CS273617B2 - Method of resorufine's derivatives production - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových derivátů resorufinu, které mohou jakožto fluorescenčně značené nízkomolekulární a vysokomolekulámí sloučeniny nacházet mnohostranné použití.

Fluoreskující sloučeniny nacházejí na základě své schopnosti vysílat po aktivaci světlem určité vlnové délky, široké použití jako značkující sloučeniny v chemických a biologických postupech, jako například v klinické analytice, avšak také ve stále větším počtu nových oblastí. V biochemii nacházejí fluorescenční barviva jako vysoce citlivé značkovací látky rostoucí použití. Přitom se používá jak sloučenin z fluorescenčních barviv s nízkomolekulárními tak i vysocemolekulárními látkami. Jako příklady pro široký rozsah použití takovýchto fluorescenčních konjugátů lze uvést:

Fluorescenční imunoanalýzu, pro kterou se používá bu5 hapten, antigén nebo specifická protilátka značená fluorescenčním barvivém. Specifickou vazbou protilátky na hapten nebo antigén lze pomocí různých postupů stanovit koncentraci těchto látek nebo protilátky.

V imunofluorescenční mikroskopii se antigeny, jako například celé buňky nebo bílkoviny stávají pod mikroskopem působením fluorescenčně značených protilátek viditelnými (srov. Wang a další, Meth. Enzymology 85, 514 a další).

Rovněž tak je možno přímo pozorovat rozdělení haptenu nebo antigénu v buňce, jestliže se do buňky přivede příslušná sloučenina fluorescenčně značená a sleduje se pod mikroskopem.

Fluorescenčně značené částice latexu nacházejí použití při třídění buněk v Fluoreocent Activated Cell Sorter (FAC3).

Nikoli v poslední řadě slouží látky nesoucí fluorescenční značení ke stanovení a měření aktivity enzymů,

Kompetltivní imunoanalýzy jsou založeny na konkurenci mezi ligandem, který se má stanovit ve vzorku, a značeným a ve známé koncentraci přítomným ligandem, týkající se známého, avšak omezeného počtu vazebných míst ligandů na protilátky, které jsou specifické jak pro určované tak i pro značené ligandy. Koncentrace určovaného ligandu ve vzorku je rozhodující pro to, kolik značených molekul je vázáno na protilátky. Koncentrace komplexů sestávajících z protilátek a fluorescenčně značených ligandů je možno zjistit spektroskopickými metodami. Tato koncentrace je obráceně proporcionální vůči určované koncentraci ligandu, který se nachází ve vzorku. Jako značených ligandů, které se přidávají ke vzorku se stanovovanými ligandy ve známé koncentraci, se původně převážně používalo ligandů značených radioisotopy. Vzhledem ke známým nevýhodám značení radioisotopy nabývá značení fluoreskujícími sloučeninami na stále větším významu. Fluoreskující sloučeniny se přitom vážou na molekuly stanovované látky. Tyto konjugáty se pak mohou používat principiálně pro nejrúznější fluorescenční imunoanalýzy, jako je například fluorescenční polarisační imunoanalýza, fluorescenční Imunoanalýza s řízeným zastavením reakce nebo fluorescenční imunoanalýza s použitím pomocných prostředků.

Jako značkovací látky se hodí principiálně všechna fluorescenční barviva, která mají vysoký koeficient extinkce a vysoký kvantový výtěžek, jakož i dostatečnou stabilitu za podmínek, při kterých se test provádí. Dosud se tudíž obvykle používalo fluoresceinu nebo derivátů fluoresceinu (J. Landon and R. S, Kamel v: Immunoassays 80s, Univ. Park Press, Baltimore, Md., 1980, str. 91 až 112). Fluoresceinem nebo jeho deriváty značené vysokomolekulámí nebo nízkomolekulární sloučeniny mají však různé nevýhody. Absorpční a emisní maxima látek značených fluoresceinem se pohybují ve vlnovém rozsahu mezi 490 a 520 nm. Vzhledem lc tomu, že značná část analytických metod, především fluorescenční imunoanalýzy, se provádějí v tělních tekutinách, jako například v séru, dochází v uvedeném spektrálním rozsahu k poruchám vlastní fluorescencí biologického materiálu ve vzorku. Zejména pak je to v důsledku bilirubinu, který rovněž absorbuje světlo v rozsahu vlnových délek kolem 500 nm a emituje fluorescenci.

Mnohá měřicí zařízení vyžadují značící látky s pokud možno velkým Stokesovým posunem. U derivátů fluoresceinu činí tento posun nejvýše 30 nm. To vede k problémům s rozptylem světla, což ovlivňuje citlivost fluorescenčního měření, Pro takovéto případy by byly žádoucí sloučeniny s větším Stokesovým posunem, než jaký mají deriváty fluoresceinu.

Úkolem předloženého vynálezu bylo tudíž připravit sloučeniny, které by neměly uvedené nevýhody. Tento úkol byl vyřešen nalezením nových derivátů resorufinu.

Předmětem předloženého vynálezu je tudíž způsob výroby derivátů reBorufinu obecných vzorců Ia a Ib

(Ia)

(Ib) ve kterých

R*· znamená atom vodíku nebo atom halogenu, o

R znamená atom vodíku nebo atom halogenu,

R znamená atom vodíku, atom halogenu nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku,

R^ znamená atom vodíku,,atom halogenu nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, c

Fr znamená atom vodíku, nebo

4-5

R a R mohou společné tvořit anelovany benzenový kruh, _M 12

Z znamená můstkový člen vytvořený ze zbytků X a X , přičemž

X znamena karbonylovou skupinu, spojenou s atomem halogenu, s aminoskupinou, která je popřípadě substituována jedním nebo dvěma alkylovými zbytky s 1 až 5 atomy uhlíku, s piperazinovým zbytkem nebo piperidinovým zbytkem, přičemž alkylové zbytky jakož i piperidinový zbytek mohou být substituovány karboxylovou skupinou esterifikovanou lí-hydroxysukcinimidem, nebo s alkylovou skupinou s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou ekupinou esterifikovanou N-hydroxysukcinimidem, a

X znamená karbonylovou skupinu, která je substituována zbytkem 15-oxysukcinimidu nebo alkylovým 2bytkem s 1 až 5 atomy uhlíku, který opět nese karboxylovou skupinu esterifikovanou K-hydroxysukcinimidem, nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifikovanou lí-hydroxysukcinimidem, nebo znamená aminoskupinu nebo hydroxyskupinu, a

A znamená zbytek ligandu zvoleného ze souboru, který je tvořen haptenem, antigenem, protilátkou, substrátem, nosičem a od nich odvozenými sloučeninami a n znamená celé číslo od 1 do 200.

Alkylové skupiny ve významu substituentů íP a R'¹’’ obsahují uhlovodíkové řetězce s až 3 atomy uhlíku. Zvláště výhodnými jsou methylová skupina a ethylová skupina, popřípadě methoxyskupina a ethoxyskupina.

Halogenem ve významu substituentů r\ R², R^ a R^ je fluor, chlor, brom nebo jod.

Zvláště výhodnými jsou chlor a brom.

Můstkový člen Z se tvoří obvyklými edičními popřípadě kondenzačními reakcemi mezi reaktivním substituentem X základního skeletu resorufinu a reaktivní skupinou X ligandu popřípadě analogu ligandu.

V následující tabuloe 1 jsou uvedeny příklady možných významů takovýchto substi12 tuentů X a X , jakož i můstkový člen Z, vzniklý při této reakci.

Tabulka 1:

Nekteré významy reaktivních skupin X a X , jakož i můstkového členu Z, který z nich vzniká

-COOH _NH₂

-COOT^X ’ -NH₂

-CONH-C01JHCS 273617 B2

Tabulka 1 - pokračování

X¹ X² Z

-COOCOgT¹ ,xx

-NH,

-NCO

-NCS

-NH,

-NH,

-CONH-NHCONH-NHCSNHCl

-NH,

-^m-\a

NH-CHO

-NH,

-CH=N-CO-H /

oot’

-NH,

-co-n; }—co-nhx

T znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku nebo elektronegativní aktivovanou esterovou skupinu, jako například N-hydroxysukcinimidoesterovou skupinu xx ,

T^A znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku.

Ligandem ve významu symbolu A se rozumí hapteny, antigený, protilátky, substráty, jakož i nosiče á od nich odvozené sloučeniny.

Haptenem se ve smyslu tohoto vynálezu rozumí látka s nižší molekulovou hmotností, která sama o sobě není zpravidla schopna tvořit protilátky. Jako látky s nižší molekulovou hmotností se označují sloučeniny 3 molekulovou hmotností od asi 100 do asi 2000. Jako příklady takových látek lze uvéet fyziologicky aktivní látky, které jsou přítomny v organismu savců nebo lidí, jakož i jejich metabolity nebo léčiva, která se podávají zvířatům nebo lidem, jakož i jejich metabolity. Pojmem hapten se však mohou rozumět také další nízkomolekulární sloučeniny, pokud tyto sloučeniny mají molekulovou hmotnost pouze ve shora uvedeném rozmezí. Jako příklady možných haptenů lze uvést aminy, steroidy, hormony, glycidy, peptidy, oligonukleotidy, jejich kombinace atd.

Antigený jsou vysocemolekulární sloučeniny. Antigený mají obvykle schopnost tvořit v organismu, který byl jimi pšetřen, protilátky. Ve smyslu tohoto vynálezu jsou vysokomolekulárními sloučeninami takové sloučeniny, které mají molekulovou hmotnost alespoň 2000, výhodně však takové sloučeniny, které mají molekulovou hmotnost alespoň asi 5000. láolekulová hmotnost takovýchto sloučenin nemůže být směrem nahoru omezena. Kůže činit až hodnot 20 milionů, avšak může být ještě i nad touto molekulovou hmotností. Antigeny, které se mohou vyskytovat jako ligandy ve sloučeninách obecného vzorce Ia/Ib, jsou představovány bílkovinami, nukleinovými kyselinami, polysacharidy, kombinacemi těchto látek nebo dalšími vysoce molekulárními látkami. Ve smyslu tohoto vynálezu se pojmem antigen rozumí všechny vysokomolekulární sloučeniny, které mají minimální molekulovou hmotnost alespoň asi 2000,

Protilátky jsou představovány všemi těmi bílkovinami nebo glykoproteiny, které a antigeny nebo hapteny, jakož i se sloučeninami, které jsou od nich odvozeny, specificky reagují a tvoří s nimi komplex. Podle vynálezu se mohou jako ligandy používat ve sloučeninách obecného vzorce Ia/Ib intaktní protilátky nebo také jejich fragmenty. Také tyto fragmenty se mohou podle vynálezu označovat jako protilátky pokud mají schopnost vázat antigeny, hapteny a od nich odvozené sloučeniny.

Substráty se rozumí sloučeniny, které v chemické reakci zůstávají bez prokazatelné změny. Tak například se mohou těmito substráty rozumět všechny ty sloučeniny nebo od nich odvozené látky, na které působí enzymy, jako jsou například aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, glykosidy, oligosacharidy nebo polysacharidy, nukleotidy, nukleinové kyseliny, kombinace těchto látek nebo další enzymaticky změnitelné látky.

Kosici mohou být přirozeně se vyskytující nebo syntetické, zesítené nebo nezesítěné materiály a určitou formou nebo bez určité formy. Rozumí se jimi jednotlivé sloučeniny nebo směsi sloučenin. Jako nosiče se mohou používat například sloučeniny nebo směsi sloučenin, jako jsou polysacharidy, nukleinové kyseliny, peptidy, bílkoviny, kom binace těchto látek nebo také klovatina, lignin, sklo, uhlí, syntetické adiční nebo kondenzační polymery, jako polystyren, polyakryl, vinylové sloučeniny, polyestery, polyethery a polyamidy nebo také komplexní útvary, jako částice latexu, vesikel, liposomy, části buněčných stěn nebo dokonce celé buňky.

Sloučenina odvozená od určitého ligandu se označuje jako analogon ligandu. Analogonem ligandu se rozumí látka, která se strukturně nepatrně liší od původního ligandu, avšak, pokud se jejich vlastností týká, pak mezi nimi neexistuje žádný podstatný rozdíl, Rozdíl může spočívat například v přídavném substituentu nebo v chybějící části mo lekuly.

Zásadně se mohou k tvorbě sloučenin obecného vzorce Ia nebo Ib podle vynálezu po užívat všechny ligandy, které obsahují volné aminoskupiny, hydroxylové skupiny, merkap to skupiny nebo karboxylové skupiny, přes které se mohou ligandy vázat se základním skeletem resorufinu. Zvláště výhodnými jsou volné aminoskupiny nebo karboxylové skupiny. Volnými aminoskupinami se rozumí jak primární tak i sekundární aminoskupiny. Kemají-li ligandy žádné vhodné skupiny, pak se musí takové skupiny zavést syntetickou cestou, jako například aminoskupiny nebo karboxylové skupiny. Dále je možné, popřípadě přítomná, nereaktivní funkční skupiny takových ligandů chemicky aktivovat. Vzhledem k tomu, že takto vzniklé látky nejsou s původními sloučeninami již zcela shodné, hovoří se o analozích ligandu.

Číslo n udává, kolik molekul resorufinu je vázáno na jeden ligand nebo na jeden analog ligandu. Toto číslo závisí na počtu reaktivních skupin v odpovídajícím ligandu nebo analogonu ligandu. Čím více reaktivních skupin ligand nebo analogon ligandu má, tím více molekul resorufinu se může vázat. Číslo n činí obvykle 1 až 200, zvláště výhodně 1 až 100.

Podle tohoto vynálezu se slpučeniny obecných vzorců Ia a Ib připravují tím, že se na sloučeniny obecných vzorců Ila a Hb

ve kterých

R*·, R², r\ R²* a R^ mají významy uvedené pod obecným vzorcem Ia a Ib, a

X¹ znamená karhonylovou skupinu spojenou s atomem halogenu, s aminoskupinou, která je popřípadě substituována jedním nebo dvěma alkylovými zbytky s 1 až 5 atomy uhlíku, s piperazinovým zbytkem nebo piperidinovým zbytkem, přičemž alkylové zbytky jakož i piperidinový zbytek mohou být substituovány karboxylovou skupinou esterifikovanou R-hydroxysukcinimidem, nebo s alkylovou sku pinou s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifikovanou N-hydroxysukcini midem, působí ligandem obecného vzorce III

X² - A (III) ve kterém

A znamená zbytek ligandu zvoleného ze souboru, který je tvořen haptenem, antigenem, protilátkou, substrátem, nosičem a od nich odvozenými sloučeninami, a ρ

X znamená karbonylovou skupinu, která je substituována zbytkem

N-oxysukcinimidu nebo alkylovým zbytkem s 1 až 5 atomy uhlíku, který opět nese karboxylovou skupinu esterifikovanou N-hydroxysukcinimldem, nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifikovanou iŤ-hydroxysukcinimidem, nebo znamená aminoskupinu nebo hydroxyskupinu.

„, , 12 Příklady reaktivních skupin jsou uvedeny v tabulce 1 pod symbolem X a X „ Tyto skupiny jsou samozřejmě navzájem vyměnitelné.

Sloučeniny obecného vzorce Ila a obecného vzorce lib se získávají výhodným způso-

bem z derivátů nitroresorcinu obecného vzorce V
rK	R5	-NO-
	' 2	(V)
HO	r3	XOH

ve kterém

4-5

R , lr a Ir mají význam uvedený shora, reakcí s deriváty resorcinu obecného vzorce VI

(VI) ve kterém 112 a , R a R mají shora uvedeny význam, _{w w} 1 _v 2 přičemž X múze mít také význam shora uvedeného substituentu X s tím, že v 12* při téže reakci je význam substituentů X a X navzájem různý.

Reakce sloučenin obecného vzorce V s deriváty resorcinu obecného vzorce VI se provádí účelně v přítomnosti oxidu manganičitého a kyseliny sírové při nízkých teplotách. Při reakci vznikají nejdříve deriváty resazurlnu, které se dají snadno převést na deriváty resorufinu obecného vzorce Ila a lib.

Reakce sloučenin obecného vzorce V se sloučeninami obecného vzorce VI se provádí obvykle při teplotách mezi -10 a’50 °C, výhodně při teplotách mezi 0 a 30 °C. Zvláště šetrně probíhá reakce, jestliže se sloučeniny obecného vzorce V a obecného vzorce VI smísí' při teplotě asi 0 °C a reakční směs se pak nechá zahřát na teplotu místnosti. KonCS 273617 B2 centrace oxidu manganičitého má činit účelně 0,5 až 5, výhodně 1 až 2 mol/litr, Koncentrace kyseliny sírové by měla činit 0,5 až 5, výhodně 1 až 3 mol/litr.

Redukce zprvu vzniklých derivátů resazurinu na resorufiny obecných vzorců Ha a lib se provádí výhodně v amoniakálním roztoku zinkovým prachem (srov. Nietzki a další, Ber. Dtech. Chem. Ges. 22, 3020 /1889/) nebo natriumborhydridem. Jako rozpouštědla se používá účelně směsí vody a alkoholu, výhodně směsi sestávající z 1 dílu vody a O až 4 dílů methanolu. Na 1 mol redukované sloučeniny se přidává 1 až 20, výhodně 1 až 5 mol zinkového prachu., popřípadě natriumborhydridu. Teplota reakčního roztoku se přitom udržuje na -10 až +35 °C, výhodně na +5 až +10 °C. Přesné dodržování teplotního rozsahu se ukázalo jako nutným opatřením pro jednoznačný průběh reakce. Bez chlazení vede exotherm ní reakce k vedlejším produktům, které lze těžko oddělit.

Za zvolených mírných podmínek probíhá reakce mezi látkami obecného vzorce V a obec ného vzorce VI jednoznačně a s dobrým výtěžkem. Zvolený způsob syntézy je ovšem schopen obměn. To otevírá zejména a ohledem na přípravu nesymetricky substituovaných derivátů resorufinu četné možnosti syntézy. V důsledku tohoto mimořádně variabilního způsobu výroby je dostupná celá řada sloučenin značených resorufinem, které svými rozdílnými substituenty v různých polohách chromóforu otevírají široký rozsah barev.

Před reakcí derivátů resorufinu obecných vzorců Ha a lib se sloučeninami obecného vzorce III se sloučeniny obecných vzorců Ha a lib převádějí účelně na deriváty triacyl dihydroresorufinu obecného vzorce VII ve kterém

R⁶ znamená alkylovou skupinu, arylovou skupinu nebo aralkylovou skupinu.

Alkylovou skupinou ve významu substituentu R^ je alkylová skupina s 1 až 5 atomy uhlíku, výhodně s 1 až 3 atomy uhlíku. Zvláště výhodnou je methylová skupina a ethylová skupina. Jako arylová skupina je zvláště výhodná fenylová skupina. Aralkylová skupina obsahuje výhodně jako arylovou část fenylovou skupinu, zatímco alkylová část obsahuje 1 až 5 atomů uhlíku, výhodně 1 až 3 atomy uhlíku. Jako aralkylová skupina je zvláště výhodná benzylová skupina.

Za účelem výroby triacylderivátů obecného vzorce VII se odpovídající deriváty resorufinu obecných vzorců Ila a lib nejdříve elektrochemicky redukují pomocí silného re9 dukčního činidla, jako například chloridu oínatého něho octanu chromnatého, Za účelem redukce ae zahřívá derivát resorufinu 10 minut až jednu hodinu se 2 až 10, výhodně se 2 až 6 ekvivalenty redukčního činidla ve vhodném rozpouštědle, výhodně s chloridem cínatým v 5 až 35% vodné chlorovodíkové kyselině. Při ochlazení se vyloučí dihydroderivát. Acylace se provádí obvyklým způsobem působením vhodného acylačního činidla, například acetanbydridu, benzoylchloridu atd. Výhodně se sloučeniny obecného vzorce VII vyrábějí postupem prováděným v jediné reakční nádobě redukční acylací derivátů resorufinu obecného vzorce Ha a lib. Odpovídající derivát resorufinu se pro tyto účely zahřívá se 2 až 6 ekvivalenty redukčního činidla po dobu 5 minut až 3 hodin za přítomnosti acylačního činidla ve vhodném rozpouštědle k varu pod zpětným chladičem nebo při teplotě místnosti po dobu 4 až 16 hodin.

V takto získaných derivátech triacyldihydroresorufinu obecného vzorce VII lze přeměnit reaktivní skupinu X¹ před další reakcí popřípadě na jinou reaktivní skupinu. Zejména, jestliže X^ znamená karboxylovou skupinu, je účelné převést tuto skupinu na chlorid karboxylové kyseliny, na anhydrid karboxylové kyseliny nebo na reaktivní esterovou funkci. To lze provádět nejrůznějaími způsoby, například působením karbodiimidů, alkoholů, halogenidů, N-hydroxysukcinimidu atd. Odborníkovi jsou v tomto směru k dispozici četné postupy známé z literatury. Zvláště výhodné je převedení funkce karboxylové kyseliny na chlorid karboxylové kyseliny, například působením směsi thionylchloridu a dimethylformamidu nebo směsi oxalylchloridu a dimethylformamidu, jakož i na aktivovaný eater, například na N-hydroxysukcinimidester.

Obsahuje-li ligand nebo analog ligandu volnou aminoskupinu, hydroxylovou skupinu nebo merkaptoskupinu, pak mohou tyto ligandy reagovat jako reaktivní skuoiny X . Ligan„, ' „ 2 , č dy popřípadě analoga ligand vzorce X -A pak mohou přímo reagovat se sloučeninami obecného vzorce Ha a Hb, popřípadě po předchozí přeměně na deriváty triacyldihydroresorufinu nebo/a po aktivaci skupiny X^ za vzniku amidů, esterů nebo thioesterú. Na základě své stability se za zvláště výhodný pokládá vznik alespoň jedné amidové vazby, přičemž se za účelem jejího vzniku vychází výhodně ze sloučenin obecných vzorců Ha/IIb popřípadě VII, ve kterých X^ znamená halogenid karboxylové kyseliny. Jeho reakce s ligandem, který obsahuje aminoskupinu, popřípadě s analogonem ligandu, který obsahuje aminoskupinu, se provádí podle obvyklých metod, například v organickém rozpouštědle, jako v dichlormethanu, za přídavku terciárního aminu, jako triethylaminu, jako báze. Vždy podle velikosti ligandu popřípadě analogonu ligandu a s tím souvisejícím počtem jeho volných aminoskupin a podle použitého množství sloučenin obecných vzorců Ha/IIb se může na jednu molekulu ligandu popřípadě na jednu molekulu analogonu ligandu vázat několik chromoforú.

Použijí-li se k výrobě sloučenin obecných vzorců Ia a Ib podle vynálezu triacylderiváty obecného vzorce VII, pak se musí po reakci acylové zbytky části dihydroresorufinu, které byly použity jako chránící skupiny, selektivně odštěpit a výsledný zbytek leukobarviva se oxiduje na chromofor sloučeniny obecného vzorce Ia/Ib.

0-acylové zbytky části dihydroresorufinu se odštěpují zvláště výhodně reakcí se 2 až 10 mol, výhodně se 2 až 4 mol siřičltanu sodného, ve směsi vody a rozpouštědla, které je rozpustné ve vodě, jako 1,4-dioxanu, methanolu nebo ethanolu, výhodně ve směsi vody a 1,4-dioxanu v poměru 1 : 1. Reakční teplota činí 20 až 100 °C, výhodně 80 až 100 °C. Za těchto reakčnich podmínek se dají deriváty N-acyldihydroresorufinu vyrábět ve vysokých výtěžcích.

Oxidace části dihydroresorufinu na sloučeniny obecných vzorců Ia a Ib se může provádět působením mírných oxidačních činidel. Výhodně se používá hexakyanoželezitanu draselného, který je přítomen ve dvojnásobném až šestinásobném molárnim nadbytku, zvláště výhodně ve dvojnásobném až čtyřnásobném molárnim nadbytku vůči leukobarvivu ve směsi vody a rozpouštědla, které je mísitelné s vodou, jako je 1,4-dioxan, methanol nebo ethanol, výhodně ve směai vody a methanolu v poměru 3 : 1. Reakce se výhodně provádí v přítomnosti pomocné báze, jako hydrogenuhličitanu sodného nebo uhličitanu sodného. Reakční teplota činí 10 až 40 °C, výhodně pak se pracuje při teplotě místnosti.

Zvláště výhodně je možno provádět selektivní odštěpení N-acylového zbytku, jež byl použit jako chránící skupina, a oxidaci části dihydroresorufinu. v jediné reakční nádobě. Za tím účelem se k N-acylovanému derivátu dihydroresorufinu ve směsi vody a methanolu v poměru 3 : 1 přidá nejdříve 2 až 4 mol hydrogenuhličitanu sodného a ekvimolární množství IN roztoku hydroxidu eodného a potom 2- až 4-násobný molární nadbytek hexakyanoželezitanu draselného. Po asi 10 minutách až 2 hodinách, výhodně po 0,5 hodině při teplotě místnosti je reakce ukončena.

Pro reakci derivátů resorufinu obecných vzorců Ila/IIb popřípadě obecného vzorce VII s vysokomolekulárními ligandy obecného vzorce III, se jako zvláště výhodné ukázaly N-bydroxysukcinimidestery. Tak postačí například při kopulaci na králičí IgG již 6 mol derivátu resorufinu na 1 mol IgG, aby se dosáhl stupeň značení 3 molekul resorufinu na 1 mol IgG. Fluorescenční barviva, která byla dosud, obvyklá pro tento účel, a která mají maximální vlnovou délku absorpce λ 470 nm, obsahující jako reaktivní skupinu isothiokyanátový zbytek nebo zbytek chloridu sulfonové kyseliny., jako například fluoresceinisothiokyanát nebo texasská červeň, se musí za účelem kopulace na králičí IgG používat v podstatně vyšším nadbytku barviva, aby se dosáhlo stejného stupně značení.

Konjugace vysokomolekulárních sloučenin obecného vzorce III, jako například bílkovin, se provádí v pufru, zvláště výhodně v O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o

2 pH 8,0 až 9,0, jestliže reaktivní skupinou X nebo X je N-hydroxysukcinimidester. Reakční teplota má vždy činit 10 až 35 °C. Výhodně se reakce provádí při teplotě místnosti.

Na základě zvláště příznivých spektrálních vlastností se předložený vynález rovněž týká použití sloučenin obecného vzorce Ia a Ib při analytických postupech, při kterých se zjišíuje popřípadě měří fluorescenční vlastnost sloučenin obecného vzorce la/Ib popřípadě produktů přeměny těchto sloučenin v závislosti na použitém způsobu přípravy.

Při heterogenních imunoanalýzách je zapotřebí rozdělení ligandů vázaných na proti látky a volných ligandů srážením vhodnými látkami nebo použitím protilátek vázaných na pevné nosiče dříve než se stanovuje buň koncentrace volných ligandů. nebo koncentrace vázaných ligandů. Při homogenních imunoanalýzách ae stanovení komplexní vazby protilátka-ligand ve vzorku provádí bez takového rozdělování. K metodám homogenní imunoanalýzy počítáme například fluorescenční imunoanalýzy -s řízeným zastavením reakce, fluorescenční imunoanalýzy s použitím pomocných prostředků jakož i fluorescenční polarisační metody, při nichž se používá jako značkovacích prostředků fluorescenčních látek. Zvláště posléze uvedená metoda postrádá dosud vzhledem k nevýhodám používaných upotřebitelných fluorescenčních značkovacích prostředků, které byly popsány v úvodu, vhodné značkovací prostředky. Vzhledem k tomu, še sloučeniny obecných vzorců Ia nebo Ib mají absorpční maxima a emisní maxima, která leží vysoce nad maximy biologického materiálu, která působí rušivě v tělních tekutinách v důsledku své vlastní fluorescence, jsou zvláště vhodné pro použití při fluorescenční polarizační imunoanalýze. Další výhoda sloučenin vyráběných postupem podle vynálezu spočívá v tom, še při vhodné substituci mají zvláště vysoký Stokesův posun až do asi 70 nm.

Fluorescenční polarizační imunoanalýza je zásadně založena na principu obvyklé fluorescenční imunoanalýzy.

Jestliže se vhodné fluorescenčně značené ligandy aktivují za účelem fluorescence lineárně polarizovaným světlem, pak molekula může vzhledem k nepatrnému .časovému zpomalení mezi aktivací a emisí '- dříve než začne emitovat záření - rotovat. Tím se poo11

CS 273617 32 točí rovina lineárně polarizovaného světla rovněž o určitý úhel. U řady molekul může během tohoto krátkého časového Intervalu docházet rotační difusí k určité depolarizael fluorescenční emise. Pro polarizaci emitované fluorescence platí, že je o to vyšší, oč větší je molekula, a v důsledku toho čím pomalejší je rotace. Tento vzájemný vztah lze využít pro měření vazby ligandů na protilátky, protože volné, značené ligandy mají menší objem molekuly než komplexy značených ligandů navázaných na protilátky. Obráceně je pak polarizace proporcionální vůči koncentraci ligandů, která ae stanovuje a ktorá je přítomna ve vzorku.

Koncentrace značených ligandů nebo analogonů ligandů a protilátky, které je zapotřebí pro takovéto imunologické postupy, se řídí podle použitého měřicího zařízení, jakož i podle příslušných charakteristických vlastností použitého značeného ligandů nebo značeného analogonů ligandů a samotné protilátky. Zásadně závisí tyto koncentrace přirozeně také na koncentraci určovaného ligandů a musí se tudíž empiricky zjišťovat, Toto zjištění může každý odborník provést jednoduchou optimalizací.

τ -13

Koncentrace ligandů, která se má určit, kolísá obecně od asi 10“ až do asi 10 K Je výhodné, jestliže se pro měření upraví koncentrace ligandů ve stanovovaném vzorku od asi ÍO“·⁵ do asi zvláště výhodně od asi 10“⁴ do asi 10“ M. Vyšší koncentrace ligandů se mohou měřit po zředění původního vzorku.

Měření ae provádí při určitých hodnotách pil, které mohou dosahovat od asi 3 až do aai 12. Obvykle se pohybují v rozmezí od asi 5 až do asi 10, výhodně v rozsahu ptl od asi 6 do aai 9. K dosažení a udržování hodnoty pH během měření ae mohou používat různé pufry, jako například borátový pufr, fosfátový pufr, karbonátový pufr nebo Trispufr. Pro. předložený vynález není rozhodující jaký pufr se použije. Výběr ee řídí především použitou protilátkou, podle ligandů, který se má stanovovat jakož 1 podle použitého fluorescenčního značkovacího prostředku.

Fluorescenční polarizační imunoanalýzy se provádějí výhodně při konstantní teplotě. Obvykle lze volit teplotu v rozsahu od asi O do 50 °C, výhodně v rozsahu od asi 10 do asi 40 °C.

Přesný vzájemný vztah mezi polarizací a koncentrací ligandů nebo analogonů ligandu, který se stanovuje, lze vždy odečíst z kalibrační křivky. Takové křivky se získají tím, Že se změří hodnoty polarizace roztoků látek s rozdílnými avšak známým koncentracemi, Neznámé koncentrace ligandů vo zkoumaném vzorku no pak mohou při znalostí polarizace zjistit z takovýchto kalibračních křivek.

Širokou oblast použití sloučenin obecných vzorců la a lb, které se vyrábějí postupem podle vynálezu, nutno spatřovat v jojioh obočné použitelnonti jakožto fiuorouoončního značkovacího prostředku. Tak se mohou například při lmunofluoreocenční mikroskopii učinit viditelnými pomocí fluorescenčně značených protilátek jakožto antigeny bílkoviny nebo oelé buňky. Odpovídajícím způsobem lift rovněž přímo pozorovat, rozdělení haptenu nebo antigénu v buňce, jestliže se do buňky přivede příslušné fluorescenčně značená sloučenina, a sleduje se například pod mikroskopem. Přitom se - na rozdíl od shora popsaných fluorescenčních imunoanalýz - nemění fluorescenční vlastností derivátů resorufinu.

Známými barvivý, která byla dosud používána jako fluorescenční značkovací prostřed ky, jsou například fluorescelny, jako fluoroacelniaothlokyanát nebo rhodondnová barvívá, jako texasská červeň. Jak již bylo dříve uvedeno, mají však fluorescelny tu nevýhodu, Se fluoreskují při relativní nízkých vlnových délkách. Kromě toho jo výtěžnost kopulsční reakce podle zkušenosti na příslušný nosič většinou nízká a navíc je barevná stálost kopulačních produktů špatná. Totéž platí i pro rhodaminová barviva.

Právě s ohledem na tyto produkty vykazují sloučeniny podle vynálezu obecných vzorců la a lb zřetelné výhody oproti fluorescenčním značkovacím prostředkům, které jaou známé ze stavu techniky. Fluoreskují v rozsahu dlouhých vln při dobré barevné stálosti a dají se vyrábět v dobrém výtšžku ze sloučonin obecných vzorců Ha nebo lib a odpo vídajících kopulačních složek.

Sloučeniny obecného vzorce Ila nebo lib, které se připravují postupem podle vynálezu, se dají přirozeně používat také ke značení látek při jiných než uvedených fluorescenčních imunologických postupech. Tak je pomocí těchto látek možné také značení složky jiného komplexotvorného systému za použití těchto reaktivních derivátů resorufinu. Pod komplexotvornýml systémy se přitom mohou rozumět věechny ty kombinace látek, které jeou na základě specifického, výměnného účinku schopny tvořit komplexy. Známými kombinacemi jsou například kombinace hormonu a specifického receptoru, kombinace biotinu a avidinu, kombinace derivátu glycldu a lectinu atd. Jako příklad je možno uvé3t bílkoviny značené biotinem, které lze stanovit pomocí kopulačního produktu avidinu a reaktivní sloučeniny obecného vzorce Ila nebo lib. Další výhodná použitelnost sloučenin obecného vzorce Ia a Ib, vyráběných postupem podle vynálezu, spočívá ve stanoveních složky systému lectin/derivát glycidu.

Ke třídění buněk ve Fluorescent Activated Cell Sorter se používá fluorescenčně značených částic latexu. Takovéto částice se mohou rovněž velmi dobře fluorescenčně značit, například reakcí částic latexu Obsahujících hydroxylové skupiny, merkaptoskupiny, aminoskupiny nebo také karboxylové skupiny nebo sulfoskupiny, s reaktivními deriváty resorufinu obecných vzorců Ila nebo lib.

Sloučeniny obecných vzorců Ia a Ib se dají rovněž výhodně používat ke stanovování enzymů. Zn tímto účelem se může vázat derivát resorufinu obecného vzorce Ila nebo lib na substrát, který lze štěpit pomocí stanovovaného enzymu. Také tento kopulační produkt je představován sloučeninou obecného vzorce Ia a Ib, připravovanou postupem podle vynálezu. Po reakci substrátu, který je značen resorufinem, s enzymem a po oddělení štěpných produktů a nezreagovaného substrátu, lze určit aktivitu onzymu. Tak například lze vázat reaktivní derivát resorufinu obecného vzorce Ila nebo lib na glykopeptid a takto získaný kopulační produkt lze potom použít jako substrát pro důkaz účinnosti endoglukosidázy. Ke stanovení endoglukosidáz je známé značení pomocí derivátů dansylu (siov. Iwase a další, Anal,-Biochem. 113, 93-95 /19S1/). Deriváty resorufinu se ve srovnání s těmito sloučeninami vyznačují zvláště svou vyšší citlivostí.

Následující příklady slouží k objasnění vynálezu. Tyto příklady, které rozsah vy. nálezu v žádném směru neomezují, mají ukázat zásadní možnost značení nízkomolekulárních a vysocemolekulárních sloučenin a jejich použití.

Příklad 1 [3-(l-difenylhydantoinyl)ethylkarbonyl]piperazidresorufln-4-karboxylové kyseliny

a) Resorufin-4-karboxylová kyselina g nitrosoresorcinu, 15,5 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny a 8,6 q oxidu man ganičitého (burelu) se suspenduje ve 200 ml methanolu a pak se suspenzeochladí na 0 °C. K takto ochlazené suspenzi se přikape 10,6 ml koncentrované kyseliny sírové a reakčni směs se míchá potom ještě 2 hodiny při teplotě místnosti. Vyloučená červená resazurin-4-karboxylová kyselina se^ odfiltruje, promyje se methanolem a vysuší se.

Derivát resasurinu se rozpustí ve 200 ml vody a 50 ml 25% roztoku amoniaku a získaný roztok se zfiltruje. K modrému filtrátu se přidá za chlazení ledem po částech 50 g práškového zinku a směs sé nechá zahřát na teplotu místnosti. Průběh redukce se dá snadno sledovat chromát.pgrafií na tenké vrstvě (rozpouStědlový systém:

směs methanolu a ethylacetátu v poměru 1 ·. 1} silikagelové desky pro chromatografii na tenká vrstvě). Reakční roztok se zfiltruje, filtrát se potom okyselí ledovou ky selinou octovou a malým množstvím koncentrované chlorovodíkové kyseliny. Vyloučená resorufin-4-karboxylová kyselina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu oxidem fosforečným. Výtěžek: 16,33 g % , R^ (sUlkageli rozpouštědlový systém: směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1)

0,4.

b) N,0,0-triacetyldihydroresorufin-4-karboxylová kyselina

12,9 g resorufin-4-karboxylové kyseliny se rozpustí ve 30 ml ledové kyseliny octové a 30 ml aoetanhydridu, přidá se 27,6 g chloridu cínatého a směs se míchá 1 hodinu'při teplotě 80 °C. Směs ae vylije do 600 ml ledové vody, pak se míchá po dobu 1 hodiny a sraženina se odfiltruje. Po vysušení se pevná látka vyjme 500 ml acetonu. Roztok se zfiltruje a filtrát se odpaří.

Po vysušení se získá 11,3 g produktu.

^H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

. . ά - 2,24, 2,26 a, 2,29 (vždy β, 9H)?

6,94 (dvojitý d, J . 8,5 a 2,2 Hz, 1H);

6,98 (d, J «·, 2,2 Hz, 1 H){ ,7,04 (d, J * 9 Hz, 1 H)j 7,61 (a, J Μ 8,5 Hz, 1 H)j . 7,67 ppm (d, J - 9 Hz, 1 H).

Hodnota R^ 0,46 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 0,1),

o) Chlorid lí,0,0-trlaoetyldihydroreaorufin-4-karboxylové kyseliny

38,5 g triaoetátu popsaného v příkladu 1b) ae smísí a prídavkom 54 ml oxnlylchloridu a směa se ochladí na teplotu 0 °C. K této směsi ae přidá několik kapek dimethylformamidu a směs ae nechá zahřát na teplotu místnosti. Edukt sc přitom rozpouští za vývinu plynu. Směe ae odpaří za sníženého tlaku k suchu, zbytek no vyjme . vždy, 3-krát, 200,ml absolutního methylenchloridu a methylenchloridový roztok se znovu odpaří k suchu»’

Výtěžek: 41

d) H-tercbutoxykarbonylpiparazin

12,61 g N-benzhydrylpiperazinu se rozpustí ve 100 ml směsi 1,4-dioxanu a vody v poměru 3 :,1., K tomuto roztoku se přikape roztok 12,0 g di-terc.butyldikarbonátu rozpuštěného v 50 ml 1,4-ďioxanu. Po 1/2 hodině míchání se ke směsi přikape 50 ml vody, směs se zfiltruje a sraženina se vysuší,

... Výtěžek: , 16,2 g K-terc. butoxykarbonyl-H'-bonshydrylpiperazlnu.

Hodnota R^ 0,92 (silikagel, rozpouštědlový Ryntém: směa chloroformu, methanolu o ledové kyseliny ootová v poměru 9 ι 1 « 0,1),

14.

g N-terc.butoxykarbonyl-I^-benzhydrylpiperazinu se rozpustí ve 100 ml ethylacetátu a 5 ml ledové kyseliny octové, Přidá se 0,3 g paladia na aktivním uhlí a provede se hydrogenaoe. Potom se katalyzátor odfiltruje a filtrát se odpaří. Ke zbytku se přidá 100 ml vody a 20 ml IN roztoku chlorovodíkové kyseliny a směs se zfiltruje. Filtrát se dvakrát extrahuje ethylacetátem a potom se vodná fáze zalkalizuje hydroxidem sodným. Produkt, který se vyloučí v olejovité formě, se extrahuje dichlormethanem. Po vysušení síranem 3odným a po odpaření se získá 3,2 g N-terc.but oxykarbonyl-piperazinu ve formě oleje, který po několika dnech úplně vykryataluje. Hodnota R^ = 0,05 .

(silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1). Při použití ninhydrinu vzniká modré zbarvení.

e) N^-terc.butoxykarbonylpiperazid N,0,0-triacetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny

K 25 g chloridu kyseliny, který je popsán v příkladu lc), a 17,3 ml triethylaminu ve 450 ml dichlormethanu se při teplotě 0 °C přikape roztok 13,8 g lí-terc.butoxykarbonylpiperazinu v 50 ml dichlormethanu. Reakční směs se míchá bez chlazení po dobu 1 hodiny, třikrát se extrahuje vodou a organická fáze se odpaří.

Výtěžek: 36,0 g Hodnota Rf = 0,64 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

f) N^-terc.butoxykarbonylpiperazid N-acetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny

34»3 g triacetátu, který je popsán v příkladu le) a 17,1 g siřičitanu sodného se míchá 1 hodinu při teplotě 60 °C v 500 ml směsi 1,4-dioxanu a vody v poměru 1 : Potom se reakční směs odpaří, zbytek se vyjme ethylacetátem, ethylacetátový roztok se zfiltruje za účelem odstranění nerozpustných solí a chromatografuje se na 2 litrech silikagélu (eluční činidlo: směs ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 4:1» jakmile se začne vymývat produkt, přemění se na čistý ethylaoetát).

Výtěžek: 14 g Hodnota R„ a 0,28 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 4 : 1).

g) ΙΤ'-terc.butoxykarbonylpiperazid resorufin-4-karboxylové kyseliny g N-acetylderivátu popsaného v příkladu lf) Be rozpustí ve 200 ml methanolu a 600 ml vody, K získanému roztoku se přidá 1,8 g natriumhydrogenuhličitanu sodného a 10,7 ml IN roztoku hydroxidu sodného a potom 14 g kaliumhexakyanoželezitanu.

Po 1/2 hodině míchání při teplotě místnosti se hodnota pH upraví na 5. Produkt se vyloučí a odfiltruje se.

Výtěžek: 2,72 g

Hodnota Rf « 0,28 * (silikagel,' rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

C3 273617 32

h) Trifluoracetát terc.butoxypiperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny g terc.butoxykarbonylderivátu popsaného v příkladu Ig) se ponechá stát 1.5 mi r.ut ve 20 ml trifluoroctové kyseliny. Roztok se odpaří, zbytek se digeruje s etherem a produkt se odfiltruje.

Výtěžek: 0,96 g Hodnota = 0,92 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

i) Kopulace piperazidu resoruřin-4-karboxylové kyseliny s K-hydroxysukcinimidesterem

3-(1-difenyIhydantoinyl)propionová Iryseliry

191 mg trifluoracetátu piperazidu popsaného v příkladu lh) a 210 mg Ií-hydroxysukcinimidesteru 3-(1-difenyIhydantoinyl)propionová kyseliny (připraveného ze sodné soli difenylhydantoinu a ethylesteru 3-brompropionové kyseliny analogicky podle postupu, který popsali Cook a další, Res. Communications in Chemical Pathology and Pharmacology 5 (1973), str. 767) se míchá po dobu 15 hodin ve 20 ml dioxanu a 20 ml 0,114 roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5. Vyloučený produkt se odfiltruje, fil trát se odpaří a odparek se chromatografuje na silikagelu (RP18) za použití isopropylalkoholu jako elučního činidla, přičemž se získá další část produktu. Produkt se překrystaluje ze směsi ethylacetátu a methanolu a získá se celkem 250 mg kopulačního produktu.

Hodnota R_f = 0,61 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

^H-NKR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

ά = 2,6 - 2,8 (m, 2H); 3,0 - 3,8 (m, 10H);

6,74 (d, J = 2,2 Hz, 1H);

6,82 (d, J = 9,5 Hz, 1H);

6,91 (dvojitý d, J = 9,5 a 2,2 Hz);

7,25 - 7,33 (m,. ICH)?

7,55 a 7,66 ppm (vždy d, J = 9,5 Hz, 2H).

UV/VIS (O,1M kaliumfosfátový pufr pil 7,5):

^Amax = ⁵⁷⁶’^{8 nin} Fluorescenční emise:

Příklad 2

Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s K-hydroxysukcinimidesterem 3-(1-difenyIhydantoinyl)octové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 365 mg trifluoracetátu pi perazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 339 mg U-hydroxysukcinimidesteru 3-(l-dife nyIhydantoinyl)octové kyseliny získá 210 mg Žádaného produktu.

Hodnota = 0,82 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1: 1).

^H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

£ = 3,2 - 4,5 (ra, IOH); 6,60 (d, J = 2,4 Hz, IH); 6,71 Cd, J = 9,5 Hz, IH); 6,80 (dvojitý d, J = 9,05 a 2,4 Hz, IH);

7,39 (s, IOH); 7,52 (d, J = 9,5 Hz, IH);

7,61 (d, J = 9,0 Hz, IH);

9,65 ppm (s, IH).

UV/VIS (O,1M roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,0): ^λ max = ⁵⁷⁵’^{4 nm}

Fluorescenční emise: ^λ max = ^{592 nm}

Příklad 3

Kopulace piperazidu resorufiň-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinlmidesterem N-terc.hutoxykarbonyl-l-thyroxinu

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 212 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 419 mg N-hydroxysukcinimidesteru N-terc.butoxykarbonyl-I-thyroxinu získá 320 mg produktu.

Hodnota R_f = 0,58 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

N-Hydroxysukcinimidester U-terc.butoxykarbonyl-L-thyroxinu se získá následujícím způsobem:

a) H-terc.butoxykarbonylthyroxin

Roztok 10 g (12,5 mmol) monohydrátu sodné soli 1-thyroxinu ve směsi 300 ml dioxanu a vody v poměru 2 : 1 a 15 ml IH roztoku hydroxidu sodného se smísí s přídavkem 3 g (13,75 mmol) di-terc.hutyldikarbonátu (BOC)₂0 a směs se míchá při teplotě místnosti za vyloučení světla.

Přidáním 2M roztoku hydrogensíranu draselného se hodnota pH upraví na 2, provede se extrakce ethylacetátem, ethylacetátový extrakt se promyje vodou, vysuší se síranem sodným a odpaří se. Pevný zbytek se rozetře s petroletherem, suspenze se zfiltruje a produkt se vysuší v exsikátoru.

Výtěžek: 9,45 g = 86 % teorie Hodnota R^ a 0,6 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, ligroinu a octové kyseliny v poměru 6:3:1).

b) H-Hydroxysukcinimidéster H-BOC-tbyroxinu

K roztoku 8,8 g l-BOC-thyroxinu ve 200 ml ethylenglykoldimethyletheru se přidá 1,2 g (9,5 mmol) H-hydroxysukcinimidu. Roztok se ochladí na 10 °C a potom se k němu přikape roztok 2,3 g (9,9 mol) dicyklohexylkarbodiimidu ve 40 ml ethylenglykoldimethyl

C3 273617 B2 etheru. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti se vyloučená dicyklohexylmočovir.a odfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku při teplote 40 °C. Zbytek se roztírá s isopropylalkoholem a suspenze se zfiltruje. Produkt se vysuší v ezsikátoru při teplotě místnosti.

Výtěžek: 9,19 g = 94 % teorie (celkový výtěžek, vztaženo na rtyroxin = 81 %). Hodnota R^ = 0,6 (vysoceúčinná kapalinová chromátografie HPTLC-RP 18; rozpouštědlový systém: směs acetonitrilu a vody v poměru 8 : 2).

’ή-ΜΚΗ spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

£ = 1,36 (₃, 9H); 2,81 (s, 4H);

2,9 - 3,2 (m, 2H); 4,5 - -1,9 (m, IH);

7,03 (s, 2H); 7,63 (d, J = 9 Hz, IH);

7,90 (3, 2H); 9,2 (s, IH);

Příklad 4

Populace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s 3-0-[3-(K~sukcinimidooxykarbony1)propyIjestradiclem

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 212 mg trifluoracetátu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 220 mg 3-0-[3-(N~sukcinimidyloxykarbonyl)propylJestradiolu získá 295 mg produktu.

Hodnota R^. = 0,58 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

3-0~[3~(N~Sukcinimidoxykarbonyl)propyl]estradiol se získá obvyklým způsobem z 3-0-karboxypropylestradiolu (z estradiolu a brommáselné kyseliny analogicky podle postupu, který popsali Liibke a další v Immunologische Teste fur niederreolekulare Wirkstoffe, G. Thieree Verlag, Stuttgart, str. 94) a N-hydroxysukcinimidu v přítomnosti d.icyklohexylkarbodiimidu.

Příklad 5

Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s H-[3-(N-sukcinimidoxykarbonyl)propyljfenobarbitalem

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 212 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 205 mg N-[3-(H-sukcinimidoxykarbonyl)propyljfenobarbitalu získá 220 mg produktu.

Hodnota R^. = 0,45 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

K-[3-(N-Sukcinimidoxykarbonyl)propylJfenobarbital se získá obvyklým způsobem z fe nobarbital-l-máselné kyseliny (T. Nistikawa a další, Clin. Chim. Acta 91 /1979/, str. 59) a H-hydroxysukcinimidu v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu.

Příklad 6

Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s lí-hydroxysukcinimidesterem theofylin-7-propionové

Z 212 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 175 mg N-hydroxysukcinimidesteru theofylin-7-propionové kyseliny se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) 200 mg produktu.

Hodnota R^. a 0,44 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

N-hydroxysukcinimidester theofyiin-7-propionové kyseliny se získá obvyklým způsobem z theofylin-T-propionové kyseliny (T. Nistikáwa a další, Chem. Pharm. Bull. 27 /1979/ str. 893) a N-hydroxysukcinimidu v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu.

P ř í k 1 a d 7

Kopulace ϊΓ-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resoruflnylkarbonyl)sarkosinu s l-(2-aminoe thyl)d ifenylbydantoinem

a) (terč.butoxykarbonyImethyl)methylamid N,0,O-triacetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny g chloridu kyseliny, který je popsán v příkladu lc), se nechá reagovat analogickým způsobem jako v příkladu le) s terč.butylesterem sarkosinu.

Výtěžek: 7,5 g

Hodnota R^ a 0,77 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

b) (terč.butoxykarbonyImethylJmethylamid N-acetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny

7.5 g produktu, který je popsán v příkladu 7a), se analogickým postupem jako je popsán v příkladu lf) deacetyluje.

Výtěžek: 5,2 g Hodnota R^ β 0,56 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

o) (terc.butoxykarbonylmethyl)methylamid resorufin-4-karboxylové kyseliny

4.5 e produktu popsaného v příkladu 7b) se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu lg).

Výtěžek: 2,6 g

Hodnota s 0,64 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

C3 273617 B2

d) (karboxyinethyljmethylamid resorufin~4~karboxylové kyseliny

0,55 s produktu popsaného v příkladu 7c) se ponechá stát v klidu při teplotě místnosti v 6 ml trifluoroctové kyseliny. Potom se reakčni směs odpaří k 3uchu, zbytek se roztírá s etherem a produkt se odfiltruje.

Výtěžek: 0,45 g Hodnota Ih, u 0,11 (silikagel, rozpouštedlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1),

e) íi^-hydroxysukcinimidester H-(4-resorufinylkarbonyl)3arkosinu

200 mg produktu z příkladu 7d) se míchá s 72 mg N-hydroxysukcinimidu a 138 mg dicyklohexylkarbodiimidu 14 hodin ve 40 ml tetrahydrofuranu. Vyloučená močovina se odfiltruje, filtrát se odpaří a odparek se chromatografuje na silikagelu (RF 18) za použití směsi nitromethanu a ethanolu v poměru 4 : 1 jako elučního činidla. Výtěžek: 150 mg

Hodnota - C-,73 (silikagel RP-18, rozpouštědlový systém; směs nitromethanu a ethanolu v poměru 4 ; 1).

f) Kopulace H -hydroxysukcinimidesteru H-(4-resorufinylkarbonyl)sarkosinu s l-(2-aminoethyl)dif enylhydantoir.em

125 mg «-hydroxysukcinimidesteru z příkladu 7e) se míchá 1 hodinu s 90 mg 1-(2-aminoethyl)difenylhydantoinem ve 40 ml směsi dioxanu a kaliumfosfátového pufru c pH 8,5 v poměru 1 ; 1. Dioxan se úplně odpaří, k odparku se přidá až do úplné barevné přeměny amoniak, směs se zfiltruje a z filtrátu se přidáním chlorovodíkové kyseliny vyloučí produkt.

Výtěžek: 110 mg Hodnota = 0,78 (silikagel, rozpouštedlový systém: směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).

UV/VIS (0,1 molární roztok kaliurafosfátového pufru, pH 8,0);

^Á max = ⁵⁷⁵ ™

Fluorescenční emise:

^Λ max = ^{552 nm}«

Příklad 8

2-(l-difenylhydantoinyl)ethylamid resorufin-4-karboxylové kyseliny

a) 2-(l-difenylhydantoinyl)ethylamid H,0,0-triacetylhydroresorufin-4-karboxylové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu le) se nechá reagovat 1,37 g l-(2~aminoethyl)difenylhydantoinu s 1,2 g chloridu Ν,Ο,Ο-triacetyldihydroresorufinkarboxylové kyseliny. Získá se 1,9 g produktu ve formě slabě zbarvené pěny.

b) 2-(l-difenylliydantoinyl)ethylamid re3orufin-4-karboxylové kyseliny

Produkt získaný v příkladu 8a) se analogickým postupem jako je popsán v příkladech lf) a lg) oxidačně deacetyluje. Z 1,9 g eduktu se získá 600 mg produktu. Hodnota R^ s 0,68 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

^H-lffiR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulf oxid):

δ = 3,2 - 3,6 (m, 4H), 6,73 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6.,84 (d, J « 9,5 Hz, IK),

6,86 (dvojitý d, J = 9,5 a 2,2 Hz, 1H), 7,2 - 7,4 (m, 10H), 7,62 a 7,66 (vždy d, J a 9,5 Hz, 2H), 8,66 (t, široký, J a 5 Hz, 1H), 9,58 ppm (s, 1H).

UV/VIS (0,1 molární roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,0):

Λ = 575 nm max ^JIJ

Fluorescenční emise:

Příklad 9

Kopulace piperazidu 6-methylresorufin-4-karboxylové kyseliny s M-hydroxysukcinimidesterem [2-(l-difenylhydantoinyl)]octové kyseliny

a) 2-methyl-4-nitrosoresorcin

19,8 g 2-methylresorcinu a 13,4 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 120 ml ethanolu a roztok se ochladí na teplotu 5 °C. K takto ochlazenému roztoku se přikape 24 ml isopentylnitritu, směs se míchá 3 hodiny a sraženina se odfiltruje. Žlutá pevná látka se vmíchá do 200 ml 5U roztoku kyseliny sírové. Přitom se vyloučí světle žlutý produkt.

Výtěžek: 22 g Hodnota R^ a 0,53 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

b) 6-methylresazurin-4-karboxylová kyselina

15,3 g 2-methyl-4-nitrosoresorcinu, 15,4 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny,

8,8 g burelu a 11 ml koncentrované kyseliny sírové se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu la).

Výtěžek: 28,7 g Hodnota R_f a 0,15 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

c) H, 0,0-triacetyl-6-methyldihydroresorufin-4-karboxylová kyselina

Z 10 g 6-methylresazurin-4-karboxylové kyseliny, 19,8 g chloridu cínatého, ml acetanhydridu a 150 ml .ledové kyseliny octové se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu lb) přímo triacetylovaná leukosloučenina. Surový produkt se Čistí vyvařením v acetonu.

C3 273617 32

Výtěžek: 7,3 g Hodnota = 0,51 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1), spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid): o = 2,10, 2,25, 2,29, 2,33 (vždy s, 12Π), 7,00, 7,09, 7,50 a 7,74 ppm (vždy d,

J = 3,8 Hz, S4H).

d) 1' -butoxykarbonylpiperazid M,0,0-triacetyl-6-m.ethyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladech ld) až le) se z 5 g Ν,Ο,Ο-triacetyl-S-methyldihydroresoruíin-4-karboxylové kyseliny, 10,7 ml oxalylchloridu a 2 g κ-butoxykarbonylpiperazinu získá 3 g produktu,

Hodnota = 0,57 (silikagel, rozpouštědlový systém: ethylacetát).

e) Trifluoracetát piperazidu 6-methylresorufin-4-karboxylové kyseliny g tria četyIderivátu, který je popsán v příkladu 9d), se nechá reagovat analogickým způsobem jako je popsán v příkladech lg) až lh).

Výtěžek: 0,43 g

f) Kopulace K-hydroxysukcínimidesteru 2-(l-difenylhydantoinyl)octovc kyseliny s piperazidem 6-methylresorufin-4-karboxylové kyseliny

222 mg sloučeniny získané v příkladu 9e) se nechá reagovat s 200 mg K-hydroxysukcinimldesteru 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyseliny.

Výtěžek: 250 mg

UV/VIS (0,1 molárni kaliumfosfátový pufr, pH 8,0):

= 584 nm fluorescenční emise:

Příklad 10

Kopulace piperazidu 9-hyóroxy-5~benzo[aJfenoxazon-8-karboxylové kyseliny s K-hydroxysukcinimidesterem [2-(l-difenylhydantoinyl)]octové kyseliny

a) 12-oxid 9-hydroxy-5-benzo[aJfenoxazon-8-karboxylové kyseliny

2,84 g l,3-dihydroxy-4~nitrosonaftalenu, 2,31 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 1,29 g burelu a 1,6 ml koncentrované kyseliny sírové se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu la).

Výtěžek: 2,8 g Hodno ta = 0,63 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1),

b) 12-acetyl-5,9-diacetoxybenzo [a]fenoxazon-8-karboxylová kyselina

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu 9c) se z 2,4 g 12-oxidu 9-hydro xy-5-benzo[a]fenoxazon-8-karboxylové kyseliny získá 1,8 g triacetylované dihydrosloučeniny.

Hodnota R_f «>0,31 (silikagel, rozpouStedlový systém: směs chloroformu, mothonolu o ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 í 0,1),

c) Ν'-butoxykarbonylpiperazid 12-acetyl-5,9-diacetoxybenzo[aJfenoxazin-8-karboxylové kyseliny

1,6 g triacetylderivátu popsaného v příkladu 10b) ss nechá reagovat analogickým postupem Jako Jo popsán v příkladu 9d) o oxolylchloridein a N-butoxykarbonylpiperazinem.

Výtěžek: 1,2 g ^H-NMR spektrum (deuterochloroform):

cf » 1,49 (s, 9H), 2,12, 2,27, 2,46 (vždy s, 12H), 3,0 - 3,9 (m, 8H), 7,03 (d, J - 9 Hz, 1H), 7,16 - 7,94 ppm (m, 6H).

d) Ν'-butoxykarbonylpiperazid 9-hydroxy-5-benzo[a]fenoxazon-8-karboxylové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu lf) se z 0,93 g triacetylderivátu z příkladu 10c) získá 0,51 g produktu.

Hodnota R^ = 0,69 (silikagel, rozpouatědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 s 0,1).

e) Trifluoracetát piperazidu 9-hydroxy-5-benzo[a]fenoxazon-8-karboxylové kyseliny

Z 0,5 g butoxykarbonyl-chráněnó sloučeniny popsané v příkladu lOd) se analogickým postupem jako je popsán v příkladu lh) získá 0,5 g produktu.

Hodnota R_f a 0,02 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

f) Kopulace piperazidu 9-hydroxy-5-benzo[a]fenoxazon-8-karboxylové kyseliny s N-hydroxyeukcinimidesterem 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyaeliny

Z 50 mg piperazidu, který byl připraven podle příkladu lOe) a 150 mg N-hydroxy sukcinimidesteru 2-(l-difonylhydantoinyl)octové kyseliny se analogickým ppstupem ja ko je popsán v příkladu li) získá 70 mg produktu.

• Hodnota R_f a 0,57 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

UV/VIS (0,1 molární roztok kaliumfoefátového pufru, pH 8,0):

^Λ max = ⁵⁶⁰ Fluorescenční emise:

^Amax ^{3 615 nm} bl-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

£ - 3,0 - 4,5 (m, 10H), 6,37 (s, 1H), 6,80 (d, J » 8 Hz, 1H), 7,2 - 7,35 (m, 10H), 7,35 - 8,0 (m, 3H), 8,10 (dvojitý d, J = 8 a 2 Hz, 1H), 8,56 (dvojitý d, J - 8 a 2 Hz, 1H), 9,60 ppm (s, 1H).

P ř í k 1 β d 11 >' (l-difenylhydantolnylmethylkarbonyl)piperazid 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyseliny

a) 6-ethyl-4-nitrosoresorcin

Analogickým postupem jako v příkladu 9a) se z 7,5 g 4-ethylresorcinu, 4,5 g hydroxidu draselného a 8 ml isopentylnitritu získá ve formě žluté pevné látky 6-ethyl -4-nltrosoresorcin.

Výtěžek: 7,5 g Hodnota Rf β 0,37 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v,poměru 9 : 1 : 0,1).

b) 8-ethylresorufin-4-karboxylová kyselina

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu la) se ze 7,4 g 6-ethyl-4-nit.roresorcinu, 6,8 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 3,9 g oxidu manganičitého a 5 ml koncentrované kyseliny sírové po redukci 8 g práškového zinku získá 9,5 g produktu. Hodnota Rf « 0,05 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

c) N'-butoxykarbonylpiperazid N,0,0-trlacetyl«8-ethyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu Id) se ze 7,7 g 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyseliny, 15,4 g chloridu cínatého, 30 ml ledové kyseliny octové a

15,3 ml aoetanhydridu získá W,0,0-triaeetyl~8-ethylresorufin-4-karboxylová kyselina, která se jako surový produkt analogickým postupem jako je popsán v příkladu lc) přímo dále zpracovává na chlorid kyseliny a analogickým postupem jako je popsán v příkladu le) se přímo dále zpracovává na butoxykarbonylpiperazid.

Výtěžek: 4 g Hodnota Rf = 0,86 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

d) N'-butoxykarbonylpiperazid S-ethylrosorufin-4-karboxylové kyseliny

Ze 4 g N'-butoxykarbonylpiperazidu H,0,0-triacetyl-8-ethyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu lf) a Ig) odpovídající N'-butoxykarbonylpiperazid karboxylové kyseliny.

Výtěžek: 0,5 g

Hodnota => 0,67 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu a methanolu v poměru 4 : 1).

e) Trifluoracetát piperazidu 8-etbylresorufin-4-karboxylové kyseliny

330 mg odpovídajícího hutoxykarbonylpiperazidu se nechá v klidu 1,5 hodiny ve 35 ml směsi dichlormethanu a trifluorootové kyseliny v poměru 6 : 1. Po odpaření se zbytek digeruje s etherem, produkt se odfiltruje a vysuší.

Výtěžek: 350 mg Hodnota R^ 0,33 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1: 1).

f) Reakce s H-hydroxysukcinimidesterem 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se z 325 mg trifluoracetátu piperazidu 8-ethylresorufin-4-karboxylové kyseliny a 435 mg N-hydroxysukcinimideste ru 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyseliny získá 120 mg produktu.

Hodnota R^ a 0,43 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

^H-NMR (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

á = 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,52 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 3,1 - 4,0 (m, 8H),

4,25 - 4,45 (m, 2H), 6,42 (s, široký, IH), 6,94 (d, J = 9,0 Hz, IH),

7,3 - 7,5 (m, 11H), 7,68 (d, J = 9,0 Hz, IH), 9,54 (s, IH), 11,2 ppm (s, široký, IH).

UV/VIS (0,1 molární roztok kaliumfosfátového pufru, pH a 8,0):

^Amax ^{a 575 nm} Pluorescenční emise:

^Amax ” ^{598 nm}·

Příklad 12 (Í-Difenylhydantoinylmethylkarhonyl)piperazid 8-chlorresorufin-4-karhoxylové kyseliny

a) 8-chlorresazurin-4-karhoxylová kyselina

Ze 17,3 g 4-chlor-6-nitrosoresorcinu (připraveného podle Plampina a Caina,

J. Med, Chem. j6, 247 (1963)), 15,4 g 2,6-dihydroxybenzoové kyseliny, 8,6 g oxidu manganičitého a 10,7 ml koncentrované kyseliny sírové se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu la) 8-chlorresazurin-4-karhoxylová kyselina.

Výtěžek: 17,1 g

Hodnota R^ a 0,58 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs butanolu, ledo.vé kyseliny octové a vody v poměru 4:1*: 1).

b) N,0,0-triacetyl-8-chlordihydroresorufinkarboxylová kyselina

16,3 g 8-chlorresazurin-4-karboxylové kyseliny a 18,9 ε chloridu cínatého se zahřívá 1/2 hodiny ve 100 ml směsi ledové kyseliny octové a acetanhydridu v poměru 1 : 1 na teplotu 1 80 °C a potom se směs vylije do 500 ml vody ochlazené ledem. Reakčni směs se. míchá 2 hodiny, potom se sfiltruje za účelem odstranění sraženiny n

a vysuší se pomocí prostředku Sieapent Pevná látka se vyjme 500 ml acetonu a nerozpustné zbytky ae odfiltrují. Filtrát ae odpaří a po vysušení se získá 12,3 g produktu.

Hodnota R^ » 0,39 (silikagel, rozpouStědlový systém : směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1), ^H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

2,25 (s, 3H), 2,33 (a, 6H), 7,16 (d, J » 8,8 Hz, lil), 7,30 (c, lil),

7,76 (d, J - 8,8 Hz, 1H), 7,90 ppm (s, 111).

c) Ν'-butoxykarbonylpiperazid 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny

Analogickým postupem jako v příkladu 1b), c), e) až g) se získá z 5 g N.0,0-triacetyl-8»chlordihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny 0,8 g produktu.

Hodnota R^ 0,7 (silikagel, rozpouStědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové ky seliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1),

d) Trifluoracetát piperazidu 8~chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny

Z 0,8 g butoxykarbonyl-chráněné sloučeniny z příkladu 12c) se získá 0,81 g produktu analogickým postupem jako je popsán v příkladu lh).

Hodnota R^ β 0,07 (silikagel, rozpouStědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové ky seliny octové v poměru 9 : 1 i 0,1).

e) Kopulace piperazidu 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimidesterem 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu li) se ze 400 mg trifluoracets tu piperazidu 8-chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny o 410 mg N-hydroxysukcinimid esteru 2-(l-difenylhydantoinyl)octové kyseliny získá žádaný produkt.

Výtěžek: 150 mg Hodnota R^, 0,38 (silikagel, rozpouStědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové ky seliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1),

UV/VIS (O,1M roztok kallumfoafátového pufru, pH 8,0):

« 581 nm mex

Fluorescenční emise:

^Amax “ ^{597 nm}CS 273617 B2

Příklad 13

Kopulace piperazidu 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny s (2-aminoethyl)amidem theofylin-7-propionové kyseliny

a) 8-chlorresorufin-l-karboxylová kyselina

8,7 g 4-chlor-6~nitrosoresorcinu a 7,71 g 3,5-dihydroxybenzoové kyseliny se rozpustí ve 200 ml methanolu, k získanému roztoku se při teplotě 0 °C přidá 4,8 g oxidu manganičitého a po částech 5,3 ml koncentrované kyseliny sírové. Reakčni směs se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti, potom se zfiltruje a až do barevného přechodu na modrou barvu se přidá amoniak a 200 ml vody. Získaný roztok se zfiltruje, k filtrátu se přidá 25 ml koncentrovaného amoniaku a 20 g práškového zinku při chlazení ledem a potom se směs bez dalšího chlazení míchá dalších asi 15 minut. Ke směsi se přidá 200 mg aktivního uhlí, směs se zfiltruje, filtrát se okyselí na pH 2 a vyloučený derivát resorufinu se odstředí.

Výtěžek: 3,9 g Hodnota R_f = 0,88 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs n-butanolu,. ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1).

b) N,0,0-triacetyl-8-chlordihydroresorufin-l-karboxy.lová kyselina

Z· 3,5 g 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny se analogickým postupem jako je popsán v příkladu lb) získá 3,2 g produktu.

Hodnota R^ = 0,43 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1).

c) Trifluoracetát piperazidu 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny

Ze 3 g triacetylderivátu, který byl připraven jako v příkladu 11b), se získá analogickým postupem, jako se popisuje v příkladech lc až lh), 1,4 g produktu. Hodnota R^ a 0,08 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu, ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

d) Kopulace piperazidu 8-chlorresorufin-l-karboxylové kyseliny s (2-aminoethyl)amidem theofyiin-7-propionové kyseliny

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu 8 se ze 420 mg piperazidu 17,0,0-triaoetyl-8-chlordihydrore8orufin-l-karboxylové kyseliny a 30Ό mg (2-aminoethyl)amidu theofylin-7-propionové kyseliny získá 190 mg produktu.

Příklad 14

Značení imunoglobulinu G pomocí N^-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)sarkosinu ,

100 mg lidského imunoglobulinu G (IgG) se rozpustí v 10 ml O,1M kaliumfosfátového pufru o pH 8,0 a k získanému roztoku se přidá 5 mg N*-hydroxysukcinimidesteru N-(4-reso rufinylkarbonyl)sarkosinu (srov. příklad 7e). Směs se ponechá v klidu 12 hodin při teplote místnosti a potom se chromátogrnfuje na sorbentu Ultrogel ACA 2002 (LKB). Značená bílkovina se přitom vymývá před volným nízkomolekulárním resorufinem. Stupeň značení se zjištuje měřením extinkce. Činí hodnotu 3, tzn., že na 1 molekulu imunoglobulinu G j3ou vázány 3 molekuly derivátu resorufinu.

Příklad 15

Značení imunoglobulinu C- pomocí N^-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny

a) N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylová kyselina

2,0 g chloridu 'i,O,O-triacetyldihydroresorufin-4-karboxylové kyseliny, který je popsán v příkladu lc), se nechá reagovat analogickým postupem jako je popsán v příkladu le) s 0,9 g hydrochloridu methylesteru piperidin-4-karboxylové kyseliny, analogickým postupem jako je popsán v příkladu lf) a lg) se produkt deacetyluje a oxiduje a zmýdelní se působením hydroxidu sodného na N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylovou kyselinu.

Výtěžek: 0,9 g Hodnota = 0,44 (silikagel RP-18, rozpouštědlový systém: směs nitromethanu a ethylalkoholu v poměru 4 : 1).

UV/VIS (O,1M roztok kaliumfosfátového pufru, pH 8,5):

λ = 576,2 nm max

b) R -hydroxysukcinimidester N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny

Z 200 mg N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny, 240 mg N-hydroxysukcinimidu a 468 mg dicyklohexylkarbodiimidu se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu 7e) 190 mg produktu.

Hodnota R^ = 0,7 (silikagel RP-18, rozpouštědlový systém: směs nitromethanu a ethanolu v poměru 4 : 1).

IČ spektrum (technika KBr):

3415 (m, široký), 1814 (w), 1773 (m), 1734 (s), 1626 (m), 1214 (m) cm^-1.

c) Značení králičího imunoglobulinu G pomocí N^-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny

K 10 mg králičího imunoglobulinu G rozpuštěného v 1 ml Q,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5 se přidá 100 /Ul roztoku 1,9 mg N-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)píperidin-4-karboxylové kyseliny v 1 ml 1,4-dioxanu a směs se ponechá stát 2 hodiny při teplotě místnosti. To odpovídá poměru 6,4 mol derivátu resorufinu na 1 mol králičího imunoglobulinu G.

Po chromatografii na ACA 202 za použití O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,5 jako elučního činidla se získá frakce bílkoviny, která má absorpční poměr ^A57g/^A280 “ což odpovídá stupni zatížení 3,4 mol resorufinu na 1 mol imunoglobulinu G.

Přidá-11 se při analogickém pokusu k 10 mg králičího imunoglobulinu O 20 yUl roztoku aktivovaného resorufinu, pak se získá při 1,05 mol nabídnutého barviva na 1 mol imunoglobulinu G stupeň zatížení 0,8.

Absorpční maximum imunoglobulinu G značeného resorůfinem činí 578 nm. Roztok fluoreskuje intenzívně světle červenou barvou.

Vystaví-li se roztok imunoglobulinu G značeného resorůfinem po dobu jednoho měsíce dennímu světlu, klesne hodnota fluorescence na 59 % původní hodnoty,, zatímco u analogicky vyrobeného imunoglobulinu G značeného fluoresceinisothiokyanátem na 16 % a u imunoglobulinu G značeného texasskou červení na 12 %.

Příklad 16

Stanovení difenylhydantoinu v lidském séru pomocí PPIA

K 1950 ,ul O,1M roztoku natriumfosfátového pufru (pH 7,8) se přidá 5 /Ul vzorku (i) ' , ' (31 ^v , 25 /ul roztoku protilátky ' ' a 25 /Ul roztoku difenylhydantoin-resorufinu' .

Po 5-minutové inkubaci při teplotě 37 °C se měří fluorescenční polarizace. (Excitační vlnová délka: 575 nm, emisní vlnová délka 594 nm, měřicí přístroj: fluorescenční spektrometr 65O-1OS, Hitachi), (1)

Vzorek: lidské sérum od dárce se známým množstvím difenylhydantoinu. Ke zhotovení kalibrační křivky se použije sérum lidského dárce., které obsahuje difenylhydantoin v koncentraci

a)	2,5	i /Ug/ml
b)	5	/ug/ml
c)	10	/Ug/ml
d)	20	/Ug/ml
e)	40	/Ug/ml,

(2)

Roztok protilátky: 450 yug protilátky/ml O,1M roztoku natriumfosfátového pufru (pH 7,8)

Protilátky se získají imunisací ovcí difenylhydantoinem, který je vázán na albumin hovězího'séra, podle obvyklých metod.

Antisérum se čistí srážením síranem amonným a chromatografii na celulóze DEAE.

(3)

Roztok difenylhydantoinresorufinu (10 M):

konjugát difenylhydantoinresorufin z příkladu li) v O,1M roztoku ha^řiumfosfátového pufru (pH 7,8).

Naměřené výsledky, které byly získány pomocí roztoků difenylhydantoinu la), lb), lc). ld) a le), jsou znázorněny na připojeném výkresu. Na tomto výkresu jsou vyneseny koncentrace difenylhydantoinu vzorků (^ug/ml) vůči naměřeným hodnotám polarizace (mP).

Pomocí takové kalibrační křivky lze také stanovovat koncentraci difenylhydantoinu ve vzorcích s neznámým obsahem difenylhydantoinu.

Srovnatelná kalibrační křivka ae rovněž získá v případě, že se místo shora používaného konjugátu difenylhydantolnu z příkladu li) použije vždy konjugátu difenylhydantolnu z příkladů 2, 7, 8 nebo lOf).

Příkladu

Stanovení aktivity endoglykosidázy pomocí resorufin-(vyššího)glykopeptidu na bázi mannosy

Poznámka:

V další části textu bude používáno výrazu (vyšší)monnosaglykopeptid z důvodu jednoduššího vyjádření·vlastního významu tohoto slova, kterým je vyšší glykopeptld, ve kterém je částí cukru mannosa.

a) Značení (vyššího)mannoaaglykopeptidu íjNhydroxysukcinimidasterom N-(4-resorufinylkarbonyl)earkoslnu mg (vyššího)mannoaaglykopeptidu (vyrobeného podle Huanga a dalších, Carbohydrate Res. 13, 127-137 (1970)) se smísí e přídavkem 10 ml O,1M roztoku kaliumfosfátového pufru o pH 8,0. Roztok se dodatečné upraví na pH 8,0. Potom se přidá 25 mg H*-hydroxysukcinimldesteru H-(4-resorufinylkarbonyl)sarkosinu rozpuštěného ve 3 ml dioxanu, po jedné hodině ae znovu přidá stejné množství H-hydroxysukcinimidesteru barviva ve 3 ml dioxanu. Směs se míchá 14 hodin při teplota místnosti, potom se odpaří ve vakuu dioxan a zbytek se zředí vodou na obsah 70 ml a potom pufrem A (=

0,02M roztok TRIS-HC1, 2 mM chloridu horečnatého, 2 mM chloridu manganatého, 2 mM chloridu vápenatého, pH 7,2).na objem 140 ml. Hodnota pH ae dodatečné upraví vodným amoniakem na 7,2. Přitom vzniklá sraženina se odstředí. Supernatant se přenese na sloupec Con A-Sepharose (1 x 15 cm). Pufrem A se vymývá volné barvivo. Jakmile protékající kapalina již není červená, vymývá se 1. frakce resorufin-(vyššího)mannosaglykopeptldu pomocí 2% methylmannosidu v pufru A jakožto olučním činidlem (asi 100 ml). Potom ee vymývá 2, frakce 2% vodným methylmannosidem, Obš frakce se dialyzují proti vodě a lyofillzují se. Obš frakce jaou vhodné ke stanovování aktivity endoglykosidázy, které je popsáno v odstavci b) dále,

b) Stanovení aktivity endoglykosidázy

Resorufin-(vyšší)mannosaglykopeptid se inkubuje ve vhodném pufru a endoglykosidázou, například endoglykoeidáza H a citrátový pufr pH 5,5 (» vzorek 1). Paralelně k tomuto pokusu se současně provádí pokus se vzorkem, který neobsahuje endoglykosldázu, ale jinak je shodný (» vzorek 2), Po inkubaci se k oběma vzorkům přidá Con A-Sepharoee a směe se protřepává, aby se vázal resorufin-(vysší)mannosaglykopeptid. Peptid značený reeorufinem., u něhož byla část cukru v důsledku aktivity enzymu odštěpena, se neváže. Po 15 minutách se Con A-Sepharose odstředí, supernatant se upraví na pH 7,5 a změří se fluorescence (excitace například 550 nm, emise max “ 595 nm). Rozdíl mezi vzorkem 1 a nulovou hodnotou (» vzorek 2) udává množství štěpeného resorufin-(vyššího mannosaglykopeptldu a je tudíž mírou aktivity enzymu.

Příklad 18

Kopulace N-hydroxysukcinlmidesteru digitoxigenin-3-hemisukcinátu s piperažidem resorufin-4-karboxylové kyseliny

438 mg piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny a 570 mg N-hydroxysukcinimidesteru digitoxigenin-3-hemisukcinátu se rozpustí ve 160 ml směsi dioxanu a vody v poměru 1 : 1. Získaný roztok se přidáním 5% vodného roztoku uhličitanu draselného upraví na pH 8,5 a poté se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti. Poté se dioxan odpaří, hodnota pH se upraví na 1 a vyloučený produkt se odfiltruje.

Výtěžek: 670 mg

Hodnota R^ =0,64 (silikagel, vysoce účinná kapalinová chromatografie, rozpouštědlový systém: směs butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1: 1).

Hodnota R_f pro piperazid resorufin-4-karboxylové kyseliny: 0,09.

Příklad 19

Kopulace piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s N-hydroxysukcinimidesterem digoxigeninmonodigitoxosid-3—hemiglutarátem

Analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 18 se z 438 mg piperazidu re3orufin-4-karboxylové kyseliny a 731 mg N-hydroxysukcinimidesteru digoxigeninmonodigitoxosid-3 —hemiglutarátu získá 630 mg surového produktu. Po chromatografování na silikagelu (silikagel RP 18) za použití směsi isopropylalkoholu a vody v poměru 2 : 1 jako elučního činidla se získá 34 mg sloučeniny uvedené v názvu.

Hodnota R^ = 0,61 (silikagel, vysoce účinná kapalinová chromatografie; rozpouštědlový systém: směs butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1)

Příklad 20

Kopulace N-hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny s 3-amino-3-desoxydigoxigeninem

140 mg 3-amino-3-desoxydigoxigeninu a 140 mg N—hydroxysukcinimidesteru N-(4-resorufinylkarbonyl)piperidin-4-karboxylové z příkladu 15 se míchá 2 hodiny ve směsi, která sestává z 80 ml O,1M kaliumfosfátového pufru o pH 8,5 a 120 ml směsi.dioxanu a dimethylformamidu v poměru 1 : 1. Potom se reakční směs odpaří při teplotě místnosti k suchu a zbytek se čistí na silikagelu (silikagel RP 18) za použití elučního činidla s gradientem 0,1 % trifluoroctové kyseliny ve vodě až 0,1 % trifluoroctové kyseliny ve směsi isopropylalkoholu a vody v poměru 65 : 35.

Získá se 30 mg sloučeniny uvedené v názvu.

Hodnota R_f = 0,60 (silikagel RP 18, rozpouštědlový systém: směs isopropylalkoholu a vody v poměru 1 : 1).

Hodnota R_f aminodigoxigeninu: 0,55

Hodnota R^ N-hydroxysukcinimidesteru resorufinu: 0,71.

CS 273617 32

Příklad 21

Výroba thyroxinmethylesteru IJ-(3-(resorufin-2‘’-yl)propionové kyseliny s thyroxinmethylesterem

a) Hydrogenace 7-hydroxykumarinu na dihydroxyfenylpropionovou kyselinu

6,5 g 7-hydroxykumarinu se rozpustí ve 25 ml 5M roztoku hydroxidu sodného,

100 ml vody a 20 ml ethanolu a po přidání 2 g paladia na aktivním uhlí se provádí hydrogenace při teplotě místnosti a za atmosférického tlaku. Poté ae reakční směs zfiltruje, filtrát se okyselí a roztok se odpaří na rotační odparce.

Výtěžek: 90 % teorie

H-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

£ = 2,4 - 2,9 (m, 4H)

6,16 - 6,91 (m, 4H)

b) Resorufin-2-propionová kyselina mmol dihydroxyfenylpropionové kyseliny a 40 mmol nitrosoresorcinu se rozpustí v dimethylformamidu, k získanému roztoku se přidají 3 g oxidu manganičitého a 4 ml kyseliny sírové (kyselina sírová se přikape). Derivát resazurinu se odfiltruje, rozpustí se v amoniaku a redukuje se zinkem. Čištění produktu se provádí chromátografováním na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 8 : 1 jako elučniho Činidla.

Výtěžek: 25 % teorie

Hmotové spektrum (TMS2-produkt, Εϊ): M + 429

e) Kopulační reakce mg resorufin-2-propionové kyseliny se nechá reagovat s N-hydroxysukcinimidem a morfolinoethylisokyanidem v dimethylfoiramidu za vzniku aktivovaného esteru. Potom se přidá 100 mg thyroxinmethylesteru a triethy lamin. Po ukončení reakce se reakční směs okyselí a čistí se filtrací pres Sephadex LH 20 ve směsi s dimethylformamidem. Výtěžek: 20 mg

Hmotové spektrum: PAB pos 1059, neg 1057

Příklad 22

Výroba N-(3-reaorufin-2”-yl}propionyl)aminoethylhydantoinu kopulací resorufin-2-propionové kyseliny s aminoethylhydantoinem

Analogickým způsobem jako při předešlé reakci se vždy ze 150 mg eduktu získá 100 mg žádaného produktu.

K-NMR spektrum (perdeuterovaný dimethylsulfoxid):

£ = 6,27 - 7,95 (m, 5H)

7,34 (s, 10H)

Příklad 23

Výroba (digoxigenineukcinoyl)piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny kopulací piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny ve formě trifluoracetátu s digoxigeninaukcinoyl -W-hydroxysukcinimidem

Vždy 1 mmol výchozích látek ae nechá reagovat způsobem popsaným v příkladu 1 a poté se reakční směs zpracuje. Získá se 170 mg žádaného produktu.

Hodnota R^ = O,19 (silikagels rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1),

Příklad 24

Kopulace sarkosin-lí-hydroxyBukcinimidesteru resorufin-4-karboxylové kyseliny 3 aminodigoxigeninem

Vždy 0,174 mmol výchozích látek se nechá reagovat za podmínek popsaných v příkladu 7f) za vzniku žádaného produktu.

Hodnota R^ 0,28 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs methanolu, chloroformu a ledové kyseliny octové v poměru 1 : 9 : 0,1).

Příklad 25

Kopulace trifluoracetátu piperazidu 2-ohlorresorufin-4-karboxylové kyseliny s W-hydroxysukcinimidem difenylhydantoinoctové kyseliny

Reakce se provádí analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 1. Z 270 mg trifluoracetátu piperazidu 2-chlorresorufin-4-karboxylové kyseliny a 173 mg N-hydroxysukcinimidesteru difenylhydantoinyloctové kyseliny se získá 20 mg žádaného produktu. Hodnota R^ a 0,38 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9 : 1 : 0,1).

P ř í k 1 a d 26

Kopulace tetrajodthyrooctové kyseliny s.trifluoracetátem piperazidu resorufip-4-karboxylové kyseliny

a) N-hydroxysukclnimidester tetrajodthyrooctové kyseliny

Obvyklým způsobem (například způsobem popsaným v příkladu 21 se z 500 mg kyseliny reakcí s N-hydroxysukcinimidem a morfolinoethylisokyanidem připraví aktivovaný ester.

Výtěžek: 300 mg

Hodnota Rp = 0,87 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1),

b) Kopulační reakce

0,18 mmol výchozích látek se nechá reagovat způsobem popsaným v příkladu 1 ve směsi dioxanu a pufru o pH 8,5 a získaný produkt 3e čistí preparativní vysoce účinnou kapalinovou chromatografii.

Výtěžek; 20 mg

H-.NMR spektrum (perdeuterovaný methylalkohol):

(Γ « 7,06, 7,11, 7,80, 7,85 (4s, 4H), 6,35 - 7,58 (m, 5H).

Příklad 27

Kopulace trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny s l-methyl-3-(N-sukcinimidokařbonyDpropylxenthinem

Reakce so provádí analogickým postupem jako je popsán v příkladu 1, Ze 194 mg l-methyl-3-(N-sukcinimidokarbonyl)propylxanthinu a 245 mg trifluoracetátu piperazidu resorufin-4-karboxylové kyseliny se získá 110 mg žádaného produktu.

Hodnota Rp = 0,43 (silikagel, rozpouštědlový systém: směs chloroformu, methanolu a ledo vé kyseliny octové v poměru 9:1: 0,1),

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby derivátů resorufinu obecných vzorců Ia a Ib ??

   4.

   (Ib) ve kterých

   R* znamená atom vodíku nebo atom halogenu,

   R znamena atom vodíku nebo atom halogenu, znamená atom vodíku, atom halogenu nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku,

   R^ znamená atom vodíku, atom halogenu nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, c ,

   R' znamena atom vodíku, nebo

   R^ a R^ mohou společně tvořit anelovaný benzenový kruh, i o „ „ f

   Z znamená můstkový člen vytvořený ze zbytků X a X , přičemž

   X¹ znamená karbonylovou skupinu spojenou s atomem halogenu, s aminoskupinou, která je popřípadě substituována jedním nebo dvěma alkylovými zbytky s 1 až 5 atomy uhlíku, s piperazinovým zbytkem nebo piperidinovým zbytkem, přičemž alkylové zbytky jakož i piperidinový zbytek mohou být substituovány karboxylovou skupinou esterifikovanou lí-hydro sukoinimidem, nebo s alkylovou skupinou s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifíkovanou H-hydroxysukcinimidem, a o

   X znamená karbonylovou skupinu, která je substituována zbytkem N-oxysukcinimidu nebo alkylovým zbytkem s 1 až 5 atomy uhlíku, který opět nese karboxylovou skupinu esterifikovanou lí-hydroxysukcinimidem, nebo znamená alkylovou skupinu β 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifikovanou N-hydroxysukoinimidem, nebo znamená aminoskupinu nebo hydroxyskupinu, á

   A znamená zbytek ligandu zvoleného ze souboru, který je tvořen haptenem, antigenem, protilátkou, substrátem, nosičem a od nich odvozenými sloučeninami a n znamená celé číslo od 1 do 200,

   CS 273617 32 a sloučeniny obecných vzorců lia a lib vyznačující se tím, že se ni ve kterých (Ha) (Hb)

   R¹, R², R³, R⁴ a R⁵ mají významy uvedené pod obecným vzorcem Ia a Ib, a

   X znamená karhonylovou skupinu spojenou s atomem halogenu, s aminoskupinou, která je popřípadě substituována jedním nebo dvěma alkylovými zbytky s 1 až 5 atomy uhlíku, s piperazinovým zbytkem nebo piperidinovým zbytkem, přičemž alkylové zbytky jakož i piperidinový zbytek mohou být substituovány karboxylovou skupinou esterifikovanou N-hydroxysukcinimidem, nebo s alkylovou skupinou s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifikovanou H-hydroxysukcinimidem, působí ligandem obecného vzorce IH

   X² — A (III) ve kterém

   A znamená zbytek ligandu zvoleného ze souboru, který je tvořen haptenem, antigenem, protilátkou, substrátem, nosičem a od nich odvozenými sloučeninami, a
2. 2 , ~í~ znamena karhonylovou skupinu, která je substituovaná zbytkem N-oxysukcinimidu nebo šlkylovým zbytkem s 1 až 5 atomy uhlíku, který opět nese karboxylovou skupinu esterifikovanou N-hydroxysukcinimidem, nebo znamená alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, která je substituována aminoskupinou nebo karboxylovou skupinou esterifikovanou N-hydroxysukcinimidem, nebo znamená aminoskupinu nebo hydroxyakupinu.