JPH093343A - 新規なオキサジン染料およびその染料の蛍光マーカーとしての使用 - Google Patents
新規なオキサジン染料およびその染料の蛍光マーカーとしての使用Info
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- JPH093343A JPH093343A JP8147691A JP14769196A JPH093343A JP H093343 A JPH093343 A JP H093343A JP 8147691 A JP8147691 A JP 8147691A JP 14769196 A JP14769196 A JP 14769196A JP H093343 A JPH093343 A JP H093343A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B19/00—Oxazine dyes
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 一般式Ｉ、例えば式９
のカップリングが可能な新規オキサジン染料
【効果】 生物学的活性物質へのカップリングに適し、
高い収量を有し、645〜700 nmの範囲で吸収を示し、非
特異的結合は非常に低いので、イムノアッセイやＤＮＡ
分析における、蛍光マーカーとして有用である。
高い収量を有し、645〜700 nmの範囲で吸収を示し、非
特異的結合は非常に低いので、イムノアッセイやＤＮＡ
分析における、蛍光マーカーとして有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はカップリングが可能
である新規なオキサジン染料および複合体中における蛍
光マーカーとしてのそれらの使用に関する。
である新規なオキサジン染料および複合体中における蛍
光マーカーとしてのそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】マーカーまたは標識は、分析物に特異的
な反応の終了後に分析物の定量を可能とする免疫学的ア
ッセイやＤＮＡ分析を実施するために必要である。特
に、蛍光測定マーカーはそれらの高い感度のために、最
近重要性が増してきた。例えば、抗体またはヌクレオチ
ドを蛍光染料で標識することにより直接的な定量ができ
る。
な反応の終了後に分析物の定量を可能とする免疫学的ア
ッセイやＤＮＡ分析を実施するために必要である。特
に、蛍光測定マーカーはそれらの高い感度のために、最
近重要性が増してきた。例えば、抗体またはヌクレオチ
ドを蛍光染料で標識することにより直接的な定量ができ
る。
【０００３】普及している蛍光染料には、例えばＦＩＴ
Ｃ（フルオレセインイソシアネート）、ＦＬＵＯＳ（フ
ルオレセインＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル）、レゾルフィン(resorufin) およびローダミン標識
物があるが、それらを励起するにはアルゴンレーザーな
どの比較的複雑な光源を必要とする。小型化システムを
作るのに非常に優れていることに加えて、630〜780 nm
の発光範囲を有する安価なレーザーダイオードの急速な
発展により、これらの波長範囲で吸収する染料を得るこ
とが望ましい。
Ｃ（フルオレセインイソシアネート）、ＦＬＵＯＳ（フ
ルオレセインＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル）、レゾルフィン(resorufin) およびローダミン標識
物があるが、それらを励起するにはアルゴンレーザーな
どの比較的複雑な光源を必要とする。小型化システムを
作るのに非常に優れていることに加えて、630〜780 nm
の発光範囲を有する安価なレーザーダイオードの急速な
発展により、これらの波長範囲で吸収する染料を得るこ
とが望ましい。
【０００４】標識として用いることのできる五環式ロー
ダミン染料がEP-A-0 543 333に記載されている。それら
の吸光度は主に660 nmまでの範囲にある。WO 88/047 77
にはフタロシアニン染料が記載されているが、これら染
料は２以上の官能基を持つために、例えば抗体と結合す
るときに架橋が生じ、非常に精製に時間のかかる生成混
合物が得られる。
ダミン染料がEP-A-0 543 333に記載されている。それら
の吸光度は主に660 nmまでの範囲にある。WO 88/047 77
にはフタロシアニン染料が記載されているが、これら染
料は２以上の官能基を持つために、例えば抗体と結合す
るときに架橋が生じ、非常に精製に時間のかかる生成混
合物が得られる。
【０００５】五環式オキサジン誘導体はレーザー染料と
してUS-P-5,149,807に記載されている。しかし、それら
は官能基を持たないために、タンパク質、ハプテンおよ
び核酸などの生物学的分子に対する特異的なカップリン
グには適さず、そうした適用は言及されていない。アミ
ン置換基が非環形成アルキル基により置換されているだ
けのDojindo社の三環式活性化オキサジン化合物が知ら
れている。その対応する複合体は非常に収量が低い。
してUS-P-5,149,807に記載されている。しかし、それら
は官能基を持たないために、タンパク質、ハプテンおよ
び核酸などの生物学的分子に対する特異的なカップリン
グには適さず、そうした適用は言及されていない。アミ
ン置換基が非環形成アルキル基により置換されているだ
けのDojindo社の三環式活性化オキサジン化合物が知ら
れている。その対応する複合体は非常に収量が低い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
学的分子へのカップリングに適し、かつ収量が高く、64
5〜700 nmの吸収範囲で吸収し、そして生物学的化合物
または固相に対する非特異的結合が可能なかぎり低い染
料を提供することにある。
学的分子へのカップリングに適し、かつ収量が高く、64
5〜700 nmの吸収範囲で吸収し、そして生物学的化合物
または固相に対する非特異的結合が可能なかぎり低い染
料を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は、特許請求の
範囲により特徴付けられる本発明により達成される。本
発明は以下の一般式（Ｉ）：
範囲により特徴付けられる本発明により達成される。本
発明は以下の一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化５】
【０００９】（式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ10
は水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲ
ン、カルボキシル、スルホニルまたはアミノを表し；Ｒ
2、Ｒ3は水素、アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒド
ロカルビル単位、フェニル、フェニルアルキルを表し、
これらはヒドロキシ、ハロゲン、スルホニル、カルボキ
シ、アミノ、アルコキシカルボニルにより置換されても
よく； Ｒ2はＲ1とともにまたはＲ3はＲ4とともに飽和
または不飽和のＣ２またはＣ３架橋を形成していてもよ
く、またはＲ2はＲ3とともに飽和または不飽和のＣ４ま
たはＣ５架橋を形成していてもよく；Ｒ8、Ｒ9は水素、
アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単
位、フェニル、フェニルアルキルを表し、これらはヒド
ロキシ、ハロゲン、スルホニル、カルボキシ、アミノ、
アルコキシカルボニルにより置換されていてもよく；Ｒ
8はＲ7とともにまたはＲ9はＲ10とともに飽和または不
飽和のＣ２またはＣ３架橋を形成していてもよく、また
はＲ8はＲ9とともに飽和または不飽和のＣ４またはＣ５
架橋を形成していてもよく；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9残基の
少なくとも１つは、カップリングの可能な活性化基また
はカップリングするように活性化可能な基により置換さ
れている非架橋形成残基を表し；そしてＲ2、Ｒ3、
Ｒ8、Ｒ9残基の少なくとも１つは、アルキルにより任意
に置換されてもよい架橋形成残基を表す。）で示される
カップリング可能な官能性オキサジン誘導体に関する。
は水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲ
ン、カルボキシル、スルホニルまたはアミノを表し；Ｒ
2、Ｒ3は水素、アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒド
ロカルビル単位、フェニル、フェニルアルキルを表し、
これらはヒドロキシ、ハロゲン、スルホニル、カルボキ
シ、アミノ、アルコキシカルボニルにより置換されても
よく； Ｒ2はＲ1とともにまたはＲ3はＲ4とともに飽和
または不飽和のＣ２またはＣ３架橋を形成していてもよ
く、またはＲ2はＲ3とともに飽和または不飽和のＣ４ま
たはＣ５架橋を形成していてもよく；Ｒ8、Ｒ9は水素、
アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単
位、フェニル、フェニルアルキルを表し、これらはヒド
ロキシ、ハロゲン、スルホニル、カルボキシ、アミノ、
アルコキシカルボニルにより置換されていてもよく；Ｒ
8はＲ7とともにまたはＲ9はＲ10とともに飽和または不
飽和のＣ２またはＣ３架橋を形成していてもよく、また
はＲ8はＲ9とともに飽和または不飽和のＣ４またはＣ５
架橋を形成していてもよく；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9残基の
少なくとも１つは、カップリングの可能な活性化基また
はカップリングするように活性化可能な基により置換さ
れている非架橋形成残基を表し；そしてＲ2、Ｒ3、
Ｒ8、Ｒ9残基の少なくとも１つは、アルキルにより任意
に置換されてもよい架橋形成残基を表す。）で示される
カップリング可能な官能性オキサジン誘導体に関する。
【００１０】Ｒ3がＲ4とともにおよび／またはＲ7がＲ8
とともに飽和または不飽和のＣ３架橋を形成する場合が
好ましい。Ｒ3がＲ4とともにおよび／またはＲ7がＲ8と
ともにＣ３架橋を形成すると同時に、Ｒ2および／また
はＲ9が非架橋形成置換基、好ましくはアルキルを表
し、そして少なくとも１つの非架橋形成置換基が、カッ
プリングの可能な活性化基または活性化の可能な基によ
り置換されている場合が特に好ましい。
とともに飽和または不飽和のＣ３架橋を形成する場合が
好ましい。Ｒ3がＲ4とともにおよび／またはＲ7がＲ8と
ともにＣ３架橋を形成すると同時に、Ｒ2および／また
はＲ9が非架橋形成置換基、好ましくはアルキルを表
し、そして少なくとも１つの非架橋形成置換基が、カッ
プリングの可能な活性化基または活性化の可能な基によ
り置換されている場合が特に好ましい。
【００１１】「ポリオキシヒドロカルビル単位」との用
語は、本発明の意義の範囲内においてはＯ架橋により結
合しているポリマーまたはオリゴマーの有機残基として
理解される。特に、この用語はポリエーテル、ポリオー
ル、可溶性炭水化物、それらの誘導体または水溶性ポリ
マーと理解される。全化合物の分子量が800〜1200、好
ましくは約1000となるような大きさのポリエチレンオキ
シ基が特に好ましい。前記ポリエチレンオキシ基はその
溶解度を向上させ、化合物のタンパク質に対する非特異
的結合を減少させ、二量体化を妨げる。
語は、本発明の意義の範囲内においてはＯ架橋により結
合しているポリマーまたはオリゴマーの有機残基として
理解される。特に、この用語はポリエーテル、ポリオー
ル、可溶性炭水化物、それらの誘導体または水溶性ポリ
マーと理解される。全化合物の分子量が800〜1200、好
ましくは約1000となるような大きさのポリエチレンオキ
シ基が特に好ましい。前記ポリエチレンオキシ基はその
溶解度を向上させ、化合物のタンパク質に対する非特異
的結合を減少させ、二量体化を妨げる。
【００１２】アルキル基は１〜１０炭素原子、好ましく
は１〜７炭素原子を有し、枝分れしていても直鎖でもよ
く、特に好ましくは１〜４炭素原子を有し、例えば特に
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イ
ソブチルまたはtert- ブチルである。好ましくは１〜３
炭素原子をアルキル基に有するフェニルアルキル基は特
にフェネチル基またはベンジル基である。
は１〜７炭素原子を有し、枝分れしていても直鎖でもよ
く、特に好ましくは１〜４炭素原子を有し、例えば特に
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イ
ソブチルまたはtert- ブチルである。好ましくは１〜３
炭素原子をアルキル基に有するフェニルアルキル基は特
にフェネチル基またはベンジル基である。
【００１３】ハロゲンはフッ素、塩素、臭素またはヨウ
素と理解され、好ましくは塩素と理解される。アルコキ
シカルボニル基中のアルコキシ基は１〜１０炭素原子、
好ましくは１〜４炭素原子、特に好ましくは１または２
炭素原子を有する。式Ｉの本発明による化合物におい
て、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9残基の少なくとも１つは、カッ
プリングの可能な活性化基またはカップリングのために
活性化可能な基により置換されている非架橋形成残基と
して存在するのが好ましい。そのような活性化基は特に
活性化可能なカルボン酸基またはスルホン酸基から得ら
れ、例えば酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、好
ましくは臭化物、特に塩化物またはＮ-ヒドロキシスク
シンイミドエステルである。DADOO等のリンカー化合物
を活性化基と非架橋形成残基との間に挿入してもよい。
素と理解され、好ましくは塩素と理解される。アルコキ
シカルボニル基中のアルコキシ基は１〜１０炭素原子、
好ましくは１〜４炭素原子、特に好ましくは１または２
炭素原子を有する。式Ｉの本発明による化合物におい
て、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9残基の少なくとも１つは、カッ
プリングの可能な活性化基またはカップリングのために
活性化可能な基により置換されている非架橋形成残基と
して存在するのが好ましい。そのような活性化基は特に
活性化可能なカルボン酸基またはスルホン酸基から得ら
れ、例えば酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、好
ましくは臭化物、特に塩化物またはＮ-ヒドロキシスク
シンイミドエステルである。DADOO等のリンカー化合物
を活性化基と非架橋形成残基との間に挿入してもよい。
【００１４】下記の表にカップリング可能な活性化基に
ついて数例示す。さらに別のそうした基は複合体の合成
化学から当業者には公知である。
ついて数例示す。さらに別のそうした基は複合体の合成
化学から当業者には公知である。
【００１５】 表１ 活性化基 結合相手 生成物 ＮＨＳエステル アミン類 アミド イソチオシアネート アミン類 チオ尿素 混合無水物 アミン類 アミド マレイミド チオール チオエーテル チオール マレイミド チオエーテル類 ハロアセチル チオール チオエーテル類 ヒドラジン アルデヒド ヒドラゾン類 アミン類 アルデヒド アミン（還元後）アミン類 反応性カルボン酸 アミド類
【００１６】電荷の中和に適し、カチオン性主鎖と適合
性のあるアニオンはいずれも対イオンとして用いること
ができる； 過塩素酸塩が好ましく用いられ、またはこ
の対イオンは残基の１つのカルボキシルまたはスルホン
基から得られる。残基の選択と組合せに加えて、適当な
対イオンの選択により、所望の親油性の程度を、意図す
る応用目的に応じて最適化することができる。
性のあるアニオンはいずれも対イオンとして用いること
ができる； 過塩素酸塩が好ましく用いられ、またはこ
の対イオンは残基の１つのカルボキシルまたはスルホン
基から得られる。残基の選択と組合せに加えて、適当な
対イオンの選択により、所望の親油性の程度を、意図す
る応用目的に応じて最適化することができる。
【００１７】Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8またはＲ9の意味で特に好ま
しい置換基の例には、水素、メチル、カルボキシメチ
ル、エチル、カルボキシエチル、３-スルホプロピル、
４-スルホブチル、３-カルボキシプロピル、４-カルボ
キシブチル、３-メトキシカルボニルプロピル、３-エト
キシカルボニルプロピル、メトキシエトキシエチル、ヒ
ドロキシエトキシエチル、ベンジルがある。
しい置換基の例には、水素、メチル、カルボキシメチ
ル、エチル、カルボキシエチル、３-スルホプロピル、
４-スルホブチル、３-カルボキシプロピル、４-カルボ
キシブチル、３-メトキシカルボニルプロピル、３-エト
キシカルボニルプロピル、メトキシエトキシエチル、ヒ
ドロキシエトキシエチル、ベンジルがある。
【００１８】親水性マーカーとして用いる場合、Ｒ2と
Ｒ3残基がＲ8 とＲ9とは異なり、例えば３-カルボキシ
プロピルまたは４-カルボキシブチル基（Ｒ2または／お
よびＲ3）および３-スルホプロピルまたは４-スルホブ
チル基（Ｒ8および／またはＲ 9）を示している非対称置
換生成物を用いるのが都合がよい。式Ｉの化合物の特に
好ましい残基は、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6および／またはＲ
10が水素であり；Ｒ3はＲ4とともにおよび／またはＲ8
はＲ7とともに（ＣＨ2）3、
Ｒ3残基がＲ8 とＲ9とは異なり、例えば３-カルボキシ
プロピルまたは４-カルボキシブチル基（Ｒ2または／お
よびＲ3）および３-スルホプロピルまたは４-スルホブ
チル基（Ｒ8および／またはＲ 9）を示している非対称置
換生成物を用いるのが都合がよい。式Ｉの化合物の特に
好ましい残基は、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6および／またはＲ
10が水素であり；Ｒ3はＲ4とともにおよび／またはＲ8
はＲ7とともに（ＣＨ2）3、
【００１９】
【化６】
【００２０】であり；Ｒ1はＲ2とともにまたはＲ9はＲ
10とともに（ＣＨ2）3であり；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9は−
ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨであ
り； そしてＲ2はＲ3とともにまたはＲ8はＲ9とともに
（ＣＨ2）4である。
10とともに（ＣＨ2）3であり；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9は−
ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨであ
り； そしてＲ2はＲ3とともにまたはＲ8はＲ9とともに
（ＣＨ2）4である。
【００２１】さらに、本発明は、式IIの本発明による蛍
光染料がカップリングした生物学的に活性な物質（複合
体）にも関する。
光染料がカップリングした生物学的に活性な物質（複合
体）にも関する。
【００２２】
【化７】
【００２３】（式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ10
は上記の意味を有し；Ｒ2’、Ｒ3’は水素、アルキル、
アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニ
ル、フェニルアルキルを表し、これらはヒドロキシ、ス
ルホニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシカルボニル
により置換されていてもよく； Ｒ2’はＲ1とともにま
たはＲ3’はＲ4とともに飽和または不飽和のＣ４または
Ｃ５架橋を形成していてもよく；Ｒ8’、Ｒ9’は水素、
アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単
位、フェニル、フェニルアルキルを表し、これらはヒド
ロキシ、スルホニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシ
カルボニルにより置換されていてもよく； Ｒ2 ’はＲ
1とともにまたはＲ3’はＲ4とともに飽和または不飽和
のＣ４またはＣ５架橋を形成していてもよく；Ｒ2’、
Ｒ3’、Ｒ8’またはＲ9’残基の少なくとも１つは、生
物学的活性物質にカップリングされた非架橋形成残基を
表し； Ｒ2’、Ｒ3’、Ｒ8 ’およびＲ 9’残基の少な
くとも１つは、アルキルにより任意に置換されていても
よい非架橋形成残基を表す。） 生物学的活性物質は、特にハプテン、抗原、抗体または
その断片、タンパク質またはモノヌクレオチドもしくは
ポリヌクレオチド（ＰＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）
であると理解される。
は上記の意味を有し；Ｒ2’、Ｒ3’は水素、アルキル、
アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニ
ル、フェニルアルキルを表し、これらはヒドロキシ、ス
ルホニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシカルボニル
により置換されていてもよく； Ｒ2’はＲ1とともにま
たはＲ3’はＲ4とともに飽和または不飽和のＣ４または
Ｃ５架橋を形成していてもよく；Ｒ8’、Ｒ9’は水素、
アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単
位、フェニル、フェニルアルキルを表し、これらはヒド
ロキシ、スルホニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシ
カルボニルにより置換されていてもよく； Ｒ2 ’はＲ
1とともにまたはＲ3’はＲ4とともに飽和または不飽和
のＣ４またはＣ５架橋を形成していてもよく；Ｒ2’、
Ｒ3’、Ｒ8’またはＲ9’残基の少なくとも１つは、生
物学的活性物質にカップリングされた非架橋形成残基を
表し； Ｒ2’、Ｒ3’、Ｒ8 ’およびＲ 9’残基の少な
くとも１つは、アルキルにより任意に置換されていても
よい非架橋形成残基を表す。） 生物学的活性物質は、特にハプテン、抗原、抗体または
その断片、タンパク質またはモノヌクレオチドもしくは
ポリヌクレオチド（ＰＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）
であると理解される。
【００２４】式Ｉの化合物は式IIIの１,３-アミノフェ
ノール類を式IVのニトロソアミノフェノール類と縮合さ
せることにより得ることができる。
ノール類を式IVのニトロソアミノフェノール類と縮合さ
せることにより得ることができる。
【００２５】
【化８】
【００２６】活性化可能な基を活性化して公知の方法に
よりカップリングの可能な基を形成し、これを生物学的
活性分子の反応性基にカップリングさせて式IIの複合体
を形成する。このプロセスにおいて、活性化基と生物学
的活性分子との間にリンカーを導入することもできる。
本発明による化合物は、それらの分光的性質（645〜700
nm範囲の吸収極大）により、カップリングの可能な吸
収染料、特にハプテン／および抗体−タンパク質複合体
での適用のため、ポリヌクレオチド標識のため、そして
ラテックス（蛍光ラテックス）の染色のための蛍光染料
に非常によく適する新規な化合物を提供する。その収量
は高く、エタノール溶液中で４０〜７０％である。
よりカップリングの可能な基を形成し、これを生物学的
活性分子の反応性基にカップリングさせて式IIの複合体
を形成する。このプロセスにおいて、活性化基と生物学
的活性分子との間にリンカーを導入することもできる。
本発明による化合物は、それらの分光的性質（645〜700
nm範囲の吸収極大）により、カップリングの可能な吸
収染料、特にハプテン／および抗体−タンパク質複合体
での適用のため、ポリヌクレオチド標識のため、そして
ラテックス（蛍光ラテックス）の染色のための蛍光染料
に非常によく適する新規な化合物を提供する。その収量
は高く、エタノール溶液中で４０〜７０％である。
【００２７】ハプテン／抗体／タンパク質またはポリヌ
クレオチド複合体での適用のために、染料が易水溶性で
ある場合が有利である。この適用のために、Ｒ2、Ｒ3、
Ｒ8、Ｒ9ができるだけ親水性である一般式Ｉの化合物を
用いることが好ましい。これらの化合物は、例えばカル
ボキシル基ならびにスルホン酸基を含有する非対称置換
生成物であるのが好まい。複合体に対するカップリング
は、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、またはＲ9残基のこれらの活性化置
換基の１つ、特にヒドロキシスクシンイミド基を介して
達成される。
クレオチド複合体での適用のために、染料が易水溶性で
ある場合が有利である。この適用のために、Ｒ2、Ｒ3、
Ｒ8、Ｒ9ができるだけ親水性である一般式Ｉの化合物を
用いることが好ましい。これらの化合物は、例えばカル
ボキシル基ならびにスルホン酸基を含有する非対称置換
生成物であるのが好まい。複合体に対するカップリング
は、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8、またはＲ9残基のこれらの活性化置
換基の１つ、特にヒドロキシスクシンイミド基を介して
達成される。
【００２８】例えば、蛍光染料とハプテン（例えばテオ
フィリン、ジゴキシン、Ｔ3、Ｔ4）またはタンパク質
（例えば抗体）との複合体が、例えば診断システム、特
に蛍光イムノアッセイにおける使用に適する。本発明の
さらに別の主題は第一免疫学的結合性物質の測定方法で
あり、該方法は、本発明の化合物の複合体を、第一物質
と同一でも異なってもよい第二免疫学的結合性物質とと
もに用い、第一物質に特異的な免疫学的結合反応により
引き起された本発明の化合物の吸光度または蛍光もしく
は蛍光偏光の変化を、試料中に含まれる測定すべき物質
の量の尺度として測定することを特徴とする。
フィリン、ジゴキシン、Ｔ3、Ｔ4）またはタンパク質
（例えば抗体）との複合体が、例えば診断システム、特
に蛍光イムノアッセイにおける使用に適する。本発明の
さらに別の主題は第一免疫学的結合性物質の測定方法で
あり、該方法は、本発明の化合物の複合体を、第一物質
と同一でも異なってもよい第二免疫学的結合性物質とと
もに用い、第一物質に特異的な免疫学的結合反応により
引き起された本発明の化合物の吸光度または蛍光もしく
は蛍光偏光の変化を、試料中に含まれる測定すべき物質
の量の尺度として測定することを特徴とする。
【００２９】本発明のさらに別の主題は本発明による複
合体のイムノアッセイのための使用である。カップリン
グの可能な式Ｉの本発明の化合物はモノヌクレオチドも
しくはポリヌクレオチドまたはＰＮＡとの複合体の製造
にも適する。したがって、本発明はこれらの複合体のＤ
ＮＡ分析のための使用にも関する。
合体のイムノアッセイのための使用である。カップリン
グの可能な式Ｉの本発明の化合物はモノヌクレオチドも
しくはポリヌクレオチドまたはＰＮＡとの複合体の製造
にも適する。したがって、本発明はこれらの複合体のＤ
ＮＡ分析のための使用にも関する。
【００３０】
実施例１ Ｉの合成 0.6 g（2.3 mmol）のγ-（７-ヒドロキシ-１,２,３,４-
テトラヒドロキノール-１-イル）酪酸エチルエステルと
0.5 g（2.4 mmol）のＮ-エチル-７-ヒドロキシ-６-ニ
トロソ-１,２,３,４-テトラヒドロキノリンを、2 mlの
2.5 M塩酸の添加後、12 mlエタノール中で還流しながら
２時間煮沸した。この溶液をロータリーエバポレーター
を用いて蒸発乾涸した。残留物をエタノールに吸収さ
せ、酸化アルミニウムによるクロマトグラフィーで前精
製した。このようにして得られた目的とする染料のエチ
ルエステルはエタノール中で653 nmに吸収極大を有して
いた。
テトラヒドロキノール-１-イル）酪酸エチルエステルと
0.5 g（2.4 mmol）のＮ-エチル-７-ヒドロキシ-６-ニ
トロソ-１,２,３,４-テトラヒドロキノリンを、2 mlの
2.5 M塩酸の添加後、12 mlエタノール中で還流しながら
２時間煮沸した。この溶液をロータリーエバポレーター
を用いて蒸発乾涸した。残留物をエタノールに吸収さ
せ、酸化アルミニウムによるクロマトグラフィーで前精
製した。このようにして得られた目的とする染料のエチ
ルエステルはエタノール中で653 nmに吸収極大を有して
いた。
【００３１】このエチルエステルを30 mlのアセトン、2
0 mlの水および1 mlの2.5 M塩酸の混合物中で還流しな
がら30分間煮沸した。精製のために、この染料をシリカ
ゲルによるクロマトグラフィー（移動相：最初にアセト
ン／クロロホルム（３：１）、次にアセトン、最後にエ
タノール）にかけた。0.5 gのＩが得られた。
0 mlの水および1 mlの2.5 M塩酸の混合物中で還流しな
がら30分間煮沸した。精製のために、この染料をシリカ
ゲルによるクロマトグラフィー（移動相：最初にアセト
ン／クロロホルム（３：１）、次にアセトン、最後にエ
タノール）にかけた。0.5 gのＩが得られた。
【００３２】
【化９】
【００３３】実施例２ オキサジン-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルII 40 mgのオキサジンＩを10 mgのＮ-ヒドロキシスクシン
イミドエステルと19 mgのジシクロへキシルカルボジイ
ミドとともに20 mlのアセトニトリルに溶解した。４時
間室温で撹拌し、生成混合物をロータリーエバポレータ
ーで処理した。その生成物を逆相シリカゲルにより精製
した。
イミドエステルと19 mgのジシクロへキシルカルボジイ
ミドとともに20 mlのアセトニトリルに溶解した。４時
間室温で撹拌し、生成混合物をロータリーエバポレータ
ーで処理した。その生成物を逆相シリカゲルにより精製
した。
【００３４】
【化１０】
【００３５】ジゴキシン-３-カルボキシメチルエーテル
−ジアミノジオキソオクタン複合物III（Dig-CME-DADO
O） ハプテン−蛍光複合体を、11 mgのＩと17.5 mgのDig-DA
DOOとをアセトニトリル中、室温で18時間反応させるこ
とにより得た。この混合物をロータリーエバポレーター
で処理し、次にシリカゲル（溶離剤クロロホルム−メタ
ノール−酢酸 3: 1 : 0 : 1）で精製した。 収量： 4 mg 分析： MSが一致
−ジアミノジオキソオクタン複合物III（Dig-CME-DADO
O） ハプテン−蛍光複合体を、11 mgのＩと17.5 mgのDig-DA
DOOとをアセトニトリル中、室温で18時間反応させるこ
とにより得た。この混合物をロータリーエバポレーター
で処理し、次にシリカゲル（溶離剤クロロホルム−メタ
ノール−酢酸 3: 1 : 0 : 1）で精製した。 収量： 4 mg 分析： MSが一致
【００３６】IIによるタンパク質の標識 10 mgのタンパク質、例えばMAB＜TSH＞を1 mlのリン酸
水素ナトリウム緩衝液（pH 8）に溶解した。500 μl の
DMSOに溶解した10倍モル過剰のIIの溶液をこれに加え
た。その反応溶液を１時間室温で振盪した。その複合体
をセファデックスG50カラム（移動相＝緩衝液）により
精製し、３回水に対して透析し、凍結乾燥した。
水素ナトリウム緩衝液（pH 8）に溶解した。500 μl の
DMSOに溶解した10倍モル過剰のIIの溶液をこれに加え
た。その反応溶液を１時間室温で振盪した。その複合体
をセファデックスG50カラム（移動相＝緩衝液）により
精製し、３回水に対して透析し、凍結乾燥した。
【００３７】
【化１１】
【００３８】実施例３活性化可能なCOOH基を有する式IV-Xのオキサジンの合成 3 mmolの置換ｍ-アミノフェノールまたはｍ-アミノアニ
ソールおよび33 mmolの６-ニトロソ-３-アミノ-フェノ
ールを20 mlのエタノールと1 mlの2.5 N塩酸の混合物に
溶解し、加熱還流した。このプロセスで起こる染料形成
は分光測定によりモニターした（650〜700 nmの範囲の
λmax）。この反応は、染料濃度が増加しなくなったと
きに止めた。
ソールおよび33 mmolの６-ニトロソ-３-アミノ-フェノ
ールを20 mlのエタノールと1 mlの2.5 N塩酸の混合物に
溶解し、加熱還流した。このプロセスで起こる染料形成
は分光測定によりモニターした（650〜700 nmの範囲の
λmax）。この反応は、染料濃度が増加しなくなったと
きに止めた。
【００３９】このようにして得られた溶液を約10 mlの
体積まで留去し、次に200 mlの10% NaBF4水溶液に滴下
した。この染料テトラフルオロホウ酸エステルはこのプ
ロセスで完全に沈殿した。上清をデカントし、濾過した
後、残留物を100 mlのジクロロメタンに吸収させ、この
溶液を３回それぞれ100 mlの水で洗浄した。溶液をNa2S
O4で乾燥し、ロータリーエバポレーターで処理した。こ
のプロセスで染料は粘性のあるほぼ黒色のオイルとして
蓄積した。収率： 40〜60 %。
体積まで留去し、次に200 mlの10% NaBF4水溶液に滴下
した。この染料テトラフルオロホウ酸エステルはこのプ
ロセスで完全に沈殿した。上清をデカントし、濾過した
後、残留物を100 mlのジクロロメタンに吸収させ、この
溶液を３回それぞれ100 mlの水で洗浄した。溶液をNa2S
O4で乾燥し、ロータリーエバポレーターで処理した。こ
のプロセスで染料は粘性のあるほぼ黒色のオイルとして
蓄積した。収率： 40〜60 %。
【００４０】加水分解：この粗染料（エチルエステル）
を30 mlのアセトン、15 mlの水および1 mlの2.5 N塩酸
の混合物に溶解し、加熱還流した。その加水分解は薄層
クロマトグラフィー（シリカゲル、MeOH/H2O 3 : 1）に
よりモニターした。ほとんど完全な反応後に反応溶液を
約30℃でロータリーエバポレーターで処理し、残留物を
クロマトグラフィーで精製した。
を30 mlのアセトン、15 mlの水および1 mlの2.5 N塩酸
の混合物に溶解し、加熱還流した。その加水分解は薄層
クロマトグラフィー（シリカゲル、MeOH/H2O 3 : 1）に
よりモニターした。ほとんど完全な反応後に反応溶液を
約30℃でロータリーエバポレーターで処理し、残留物を
クロマトグラフィーで精製した。
【００４１】 反応時間 加水分解の時間 精製 λmax. EtOH IV 1.5時間 7時間 −− 660 Ｖ 70分 9時間 シリカゲルＭＳ 650 ＝クロロホルム/EtOH VI 75分 9時間 シリカゲルＭＳ 649 ＝クロロホルム/EtOH VII 40分 10時間 シリカゲルＭＳ 672 ＝クロロホルム/EtOH VIII 90分 48時間 シリカゲルＭＳ 682 ＝クロロホルム/EtOH IX 3時間 24時間 シリカゲルＭＳ 673 ＝クロロホルム/EtOH Ｘ 60分 24時間 シリカゲルＭＳ 672 ＝クロロホルム/EtOH
【００４２】
【化１２】
【００４３】
【化１３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール−ハインツ ドレクサーゲ ドイツ連邦共和国 ディー−57076 シー ゲン，シャンツェンヴェーク 50番地 (72)発明者 ニコラス−ヨセフ マルクス オランダ国 エヌエル−57399 キルシュ ヒュンデム，ヴァルステ 78番地
Claims (14)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ10は水素、アル
キル、ヒドロキシ、ハロゲン、カルボキシル、スルホニ
ルまたはアミノを表し；Ｒ2、Ｒ3は水素、アルキル、ア
ルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニル、
フェニルアルキルを表し、これらはヒドロキシ、スルホ
ニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシカルボニルによ
り置換されてもよく； Ｒ2はＲ1とともにまたはＲ3は
Ｒ4とともに飽和または不飽和のＣ２またはＣ３架橋を
形成していてもよく、またはＲ2はＲ3とともに飽和また
は不飽和のＣ４またはＣ５架橋を形成していてもよく；
Ｒ8、Ｒ9は水素、アルキル、アルコキシ、ポリオキシヒ
ドロカルビル単位、フェニル、フェニルアルキルを表
し、これらはヒドロキシ、スルホニル、カルボキシ、ア
ミノ、アルコキシカルボニルにより置換されていてもよ
く； Ｒ8はＲ7とともにまたはＲ9はＲ10とともに飽和
または不飽和のＣ２またはＣ３架橋を形成していてもよ
く、またはＲ8はＲ9とともに飽和または不飽和のＣ４ま
たはＣ５架橋を形成していてもよく；そしてＲ2、Ｒ3、
Ｒ8、Ｒ9残基の少なくとも１つは、カップリングの可能
な活性化基またはカップリングするように活性化の可能
な基によりさらに置換されている非架橋形成残基を表
し；そしてＲ2、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ9残基の少なくとも１つ
は、アルキルにより任意に置換されていてもよい架橋形
成残基を表す。）で示されるオキサジン誘導体。 - 【請求項２】 Ｒ3はＲ4とともにおよび／またはＲ7は
Ｒ8とともに飽和または不飽和のＣ３架橋を形成してい
る請求項１に記載のオキサジン誘導体。 - 【請求項３】 Ｒ2および／またはＲ9は非架橋形成置換
基を表し、さらにそのうちの少なくとも１つは、カップ
リングの可能な活性化基またはカップリングするように
活性化の可能な基により置換されている請求項１または
２に記載のオキサジン誘導体。 - 【請求項４】 非架橋形成置換基が、活性化の可能な基
または活性化基により置換されているアルキル残基を表
す請求項３に記載のオキサジン誘導体。 - 【請求項５】 前記の活性化の可能な基がカルボン酸基
またはスルホン酸基を表すか、または前記の活性化基が
酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物またはＮ-ヒド
ロキシスクシンイミドエステルを表す請求項３または４
に記載のオキサジン誘導体。 - 【請求項６】 一般式（II）： 【化２】 （式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ10は水素、
アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、カルボキシル、スル
ホニルまたはアミノを表し；Ｒ2’、Ｒ3’は水素、アル
キル、アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単位、フ
ェニル、フェニルアルキルを表し、これらはヒドロキ
シ、スルホニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシカル
ボニルにより置換されてもよく； Ｒ2’はＲ1とともに
またはＲ3 ’はＲ4とともに飽和または不飽和のＣ２ま
たはＣ３架橋を形成していてもよく、またはＲ2’は
Ｒ3’とともに飽和または不飽和のＣ４またはＣ５架橋
を形成していてもよく；Ｒ8’、Ｒ9’は水素、アルキ
ル、アルコキシ、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェ
ニル、フェニルアルキルを表し、これらはヒドロキシ、
スルホニル、カルボキシ、アミノ、アルコキシカルボニ
ルにより置換されていてもよく； Ｒ8’はＲ7とともに
またはＲ9’はＲ10とともに飽和または不飽和のＣ３架
橋を形成していてもよく、またはＲ8’はＲ9’とともに
飽和または不飽和のＣ４またはＣ５架橋を形成していて
もよく；Ｒ2’、Ｒ3’、Ｒ8’またはＲ9’残基の少なく
とも１つは、生物学的活性基でさらに置換されている非
架橋形成残基を表し；そしてＲ2’、Ｒ3’、Ｒ8’、
Ｒ9’残基の少なくとも１つは、アルキルにより任意に
置換されていてもよい架橋形成残基を表す。）で示され
るオキサジン染料複合体。 - 【請求項７】 Ｒ3’はＲ4とともにおよび／またはＲ7
はＲ8’とともに飽和または不飽和のＣ３架橋を形成し
ている請求項６に記載のオキサジン複合体。 - 【請求項８】 Ｒ2’および／またはＲ9’は、少なくと
も１つの置換基が生物学的活性基により置換されている
非架橋形成置換基を表す請求項６または７に記載のオキ
サジン複合体。 - 【請求項９】 前記の生物学的活性基がハプテン、抗
原、抗体またはタンパク質である請求項６〜８のいずれ
か一項に記載のオキサジン複合体。 - 【請求項１０】 前記の生物学的活性基がモノヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチドである請求項６〜８のいず
れか一項に記載のオキサジン複合体。 - 【請求項１１】 第一免疫学的結合性物質の測定方法で
あって、請求項９に記載の複合体を、その第一物質と同
一でも異なってもよい第二免疫学的結合性物質とともに
用い、第一物質に特異的な免疫学的結合反応により引き
起された本発明の化合物の吸光度または蛍光もしくは蛍
光偏光の変化を、試料中に含まれる測定すべき物質の量
の尺度として測定する前記測定方法。 - 【請求項１２】 請求項９に記載の複合体のイムノアッ
セイのための使用。 - 【請求項１３】 請求項１０に記載の複合体のＤＮＡ分
析のための使用。 - 【請求項１４】 一般式（III）： 【化３】 で示される１,３-アミノフェノール類を、一般式（I
V）： 【化４】 で示されるニトロソアミノフェノール類と縮合する、請
求項１に記載の一般式（Ｉ）で示されるオキサジン誘導
体の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19521231:2 | 1995-06-10 | ||
| DE19521231A DE19521231A1 (de) | 1995-06-10 | 1995-06-10 | Neue Oxazinfarbstoffe und ihre Verwendung als Fluoreszenzmarker |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH093343A true JPH093343A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=7764113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8147691A Pending JPH093343A (ja) | 1995-06-10 | 1996-06-10 | 新規なオキサジン染料およびその染料の蛍光マーカーとしての使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030224421A1 (ja) |
| EP (1) | EP0747447B1 (ja) |
| JP (1) | JPH093343A (ja) |
| DE (2) | DE19521231A1 (ja) |
| ES (1) | ES2161945T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004508448A (ja) * | 2000-09-06 | 2004-03-18 | エボテック・オーアーイー・アーゲー | オキサジン誘導体 |
| JP2007502798A (ja) * | 2003-08-18 | 2007-02-15 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 近赤外線造影剤に適する３ｈ−フェノキサジン誘導体、その製造法および使用 |
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|---|---|---|---|---|
| GB9602265D0 (en) * | 1996-02-05 | 1996-04-03 | Amersham Int Plc | Benzophenoxazine dyes |
| GB9716476D0 (en) * | 1997-08-04 | 1997-10-08 | Amersham Int Plc | Dye intermediate and method |
| DE19923168A1 (de) | 1999-05-20 | 2000-11-23 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Fluoreszenzfarbstoffe und ihre Verwendung als Fluoreszenzmarker |
| EP1213328A1 (de) * | 2000-12-08 | 2002-06-12 | Evotec OAI AG | Oxazinderivate |
| DE10212960A1 (de) * | 2002-03-22 | 2003-10-23 | Gnothis Holding Sa Ecublens | Verwendung von Oxazin-Farbstoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse |
| EP2284278A1 (en) | 2003-04-04 | 2011-02-16 | Roche Diagnostics GmbH | Improved system for multi color real time PCR |
| DE10329860A1 (de) * | 2003-07-02 | 2005-01-20 | Atto-Tec Gmbh | Sulfonamidderivate polycyclischer Farbstoffe für analytische Anwendungen |
| ATE406462T1 (de) * | 2004-08-18 | 2008-09-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur messung einer nukleinsäureamplifikation in real time beinhaltend die positionierung eines reaktionsgefässes relativ zu einer detektionseinheit |
| EP1674580A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for identifying activators and/or inhibitors of enzyme activity |
| EP1936377B1 (en) | 2006-12-21 | 2014-02-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for detection of cAMP and cGMP |
| US7910087B2 (en) | 2007-03-02 | 2011-03-22 | University Of Massachusetts | Luciferins |
| US20080299592A1 (en) * | 2007-03-02 | 2008-12-04 | Miller Stephen C | Red-Shifted Luciferase |
| JP2008222084A (ja) * | 2007-03-14 | 2008-09-25 | Yamaha Motor Electronics Co Ltd | 電動ゴルフカーのブレーキ劣化検出方法及びこれを用いた電動ゴルフカー |
| US20120010404A1 (en) * | 2008-06-10 | 2012-01-12 | Sigma-Aldrich Co. | Oxazine dyes with improved aqueous solubility |
| EP2876166B1 (en) | 2013-11-20 | 2016-12-14 | Roche Diagnostics GmbH | New compound for sequencing by synthesis |
| EP3562845A2 (en) | 2016-12-27 | 2019-11-06 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Novel biotin-specific monoclonal antibody and use thereof |
| US20230278968A1 (en) * | 2022-02-16 | 2023-09-07 | Promega Corporation | Oxazine dyes and their use in nucleic acid amplification reactions |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4714763A (en) * | 1985-07-11 | 1987-12-22 | Viomedics Inc. | Novel oxazine-ureas and thiazine urea chromophors as fluorescent labels |
| US5149807A (en) * | 1991-09-18 | 1992-09-22 | The United States Of America, As Represented By The United States Department Of Energy | Oxazine laser dyes |
| DE4137934A1 (de) * | 1991-11-18 | 1993-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue pentacyklische verbindungen und ihre verwendung als absorptions- oder fluoreszenzfarbstoffe |
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| DE4302459A1 (de) * | 1993-01-29 | 1994-08-04 | Bayer Ag | Sulfocumarinhaltige Nukleotide und deren Verwendung in Nachweisverfahren für Nukleinsäuren |
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1995
- 1995-06-10 DE DE19521231A patent/DE19521231A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-06-06 DE DE59607483T patent/DE59607483D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 ES ES96109101T patent/ES2161945T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 EP EP96109101A patent/EP0747447B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-10 JP JP8147691A patent/JPH093343A/ja active Pending
-
2003
- 2003-04-03 US US10/407,768 patent/US20030224421A1/en not_active Abandoned
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|---|---|---|---|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2161945T3 (es) | 2001-12-16 |
| US20030224421A1 (en) | 2003-12-04 |
| EP0747447A3 (de) | 1997-06-18 |
| DE19521231A1 (de) | 1996-12-12 |
| DE59607483D1 (de) | 2001-09-20 |
| EP0747447B1 (de) | 2001-08-16 |
| EP0747447A2 (de) | 1996-12-11 |
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