ES2311423A1 - Inmunoensayo de doble reconocimiento para la deteccion de anticuerpos. - Google Patents
Inmunoensayo de doble reconocimiento para la deteccion de anticuerpos. Download PDFInfo
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Abstract
El inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos específicos de un antígeno diana en una muestra comprende poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos específicos de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador; y detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador. El inmunoensayo puede utilizarse, entre otras aplicaciones, en el diagnóstico de infecciones causadas por organismos patógenos con elevada sensibilidad y especificidad.
Description
Inmunoensayo de doble reconocimiento para la
detección de anticuerpos.
La invención se relaciona, en general, con un
inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de
anticuerpos en una muestra, de elevada especificidad y
sensibilidad. La invención también se relaciona con un kit que
comprende los componentes necesarios para llevar a cabo dicho
inmunoensayo.
Un inmunoensayo es un ensayo basado en la
especificidad de la unión antígeno-anticuerpo que
permite detectar, y, opcionalmente, cuantificar, antígenos o
anticuerpos. Los inmunoensayos pueden clasificarse en inmunoensayos
que utilizan reactivos (antígenos o anticuerpos)
no-marcados y los inmunoensayos que utilizan
reactivos marcados en los cuales el reactivo (antígeno o
anticuerpo) está marcado con un marcador, tal como un isótopo
radiactivo, una enzima, un fluoróforo o una sustancia implicada en
una reacción (quimio) luminiscente, dando lugar a los denominados
radioinmunoensayos (e.g., RIA, IRMA), inmunoensayos enzimáticos
(e.g., EMIT, CEDIA, ELISA), fluoroinmunoensayos (e.g., FPIA, SLFIA,
FETI, DELFIA) o luminoinmunoensayos, respectivamente.
Entre los inmunoensayos que utilizan reactivos
marcados se encuentran los inmunoensayos homogéneos y los
inmunoensayos heterogéneos; estos últimos comprenden la realización
de una o más etapas de separación del antígeno o anticuerpo no
unido al otro miembro del par de unión (antígeno o anticuerpo) el
cual, en general, estará unido a una fase sólida o soporte, por
ejemplo, microplacas, partículas magnéticas, membranas de
nitrocelulosa, etc. Asimismo, dependiendo del diseño del ensayo,
los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos o no
competitivos, dependiendo de si el reactivo (antígeno o anticuerpo)
marcado se añade en cantidad limitada o en exceso,
respectivamente.
Los inmunoensayos permiten identificar antígenos
(técnicas directas) o bien anticuerpos frente a un antígeno
(técnicas indirectas). Entre estas técnicas indirectas se
encuentran los inmunoensayos indirectos y los inmunoensayos de
bloqueo o competición. Los inmunoensayos indirectos, a pesar de
tener una elevada sensibilidad, presentan problemas de
especificidad por los falsos positivos obtenidos, normalmente por
los problemas de fondo inespecífico. Además, no permiten detectar
IgMs porque normalmente se usan anticuerpos
anti-IgGs, por lo que no detectan a los animales
positivos hasta las 2-3 semanas
post-infección o post-vacunación.
Los inmunoensayos de bloqueo o competición, en general, son más
específicos que los inmunoensayos indirectos pero menos
sensibles.
Debido a la especificidad y sensibilidad de los
inmunoensayos, se han desarrollado numerosos inmunoensayos para
diversas aplicaciones, tanto para su empleo en el análisis de
muestras medioambientales o de alimentos como con fines de
diagnóstico. Entre las infecciones causadas por virus animales que
pueden ser diagnosticadas mediante inmunoensayos se encuentran, a
modo ilustrativo, la Lengua Azul y el Síndrome Respiratorio y
Reproductivo Porcino (PRRS).
La Lengua Azul es una enfermedad causada por el
virus de la Lengua Azul (BTV, del inglés "Blue Tongue Virus"),
un arbovirus que infecta de forma natural a rumiantes domésticos y
salvajes, camélidos y algunos otros herbívoros, tales como
elefantes, aunque la enfermedad afecta casi exclusivamente a las
ovejas, originando cursos clínicos agudos o subagudos. En vacas y
cabras, la enfermedad clínica es rara, y, cuando se presenta, es
mucho más suave que en ovejas. La oveja afectada puede morir
después de una enfermedad aguda o crónica, o puede recuperarse con
la pérdida de peso y/o roturas de lana. Actualmente existen 24
serotipos de BTV reconocidos. Las pruebas recomendadas para la
detección de anticuerpos y serogrupos específicos de BTV incluyen
la inmunodifusión en gel de agar y un ELISA competitivo,
preferentemente éste último debido a su mayor exactitud y
adaptación a rápidas pruebas convencionales de laboratorio y
tecnología de lectura. La prueba recomendada para detectar
anticuerpos de serotipos específicos del BTV es el test de
neutralización.
El virus causante del síndrome reproductivo y
respiratorio porcino (PRRSV, del inglés "Porcine Reproductive and
Respiratory Virus") es un arterivirus que causa el síndrome
reproductivo y respiratorio porcino (PRRS). Dicho virus puede causar
problemas reproductivos importantes en cerdas adultas que pueden
terminar en abortos así como problemas respiratorios, entre otros,
en cerdos neonatos o en cerdos en desarrollo. La patente europea EP
952219 B1 describe un método para el diagnóstico de PRRSV que
comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con
una proteína de fusión recombinante que comprende la secuencia de
aminoácidos de la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV
fusionada a un fragmento de la proteína del gen 10 del fago
T7.
T7.
Ahora se ha observado, sorprendentemente, que la
adición de un conjugado que comprende un antígeno y un marcador a
un complejo antígeno-anticuerpo aumenta la
especificidad y sensibilidad de un inmunoensayo para la detección de
anticuerpos específicos de dicho antígeno.
El inmunoensayo proporcionado por esta invención
ha sido denominado "inmunoensayo de doble reconocimiento" ya
que comprende el reconocimiento y unión de dos unidades del
antígeno diana al anticuerpo específico de dicho antígeno diana,
uno de ellos formando parte de un conjugado que comprende dicho
antígeno diana y un marcador. Dicho inmunoensayo ha sido validado
en sueros de referencia para los 24 serotipos de virus de lengua
azul (BTV) reconocidos (Ejemplo 1) así como en la detección de
anticuerpos específicos del virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (PRRSV) (Ejemplo 3) y posee una elevada
especificidad y sensibilidad, tal como se pone de manifiesto en el
Ejemplo 2.
Dicho inmunoensayo de doble reconocimiento se
puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar,
anticuerpos específicos de antígenos de organismos patógenos en una
muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la
infección causada por un organismo, tal como un organismo patógeno
en un sujeto susceptible de ser infectado por dicho organismo, así
como para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos
específicos de antígenos tumorales en una muestra de ensayo de un
sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de un tumor o
de un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser humano, o
para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos
de alergenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este
modo, diagnosticar la existencia de una reacción alérgica frente a
dicho alergeno en 1 dicho sujeto, preferentemente, en un ser
humano.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un un aspecto, la invención se relaciona con un
inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno
diana en una muestra que comprende poner en contacto dicho antígeno
diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo
específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la
formación de un complejo antígeno-anticuerpo, añadir
un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo
condiciones que permiten la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador,
y detectar dicho complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit que comprende un soporte que comprende un antígeno diana y
un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
inmunoensayo, en adelante inmunoensayo de la invención, para
detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una
muestra que comprende:
- a)
- poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo;
- b)
- añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador; y
- c)
- detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
El inmunoensayo de la invención permite detectar
anticuerpos específicos de antígenos diana en una muestra de
ensayo. Un anticuerpo es una inmunoglobulina producida por células
de la serie de los linfocitos B y secretadas por células plasmáticas
en respuesta a una estimulación por un antígeno, que reconoce
específicamente dicho antígeno y es capaz de unirse selectivamente
a dicho antígeno.
El término "antígeno", tal como aquí se
utiliza, se refiere, en general, a cualquier sustancia capaz de
unirse específicamente a un anticuerpo, o de inducir una respuesta
inmunitaria o de inducir la formación de anticuerpos, e incluye
células (e.g., células tumorales, etc.), organismos (e.g., virus,
bacterias, hongos, protozoos, nematodos, etc.), tanto enteros como
partes o componentes de los mismos (e.g., proteínas, péptidos,
lipopolisacáridos, carbohidratos, etc.), de origen nativo, sintético
o recombinante, idénticos o similares (es decir, capaces de ser
reconocidos por anticuerpos específicos de antígenos nativos) a los
antígenos nativos de un organismo o de una célula, alergenos, etc.
Prácticamente cualquier antígeno puede ser utilizado en la puesta en
práctica del inmunoensayo de la invención para detectar anticuerpos
específicos de dicho antígeno (antígeno diana).
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
antígenos virales incluyen antígenos de virus infecciosos y/o
patógenos de animales, incluyendo seres humanos, tales como virus
de las familias: Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae,
Birnaviridae, Bungaviridae, Caliciviridae, Coronoviridae,
Filoviridae, Flaviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae,
Iridoviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae,
Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae,
Rhabdoviridae, Togaviridae, etc., que incluyen arbovirus,
arterivirus, birnavirus, calicivirus, citomegalovirus, herpesvirus,
papilomavirus, parvovirus, pestivirus, poliovirus, retrovirus,
rhinovirus, rotavirus, etc. Entre dichos virus se encuentran virus
patógenos de ganado porcino, por ejemplo, parvovirus porcino (PPV),
el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV),
el virus de la enfermedad de Aujesky (ADV), el virus de la fiebre
aftosa (FDMV), el virus de la gastroenteritis porcina transmisible
(TGEV), el circovirus porcino, etc.; patógenos de ganado bovino,
tales como el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el virus de
la rinotraqueitis bovina (IBRV), el virus de la lengua azul (BTV),
etc.; patógenos de conejos, tales como el virus de la enfermedad
hemorrágica del conejo (RHDV), etc.; patógenos de aves, por
ejemplo, el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), el pneumovirus
aviar, etc. En una realización particular, dicho virus es el virus
de la lengua azul (BTV) o el virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (PRRSV).
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
antígenos bacterianos incluyen antígenos de bacterias patógenas de
animales, incluyendo seres humanos, tanto Gram positivas como Gram
negativas. Ejemplos específicos de bacterias patógenas incluyen:
Actinornyces israelli, Bacillus aratracis, Bacteroides sp.,
Bordetella sp., Borelia burgdorferi, Brucella sp., Campylobacter
sp. (e.g., C. jejuni), Clostridium sp. (e.g.,
C. perfringers, C. tetani), Corynebacterium sp.
(e.g., C. diphtlzeriae), Enterobacter aerogenes,
Enterococcus sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli,
Fusobacterium nucleatum, Helicobacter pylori, Haemophilus
influenzae, Klebsiella sp. (e.g., K. pyzeunaoniae),
Legionella pneumoplailia, Listeria monocytogenes, Leptospira,
Moraxella catarrhalis, Mycobacteria sp. (e.g., M
tuberculosis, M avium, M intracellulare, M. kansaii, M.
gordonae), Neisseria sp. (e.g., N. gonorrhoeae, N.
meningitidis), Pasteurella sp. (e.g., P.
multocida), Pseudomonas sp., Rickettsia sp., Salmonella sp.,
Staphylococcus sp. (e.g., S. aureus), Streptobacillus
moniliformis, Streptococcus sp. [e.g., S. pyogefaes
(Grupo A de Streptococcus), S. agalactiae (Grupo B de
Streptococcus), S. grupo viridans, S. faecalis, S. bovis,
Streptococcus (sp. anaeróbicas), S. pneumoniae],
Treponema sp. (e.g., T. pallidium, T. pertenue),
etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
antígenos de hongos incluyen antígenos de hongos patógenos de
animales, incluyendo seres humanos, tales como Blastomyces
dermatitidis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Coccidioides
immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum,
etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
antígenos de protozoos y nematodos incluyen antígenos de protozoos
y nematodos patógenos de animales, incluyendo seres humanos, tales
como Anaplasma marginale, Dirofilaria immitis, Leishmania sp.
(leishmaniasis), Plasmodium sp. (malaria) [e.g., P.
falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivaz], Schistosoma
sp., Toxoplasma sp. (e.g., T. gondii), etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
antígenos tumorales incluyen moléculas asociadas a un proceso
tumoral o canceroso capaces de provocar una respuesta inmune cuando
son presentadas en el contexto de una molécula del MHC. La selección
de antígenos tumorales puede ser realizada por un técnico en la
materia a la vista del estado de la técnica [Renkvist et
al., Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15
(2001)]. Ejemplos representativos, no limitativos, de dichos
antígenos tumorales incluyen: GD2 (neuroblastoma);
EGF-R (glioblastoma maligno); CD52 (leucemia);
proteína gp100 de melanoma humano; proteína
melan-A/MART-1 de melanoma humano;
tirosinasa; proteína NA17-A nt; proteína
MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7;
(CD11c)-TRP2; WT1 (leucemia y tumores sólidos);
HM1.24 (mieloma múltiple); mucina prostática (adenocarcinoma
prostático); antígeno específico de próstata (PSA); antígeno
SF-25 (adenocarcinoma de colon); antígenos asociados
con tumores de vejiga; MART-1 (melanoma); antígenos
tumorales asociados al cáncer de mama [e.g., Her2, mamaglobina, CA
15.3, CA 27.9, MCA (antígeno cáncer de mama), MSA (antígeno sérico
mama), BMA (antígeno mucínico), cerbB2, MUC1, áncer de tiroide
medular), etc.]; antígenos tumorales asociados al cáncer de ovario
[e.g., CAl25, SCC (teratoma inmaduro), BHCG (coriocarcinoma),
Her-2/neu, p21, etc]; antígenos tumorales asociados
al cáncer de pulmón [e.g., CD40, gp160, Cyfra-21.1,
MAGE-A3, MUT-1,
MUT-2, TPA, LAME, SWA20, SCC (antígeno células
escamosas), etc.]; antígenos tumorales asociados al cáncer de piel
[e.g., p97, gp75, EMA, MTA, MAGE-A1,
MAGE-A3, etc.]; antígenos tumorales asociados al
cáncer de colon [e.g., COA-1, CA19.9,
ND-4, CEA, TAG-72,
CA72-4; antígenos tumorales asociados a tumores
linfoides de células B [e.g., CD19, CD20, etc.]; antígenos tumorales
asociados a leucemia mieloide [e.g., CD33, etc.], antígenos
tumorales asociados a linfomas [e.g., CD 30, HSP70, etc.], etc., y
fragmentos antigénicos de dichos antígenos. Los antígenos tumorales
pueden ser preparados a partir de células tumorales o cancerosas
preparando extractos crudos de dichas células, por ejemplo, como
describe Cohen, et al., en Cancer Research, 54:1055 (1994),
purificando parcialmente los antígenos, mediante tecnología
recombinante o mediante síntesis de novo de antígenos
conocidos.
conocidos.
En una realización particular, dicho antígeno es
un alergeno, es decir, una sustancia a la que un sujeto es sensible
y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos
alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos
alergénicos de alimentos o de productos alimenticios, componentes
presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una
reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en
plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos alergenos incluyen
extractos alergénicos de gramíneas, arizónicas, platanáceas, olivo,
etc. (incluyendo de sus pólenes), extractos alergénicos de insectos
(e.g., ácaros del polvo, etc.), extractos alergénicos de alimentos
o productos alimenticios (e.g., gliadinas, gluten, pescado,
marisco, frutas, etc.). Prácticamente cualquier alergeno puede ser
utilizado en la puesta en práctica del inmunoensayo de la invención
para detectar anticuerpos específicos de dicho alergeno (antígeno
diana).
El inmunoensayo de la invención puede utilizarse
para detectar anticuerpos específicos de antígenos diana en una
muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos (muestra de
ensayo), tal como una muestra biológica, una muestra ambiental, una
muestra de laboratorio, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos
de muestras biológicas incluyen tanto muestras de tejidos como de
fluidos corporales susceptibles de contener anticuerpos específicos
de dicho antígeno diana (e.g., sangre, suero, plasma, leche,
saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo, exudados titulares,
etc.).
La muestra de ensayo puede ser una muestra de
origen animal sospechosa de contener anticuerpos específicos de
antígenos diana. En una realización particular, dicha muestra de
ensayo es una muestra de ganado bovino, canino, caprino, equino,
felino, leporino, ovino, porcino, etc., o una muestra de un ser
humano.
Antes de ponerse en contacto con el antígeno
diana, la muestra de ensayo puede ser sometida (o no) a un
tratamiento previo, precipitada, fraccionada, separada, diluida,
concentrada, o purificada.
En general, la muestra de ensayo se obtendrá por
métodos convencionales, conocidos por los técnicos en la materia,
dependiendo de la naturaleza de la muestra. En una realización
particular, dicha muestra de ensayo es una muestra biológica, tal
como una muestra de sangre, suero o plasma, que puede obtenerse por
cualquier método convencional, por ejemplo, mediante una extracción
de sangre, o una muestra de saliva, que puede obtenerse mediante el
empleo de torundas, etc.
De acuerdo con el imnunoensayo de la invención,
el antígeno diana se pone en contacto con dicha muestra sospechosa
de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno diana (es
decir, capaces de reconocer específicamente o de unirse
selectivamente a dicho antígeno diana) bajo condiciones que permiten
la formación de un complejo antígeno-anticuerpo
[etapa a)]. Si la muestra de ensayo contiene anticuerpos
específicos de dicho antígeno diana, entonces se formará dicho
complejo antígeno-anticuerpo; en caso contrario, no
se formará dicho complejo. Por tanto, según la invención, dicho
antígeno diana actúa como reactivo de captura de anticuerpos
específicos de dicho antígeno diana. Las condiciones adecuadas para
que tenga lugar la formación del complejo
antígeno-anticuerpo son conocidas por los expertos
en la materia.
Posteriormente, se añade un conjugado que
comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que
permiten la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
[etapa b)] y se detecta dicho complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
[etapa c)]. Si la muestra de ensayo contiene anticuerpos
específicos de dicho antígeno diana, se habrá formado previamente un
complejo antígeno-anticuerpo, con lo que, cuando se
pone en contacto dicho complejo antígeno-anticuerpo
con dicho conjugado que comprende el antígeno diana y el marcador,
en las condiciones adecuadas, se forma el complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador,
que será visualizado mediante la técnica apropiada dependiendo del
marcador utilizado, tal como se menciona más adelante; mientras
que, en caso contrario, es decir, cuando la muestra de ensayo no
contiene anticuerpos específicos de dicho antígeno diana, entonces
no se formará dicho complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación del
complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
son conocidas por los expertos en la
materia.
materia.
El término "marcador", tal como aquí se
utiliza, se refiere a un reactivo indicador que permite detectar el
complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador,
tal como una enzima que cataliza una reacción detectable, un
compuesto que genera una señal cuando forma parte del complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador,
etc. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho marcador puede ser
una enzima (e.g., peroxidasa, glicosidasa, fosfatasa alcalina,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
\beta-galactosidasa,
\beta-glucosidasa,
\beta-glucuronidasa, etc.), un compuesto
fluorescente o fluoróforo (e.g., fluoresceína, rhodamina, etc.), un
compuesto (quimio)luminiscente (e.g., dioxetanos,
acridinios, fenantridinios, rutenio, luminol, etc.), elementos
radiactivos (azufre, iodo, etc.), etc. En una realización
particular, dicho marcador es una peroxidasa. La selección de un
marcador particular no es critica, siempre y cuando sea capaz de
producir una señal por sí mismo o conjuntamente con unas o más
sustancias adicionales.
El conjugado que comprende dicho antígeno diana
y dicho marcador puede obtenerse por métodos convencionales
conocidos por los técnicos en la materia.
El complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
formado puede ser detectado o visualizado por cualquier técnica
apropiada, dependiendo del marcador elegido, conocida por los
técnicos en la materia, utilizando los dispositivos apropiados, por
ejemplo, mediante técnicas basadas en métodos colorimétricos,
fluorimétricos, (quimio)luminiscentes, radiactivos, etc.,
todas ellas conocidas por los técnicos en la materia.
A modo ilustrativo, cuando el marcador es una
enzima, la detección del complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un
sustrato apropiados y, opcionalmente, con los activadores y/o
agentes de amplificación enzimáticos apropiados. Ejemplos
ilustrativos de dichos sustratos incluyen:
- \bullet
- Para la fosfatasa alcalina:
- \quad
- Cromogénico: sustratos basados en p-nitrofenil fosfato (p-NPP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroblue tetrazolium (BCIP/NPT), etc.
- \quad
- Fluorogénico: fosfato de 4-metilumbelifenilo (4-MUP), 2-(5'-cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), 3,6-fluoresceín-difosfato (3,6-FDP), etc.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Para peroxidasas:
- \quad
- Cromogénico: sustratos basados en ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), o-fenilendiamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB) y 3-metil-2-benzotiazolinhidrazone (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y tetracloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB), etc.
- \quad
- Fluorogénico: ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluyendo el reactivo Amplex® Red, Amplex UltraRed, dihidroxantenos reducidos, etc.
- \bullet
- Para glicosidasas:
- \quad
- Cromogénico: sustratos basados en o-nitrofenil-\beta-D-galactósido (o-NPG), p-nitrofenil-\beta-D-galactósido y 4-metilumbelifenil-\beta-D-galactósido (MUG) para \beta-D-galactosidasa, etc.
- \quad
- Fluorogénico: resorufin \beta-D-galactopiranósido, fluorescein digalactósido (FDG), fluorescein diglucurónido, 4-metilumbeliferyl beta-D-galactopiranósido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranósido, cumarin beta-D-galactopiranósidos fluorados, etc.
En una realización particular, dicho marcador es
una peroxidasa, tal como la peroxidasa de rábano picante, y el
sustrato cromogénico es TMB.
El inmunoensayo de la invención también puede
ser utilizado para determinar la cantidad (cuantificar) de
anticuerpos específicos de un antígeno diana en una muestra de
ensayo ya que, con muchos marcadores, e.g., enzimas, la cantidad de
anticuerpo presente en la muestra de ensayo es proporcional a la
señal generada.
El inmunoensayo de la invención es un
inmunoensayo que utiliza antígenos marcados para detectar
anticuerpos, homogéneo o heterogéneo. En una realización
particular, dicho inmunoensayo es un inmunoensayo que utiliza
antígenos marcados, heterogéneo; ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de tales inmunoensayos incluyen, dependiendo del
marcador utilizado, inmunoensayos enzimáticos, tales como ELISA
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), fluoroinmunoensayos,
tales como DELFIA (fluoroinmunoensayo de disociación aumentada por
lantánidos), luminoinmunoensayos, radioinmunoensayos tales como RIA
(radioinmunoensayo heterogéneo y competitivo), IRMA
(radioinmunoensayo heterogéneo y no competitivo), etc. En una
realización particular, dicho inmunoensayo es un ELISA.
Para realizar dichos inmunoensayos heterogéneos,
el antígeno diana se inmoviliza, directa o indirectamente, sobre un
soporte, tal como un pocillo de una placa de microtitulación,
perlas magnéticas, perlas no magnéticas, columnas, matrices,
membranas, etc. Estos materiales se pueden utilizar en las formas
convenientes, tales como películas, hojas, placas, etc., o pueden
utilizarse para recubrir portadores inertes (e.g., papel, cristal,
películas de plástico, etc.). La inmovilización del antígeno diana
sobre dicho soporte incluye interacciones iónicas, hidrofóbicas,
covalentes y/o similares.
En una realización particular, el antígeno diana
se inmoviliza, directa o indirectamente, sobre un soporte, tal como
un pocillo de una placa de microtitulación. La muestra de ensayo
sospechosa de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno
diana se incuba con dicho antígeno diana durante un periodo de
tiempo y bajo condiciones apropiadas para que se formen complejos
antígeno-anticuerpo. Después de lavar el pocillo
para retirar los reactivos no unidos al antígeno, se añade un
conjugado que comprende dicho antígeno diana unido a un marcador y
se deja incubar durante un periodo de tiempo y bajo condiciones
apropiadas para que se formen complejos
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
Tras lavar para retirar los reactivos no unidos, se procede a
revelar la formación de dichos complejos
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
La detección de dichos complejos
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
es indicativa de la presencia de anticuerpos específicos de dicho
antígeno diana en la muestra de ensayo. Este tipo de ensayo permite,
además, si se desea, cuantificar la cantidad de anticuerpos
específicos del antígeno diana en la muestra de ensayo.
La formación del complejo
antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador
es indicativa de la presencia de anticuerpos específicos del
antígeno diana en la muestra de ensayo. Por tanto, el inmunoensayo
de la invención se puede utilizar para diagnosticar la infección
causada por un organismo, tal como un organismo patógeno (e.g.,
virus, bacteria, hongo, protozoo, nematodo, etc.), en un sujeto
susceptible de ser infectado por dicho organismo. Tal como aquí se
utiliza, "sujeto" se incluye a cualquier animal, incluido el
ser humano, en particular, animales vertebrados, preferentemente
mamíferos, tales como caballos, cerdos, conejos, gatos, ovejas,
perros, vacas, seres humanos, etc.
En una realización particular, el inmunoensayo
de la invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección
causada por BTV en animales susceptibles de ser infectados
independientemente de que desarrollen o no sintomatología clínica
(los cuales pueden actuar como reservorios), e.g., ganado ovino,
bovino, caprino, felino, etc. En una realización concreta, el
inmunoensayo de la invención permite detectar y, si se desea,
cuantificar, anticuerpos específicos frente a BTV en muestras de
ensayo procedentes de animales susceptibles de ser infectados por
BTV mediante un ELISA (Ejemplo 1) que comprende poner en contacto
un antígeno de BTV (e.g., la proteína recombinante VP7 (rVP7) de
BTV) inmovilizado sobre un soporte (e.g., un pocillo de una placa
de microtitulación) con una muestra de ensayo sospechosa de contener
anticuerpos específicos de BTV; en caso de que dicha muestra de
ensayo tenga dichos anticuerpos, estos se unirán al antígeno de
BTV. A continuación, tras eliminar el material no unido mediante
lavados, se añade de nuevo el mismo antígeno de BTV (proteína rVP7
de BTV) conjugado a un marcador (e.g., peroxidasa) [conjugado
rVP7/peroxidasa], y, en caso de que la muestra de ensayo contuviera
anticuerpos frente a dicho antígeno de BTV, dichos anticuerpos
podrían capturar la proteína rVP7 de BTV conjugada al marcador a
pesar de estar unidos a la proteína rVP7 de BTV inmovilizada sobre
el pocillo. El complejo
rVP7-anticuerpo-rVP7-peroxidasa
se detecta tras adición de un sustrato adecuado que desarrolla
color en presencia de la peroxidasa (e.g., TMB).
En otra realización particular, el inmunoensayo
de la invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección
causada por PRRSV en animales susceptibles de ser infectados por
PRRSV independientemente de que desarrollen o no sintomatología
clínica (reservorios), e.g., ganado porcino, etc. En una realización
concreta, dicho inmunoensayo consiste en un ELISA (Ejemplo 3) en el
que el antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la
proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV, el cual se inmoviliza
sobre un soporte antes de ponerse en contacto con la muestra de
ensayo procedente de animales susceptibles de ser infectados por
PRRSV sospechosa de contener anticuerpos específicos frente a
PRRSV, con lo que si dicha muestra de ensayo tiene dichos
anticuerpos, estos se unirán al antígeno de PRRSV. A continuación,
tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade de
nuevo el mismo antígeno de PRRSV (proteína de fusión que comprende
la proteína N de PRRSV) conjugado a un marcador (e.g., peroxidasa),
y, en caso de que la muestra de ensayo contuviera anticuerpos
frente a dicho antígeno de PRRSV, dichos anticuerpos podrían
capturar la proteína de fusión que comprende la proteína N de PRRSV
conjugada al marcador a pesar de estar unidos a la proteína de
fusión que comprende la proteína N de PRRSV inmovilizada sobre el
pocillo. El complejo antígeno de
PRRSV-anticuerpo-antígeno de
PRRSV/peroxidasa se detecta tras adición de un sustrato adecuado que
desarrolla color en presencia de la peroxidasa (e.g., TMB).
Asimismo, el inmunoensayo de la invención se
puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar,
anticuerpos específicos de antígenos tumorales en una muestra de
ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de
un tumor o de un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser
humano.
Además, el inmunoensayo de la invención se puede
utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos
específicos de alergenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y,
de este modo, diagnosticar la existencia de una reacción alérgica
frente a dicho alergeno en dicho sujeto, preferentemente, en un ser
humano.
Si se desea, para la puesta en práctica del
inmunoensayo de la invención, se pueden utilizar, además, controles
positivos y negativos.
El inmunoensayo de la invención ha sido
denominado "inmunoensayo de doble reconocimiento" ya que
comprende el reconocimiento y unión de dos unidades del antígeno
diana al anticuerpo específico de dicho antígeno diana, uno de ellos
formando parte de un conjugado que comprende dicho antígeno diana y
un marcador.
El inmunoensayo de la invención presenta una
elevada especificidad y sensibilidad tal como se pone de manifiesto
en el Ejemplo 2, en donde puede observarse que la especificidad del
inmunoensayo de la invención aplicado a la detección de anticuerpos
específicos de BTV es del 99,8% y la sensibilidad del 100%. Esta
elevada sensibilidad parece ser debida a que el inmunoensayo de
doble reconocimiento de la invención aúna las dos principales
ventajas de los inmunoensayos indirectos y de competición ya que,
por un lado, al igual que los inmunoensayos indirectos es capaz de
detectar todo tipo de anticuerpo que se una a un antígeno diana (y
no solo los anticuerpos que se unen a un epítopo determinado, como
en los ensayos de competición), y, por otro lado, al igual que en
los ensayos de competición (o bloqueo) se pueden usar elevadas
cantidades de muestra en el ensayo (sin diluir o poco diluidas), lo
que favorece la detección de positivos débiles (en los ensayos
indirectos es muy raro que se utilicen diluciones de la muestra
inferiores a 1/100). Asimismo, la elevada especificidad del
inmunoensayo de la invención parece ser debida a que el antígeno
diana debe ser reconocido dos veces por el mismo anticuerpo, la
primera vez, cuando se pone en contacto con el antígeno diana
inmovilizado sobre la fase sólida o soporte utilizado, y, la
segunda vez, cuando se pone en contacto con
el antígeno diana marcado (conjugado antígeno diana unido a marcador), normalmente en solución o sin inmovilizar.
el antígeno diana marcado (conjugado antígeno diana unido a marcador), normalmente en solución o sin inmovilizar.
Para la puesta en práctica del inmunoensayo de
la invención se pueden utilizar, además, si se desea, controles
positivos y negativos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit, en adelante kit de la invención, que comprende:
- i)
- un soporte que comprende un antígeno diana; y
- ii)
- un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.
Las características de dicho soporte (i) y del
antígeno diana inmovilizado sobre el mismo, así como las de dicho
conjugado (ii) han sido mencionadas previamente.
En una realización particular, el kit de la
invención comprende, además de dicho soporte (i) y conjugado (ii),
unos medios para revelar dicho marcador.
Dicho kit de la invención es particularmente
útil para poner en práctica el inmunoensayo de la invención.
Dicho antígeno diana es susceptible de ser
reconocido por un anticuerpo específico del mismo. Por tanto, el
kit de la invención puede ser utilizado para detectar, y si se desea
cuantificar anticuerpos específicos de dicho antígeno diana en una
muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos.
En una realización particular, el kit de la
invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección
causada por BTV en animales susceptibles de ser infectados por
dicho virus (e.g., ganado ovino, bovino, caprino, felino, etc.)
independientemente de que presenten o no sintomatología clínica (de
hecho, una aplicación muy interesante del kit e inmunoensayo de la
invención consiste en su empleo para identificar reservorios de
organismos patógenos), y comprende un soporte que comprende un
antígeno de BTV (e.g., la proteína recombinante VP7 de BTV o
cualquier otro antígeno de BTV) y un conjugado que comprende dicho
antígeno de BTV conjugado a un marcador (e.g., peroxidasa) y,
opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo antígeno
de BTV-anticuerpo-antígeno de
BTV/marcador (e.g., TMB cuando el marcador es una peroxidasa).
En otra realización particular, el kit de la
invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección
causada por PRRSV en animales susceptibles de ser infectados por
dicho virus (e.g., ganado porcino, etc.) independientemente de que
presenten o no sintomatología clínica, y comprende un soporte que
comprende un antígeno de PRRSV (e.g., una proteína de fusión que
comprende la proteína N de PRRSV o cualquier otro antígeno de
PRRSV) y un conjugado que comprende dicho antígeno de PRRSV
conjugado a un marcador (e.g., peroxidasa) y, opcionalmente, medios
para revelar la presencia de complejo antígeno de
PRRSV-anticuerpo-antígeno de
PRRSV/marcador (e.g., TMB cuando el marcador es una
peroxidasa).
Asimismo, el kit de la invención se puede
utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos
específicos de antígenos tumorales en una muestra de ensayo de un
sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de un tumor o de
un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser humano.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Con el objetivo de validar este ensayo
inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para detectar
anticuerpos específicos frente a BTV se analizaron sueros de
referencia para los 24 serotipos de BTV procedentes de diferentes
orígenes.
Como antígeno de BTV se utilizó la proteína
recombinante VP7 (rVP7) de BTV (Basak, A.K., Stuart D.I. and Roy P.
1992. J. Mol. Bio. 228:687-689). Dicha proteína se
obtuvo infectando células de Spodoptera frugiperda
Sf-9 con un baculovirus recombinante que contenía
la secuencia que codificaba la proteína VP7 de BTV y recogiendo el
cultivo con elevado efecto citopático; tras usar las células
mediante choque osmótico, el sobrenadante obtenido tras la
centrifugación se purificó por intercambio iónico en FPLC (del
inglés "Fast Protein Liquid Chromatography") y las fracciones
que contenían la proteína se identificaron y valoraron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE) al 11% de acrilamida. La proteína rVP7
de BTV así obtenida y purificada se utilizó en el tapizado de la
placa de poliestireno a una concentración determinada por ELISA en
el rango 0,1-1 \mug/ml.
Para su uso como conjugado, la proteína rVP7 se
dializó frente a tampón bicarbonato 0,1 M (pH 8,5) y se conjugó con
peroxidasa (HRPO) (Horse Radish peroxidase, ROCHE) según el método
descrito por Nakane & Kawaoi [Nakane, P.K. & Kawaoi, A.
(1974). Peroxidase-labeled antibody: A new method of
conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22: 1084-1091]
modificado. Cada proceso de marcaje generó un lote de producción de
conjugado. Cada uno de los lotes de producción se almacenó diluido
en solución salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7,4 y solución
preservante 50% (v/v) Surmodics-TM (Diarect AG) y
se almacenó a +4ºC hasta su utilización.
Con el fin de validar este ensayo, se analizaron
sueros de referencia para los 24 serotipos de BTV procedentes de
diferentes orígenes:
- -
- Laboratorio de Referencia Español (LRES) [Laboratorio Central de Veterinaria de Algete]: sueros de los serotipos 3, 10 y 19 de BTV;
- -
- Laboratorio de Referencia de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) [Pirbright]: sueros de los 24 serotipos de BTV; y
- -
- Laboratorio de Referencia del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos [USDA]: sueros de los serotipos 5, 10, 19 y 20 de BTV.
Como controles, se utilizaron sueros de control
positivo para BTV y sueros de control negativo para BTV,
procedentes de animales inmunizados o no con VP7 de BTV,
respectivamente.
Se incuban placas de poliestireno de 96 pocillos
con proteína rVP7 de BTV durante 18 horas a 4ºC en tampón
carbonato-BSA (seroalbúmina bovina), pH 9,6, con el
fin de tapizar dichas con el antígeno de BTV (proteína rVP7). A
continuación, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de
Tween® 20, pH 7,4, se estabilizan durante 1 hora a temperatura
ambiente (20-25ºC) en solución estabilizante
Surmodics-TM (Diarect AG) y se secan. Las placas
que no se van a utilizar inmediatamente, se envasan de forma
individual. y se almacenan a 4ºC.
A continuación, sobre las placas tapizadas con
el antígeno de BTV se añaden los sueros a analizar a una dilución
1/5 en PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 y se incuban durante 1
hora a 37ºC. Tras lavar el material no adherido con PBS conteniendo
0,05% de Tween® 20, las placas se incuban con un conjugado
rVP7-HRPO a una dilución predeterminada y valorada
caso por caso, durante 1 hora a 37ºC. Finalizado ese periodo de
tiempo, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 y
la reacción se revela durante 15 minutos tras adición del sustrato
TMB (trimetilbencidina). Tras parar la reacción con ácido sulfúrico
0,5 M se realiza la lectura de la absorbancia a 450 nm en un lector
de placas de ELISA.
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla
1, en donde puede apreciarse que el ensayo proporcionado por esta
invención (ELISA DR) es capaz de reconocer todos los serotipos de
BTV para los que existen sueros de referencia en distintos
Laboratorios de Referencia (véanse el apartado relativo a Sueros).
Asimismo, dichos resultados ponen de manifiesto que dicho ELISA DR
es lo suficientemente específico y sensible como para reconocer
todos los serotipos de BTV, independientemente del tipo que sean
y/o del título que tengan.
Ejemplo
2
Para determinar la especificidad del ensayo
inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para la
detección de anticuerpos frente a BTV, se realizaron estudios de
campo con 758 sueros procedentes de granjas libres de BTV. Se
analizaron sueros de vaca y de oveja. El protocolo seguido fue el
descrito en el Ejemplo 1 (ELISA DR). Los resultados obtenidos
mostraron una única muestra positiva con valores de densidad óptica
(DO) cercanos al punto de corte (establecido tras determinar la
señal de fondo de los sueros negativos de campo y observar la
diferencia con la señal obtenida por un suero positivo límite
preparado en el laboratorio, ajustando el ensayo para que dicha
diferencia sea al menos de 0,3 puntos de absorbancia) indicando una
especificidad del 99,8%.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la sensibilidad del ensayo
inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para la
detección de anticuerpos frente a BTV, se realizaron estudios de
campo con 758 sueros procedentes de granjas libres de BTV.
Siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 1 (ELISA DR) se
analizaron un total de 288 sueros de vaca y de oveja previamente
caracterizados como positivos por otras técnicas tales como
seroneutralización y otros ensayos ELISA. Todos ellos resultaron
positivos indicando una sensibilidad del 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se realizó este ensayo inmunoenzimático de doble
reconocimiento (ELISA DR) para detectar anticuerpos específicos de
PRRSV y comparar los resultados obtenidos con los de otros ensayos
ya existentes (ELISA indirecto y ELISA de bloqueo) para la
detección de anticuerpos específicos de PRRSV.
\vskip1.000000\baselineskip
Como antígeno de PRRSV se utilizó la proteína de
fusión recombinante identificada como P10-N, que
comprende la secuencia de aminoácidos de la nucleocápsida de PRRSV,
aislado europeo, fusionada a la secuencia de aminoácidos
1-259 de la proteína del gen 10 del fago T7, cuya
obtención se describe en el Ejemplo 3 de la patente europea EP
952219 B1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para su uso como conjugado, la proteína de
fusión P10-N se conjugó con peroxidasa (HRPO) según
el método descrito por Nakane & Kawaoi [Nakane, P.K. &
Kawaoi, A. (1974). Peroxidase-labeled antibody: A
new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22:
1084-1091] modificado. Cada proceso de marcaje
generó un lote de producción de conjugado. Cada uno de los lotes de
producción se almacenó diluido en PBS pH 7,4 y solución preservante
(Surmodics-TM, Diarect AG) 50% (v/v) y se almacenó
a +4ºC hasta su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron 36 sueros de campo procedentes de
cerdos de áreas geográficas diferentes que dieron positivo o
negativo en otros ensayos (ELISA indirecto y ELISA de bloqueo) para
la detección de anticuerpos específicos de PRRSV (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 100 \mul de cada uno de los sueros
problema a la dilución 1/100 en los pocillos y se incuba durante 1
h a 37ºC. A continuación, la placa se lava 4 veces con PBS
conteniendo 0,05% de Tween® 20. Seguidamente se añaden 100 \mul de
anticuerpo específico de IgG de cerdo conjugado con peroxidasa a
una dilución predeterminada a cada pocillo, se tapa la placa y se
incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente
(20-25ºC). Posteriormente, se lava la placa 5 veces
con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, se añaden 100 \mul de
sustrato ABTS (ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
en cada pocillo y la reacción se mantiene durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Finalmente, se añaden 100 \mul de
dodecilsulfato sódico (SDS) al 2% para parar la reacción y se lee
la absorbancia a 405 nm en un lector de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden los sueros problemas a una dilución en
los pocillos y se incuba durante 1 h a 37ºC. A continuación, la
placa se lava 4 veces con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20.
Seguidamente se añaden 100 \mul de anticuerpo monoclonal
específico de la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV conjugado
con peroxidasa a una dilución predeterminada y se incuba durante 20
minutos a 37ºC. Posteriormente, se lava la placa 5 veces con PBS
conteniendo 0,05% de Tween® 20, se añaden 100 \mul de sustrato
ABTS en cada pocillo y la reacción se mantiene durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Finalmente, se añaden 100 \mul de SDS al 2%
para parar la reacción y se lee la absorbancia a 405 nm en un
lector de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban placas de poliestireno de 96 pocillos
con proteína de fusión P10-N (antígeno de PRRSV)
durante 18 horas a 4ºC en tampón carbonato pH
9,6-BSA (seroalbúmina bovina) con el fin de tapizar
dichas con el antígeno de PRRSV (proteína de fusión
P10-N). A continuación, las placas se lavan con PBS
conteniendo 0,05% de Tween® 20 pH7,4 se estabilizan durante 1 hora
a temperatura ambiente en solución estabilizante
(Surmodics-TM, Diarect AG) y se secan. Las placas
que no se van a utilizar inmediatamente, se envasan de forma
individual. y se almacenan a
4ºC.
4ºC.
A continuación, sobre las placas tapizadas con
el antígeno de PRRSV se añaden los sueros a analizar a una dilución
1/5 en PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 en un volumen de 50
\mul y se incuban durante 1 hora a 37ºC. Tras lavar el material no
adherido con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, las placas se
incuban con un conjugado
(P10-N)-HRPO a una dilución
predeterminada y fijada caso por caso, durante 30 minutos a
temperatura ambiente (20-25ºC). Finalizado ese
periodo de tiempo, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de
Tween® 20 y la reacción se revela durante 15 minutos tras adición
del sustrato TMB. Tras parar la reacción con ácido sulfúrico 0,5 M
se realiza la lectura de la absorbancia a 450 nm en un lector de
placas de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla
2, en donde puede apreciarse que el ensayo proporcionado por esta
invención (ELISA DR) es capaz de detectar anticuerpos específicos
de PRRSV y que, además, dicho ensayo ELISA DR discrimina entre
sueros positivos y negativos, comparándolo con los inmunoensayos ya
existentes de competición e indirectos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (31)
1. Un inmunoensayo para detectar un anticuerpo
específico de un antígeno diana en una muestra que comprende:
- a)
- poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo;
- b)
- añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador; y
- c)
- detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
2. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el
que dicho antígeno diana es un antígeno de un organismo, un
antígeno de una célula o un alergeno.
3. Inmunoensayo según la reivindicación 2, en el
que dicho antígeno diana es un antígeno de un virus, un antígeno de
una bacteria, un antígeno de un hongo, un antígeno de un protozoo,
un antígeno de un nematodo, un antígeno de una célula tumoral o un
alergeno.
4. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el
que dicho antígeno es un antígeno de un virus patógeno de animales,
incluyendo seres humanos.
5. Inmunoensayo según la reivindicación 4, en el
que dicho virus patógeno es un virus perteneciente a la familia
Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Birnaviridae,
Bungaviridae, Caliciviridae, Coronoviridae, Filoviridae, Flaviridae,
Hepadnaviridae, Herpesviridae, Iridoviridae, Orthomyxoviridae,
Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae,
Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, o
Togaviridae.
6. Inmunoensayo según la reivindicación 5, en el
que dicho virus patógeno es un arbovirus, un arterivirus, un
birnavirus, un calicivirus, un citomegalovirus, un herpesvirus, un
papilomavirus, un parvovirus, un pestivirus, un poliovirus, un
retrovirus, un rhinovirus, o un rotavirus.
7. Inmunoensayo según la reivindicación 5, en el
que dicho virus es el parvovirus porcino (PPV), el virus del
síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), el virus de
la enfermedad de Aujesky (ADV), el virus de la fiebre aftosa
(FDMV), el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV),
el circovirus porcino, el virus de la diarrea viral bovina (BVDV),
el virus de la rinotraqueitis bovina (IBRV), el virus de la lengua
azul (BTV), el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo
(RHDV), el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), o el
pneumovirus aviar.
8. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el
que dicho antígeno es un antígeno de una bacteria patógena de
animales, incluyendo seres humanos.
9. Inmunoensayo según la reivindicación 8, en el
que dicha bacteria patógena es Actinornyces israelli, Bacillus
aratracis, Bacteroides sp., Bordetella sp., Borelia burgdorferi,
Brucella sp., Campylobacter sp., Clostridium sp., Corynebacterium
sp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus sp., Erysipelothrix
rhusiopathiae, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum,
Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Klebsiella sp.,
Legionella pneumoplailia, Listeria monocytogenes, Leptospira sp.,
Moraxella catarrhalis, Mycobacteria sp., Neisseria sp., Pasteurella
sp., Pseudomonas sp., Rickettsia sp., Salmonella sp.,
Staphylococcus sp., Streptobacillus moniliformis, Streptococcus
sp., o Treponema sp.
10. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en
el que dicho antígeno es un antígeno de un hongo patógeno de
animales, incluyendo seres humanos.
11. Inmunoensayo según la reivindicación 10, en
el que dicho hongo patógeno es Blastomyces dermatitidis, Candida
albicans, Chlamydia trachomatis, Coccidioides immitis, Cryptococcus
neoformans, o Histoplasma capsulatum.
12. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en
el que dicho antígeno es un antígeno de un protozoo o de un
nematodo patógeno de animales, incluyendo seres humanos.
13. Inmunoensayo según la reivindicación 10, en
el que dicho protozoo o nematodo es Anaplasma marginale,
Dirofilaria immitis, Leishmania sp., Plasmodium sp., Schistosoma
sp., o Toxoplasma sp.
14. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en
el que dicho antígeno es un antígeno tumoral.
15. Inmunoensayo según la reivindicación 14, en
el que dicho antígeno tumoral comprende GD2, EGF-R,
CD52, gp100 de melanoma humano,
melan-A/MART-1 de melanoma humano,
tirosinasa, NA17-A nt, MAGE-3,
p53,
HPV16E7, (CD11c)-TRP2, WT1, HM1.24, mucina prostática, antígeno específico de próstata (PSA), antígeno SF-25, un antígeno tumoral asociado con un tumor de vejiga, un antígeno tumoral asociado al cáncer de mama, un antígeno tumoral asociado al cáncer de ovario, un antígeno tumoral asociado al cáncer de pulmón, un antígeno tumoral asociado al cáncer de piel, un antígeno tumoral asociado al cáncer de colon, un antígeno tumoral asociado a tumores linfoides de células B, un antígeno tumoral asociado a leucemia mieloide, un antígeno tumoral asociado a linfomas, o un fragmento antigénico de dichos antígenos.
HPV16E7, (CD11c)-TRP2, WT1, HM1.24, mucina prostática, antígeno específico de próstata (PSA), antígeno SF-25, un antígeno tumoral asociado con un tumor de vejiga, un antígeno tumoral asociado al cáncer de mama, un antígeno tumoral asociado al cáncer de ovario, un antígeno tumoral asociado al cáncer de pulmón, un antígeno tumoral asociado al cáncer de piel, un antígeno tumoral asociado al cáncer de colon, un antígeno tumoral asociado a tumores linfoides de células B, un antígeno tumoral asociado a leucemia mieloide, un antígeno tumoral asociado a linfomas, o un fragmento antigénico de dichos antígenos.
16. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en
el que dicho antígeno es un alergeno.
17. Inmunoensayo según la reivindicación 16, en
el que dicho alergeno es un extracto alergénico de un polen, un
extracto alergénico de un insecto, un extracto alergénico de un
alimento o de un producto alimenticio, un componente presente en
saliva, pinzas o aguijones de un insecto que induce una reacción de
sensibilidad en un sujeto, o un componente presente en una planta
que induce una reacción de sensibilidad en un sujeto.
18. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en
el que dicha muestra sospechosa de contener anticuerpos específicos
de dicho antígeno diana es una muestra biológica.
19. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en
el que dicho marcador es una enzima, un compuesto fluorescente o
fluoróforo, un compuesto (quimio)luminiscente o un elemento
radiactivo.
20. Inmunoensayo según la reivindicación 19, en
el que dicho marcador es una peroxidasa.
21. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en
el que dicho inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático, un
fluoroinmunoensayo, un luminoinmunoensayo o un
radioinmunoensayo.
22. Inmunoensayo según la reivindicación 21, en
el que dicho inmunoensayo es un ELISA.
23. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en
el que dicho antígeno diana está inmovilizados sobre un
soporte.
24. Inmunoensayo según la reivindicación 1, que
comprende, además, cuantificar la cantidad de anticuerpos
específicos de dicho antígeno diana presentes en dicha muestra
sospechosa de contener dichos anticuerpos.
25. Un kit que comprende:
- (i)
- un soporte que comprende un antígeno diana; y
- (ii)
- un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.
26. Kit según la reivindicación 25, que
comprende, además, unos medios para revelar dicho marcador.
27. Kit según la reivindicación 25, para
detectar, y si se desea, cuantificar anticuerpos específicos de
dicho antígeno diana en una muestra sospechosa de contener dichos
anticuerpos.
28. Kit según la reivindicación 25, para
diagnosticar la infección causada por virus de la lengua azul
(BTV), que comprende un soporte que comprende un antígeno de BTV y
un conjugado que comprende dicho antígeno de BTV conjugado a un
marcador, y, opcionalmente, medios para revelar la presencia de
complejo antígeno de
BTV-anticuerpo-antígeno de
BTV/marcador.
29. Kit según la reivindicación 28, en el que
dicho antígeno de BTV es una proteína recombinante VP7 de BTV
(rVP7) y dicho conjugado comprende dicha proteína rVP7 de BTV
conjugada a una peroxidasa, y comprende, además,
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
30. Kit según la reivindicación 25, para
diagnosticar la infección causada por el virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) que comprende un
soporte que comprende un antígeno de PRRSV y un conjugado que
comprende dicho antígeno de PRRSV conjugado a un marcador, y,
opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo
antígeno de
PRRSV-anticuerpo-antígeno de
PRRSV/marcador.
31. Kit según la reivindicación 30, en el que
dicho antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la
proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV y dicho conjugado
comprende dicha proteína de fusión que comprende la proteína N de
PRRSV conjugada a una peroxidasa, y comprende, además,
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
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