ES2277376T3 - Serodiagnostico mediante elisa de la pleuroneumonia porcina de serotipo 2. - Google Patents
Serodiagnostico mediante elisa de la pleuroneumonia porcina de serotipo 2. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN EQUIPO DE DIAGNOSTICO ELISA PARA REALIZAR ENSAYOS DE ANTICUERPOS DEL SEROTIPO 2 DE A. PLEUROPNEUMONIAE EN EL SUERO DE LOS CERDOS, QUE COMPRENDE EN ENVASE APARTE, AL MENOS UNO DE LOS SIGUIENTES ELEMENTOS: A) UNA PLACA O SOPORTE SOLIDO QUE LLEVA ADHERIDO UN LIPOPOLISACARIDO PURIFICADO ANTIGENO DEL SEROTIPO 2 DE A. PLEUROPNEUMONIAE PARA ADHERIRSE ESPECIFICAMENTE A LOS ANTICUERPOS ANTISEROTIPO 2 DE A. PLEUROPNEUMONIAE PRESENTES EN EL SUERO DE LOS CERDOS; B) SUERO DE CERDOS A LOS QUE SE HA INOCULADO EXPERIMENTALMENTE EL SEROTIPO 2 DE A. PLEUROPNEUMONIAE PARA QUE ACTUE DE CONTROL POSITIVO; C) SUERO DE CERDOS DE PIARAS LIBRES DE A. PLEUROPNEUMONIAE PARA QUE ACTUE DE CONTROL NEGATIVO; Y D) UN CONJUGADO MARCADO DE MANERA DETECTABLE QUE SE ADHIERA A LOS ANTICUERPOS PORCINOS ADHERIDOS A LA PLACA DE A).
Description
Serodiagnóstico mediante ELISA de la
pleuroneumonía porcina de serotipo 2.
La presente invención se refiere a kits para el
ensayo preciso, rápido y sensible de anticuerpos contra
A. pleuropneumoniae de serotipo 2 en suero porcino
para el serodiagnóstico de la pleuroneumonía porcina.
Actinobacillus pleuropneumoniae es
conocido como uno de los agentes más patógenos del tracto
respiratorio del cerdo. La pleuroneumonía porcina todavía es un
problema importante en las grandes operaciones porcinas, que
provoca graves pérdidas económicas en esta industria. Dado que la
presencia de A. pleuropneumoniae es a menudo inadvertida en
piaras infectadas de forma crónica, la identificación de los
animales portadores es una preocupación importante. Tras una
situación estresante pueden aparecer casos graves clínicamente
fatales en una piara dada. La infección en el cerdo puede ser
fatal, pero los animales supervivientes a la infección
frecuentemente se hacen portadores. La detección de los portadores
infectados de forma crónica es crucial, dado que estos animales
actúan como reservorios de la infección. Dado que la infección es a
menudo inadvertida, la serología ha resultado ser una herramienta
útil para la detección de la infección crónica. Varios estudios
indican que es posible controlar o eliminar la infección en ciertas
piaras basándose en los resultados serológicos.
Se han descrito varios ensayos serológicos para
A. pleuropneumoniae. Entre otros, se han usado la prueba de
fijación del complemento (CPT), el inmunoanálisis enzimático de
adsorción (ELISA); (Goyette G. y col., 1986, Int. Pig. Vet. Soc.
Proc., 9: 258) y la prueba de aglutinación en tubo con
2-mercaptoetanol (Mittal, K. y col., 1984, Am. J.
Vet. Res., 45: 715-719). De entre los
diferentes ensayos, a menudo el ELISA es el más útil, dado que es
más rápido y más fácil de realizar. Por otro lado, hasta ahora, los
resultados obtenidos sugerían el uso de una preparación antigénica
más purificada con objeto de mejorar la especificidad de la
prueba.
Actualmente se usa en algunos laboratorios un
extracto salino de células completas
hervidas-formalinizadas de A.
pleuropneumoniae (también denominado extracto bruto) como el
antígeno para el serodiagnóstico mediante ELISA (Goyette G. y col.,
1986, Int. Pig. Vet. Soc. Proc., 9: 258). La
normalización del ensayo es complicada, ya que se han advertido
variaciones entre los extractos.
Usando diferentes preparaciones de antígeno
también se han descrito reacciones cruzadas entre los serotipos y
con otras especies bacterianas (Bosse, J. y col., 1990, Can. J.
Vet. Res., 54: 427-431). Aunque se ha
demostrado que el polisacárido capsular (CPS) de A.
pleuropneumoniae es el responsable de la especificidad del
serotipo (Inzana, T. y Mathison, T., 1987, Infect. Immun.,
55: 1580-1587), la dificultad para obtener el
CPS puro en grandes cantidades impide su utilización con fines de
serodiagnóstico. Los CPS eran muy inestables y se fijaban con
dificultad a las paredes de la placa de poliestireno usada en el
ensayo ELISA (Perry, B. y col., 1990, Sero. Immunol. Infect.
Dis., 4: 299-308).
La serología, que se usa para identificar a los
animales que han desarrollado una respuesta inmune ante patógenos
específicos, es una importante herramienta en el tratamiento y la
prevención de enfermedades por infecciones por A.
pleuropneumoniae en cerdos. La importancia de las pruebas
serológicas está acentuada adicionalmente por la ausencia de una
vacuna que prevenga de forma viable la infección.
El uso de antibióticos es útil principalmente
para controlar la mortalidad, pero no tiene un beneficio real en
los cerdos con pleuroneumonía crónica. Los animales tratados a
menudo continúan portando el organismo, y pueden ser una fuente de
infección para otros animales. Además, se ha observado un número
cada vez mayor de cepas resistentes a diferentes antibióticos en
los últimos años en Québec (Nadeau, M. y Higgins, R., 1991,
Bulletin épidémiologique, 2: 4-5).
La demanda de cerdos de piaras seronegativas
para A. pleuropneumoniae está aumentando, especialmente por
parte de los productores cuyas piaras han experimentado brotes
epidémicos de la enfermedad y que han decidido "erradicar"
A. pleuropneumoniae, adquiriendo únicamente animales
seronegativos (procedentes del piaras seronegativas) para la
sustitución. Un programa de erradicación satisfactorio depende en su
mayor parte de la precisión y la fiabilidad de las pruebas
serológicas usadas para identificar a los cerdos infectados por
A. pleuropneumoniae. No obstante, la interpretación de la
serología debería realizarse cuidadosamente. Una prueba que no sea
sensible no detectará todas las piaras o animales infectados
(resultados falsos negativos) y una que no sea específica condenará
erróneamente a algunos animales no infectados (resultados falsos
positivos).
La especificidad antigénica de A.
pleuropneumoniae parece estar relacionada, al menos
parcialmente, con los polisacáridos capsulares (Altman y col.,
1988, Biochem. Cell. Biol. 66: 998-1004;
Benyon y col., 1991, Carbohydrate Res., 209:
211-223; Bosse y col., 1990a, Can. J. Res.
54: 320-325, y 1990b, Can. J. Vet. Res. 54:
427-431) o, según otros autores, con los
lipopolisacáridos lisos (Altman y col., 1989, Carbohydrate Res.
191: 295-303; Benyon y col., 1991,
Carbohydrate Res. 209: 225-238). Sin embargo,
estos polisacáridos capsulares resultan ser muy inestables y son
difíciles de adherir a las superficies de poliestireno de las
placas usadas para el ELISA (Perry y col., 1990, Immunother.
Infect. Dis. 4: 299-308; Gray B. M., 1979, J.
Immun. Methods, 28: 187-192).
Fems Immunology and Medical Microbiology, viol.
11, 1995, páginas 35-44,
Rodríguez-Barbosa y col., desvelan la
caracterización de anticuerpos monoclonales contra el antígeno 0
del lipopolisacárido de Actinobacillus
pleuropneumoniae de serotipo 2 y su uso en la clasificación de
cepas de campo.
Fems Microbiology Letters, viol. 82, 1991,
páginas 143-148, Toyotsugu Nakai y col., desvela la
estructura del epítopo en el lipopolisacárido reconocido por el
anticuerpo monoclonal específico de Actinobacillus
pleuropneumoniae de serotipo 2. Ambos describen ELISAs que usan
un extracto bacteriano bruto.
Veterinary Microbiology, vol. 52, nº 3, 4, 1996,
páginas 285-292, Stenbaeck y col., desvelan la
detección de una variante del lipopolisacárido (LPS) de
Actinobacillus pleuropneumoniae de serotipo 2. Se usa un
antígeno purificado, pero no hay ninguna descripción relativa a los
sueros de control positivo y negativo.
El documento WO
97-A1-05487 desvela kits de
detección sistemática de anticuerpos contra Actinobacillus
pleuropneumoniae en sueros porcinos usando un antígeno
purificado y los controles adecuados, pero únicamente se usan
antígenos del serotipo 5.
Hay algunas reacciones cruzadas entre los
serotipos; por ejemplo: los serotipos 3, 6 y 8, los serotipos 1, 9
y 11, y los serotipos 7 y 4. Hasta el momento no es posible
diferenciar estos serotipos serológicamente. La mayoría de estas
reacciones cruzadas son debidas a la presencia de epítopos comunes
a nivel de los LPS. Además, podrían observarse otras reacciones
cruzadas, que no se encuentran en el serotipado, en los análisis
serológicos de animales infectados de forma crónica que están
expuestos continuamente al microorganismo. Estas reacciones
cruzadas se asocian habitualmente con proteínas de la membrana
externa (proteínas de la pared celular, proteínas reprimibles por
hierro, etc.) y lipopolisacáridos rugosos. Sin embargo, es
importante recordar que una piara, e incluso un animal, podrían
estar infectados con varios serotipos simultáneamente. En este
caso, los anticuerpos detectados contra los diferentes serotipos
probablemente no son reacciones cruzadas, sino reacciones homólogas
y específicas. Este es uno de los problemas más importantes que se
ha de resolver mediante el uso de las pruebas serológicas
específicas y sensibles según la presente invención.
Los cerdos sanos portadores pueden ser
responsables de la transmisión de la enfermedad. La ausencia de
signos clínicos y/o lesiones en el matadero no implica
necesariamente la ausencia de la infección.
Tras la infección, los anticuerpos pueden
detectarse habitualmente a los 10-15 días. Algunos
animales permanecerán serológicamente positivos durante unos pocos
meses, pero la mayoría serán positivos durante un largo periodo de
tiempo, una vez más, dependerá de la prueba usada.
La proporción de cerdas seropositivas, así como
sus títulos, tendían a disminuir con la edad.
El aislamiento de A. pleuropneumoniae a
partir de cerdos portadores aparentemente sanos es difícil;
probablemente debería usarse como un complemento de la serología en
casos conflictivos.
El desarrollo de unas mejores pruebas
serológicas es una necesidad porque la infección todavía tiene un
impacto económico en la industria porcina, y las vacunas actuales no
son eficaces.
Hasta la fecha no existe un kit estable para el
serodiagnóstico eficaz de la pleuroneumonía porcina en el
campo.
Sería altamente deseable que se proporcionara un
kit para determinar fácilmente la presencia de anticuerpos contra
A. pleuropneumoniae de serotipo 2 en una muestra de
suero.
Sería altamente deseable estar provisto con un
kit diagnóstico de ELISA para A. pleuropneumoniae tal que
pudiera ser usado para el serodiagnóstico de A.
pleuropneumoniae mientras se permanece en el campo.
Un propósito de la presente invención es
proporcionar un kit para el ensayo preciso, rápido y sensible de
anticuerpos contra A. pleuropneumoniae de serotipo 2 en una
muestra.
Otro propósito de la presente invención es
proporcionar un kit diagnóstico mediante ELISA para A.
pleuropneumoniae, para usarse para el serodiagnóstico de A.
pleuropneumoniae mientras permanece en el campo. La novedad y
la originalidad del kit diagnóstico mediante ELISA de la presente
invención reside en la combinación particular de un novedoso
procedimiento de purificación del antígeno que se va a usar y
novedosos procedimientos de sensibilización y estabilización de las
placas del kit.
Los kits de la presente invención difieren del
procedimiento ELISA de la técnica anterior para la determinación de
anticuerpos contra A. pleuropneumoniae. En el procedimiento
de la técnica anterior, el antígeno se fija a las placas en un
tampón de PBS y las placas se usan inmediatamente después de que se
ha completado la fijación del antígeno. El procedimiento de la
técnica anterior puede incluir un protocolo de lectura informatizado
para la determinación de los anticuerpos en las mezclas, según
describen Trottier, Y. L. y col. (1992, J. Clin. Microbiol.,
30: 46-53). Los kits de la presente invención
difieren principalmente en que el antígeno es retenido en la capa
de fenol en lugar de en la capa de agua. Además, el procedimiento
de fijación del antígeno es diferente. De hecho, el antígeno
purificado es resuspendido en un tampón de
PBS-EDTA, que entonces se añade a cada pocillo de la
placa. Después de una incubación de 18 h se añade un tampón de HRP
a cada pocillo. Los anticuerpos de las muestras se determinan
visualmente añadiendo un cromógeno, preferiblemente TMBLue^{TM}.
Los kits de la presente invención, cuando se comparan con el
procedimiento ELISA de la técnica anterior, muestran una
sensibilidad relativa y una especificidad relativa del 100%.
Según otra forma de realización de la presente
invención se proporciona un kit diagnóstico mediante ELISA para el
ensayo de anticuerpos de A. pleuropneumoniae de serotipo 2
en el suero de cerdos que comprende, en un envase por separado:
- a)
- un soporte sólido que tiene unido al mismo un antígeno purificado de lipopolisacárido de Actinobacillus pleuropneumoniae de serotipo 2 para una unión específica a anticuerpos anti-A. pleuropneumoniae de serotipo 2 presentes en el suero de cerdos, almacenándose dicho antígeno en una disolución que comprende una disolución estabilizante de peroxidasa de rábano picante que mantiene dicho antígeno unido estable durante al menos 25 semanas a 4ºC; y opcionalmente
- b)
- suero de cerdos inoculados experimentalmente con una cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2 que sirve como control positivo;
- c)
- suero porcino de una piara sin patógeno específico que sirve como control negativo;
- d)
- un conjugado marcado de forma detectable que se une a los anticuerpos porcinos unidos a la placa de a).
El antígeno de la etapa a) puede estar unido al
soporte sólido almacenándolo en una disolución que comprende una
disolución estabilizante de HRP que mantiene dicho antígeno unido
estable durante al menos 25 semanas a 4ºC.
Los kits diagnósticos mediante ELISA de la
presente invención pueden comprender adicionalmente lo
siguiente:
- e)
- un sustrato que permita la visualización del conjugado marcado de forma detectable.
Según otra forma de realización de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para la preparación del
kit, que comprende las etapas de:
- a)
- purificar el antígeno de lipopolisacárido de Actinobacillus pleuropneumoniae de serotipo 2 mediante extracción con fenol y centrifugación de dicho extracto bruto bacteriano antigénico;
- b)
- fijar el antígeno de la etapa a) a un soporte sólido y estabilizar dicho antígeno fijado;
- c)
- inmunizar animales con una cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2 y recoger el suero, para que sirvan como sueros de control positivo;
- d)
- recoger sueros de piaras sin A. pleuropneumoniae para que sirvan como sueros de control negativo
La fijación del antígeno de la etapa b) puede
efectuarse almacenándolo en una disolución que comprende una
disolución estabilizante de HRP que mantiene dicho antígeno unido
estable durante al menos 25 semanas a 4ºC.
La fig. 1 ilustra el esquema de la placa del kit
preferido de la presente invención.
Los kits de la presente invención son novedosos
porque permiten una prueba simple rápida en el campo en el que
están los animales. Estos kits son lo suficientemente estables, ya
que tienen una vida de almacenamiento de al menos 3 meses y medio.
El antígeno se purificó según un novedoso procedimiento que permite
un aumento de la sensibilidad.
Los kits de la presente invención se basan
esencialmente en la combinación particular de un novedoso
procedimiento de purificación del antígeno de lipopolisacárido de
una cepa de referencia del antígeno de A. pleuropneumoniae
de serotipo 2 y un novedoso recubrimiento y estabilización del
antígeno en la superficie de la placa. El kit según la presente
invención es muy específico, sensible y estable. La prueba según el
kit de la presente invención consiste en la determinación de la
presencia o ausencia de anticuerpos anti-A. pleuropneumoniae
en el suero de cerdos para el serodiagnóstico de A.
pleuropneunoniae de serotipo 2.
La prueba consiste esencialmente en las
siguientes etapas:
- a)
- se lava una placa de 96 pocillos sensibilizada con el antígeno específico de A. pleuropneumoniae de serotipo 2 con una disolución tampón de PBS-Tween^{TM}-20.
- b)
- se distribuye una muestra de suero de cada cerdo de las piaras probadas en dos pocillos sensibilizados de la etapa a). Durante esta primera incubación, los anticuerpos anti-A. pleuropneumoniae de serotipo 2, si están presentes en los sueros, se unirán al antígeno fijado a la placa o unido en fase sólida.
- c)
- la placa se lava para eliminar de los pocillos cualquier material no unido. Se añade un conjugado de peroxidasa-anti-IgG a cada pocillo, obtenido preferiblemente de Jackson Immuno Research Laboratories (catálogo 0114-035-003). Este conjugado se une a cualquier IgG que se hubiera unido al antígeno fijado a la placa en la etapa b). Si el suero porcino no contiene ningún anticuerpo anti-A. pleuropneumoniae de serotipo 2, el conjugado permanecerá libre o en suspensión, y será eliminado durante esta etapa de lavado.
- d)
- la presencia de peroxidasa inmovilizada en el conjugado unido es revelada mediante la adición de un sustrato con cromógeno TMBLue^{TM} (comercializado por Transgenic Science Inc., Milford, MA 01757, EE.UU., nº de catálogo TM-102). Si el conjugado está presente se producirá una reacción de oxidación y aparecerá un color azul.
El kit preferido de la presente invención
comprende los siguientes elementos:
- 1-
- cinco placas de 96 pocillos (Nunc^{TM}, comercializadas por Gibco, Burlington, Ontario, Canadá, L7P IAI) sensibilizadas y estabilizadas con el antígeno purificado según la presente invención.
- 2-
- control positivo; cinco viales que contienen cada uno 0,1 ml de suero liofilizado de cerdos inoculados experimentalmente con una cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2.
- 3-
- control negativo; cinco viales que contienen cada uno 0,1 ml de suero porcino liofilizado de una piara sin patógeno específico.
- 4-
- control positivo débil; cinco viales que contienen cada uno 0,1 ml de suero liofilizado de cerdos inoculados experimentalmente con una cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2.
- 5-
- conjugado; cinco viales de inmunoglobulinas anti-IgG porcina acopladas a peroxidasa. Cada vial contiene 1,2 ml de conjugado estabilizado con HRP (Calbiochem Corporation, Canadá, nº 516534).
- 6-
- TMBLue^{TM}; cinco viales que contienen cada uno 12 ml de TMBLue^{TM}.
La Fig. 1 ilustra el esquema de la placa del kit
preferido de la presente invención, en el que se analizan 40 sueros
diferentes. Los pocillos se identifican como sigue:
- BL = blanco, disolución tampón de PBS-Tween^{TM}-20 (4 pocillos)
- CP = control positivo, elemento nº 2 anterior (4 pocillos)
- CN = control negativo, elemento nº 3 anterior (4 pocillos)
- CPFA = control positivo débil, ^{TM} elemento nº 4 anterior (4 pocillos)
- S1 a S40 = suero que se va a analizar, 2 pocillos para cada suero
Añadir lo siguiente a 3 l de agua destilada,
- 52,59 g de cloruro sódico;
- 1,47 g de fosfato sódico monobásico;
- 7,02 g de fosfato sódico dibásico;
- 1,5 ml de Tween^{TM}-20.
- Mezclar bien hasta conseguir una disolución completa. Verificar el pH, que debería ser de aproximadamente 7,30 \pm 0,05, si fuera diferente, ajustar el pH usando fosfato sódico dibásico. Esta disolución tiene una vida de almacenamiento de 1 semana cuando se conserva a 4ºC. La disolución tampón debería llevarse siempre a la temperatura ambiente antes de ser usada en la prueba.
Se usó la cepa de A. pleuropneumoniae de
serotipo 2, denominada cepa ATCC 27089, para la producción del
antígeno (Altman y col., 1987, Biochem. Cell Biol., 65:
414-422). La cepa se conservó liofilizada.
Se resuspendió el contenido de un vial en un ml
de medio líquido PPLO (Difco Laboratories, Detroit, MI) y se
inoculó hasta el agotamiento en una placa de agar con PPLO. La
placa se incubó aeróbicamente durante 24 horas a 37ºC. Unas pocas
colonias se resuspendieron en 5 ml de medio líquido PPLO. Las placas
con PPLO se inocularon a confluencia con una gasa estéril, después
estas placas se incubaron 6 horas a 37ºC. Tras la incubación, el
crecimiento bacteriano se recogió añadiendo 3,0 ml de disolución
salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) (Oxoid Ltd.,
Basingstoke,
Inglaterra) que contiene un 0,5% (vol/vol) de formaldehído (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) a cada placa de gel.
Inglaterra) que contiene un 0,5% (vol/vol) de formaldehído (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) a cada placa de gel.
La suspensión bacteriana obtenida se colocó en
un frasco estéril y se dejó reposar hasta el día siguiente a 4ºC.
La densidad óptica se ajustó a 5,0 con una disolución de
PBS-formaldehído al 0,5%. Las suspensiones se
separaron en viales estériles con tapón de rosca y se hirvieron 60
min. Después las suspensiones se centrifugaron a 12.000 x g durante
30-40 min, a 4ºC. Los sobrenadantes se recogieron y
se filtraron con un filtro de 0,22 \mum de tamaño de poro
(Millipore Corp., Bedford, MA).
El antígeno se purificó según el siguiente
procedimiento:
- \bullet
- preparar la disolución de fenol mezclando 90 g de cristales de fenol con 100 ml de agua destilada.
- \bullet
- mezclar un volumen igual de la disolución de fenol con un volumen igual del extracto bruto en tubos Corex^{TM}, mezclando mediante inversión y dejando reposar durante 30 min a temperatura ambiente.
- \bullet
- centrifugado a 12.000 x g, a 4ºC durante 30 min.
- \bullet
- tras la primera centrifugación se obtuvieron dos fases, con una interfase de material insoluble. La fase fenólica se recogió con una pipeta Pasteur^{TM} y el volumen se midió en un cilindro graduado.
- \bullet
- mezclar un volumen igual de la fase fenólica (primera extracción) con un volumen igual de la fase acuosa en tubos Corex^{TM}, mezclando mediante inversión, y dejar reposar durante 30 min a temperatura ambiente.
- \bullet
- centrifugado a 12.000 x g, a 4ºC durante 30 min.
- \bullet
- la fase fenólica se recogió, y el volumen se midió en un cilindro graduado.
- \bullet
- mezclar un volumen igual de la fase fenólica (segunda extracción) con un volumen igual de la fase acuosa en tubos Corex^{TM}, mezclando mediante inversión, y dejar reposar durante 30 min a temperatura ambiente.
- \bullet
- durante este período, preparar la membrana de diálisis impregnándola con agua destilada durante un periodo de tiempo suficiente.
- \bullet
- centrifugado a 12.000 x g, a 4ºC durante 30 min.
- \bullet
- la fase acuosa se recogió, y el volumen se midió en un cilindro graduado.
- \bullet
- la fase fenólica (tercera extracción) se dializó frente a 3 x 12 l de agua destilada para eliminar los restos de fenol, no dializar durante más de 24 horas.
Se obtuvieron los sueros de varios cerdos en el
matadero a partir de una piara sin patógeno específico; los sueros
se mezclaron y se añadió tiomersal (comercializado por Sigma, St-
Louis, MO 14508, EE.UU., nº de catálogo T- 5125) hasta obtener una
concentración final del 0,01%. No se ha informado de antecedentes
de A. pleuropneumoniae en esta piara desde hace al menos
cuatro años. Los sueros se probaron usando la técnica ELISA frente
a todos los serotipos de A. pleuropneumoniae en el
laboratorio de pleuroneumonía de la Facultad de Medicina
Veterinaria de la Universidad de Montreal.
Se usó la cepa de A. pleuropneumoniae de
serotipo 2 (cepa ATCC 27089) para la producción bacteriana. Se
resuspendió el contenido de un vial en un ml de medio líquido PPLO
(Difco Laboratories, Detroit, MI) y se inoculó hasta el agotamiento
en dos placas de agar con PPLO. Las placas se incubaron
aeróbicamente durante 18 horas a 37ºC.
La producción bacteriana para la inmunización de
los cerdos se efectuó según el siguiente procedimiento:
- \bullet
- recoger unas pocas colonias aisladas con una gasa estéril y resuspenderlas en un caldo PPLO.
- \bullet
- se inocularon a confluencia 5 placas de agar con PPLO con el caldo y las gasas estériles. Se inoculó una placa de agar de Mueller-Hinton con el caldo restante para que sirviera como control negativo. Una placa de agar con PPLO se inoculó hasta el agotamiento.
- \bullet
- después, estas placas se incubaron 18 horas a 37ºC. Una placa se usa para el serotipado.
- \bullet
- tras la incubación, recoger el crecimiento bacteriano añadiendo 3,0 ml de PBS-formaldehído al 0,5% a cada placa, y se mezcló con un palo de hockey hecho con una pipeta Pasteur^{TM} estéril, y recuperar la suspensión con una pipeta.
- \bullet
- la suspensión bacteriana obtenida se colocó en un frasco estéril, se mezcló bien y se incubó 18 horas a temperatura ambiente.
- \bullet
- la densidad óptica se leyó a 540 nm y se ajustó a 1,0 con una disolución de PBS-formaldehído al 0,5%.
- \bullet
- la disolución se conservó a 4ºC hasta su uso, o durante un máximo de una semana.
Para la inmunización se obtuvieron cuatro
lechones de cinco semanas de edad a partir de una piara sin
patógeno específico. No se ha informado nunca de antecedentes de
A. pleuropneumoniae en esta piara desde hace al menos cuatro
años, y no se observan lesiones pulmonares en el matadero. A su
llegada se verifica el estado de salud general de los lechones. Los
lechones son alimentados a demanda con alimento de iniciación de
engorde para cerdos (15/30 CO-OP). Después de unos
pocos días de adaptación, se toma una muestra de sangre de cada
animal. Los sueros se probaron usando la técnica ELISA frente a
todos los serotipos de A. pleuropneumoniae en el laboratorio
de pleuroneumonía de la Facultad de Medicina Veterinaria de la
Universidad de Montreal. Los sueros fueron negativos para todos los
serotipos.
Los cerdos se inmunizaron por vía intravenosa
con 5 ml de la suspensión bacteriana cada tres semanas, y así hasta
que el título de ELISA da un valor igual o superior a 1,0. Los
cerdos se desangraron y se mezclaron los sueros de todos los
animales.
Para evaluar la eficacia y la fiabilidad de los
kits de la presente invención se usaron dos procedimientos de
ELISA. En el primer procedimiento, las placas se usan
inmediatamente después de la sensibilización, los períodos de
incubación son de una hora, y se usa ABTS (ácido
2,2-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfónico)
como cromógeno. En el segundo procedimiento, las placas se tratan
con HRP (disolución estabilizante del conjugado, comercializada por
Calbiochem-Novabiochem Corporation, La Jolla, CA
92039, EE.UU., nº de catálogo 516534) después de la
sensibilización, los periodos de incubación son de 15 min y se usa
TMBLue^{TM} como cromógeno.
El ELISA consiste en:
- \bullet
- diluir en 1,5 ml de antígeno en 73,5 ml de tampón de PBS-EDTA, pH 7,3.
- \bullet
- añadir 100 \mul de antígeno a cada pocillo.
- \bullet
- precintar la placa con una lámina de acetato.
- \bullet
- incubar hasta el día siguiente a 4ºC.
Para la evaluación del kit, para los ensayos de
estabilidad, así como para los ensayos visuales, las placas se
tratan con HRP. El contenido de los pocillos se vacía y se añaden
100 \mul de HRP a cada pocillo. Las placas se conservan a 4ºC
hasta su uso.
- \bullet
- recuperar la placa y vaciar su contenido.
- \bullet
- llenar cada pocillo con tampón PBS-Tween^{TM}-20.
- \bullet
- vaciar el contenido de la placa.
- \bullet
- repetir estas etapas cuatro veces.
- \bullet
- agitar 2-3 veces sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de la disolución de lavado.
- \bullet
- los sueros se diluyen a 1/200 en tampón PBS-Tween^{TM}-20 y se distribuyen en la cantidad de 100 \mul a cada pocillo.
- \bullet
- agitar suavemente la placa para asegurar la distribución de las muestras por el fondo de los pocillos. Cubrir la placa con una lámina de acetato.
- \bullet
- dejar reposar la placa durante una hora a temperatura ambiente para el ELISA que usa ABTS, o durante 15 min a entre 18ºC y 22ºC para el ELISA que usa TMBLue^{TM}.
- \bullet
- recuperar la placa y vaciar su contenido.
- \bullet
- llenar cada pocillo con tampón PBS-Tween^{TM}-20.
- \bullet
- vaciar el contenido de la placa.
- \bullet
- repetir estas etapas cuatro veces.
- \bullet
- agitar 2-3 veces sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de la disolución de lavado.
- \bullet
- el conjugado consiste en la fracción G de inmunoglobulina marcada con peroxidasa de rábano picante de antisuero de conejo contra la IgG porcina (Jackson Immuno Research Laboratories Inc., nº de catálogo 114-035-003). El conjugado se usa a una dilución final de 1/6000. El conjugado se distribuye en la cantidad de 100 \mul a cada pocillo de la placa.
- \bullet
- agitar suavemente la placa para asegurar la distribución de las muestras por el fondo de los pocillos. Cubrir la placa con una lámina de acetato.
- \bullet
- dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante una hora para el ELISA que usa ABTS, o durante 15 min para el ELISA que usa TMBLue^{TM}.
- \bullet
- recuperar la placa y vaciar su contenido.
- \bullet
- llenar cada pocillo con tampón PBS-Tween^{TM}-20.
- \bullet
- vaciar el contenido de la placa.
- \bullet
- repetir estas etapas dos veces.
- \bullet
- agitar 2-3 veces sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de la disolución de lavado.
Este se usó únicamente para validar el kit de la
presente invención o para obtener un valor espectrofotométrico.
- \bullet
- la reacción se visualizo usando H_{2}O_{2} al 3% y ABTS (ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfónico) 40 mM (Sigma Chemical) en una disolución de citrato 50 mM (pH 5,0). Añadir 100 \mul de esta disolución de citrato-ABTS a cada pocillo de la placa.
- \bullet
- agitar suavemente la placa para asegurar la distribución de las muestras por el fondo de los pocillos.
- \bullet
- dejar reposar la placa durante 30 min a temperatura ambiente (entre 18ºC y 22ºC).
La densidad óptica se leyó a 414 nm usando un
lector de placas automatizado (MR5000^{TM}, Dynatech Laboratories
Inc.).
Los resultados se calcularon según el siguiente
procedimiento:
1- Se verificaron los valores de los ocho
pocillos BL (blanco):
- \bullet
- un valor inferior a 0,08 indica una prueba válida, continuar la lectura.
- \bullet
- un valor superior a 0,08 indica una prueba no válida, repetir la prueba con un nuevo kit o ponerse en contacto con el fabricante del kit.
2- Los valores medios de los controles negativos
y positivos se calculan como sigue (véase la Fig. 1 para la
identificación de los pocillos):
- Control positivo = ((A1 + E1 + A7 + E7)/4) - media de BL
- Control negativo = ((B1 + F1 + B7 + F7)/4) - media de BL
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- añadir 100 \mul de TMBLue^{TM} a cada pocillo de la placa.
- \bullet
- agitar suavemente la placa para asegurar la distribución de las muestras por el fondo de los pocillos.
- \bullet
- dejar reposar la placa durante entre 5 y 15 min a temperatura ambiente (entre 18ºC y 22ºC).
La lectura visual se efectuó sin ningún
instrumento de lectura, como sigue:
Los resultados se calcularon según el siguiente
procedimiento:
- 1-
- Se verifica el color de los ocho pocillos BL (blanco) y el de los controles negativos; debería ser incoloro.
- 2-
- Se verifica el color de los controles positivos; debería ser azul oscuro.
- 3-
- Se verifica el color del CPFA (control positivo débil); debería ser azul claro.
- 4-
- El resultado de cada muestra debe cuantificarse como sigue:
- 0 = pocillo incoloro o ligeramente azulado
- 1+ = pocillo de un color azul claro
- 2+ = pocillo de un color azul
- 3+ = pocillo de un color azul oscuro
- 4+ = pocillo de un color azul oscuro
Se efectuó la lectura con un espectrofotómetro y
se calculó según se describe en la sección 8a anterior. El control
positivo debería presentar una densidad óptica \geq 1,0 para
aceptar la placa.
El propósito de estas series de pruebas consiste
en verificar la reproducibilidad de la unión del antígeno en el
fondo de los pocillos de la placa. Se determinó la variación en la
fijación del antígeno entre los pocillos de una misma placa. Se
sensibilizó cada uno de los 96 pocillos de las tres placas con una
dilución a 1/50 de antígeno de A. pleuropneumoniae de
serotipo 2, las placas se usaron inmediatamente después de su
sensibilización, según el procedimiento
ELISA-TMBLue^{TM}. Los sueros de control se
distribuyeron en tres placas. El suero de control positivo se usó
en 17 pocillos de las tres placas, y el suero de control negativo
en 16 pocillos. Cada uno de los seis campos de suero de control se
distribuyó en ocho pocillos de cada placa. Los resultados se
presentan en la Tabla 1.
Se verificó la especificidad del antígeno usando
sueros de cerdos infectados experimentalmente con cepas de A.
pleuropneumoniae de diferentes serotipos, o con otros tipos de
bacterias. Se usó el procedimiento ELISA con ABTS como
cromógeno.
El antígeno dio reacciones positivas con los
sueros procedentes de cerdos infectados experimentalmente con cepas
de A. pleuropneumoniae de serotipo 2, y reacciones negativas
con sueros procedentes de cerdos infectados experimentalmente con
las cepas de A. pleuropneumoniae de los serotipos 1, 3, 4,
5, 7, 9, 10, 11 y 12 (Tabla 2). Los sueros de los cerdos inoculados
con H. parasuis, P. multocida, E. coli o A. suis
dieron reacciones negativas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En segundo lugar, las placas se trataron con HRP
tras la sensibilización con el antígeno, y se usó la técnica de
ELISA-TMBLue^{TM} (Tabla 3).
Los sueros CP, EP1 y EP2 dieron respuestas
positivas. El suero CP procedía de un conjunto de sueros obtenido
tras la inoculación de lechones de dos a cinco semanas de edad con
la cepa de referencia de A. pleuropneumoniae. Los sueros EP1
y EP2 se obtuvieron a partir de animales de una piara que mostraba
una infección aguda y en la que se observa frecuentemente una
mortalidad por A. pleuropneumoniae de serotipo 2. Los sueros
CN, EN1 y EN2 dieron respuestas negativas. El suero CN procedía de
un conjunto de sueros porcinos tomado a partir de una piara SPF (sin
patógeno específico) para la cual no se había informado de
antecedentes de pleuroneumonía, en el matadero, desde hace al menos
cuatro años. Los sueros EN1 y EN2 procedían de cerdos de dos piaras
sin antecedentes de pleuroneumonía y sin lesiones en el matadero.
Los sueros ED1 y ED2 dieron unas respuestas positivas débiles
mediante ELISA. Estos sueros se obtuvieron a partir de dos cerdos
de una piara infectada de forma crónica por A.
pleuropneumoniae de serotipo 2. Estos dos sueros se consideran
positivos débiles; de hecho, han sido clasificados por el servicio
de pleuroneumonía de la Facultad de Medicina Veterinaria (VMF) de
la Universidad de Montreal como sueros débilmente positivos
mediante la prueba de referencia de ELISA.
Durante los estudios preliminares se evaluaron
diferentes técnicas de fijación del antígeno, diferentes tampones,
así como diferentes procedimientos de conservación de las placas.
El procedimiento elegido con respecto a la fijación del antígeno
consiste en diluir 1,5 ml de antígeno en 73,5 ml de tampón de
PBS-EDTA, pH 7,3. Entonces se distribuyen \mul de
esta disolución en cada pocillo de las placas de 96 pocillos
(Nunc^{TM}), y las placas se incuban 18 horas a 4ºC. El contenido
de las placas se vacía y se añaden 100 \mul de HRP a cada
pocillo. Las placas se conservan a 4ºC. La estabilidad de las placas
se evalúa mensualmente. Además de los tres controles incluidos en
el kit, se usan ocho sueros adicionales para el estudio de
estabilidad. Estos sueros se conservan a -20ºC y se usa una nueva
alícuota para cada ensayo. El kit es validado según se describe en
el protocolo de utilización. Según se muestra en la Tabla 4, el kit
es estable durante al menos 6 meses.
Se preparó un lote de tres kits completos. Se
obtuvieron seis (6) sueros diferentes del laboratorio de serología
de la VMF; se dio un kit, así como una alícuota de cada suero sin
diluir, a diferentes usuarios. Se obtuvieron resultados idénticos
por parte de los tres usuarios diferentes (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, con objeto de verificar la
sensibilidad y la especificidad del kit de la presente invención,
se prepararon varios kits completos. Se obtuvo un total de 259
sueros del laboratorio de serología de pleuroneumonía de la
Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Montreal.
Estos sueros habían sido clasificados por este laboratorio, y
habían sido obtenidos a partir de piaras con una condición
sanitaria bien conocida. Los 117 sueros clasificados como negativos
por el laboratorio de serología de pleuroneumonía fueron
confirmados como negativos con el kit de la presente invención. De
entre los 142 sueros clasificados como positivos por el laboratorio
de serología de pleuroneumonía, 2 sueros dieron una respuesta de 1+
con el kit de la presente invención, y los restantes 140 sueros
dieron una respuesta de 2-4+ con el mismo (Tabla
6).
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la sensibilidad y la
especificidad de una prueba se lleva a cabo bien usando poblaciones
animales con una condición que sea claramente identificada como
"infectados" o como "sanos", o bien comparando los
resultados de la prueba con una prueba de referencia, un
"golden test". Según la presente invención, se usaron
ambos procedimientos.
Se usaron unos sueros con una condición bien
definida, 85 sueros de cerdos infectados experimentalmente con
cepas de A. pleuropneumoniae de diferentes serotipos, o con
diferentes bacterias. A continuación se usaron ocho sueros
adicionales de cerdos con una condición bien definida: un suero
procedía de un cerdo infectado experimentalmente con A.
pleuropneumoniae de serotipo 2 (cepa ATCC 27089), un suero
procedía de un conjunto de sueros de cerdos sin patógeno específico
(SPF) y seis sueros porcinos procedían de cerdos pertenecientes a
diferentes piaras con una condición bien definida.
El kit de ELISA de la presente invención dio una
respuesta positiva únicamente con los sueros procedentes de cerdos
infectados experimentalmente o de forma natural con A.
pleuropneumoniae de serotipo 2. Los sueros de cerdos infectados
experimentalmente con cepas de A. pleuropneumoniae de los
serotipos 1, 2, 3, 5, 9, 10, 11 y 12 y 11; H. parasuis, P.
multocida, E. coli o A. suis, así como los dos conjuntos
de sueros procedentes de cerdos SPF, dieron respuestas negativas.
Los sueros ED1 y ED2 procedían de cerdos con ningún signo clínico
de pleuroneumonía, pero se habían observado evidencias de una
infección por A. pleuropneumoniae de serotipo 2 en la piara.
Estos sueros se consideraron, por tanto, como débilmente
positivos.
El kit de ELISA de la presente invención es
estable a 4ºC durante al menos 6 meses. Los estudios de estabilidad
todavía están en curso.
La especificidad y la sensibilidad del kit de la
presente invención también fueron evaluadas usando 259 sueros
porcinos. Estos sueros fueron proporcionados por el laboratorio de
pleuroneumonía de la Facultad de Medicina Veterinaria de la
Universidad de Montreal. Este laboratorio fue considerado como el
laboratorio de referencia con respecto a la serología de
Actinobacillus pleuropneumoniae, y los resultados obtenidos
por este laboratorio se consideraron como el "golden
test". Este laboratorio ha venido analizando entre 30.000 y
40.000 sueros porcinos por año durante más de 10 años. La
metodología usada por el laboratorio de pleuroneumonía consiste en
una técnica de ELISA normalizada, con objeto de determinar la
presencia de anticuerpos. En este laboratorio ya no se usa la
prueba de fijación del complemento, debido a su carencia de
sensibilidad y especificidad. El laboratorio de serología ha
desarrollado su prueba de ELISA normalizada comparando diferentes
tipos de antígeno (Gottschalk, M. y col., 1994, Vet.
Microbiol., 42: 91-104). En vista del
gran número de sueros recibido por este laboratorio, los resultados
obtenidos por el mismo se consideraron como referencia. La
condición de los sueros así obtenidos por este laboratorio, ya sea
positiva o negativa, quedó por tanto bien certificada. Se observó
una correlación del 100% entre los resultados obtenidos con el kit
de la presente invención y la clasificación del laboratorio de
serología. Todos los sueros clasificados como negativos por el
laboratorio de serología de referencia fueron determinados, por
tanto, como negativos por el kit de la presente invención. Si se
consideran los positivos débiles o los positivos 1+ como positivos,
todos los sueros clasificados como positivos por el laboratorio de
referencia dieron una respuesta positiva usando el kit de la
presente invención.
El kit de la presente invención difiere del
procedimiento de ELISA usado por el laboratorio de serología de
referencia. En el procedimiento usado por este último, el antígeno
es fijado a las placas en un tampón de PBS, y las placas se usan
inmediatamente después de la fijación del antígeno. Además, el
laboratorio de serología utiliza un protocolo de lectura
informatizado para la determinación de los anticuerpos en las
muestras (Trottier, Y. L. y col., 1992, J. Clin. Microbiol.,
30: 46-53).
En el caso del kit de la presente invención, el
antígeno se purifica usando un antígeno retenido en la fracción
fenólica (no en la fracción acuosa), y la fijación del antígeno es
diferente. De hecho, el antígeno purificado es resuspendido en un
tampón de PBS-EDTA que a continuación se añade a los
pocillos de las placas. Después de una incubación de 18 h, se añade
un tampón de HRP a cada pocillo. Entonces los anticuerpos de las
muestras se determinan visualmente añadiendo un cromógeno,
preferiblemente TMBLue^{TM}.
Cuando se compara con el procedimiento de ELISA
normalizado usado por el laboratorio de serología, el kit de la
presente invención muestra una sensibilidad y una especificidad del
100%. Además, el kit de la presente invención es más rápido de usar
que el procedimiento de ELISA-ABTS de la técnica
anterior. De hecho, usando el kit de la presente invención se
obtienen resultados en menos de una hora, mientras que se requiere
un mínimo de tres horas para el procedimiento de
ELISA-ABTS, además de la etapa requerida hasta el
día siguiente para la fijación del antígeno. Adicionalmente, el ABTS
está considerado como potencialmente carcinógeno, además de ser
sólo moderadamente estable.
El kit de la presente invención se usa
fácilmente y proporciona rápidos resultados. El kit puede usarlo un
veterinario con un mínimo de experiencia, puede usarse en el campo
en el que están los animales y no requiere conocimientos de
laboratorio, dado que sólo hay que realizar unas etapas simples.
Además, este kit ha demostrado proporcionar unos resultados fiables
y reproducibles independientemente del usuario. Los resultados
obtenidos con el kit de la presente invención son idénticos a los
obtenidos por el laboratorio de pleuroneumonía de la VMF. El kit de
la presente invención es, por tanto, altamente ventajoso en
comparación con las pruebas de laboratorio disponibles actualmente
con respecto a su rapidez, fiabilidad, sensibilidad, especificidad,
estabilidad y coste.
Mientras que la invención se ha descrito en
relación con formas de realización específicas de la misma, se
comprenderá que es susceptible de modificaciones adicionales, y
esta solicitud pretende cubrir cualquier variación, uso o
adaptaciones de la invención que sigan, en general, los principios
de la invención y que incluyen desviaciones de la presente
descripción, tales como las que surgen en la práctica conocida o
habitual en la materia a la que pertenece la invención, y que
puedan ser aplicadas a las características esenciales establecidas
a continuación, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones
anexas.
Claims (14)
1. Un kit diagnostico mediante ELISA para el
ensayo de anticuerpos de A. pleuropneumoniae de serotipo 2
en el suero de cerdos que comprende, en un envase por separado:
- a)
- un soporte sólido que tiene unido al mismo un antígeno purificado de lipopolisacárido de Actinobacillus pleuropneumoniae de serotipo 2 para una unión específica a anticuerpos anti-A. pleuropneumoniae de serotipo 2 presentes en el suero de cerdos, almacenándose dicho antígeno en una disolución que comprende una disolución estabilizante de peroxidasa de rábano picante que mantiene dicho antígeno unido estable durante al menos 25 semanas a 4ºC; y opcionalmente
- b)
- suero de cerdos inoculados experimentalmente con una cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2 que sirve como control positivo;
- c)
- suero porcino de una piara sin patógeno específico que sirve como control negativo;
- d)
- un conjugado marcado de forma detectable que se une a los anticuerpos porcinos unidos a la placa de a).
2. El kit de la reivindicación 1, que comprende
adicionalmente lo siguiente:
- e)
- un sustrato que permita la visualización del conjugado marcado de forma detectable.
3. El kit de la reivindicación 2, en el que
dicho conjugado marcado de forma detectable comprende un marcaje
enzimático.
4. El kit de la reivindicación 3, en el que
dicho sustrato es una composición que proporciona una señal
colorimétrica, fluorimétrica o quimioluminiscente en presencia de
dicho marcaje enzimático.
5. El kit de la reivindicación 3, en el que
dicho conjugado marcado de forma detectable comprende
inmunoglobulinas anti-IgG porcina acopladas a
peroxidasa.
6. El kit de la reivindicación 4, en el que
dicha composición colorimétrica es TMBLue^{TM}
7. El kit de la reivindicación 6, en el que
cualquiera de dicho suero de control positivo o negativo es suero
liofilizado.
8. El kit de la reivindicación 7, en el que
dicho suero está en la cantidad de aproximadamente 0,4 ml de suero
liofilizado.
9. El kit de la reivindicación 1, en el que
dicho soporte sólido es una placa de 96 pocillos.
10. El kit de la reivindicación 1, en el que el
soporte sólido es una placa.
11. El kit de la reivindicación 1, en el que el
conjugado marcado de forma detectable es un vial conjugado de
inmunoglobulinas anti-IgG porcina acopladas a
peroxidasa.
12. El kit de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente unos viales de control positivo débil de
suero procedente de cerdos inoculados experimentalmente con una
cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2.
13. El kit de la reivindicación 1, que
comprende además una composición colorimétrica constituida por
TMBLue^{TM} o ABTS.
14. Un procedimiento para la preparación del
kit de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
- a)
- purificar el antígeno de lipopolisacárido de Actinobacillus pleuropneumoniae de serotipo 2 mediante extracción con fenol y centrifugación de dicho extracto bruto bacteriano antigénico;
- b)
- fijar el antígeno de la etapa a) a un soporte sólido y estabilizar dicho antígeno fijado en una solución que comprende solución estabilizante de peroxidasa de rábano picante que mantiene dicho antígeno unido estable durante al menos 25 semanas a 4ºC;
- c)
- inmunizar animales no humanos con una cepa de A. pleuropneumoniae de serotipo 2 y recoger suero, para que sirvan como sueros de control positivo; y
- d)
- recoger sueros de piaras sin A. pleuropneumoniae para que sirvan como sueros de control negativo.
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