロレゾルフィン−１−カルボン酸６．５ｇから
例１　ｂ）と同様に、生成物６．２ｇが得られる。

Ｒｆ　（シリカケ９ル、展開剤：クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸　９：１：０．１）：０．４５０）８−ク
ロロレゾルフィン−１−カルボン酸ピペラジげ一トリフ
ルオロアセテート 例１１ｂ）で製造したトリアセチル化合物６ｙ力・ら例
Ｉ　Ｃ）〜１　ｈ）と同様に生成物１．４１が傅られる
。

Ｒｆ　（シリカゾル、展開剤：クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸　９二１　：　０．１　）　：　０．０８ｄ
）８−クロロレゾルフィン−１−カルボン酸ピペラジ団
の、テオフィリン−７−ブロビオン酸−（２−アミノエ
チル）アミドとのカップリング 例８と同僚にＮ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−８−クロル−
ジヒドロレゾルフィン−１−カルボン酸ピペラジに４２
０〜およびテオフィリン−７−プロピオン酸（２−７ミ
ノエチル）アミド６００雫から生成物１９０ｍ９が得ら
れる。

例１４（参考例） Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サルコシン−Ｎ
′−ヒト四キシスクシンイミドエステルを用いるイムノ
グロブリンＧｔｖ棟ｍ付はヒト−１ｇＣ＋１００〜を０
．１Ｍリン酸カリウム緩衝液…８．０１０ゼに溶解し、
Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サルコシン−Ｎ
′−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（例７ｅ）参
照）５雫を加える。呈漏で１２時間放置し、その俊つル
トロデル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　）　ＡＣＡ　２０２（Ｌ
ＫＢ）でクロマトグラフィーにかげる。樟繊付けされた
タンパク實をその際遊離低分子レゾ定 ルフィンより前に溶離する。標識度？吸光測度により測
定する。これは６であり、即Ｔｚ　ＩｇＧ分子分子１毎
ル毎ゾルフィン防碑体６分子が結合されている。

例１５（参考例） Ｎ−（４−レゾルフイニル力ルポニルノヒペリジン−４
−カルボン［−Ｎ’−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルを用いる、イムノグロブリンＧ（７）標識付け ａ）Ｎ−（４−レゾルフィニルカルボニル）ピペリジン
−４−カルボン酸 例１Ｃ）に記載さγしたＮ、０．０−トリアセチルジヒ
ドロレゾルフィン−４−カルボン酸クロリド２．０ｇを
例ｉ　ｓ）と同様に、ピペリジ／−４−カルボン酸メチ
ルエステル−塩酸塩０．９ｇと反応させ、例ｉ　ｆ）お
よび１　ｇｌと同様に脱アセチル化し、酸化し、力性ソ
ーダ浴液を用いてＮ−（４−レゾルフィニルカルボニル
）ピペリジン−４−カル信ン酸にケン化する。

収′ｊｉｔ：０．９．Ｖ Ｒｆ　（シリカゲルＲＰ−１８、展開剤：ニト四メタン
／エタノール　４　：　１　）＝Ｌ１．４４ＵＶ／Ｖ工
Ｓ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液−８，５）カルボ
ニル）ピペリジン−４−カルボンｇ−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル１００μｌｋ加え、型温で２時間
放置する。これはレゾルフィン肪尋体６．４モル対イエ
ウサギ−ＩｇＧ１モルの比に和尚する。

ＡＣＡ　２０２を用いるクロマトグラフィー（溶離液：
　０．Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液−８，５）の後Ｉｇ
Ｇ　ｉモル嶋りレゾルフィン６．４セルの負荷度に相蟲
する、吸着比Ａ３７８／Ａ２８゜＝　０．９７を有する
、タンパク質画分が得られる。

同様の試験でイエウサギ−ＩｇＧ　１［］叩に活性化レ
ゾルフィンの浴液２０μｌを加え、Ｉｇ０１モル描り提
供された染料１．０５モルで０．８の負荷度が得られる
。

レゾルフィン＃！識付けされたＩｇＧの吸着最高値は５
７８　ｎｍである。溶液は明赤色で強くケイ元する。

レゾルフィン標識付けされた工ｇＧの溶液を１夕月間日
光にさらすと、ケイ光強さは元の値の５９％に低下し、
一方間様に装造された、フルオレセインインチオシアネ
ートで標識付けされたＩｇＧは１６％におよびテキサス
　ロート（Ｔｅｘａｓ　Ｒｏｔ　）で標識付けされたＨ
ｇＧは１２９６に低下する。

例１６（参考例） ＦＰＩＡ　ｔ−用いる、ヒト血清でのジフェニルヒダン
トイン−確定 ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，８）１９５
０μｔに試料（１１５μ１１抗体溶液（２１２５μｔお
よびジフェニルヒダントイン−レゾルフィン溶液（３１
２５μｔを加える。６７℃で５分間のインキュベーショ
ン後、ケイ光偏光を測定する（励起波長：５７５ｚｏｎ
、放射波長５９４　ｍｍ。

測定装置：ケイ光分光計６５０−１０５、ヒタチ（Ｈｌ
ｔｐｃｈｉ　）。

１）試料：公知の菫でジフェニルヒダントインで増加さ
れた提供者血清。較正商機の作成のために ａ）　　２．５μｇ／縦 ｂ）　　　　５　μｍ１７ｍ１ Ｃ）　１０μｇ／ｍｌ ｄノ　　　２０　μ（１７ｍｌ ｅ）　４０μｇ／ＴＩＬｌ の？ｌＩｎ”でジフェニルヒダントインを含Ｍする、ヒ
トの提供者血清を使用する。

２）抗体溶液：抗体４５０μｇ／ｄＯ，ＩＭリン酸−ナ
トリウム緩衝液（…７．８） 抗体は牛血清アルブミンと結合されている、ジフェニル
ヒダントインを用いる、ヒツジの免疫化によジ、常法に
より得られる。

抗血清は硫酸アンモニウム沈殿およびＤＥＡＥ−セルロ
ースでのクロマドグシフイーを介して精製される。

６）ジフェニルヒダントインレゾルフィン溶液（１０”
”Ｍ）　：　０．１Ｍリン酸ナトリウム−緩衝液（Ｐ）
（７，８＞中の、例１１）からのジフェニルヒダントイ
ン−レゾルフィン複合体 ジフェニルヒダントイン−１ｇｇｌ　ａ）　、１　ｂ）
、１Ｃ）、１ｄ）および１　ｅ）を用いて侍られる開廷
結果が第１図に示されている。そこでは、ｍａｊ足され
た慣性＋Ｋ　（ｍｐ）に対する試料のジフェニルヒダン
トイン開度（μｇ／ｍ！；）が挙げられている。

このような較正曲線を用いて、公知でないジフェニルヒ
ダントイン含量を有する、試料中のジフェニルヒダント
イン−濃度も確定できる。

例１１）からの上記で使用されたジフェニルヒダントイ
ン複合体の代わりに例２）、７）、８）景たは１０　ｆ
）からのジフェニルヒダントイン複合体を使用する場合
も、比較可能な較正曲線が得られる。

例１７（参考例） レゾルフインーハイマンノースーグリコヘフチドを用い
るエンドクリフシダーゼ活性の確定ａ）Ｎ−（４−レゾ
ルフィニルカルボニル）サルコシン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを用いるハイマンノースグリコペ
プチドの標識付け ハイマンノースグリコペプチド（Ｈｌｇｂｍａｎ−ｎｏ
ｓｅｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄ　；ファング（１１−１ａ
ａｎ　）その他ｊＪ　ｋボヒドレート　　レス（Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、）１６．１２７〜１．５
７（１９７０年）により製造）５０１ｎ９に０．１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液−８，０１ＯＮを加える。層液ｆｔ
８．０の−に後調節する。ジオキサン５ｍｌＫｍ解され
たＮ−（４−レゾルフィニルカルボニル）サルコシン−
Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミドエステル２５ｒｎ９ｅ
添加し、１時間後、さらにジオキサン６−中の１１ｉｆ
ｉ形−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの同量を
添加する。室温で１４時間攪拌し、その後真空中でジオ
キサンを蒸発し、水で７０Ｍに希釈し、そｑ）後緩衝液
ＡＣ＝０．０２Ｍ）リス−ＨＣｌ、２ｍＭ塩化マグネシ
ウム、２ｍＭ塩化マンガン（Ｉｔ）、２　ｍＭ塩化カル
シウム、ｐ）１７．２　＞で１４０プに希釈する。−を
水性アンモニアで７．２に後調節する。その際形成され
た沈ＩＪ！ｉを遠心分離泳云する。浅漬をＣ１，）ｎ　
Ａ−セファロースカラム（８ｓｐｈａｓｏｓｓｓ’ａｕ
ｌｓ　）　（ｉ　ｘ　ｉ　５　ｃｍ　）に与える。緩衝
液Ａで遊離色素を十分に洗浄する。

還流液がもはや旗色でなくなるとすぐに、画分ルゾルフ
インーへイマンノースグリコヘフチドｉ　ｇ　＋＠液と
して緩＃液人中の２％メチルモノシト（約１００祷）で
浴離する。

その彼画分２を２％水性メチルマンノシドで俗離する。

双方の一分を水に対して透析し、凍結乾燥し、双方の画
分は下記ｂ）に記載された、エンドグリコシダーゼ活性
め確定のために好適である。

ｂ）エンドクリフシダーゼ活性の確定 レゾルフインーハイマンノースグリコヘフチドを好適な
緩衝液中エンドグリコシダーゼでインキユベートシ、と
γしらはたとえはエンドグリコシダーゼＨ訃よびクエン
酸塩−緩衝液ｐＨ５，５である（＝試料１）。これと平
行して、エンドグリコシダーゼを含有しない以外は同一
の試料を共に導く（＝試料２）。レゾルフィン−・・イ
マンノースグリコペプチドを形成するために、インキュ
ベーション後双方の試料にＣｏｎＡ−セファロース會加
え、伽と５する。楯分の酵素活性により分哄される、レ
ゾルフィン標庫付けされたペプチドは結合しない。１５
分後、ＣｏｎＡ−セファロースτ遠心分耐により除去し
、残渣を−７，５にし、ケイ光を測定する（励起はたと
えば５５０ｎｍ、放射λｍａｘ　５９５　ｎｍ　）。

試料１および空１１１！（＝試料２）の相違は分離され
たレゾルフィン−ハイマンノースの量に示され、それに
より酵素活性の基準である。

【図面の簡単な説明】

第１図は試料中のＤＰＨ−濃度と極性値との関係を示す
較正曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式VIIIａ及びVIIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （VIIIａ）■ ▲数式、化学式、表等があります▼ （VIIIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか又は異なつていてよく、水素原子、ハロゲ
   ン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコ
   キシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれカ
   ルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボ
   ニル基、シアノ基又はニトロ基によつて置換されていて
   良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒になつて隣接芳香族基であ
   つてよく、Ｍは二官能化合物の基を表わし、Ｘ＾４は反
   応性の基を表わし、かつＸ＾１＾３はＸ＾１及びＸ＾３
   の反応によつて生じる官能性の基であり、この際Ｘ＾１
   及びＸ＾３は反応性の基である〕のレゾルフイン−誘導
   体。 ２、一般式VIIIａ及びVIIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （VIIIａ）■ ▲数式、化学式、表等があります▼ （VIIIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５はそ
   れぞれ同じか又は異なつていてよく、水素原子、ハロゲ
   ン原子、カルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコ
   キシカルボニル基、シアノ基又はニトロ基、それぞれカ
   ルボキシ基、カルボキサミド基、低級アルコキシカルボ
   ニル基、シアノ基又はニトロ基によつて置換されていて
   良い低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わし、こ
   の際Ｒ＾４及びＲ＾５は一緒になつて隣接芳香族基であ
   つてよく、Ｍは二官能化合物の基を表わし、Ｘ＾４は反
   応性の基を表わし、かつＸ＾１＾３はＸ＾１及びＸ＾３
   の反応によつて生じる官能性の基であり、この際Ｘ＾１
   及びＸ＾３は反応性の基である〕のレゾルフイン−誘導
   体を製造するため一般式IIａ及びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾５は前
   記のものを表わし、Ｘ＾１は反応性基を表わす〕のレゾ
   ルフイン誘導体を一般式IV： Ｘ＾３−Ｍ−Ｘ＾４（IV） 〔式中Ｘ＾３及びＸ＾４は反応性基を表わし、Ｍは二官
   能性化合物の基を表わす〕の二官能性化合物と反応させ
   ることを特徴とするレゾル フイン誘導体の製法。