JPH05505198A - ボレリアブルグドルフェリの検出方法、その精製された抗原及び該抗原と結合可能な抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ボレリア　ブルグドルフェリの検出方法、その精製された抗原及び該抗原と結合 可能な抗体 発明の背景 本発明はボレリア　ブルグドルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｌｉ）に関連する新規抗原、該抗原に対して生じる抗体及びライム（Ｌｙｍｅ） 病を診断するための該抗体の用途に関するものである。

発明の分野 ライム病スピロヘータ、ボレリア　ブルグドルフェリとその哺乳類の宿主との間 の免疫学的相互作用は不充分に理解されている〔イー、エム、ボスシー、（Ｅ、 　Ｍ、８ｏｓｌｅｒ、）、ディー、ビー、コーヘン（Ｄ、Ｐ、Ｃｏｈｅｎ　）　 、ティー、エル、シュルツｘ　（Ｔ、Ｌ、５ｃｈｕｌｚｅ　）　、シー、オルセ ン（Ｃ，０１ｓｅｎ　）　、ダプリュ、ベナード（Ｗ、Ｂｅｎａｒｄ）　、及び ビー、リスマン（Ｂ、Ｌｉｓｓｍａｎ　）　、１９８８年、　「犬及び馬におけ るボレリア　ブルグドルフエリに対する宿主応答（Ｈｏｓｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓ　ｔｏ　Ｂｏｒｒｅｌｊａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｌｉ　ｉｎ　ｄ。

ｇｓ　ａｎｄ　ｈｏｒｓｅｓ　）　Ｊ　、第２２１−２３４頁参照。ジエイ。

エル、ベナッハ（Ｊ、Ｌ、Ｂｅｎａｃｈ）　、及びイー、エム、ボスラー編、　 「ライム病及び関連症状（Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ 　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）　Ｊ　、アンナールス　オブ　ザ　ニュー　ヨーク　ア カデミ−オブ　サイエンス（Ａｎｎａｌｓ　。

ｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　 ５３９中の；ドレスク、エイ（Ｄｌｅｓｋ、Ａ、）　、　ディー、エフ、ブジャ ルナワン（Ｄ、Ｆ、Ｂｊａｒｎａｓｏｎ　）　、ビー、ミッチェル（Ｐ、　Ｍｉ 　ｔｅｈｅＩＩ）　、及びビー、マツカーティ（Ｐ、ＭｅＣ：ａｒｔｙ　）　、 １９８８年、［血清反応陰性リューマチ性関節炎として発現するライム病（Ｌａ ｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ａｓ　ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖ ｅ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄｅ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　）　Ｊ　、第４５４−４５ ５頁参照。ジェイ、エル、ベナッハ、及びイー、エム、ボスラー編、「ライム病 及び関連症状」、アンナールス　オブザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−才ブ　サ イエンス５３９中の；ドルイ、ビー。エイチ、（Ｄｕｒａｙ、Ｐ、Ｈ，）　。

及びニイ、シー、ステイア−（Ａ、Ｃ，５ｔｅｅｒｅ）　、１９８８年、　「段 階によるライム病の臨床的病理学的相関関係（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ｐａｔｈａｌ ｏｇｉｃ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｂｙ 　ｓｔａｇｅ　）　Ｊ　、第６５−７９頁参照。ノエイ、エル、ベナッハ、及び イー、エム、ボスラー編、「ライム病及び関連症状」、アンナールス　才プ　ザ 　ニュー　ヨークアカデミ−才ブ　サイエンス５３９中の、フォックス、ジェイ 、エル、（Ｆａｘ、　Ｊ、　Ｌ。＞、１９８９年、　「ライｌ、病が発現する際 の重要事項（Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　ｉｎ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｇｒｏｗｓ ）　Ｊ　、　ＡＳＭニュース５５：６５−６６：ハイド、エフ、ダブリュ、（Ｈ ｙｄｅ、　Ｆ、　Ｗ。）、アール、シー。

ジョンソン（Ｒ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ　）　、ティー６ジエイ、ホワイ’ｐ　（ Ｔ、Ｊ、Ｗｈｉｔｅ　）　、及びシー、イー、シュルバーン（Ｃ。

Ｅ、５ｈｅｌｂｕｒｎ）　、１９８９年、　「ボレリア　ブルグドルフ１りに感 染したマウス及び人間の尿中の抗原の検出、ライム病の治療剤（Ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｎ　ｕｒｉｎｅ　ｏｆ　ｍ１ｃｅ　ａｎｄ　ｈ ｕｍａｎｓ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒ ｆｅｌｉ。

ｓｔｉａｌｏｇｆｅ　ａｇｅｎｔ　ｏｆ　Ｉ、ｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　）Ｊ　 、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒａｂｉｏｌ、　２７：　５８−　ｆ３１　：マグナレ リ、エル、エイ、（Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉ、　Ｉ、、Ａ、）、１９８８年、「ラ イム病の血清学的診断（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｌｙ ｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　）　Ｊ　。

第１５４−１６１頁参照。ジェイ、エル、ベナッハ、及びイー、エム、ボスラー 編、　「ライム病及び関連症状」。

アンナールス　オプ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミーオプ　サイエンス５３９ 中の：ンユワン、ティー、ジー、（Ｓｃｈｗａｎ、Ｔ、　Ｇ、）　、ダブリュ、 プルグドルファ−（Ｗ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ）　、及びシー、エフ、ギｙｏン （Ｃ，Ｆ、　Ｇａｒ。

ｎ）、１９８８年、　「インビトロ培養の結果としての、ライム病スピロヘータ 、ボレリア　ブルグドルフェリの感染性及びプラスミド状態の変化（Ｃｈａｎｇ ｅｓ　ｉｎ　１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｌａｓｒｎｒｄ　ｐｒｏｆｉ ｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｊｒ。

ｃｈｅｔｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｌｉ、ａｓ　ａ　ｒｅｓｕ ｌｔ　ｏｆ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｉｖａｔｊｏｎ　）　Ｊ　、Ｉｎｆｅｃｔ、 　Ｉｍｍｕｎ、　５６　：　１８３１−１８３６：シュワン、ティー、ノー１． ダブリュ、プルグドルファ−、エム、イー、ンユランブ（！ｄ、　Ｅ、　Ｓｃｈ ｒｕｍｐｆ）、及びアール、エイチ、カーステンズ（Ｒ，Ｈ，Ｋａｒｓｔｅｎｓ ）　。

１９８８年、「膀胱、実験的に感染させた自足マウス（ベロミスクス　レウコブ ス）におけるボレリア　ブルグドルフエリの固定源（Ｔｈｅ　ｕｒｉｎａｒｙ　 ｂｌａｄｄｅｒ、ａ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　５ｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｂｏｒｒｅ ｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｌｉ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｊｍｅｎｔａｌｌｙ　１ｎ ｆｅｃｔｅｄ　ｒｎｉｃｅ（Ｐｅｒｏｒｒｒｙｓｃｕｓ　１ｅｕｃｏｐｕｓ　） 　Ｊ　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２６　：　８９３−８９５　；スティツチトーグロー、ヴ イ（Ｓｔｉｅｈｔ−Ｇｒｏｈ、Ｖ、）　、　アール、マーチン（Ｒ，Ｍａｒｔｉ ｎ）　、及びアイ、シュミットーヲルフ（＋、Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗ。

ｉｆ）、１９８８年、「血液提供者における及び患者の二つの異なる群における ボレリア　ブルグドルフェリに対する抗体滴定決定（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔ ｅｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂ ｕｒｇｄｏｒｆｅｌｉ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ｄｏｎｏｒｓ　ａｎｄ　ｉｎｔｗｏ 　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ）　Ｊ　、第４ ９７−４９９頁参照。ジェイ、エル、ベナッハ、及びイー、エム。

ボスラー編、「ライム病及び関連症状」、アンナールスオブ　ザ　ニュー　ヨー ク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９中の：スティールンステット、ジー、（ Ｓｔｉｅｒｎｓｔｅｄｔ、　Ｇ。）、アール、グスタフソン、（Ｒ，Ｇｕｓｔａ ｆｓｓＯｎ）、エム、カールソン（Ｍ、Ｋａａｒｌｓｓｏｎ　）　、ビー、スヴ エヌングソン（Ｂ、Ｓｖｅｎｕｎｇｓｓｏｎ　）　ｒ及びビー６スコルデンベル グ（Ｂ、Ｓｋｏｌｄｅｎｈｅｒｇ　）　、１９８８年、「神経ボレリア症の臨床 的発現及び診断（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　ｍａｎｊｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　 ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｂｏｒｒｅｌｉｏｓｊｓ　）　Ｊ　ｌ第 ４６−５５頁参照。ジエイ、ニル、ベナッハ、及びイー、エム、ボスラー編、「 ライム病及び関連症状」、アンナールス　オブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ −オブサイエンス５３９及びウィルスケ、ビー（Ｗｊｌｓｋｅ、Ｂ、　）　。

ヴイ、ブリークームルシック（Ｖ、　Ｐｒｅａｃ−Ｍυｒｓｉｃ）　、ジー。

シールツ（Ｇ、５ｃｈｉｅｒｚ　）　、アール、クーベブク（Ｒ，Ｋｕｈｂｅｃ ｋ　）　、　エイ、ジー、パーボー（Ａ、Ｇ、Ｂａｒｂｏｕｒ　）　、及びエム 、クラマー（Ｍ、Ｋｒａｍｅｒ）　、１９８８年２　「ボレリアブルグドルフェ リの抗原の変動性（Ａｎｔｉｇｅｎｉｅ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｏ ｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｌｉ　）　、第１２６−１４３頁参照参照。

ジェイ、エル、ベナッハ、及びイー、エム。

ボスラー編、　「ライム病及び関連症状」、アンナールスオブ　ザ　ニュー　ヨ ーク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９参照〕。大部分の哺乳類宿主はスピロ ヘータに応答する抗体を有するが、しかし前記抗体は他の種類のボレリアとしば しば血清学的に競争反応的であり、且つ血清反応陰性感染の債々のものは標準ス クリーニング診断基準を使用して対処されていた〔ドレスク、エイ。

ディー、エフ、ブジャルナソン、ピー、ミッチェル、及びビー、マツカーティ、 １９８８年、ｒ血清反応陰性リューマチ性関節炎として発現するライム病」、第 ４５４−４５５頁参照。ジェイ、エル、ベナッハ、及びイー。

エム、ボス子−１「ライム病及び関連症状」、アンナールス　才ブ　ザ　ニュー 　ヨーク　アカデミ−オフサイエンス５３９中の；フォックス、ジエイ、エル、 。

１９８９年、　「ライム病が発現する際の重要事項Ｊ、ＡＳＭニュース５５：８ ５−６６；ハイド、エフ、ダブリュ、、アール、シー、ジョンソン、ティー、ジ エイ９ホワイト、及びシー、イー、シュルバーン、１９８９年。

「ボレリア　プルグドルフェリに感染したマウス及び人間の尿中の抗原の検出、 ライム病の治療剤Ｊ　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌ、　２７＋　５８−６１　；　ｖグナレリ、エル、エイ、。

１９８８年、　「ライム病の血清学的診断」、第１５４−１８１頁参照。ジェイ 、エル、ベナッハ、及びイー、エム、ボスラー編、　「ライム病及び関連症状」 、アンナールス　オブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−オフサイエンス５３９ 中の：スティッチトーグロー、ヴイ。

アール、マーチン、及びアイ、シュミットーヲルフ、１９８８年、　「血液提供 者における及び患者の二つの異なる群におけるボレリア　ブルグドルフェリに対 する抗体滴定決定」、第４９７−４９９頁参照。ジエイ、エル。

ベナブハ、及びイー、エム、ボスラー編、　「ライム病及び関連症状」、アンナ ールス　オブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９及びウ ィルスケ、ビー、ヴイ、ブリークームルシック、ジー８　シールツ、アール、ク ーベック、エイ、ジー、バーボー、及びエム　クラマー、１９８８年、　「ボレ リア　プルグドルフェリの抗原の変動性、第１２６−１４３頁参照参照。

ジェイ、エル、ベナッハ、及びイー、エム、ボスラー編。

「ライム病及び関連症状」、アンナールス　オプ　ザニュー　ヨーク　アカデミ −オブ　サイエンス５３９・１２６−１４３参照〕。更に、ボレリア　ブルグド ルフ工り単離体の間の株の変化、及び母集団内の抗体の変化は、モノクローン性 抗体に基づいて、幾つかの宿主における循環性で且つ排泄された抗原の検出のた めの潜在的に鈍感で且つ不正確な免疫学的診断を与える〔エイ、ジー、バーボー 、アール、エイチ、ハイランド（Ｒ，Ｈ，Ｈｅ１ｌａｎｄ　）　、及びティー、 アール、ハウ（Ｔ、Ｒ，Ｈｏｗｅ）　、１９８５年、　「ライム病ボレリアにお ける主要な蛋白質の異質性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　ｍａｊｏｒ　 ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｂｏｒｒｅｌｉａｅ　） 　：化アメリカ及びヨーロッパの単離体の分子分析（ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎａｎｄ　Ｅｕｒｏｐｅ ａｎ　１ｓｏｌａｔｅｓ）　Ｊ　、　Ｊ、［ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５２　 ：４７８−４８４及びウィルスケ、ビー、ヴイ、ブリークームルシック、ジー、 ンールッ、アール、クーベック。

エイ、ジー、バーボー、及びエム、クラマー、１９８８年、　「ボレリア　プル グドルフェリの抗原の変動性、第１２６−１４３頁参照参照。ジエイ、エル、ベ ナッハ。

及びイー、エム、ボスラー編、　［ライム病及び関連症状」、アンナールス　オ ブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９：１２６−１４３ 参照〕。

それ故、臨床的症状、患者層、及び血液又は組織生検材料からのスピロヘータの 時折の一次単離は、大部分の診断のための基礎を提供する〔ジエイ、エル、ベナ ッハ。

イー、エム、ボスラー、ジエイ、ビー、ハンラハン（Ｊ。

Ｐ、Ｈａｎｒａｈａｎ）　、　ジエイ、エル、コールマン（Ｊ、　Ｌ、　Ｃｏｌ ｅｍａｎ）、ジー、ニス、ハビッチト（Ｇ、Ｓ、Ｈａｂｉｃｈｔ　）　、ティー 、エフ、バースト（Ｔ、　Ｆ、　ｅａｓｔ）　、ディー、ジェイ、キヤメロン（ Ｄ、Ｊ、Ｃａｍｅｒｏｎ　）　、ジエイ、エル、ライ−グラ−（Ｊ、Ｌ、Ｚｉｅ ｇｌｅｒ　）　、　エイ、シ＋、　／＜−ホ＋、！！１’）　ユ。

プルグドルファ一、アール、ニーデルマン（Ｒ，Ｅｄｅｌｍａｎ）、及びアール 、エイ、カスロー　（Ｒ，Ａ、Ｋａｓｌｏｗ）　、１９８３年、［ライム病の２ 患者の血液から単離されたスピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　１ｓｏｌａ ｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗ ｉｔｈ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　）　Ｊ　、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　！ Ｊｅｄ、３０８ニア４０−７４２；　ドレスク、エイ、ディー、エフ、ブジャル ナソン、ピー、ミフチェル、及びビー、マツカーティ、１９８８年、「血清反応 陰性リューマチ性関節炎として発現するライム病」、第４５４−４５５頁参照。

ジェイ、エル、ベテッハ、及びイー、エム　ボスラー編、「ライム病及び関連症 状」、アンナールス　オブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−オブ　サイエンス ５３９・４５４−４５５．ドユレイ、ピー、ニイチ、。

及びエイ、シー、ステイア−，１９８８年、　「段階によるライム病の臨床的病 理学的相関関係」、第６５−７９頁参照。ジエイ、エル、ベナッハ、及びイー、 エム、ボスラー編、「ライム病及び関連症状」、アンカールスオブ　ザ　ニュー 　ヨーク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９・６５−７９及びローリンゲス、 ジエイ、エイ、（Ｒａｗｌｊｎｇｓ、Ｊ、Ａ、　）　、ビー、ヴイ、フヤ−ニ− （Ｐ。

Ｖ、Ｆｏｒｎｉｅｒ　）　、及びジー、ジエイ、チルトウ（Ｇ、Ｊ、Ｔｅｌｔｏ ｗ）、１９８７年、　「テキサスにおける患者からのボレリア　スピロヘータの 単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ 　ｆｒｏｍ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｔｅｘａｓ）　Ｊ　、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２７：１１４８−１１５０．　２０参照〕。前記問題 は、ライム病のための報告が乏しい診断的悄眼に影響する因子としてしばしば引 用されろ〔）ｔツクス、ジエイ、エル、、１９８９年、　［ライム病が発現する 際の重要事項Ｊ、ＡＳＭニュース５５：６５−６６）。

大部分の仕事は今日、診断的用途、並びに疫学的及び病原的研究のための確認的 に観察された種−特異性細胞表面抗原に向けられている。外表面蛋白質Ａ　（Ｏ ｓｐＡ）の発現はボレリア　ブルグドルフェリ単離体の間では普遍的であると考 えられているが、しかし関連したスピロヘータの間では普遍的ではない〔エイ、 ジー、バーボー。

アール６エイチ、ハイランド、及びティー、アール、ハウ、１９８５年２　「ラ イム病ボレリアにおける主要な蛋白質の異質性：化アメリカ及びヨーロッパの単 離体の分子分析Ｊ　、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１５２　：４７８−４ ８４；ｚイ、ジー、バーボー、ニス、エル、テラシア（Ｓ、　Ｌ、　Ｔｅ５ｓｉ ｅｒ　）　、ダブリュ、ジエイ、トッド（Ｗ、Ｊ、Ｔｏｄｄ）　、１９８３年、 　「ライム病スピロヘータ及びマダニスピロヘータはモノクローン性抗体によっ て定義された一般表面抗原決定因子を分配する（Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　５ ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　ａｎｄｊｘｏｄｉｄ　ｔｉｃｋ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅ ｓ　５ｈａｒｅ　ａ　ｃｏｍｌＩＩｏｎ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ 　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂｙ　ａ　ｒｎｏｎｏｃｌｏｎａ ｌ　ａｎｔｊｂ。

ｄｙ）　Ｊ　、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４１　：　７９５−８０４　 ；ベルゲストローム、ニス（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、Ｓ、）　、　ブイ。ジー、ブ ンドク（ν、Ｇ、　Ｂｕｎｄｏｃ）−、及びエイ、ジー、バーボー、１９８９年 、　「ライム病スピロヘータ、ボレリア　ブルグドルフェリの直鎖状のプラスミ ド−コード化された主要な表面蛋白質、　０ｓｐＡ及び０ｓｐＢの分子分析（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　１ｉｎｅａｒ　ｐｌａｓＩＩＩｉ ｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ　ｍａｊｏｒ　５ｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｊｎｓ、ｏｓｐ Ａ　ａｎｄ　Ｏｓｐ［（、ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒ ＯＣｈａｅｔｅＢｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ目）　Ｊ　、Ｍｏｌ、Ｍ ｉｃｒａｂｉｏｌ、３　：　４７９−４８８　、ハイド、エフ、ダブリュ、、ア ール、シー。

ジョンソン、ティー、ジエイ、ホワイト及びシー、イー　シュルバーン、１９８ ９年、「ボレリア　ブルグドルフエリに感染したマウス及び人間の尿中の抗原の 検出、ライム病の治療剤１　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２ ７：　５８−６１；マグナレリ、エル、エイ、、１９８８年、　「ライム病の血 清学的診断」、第１５４−１６１頁参照。ジェイ、エル７ベナツハ、及びイー、 エム、ボスラー編、　「ライム病及び関連症状」、アンナールス　オブ　ザ　ニ １５４−１６１．及びウィルスケ、ビー、ヴイ、ブリークームルシック、ジー、 シールッ、アール、クーベック。

エイ、ジー、バーボー、及びエム、クラマー、１９８８年２　「ボレリア　ブル グドルフェリの抗原の変動性、第１２６−１４３頁参照参照。ジェイ、エル、ベ ナッハ。

及びイー、エム、ポスラー編、　［ライム病及び関連症状」、アンナールス　オ ブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９：１２６−１４３ 参照〕。

前記蛋白質は免疫的であるが、しかし０ｓｐＡに対する表面反応性モノクローン 性抗体は幾つかの単離体を認識し７ないので、表面長Ｎ＠域は抗原的に変わり得 ることが認められている〔エイ、ジー、バーボー、アール、ニイチ。

ハイランド、及びティー、アール、ハウ、１９８５年。

「ライム病ボレリアにおける主要な蛋白質の異質性：化アメリカ及びヨーロッパ の単離体の分子分析Ｊ　、　Ｊ、　ＩｎｆｅＣｔ、　Ｄｉｓ、　１５２　：　４ ７８−４８４　；ハイド、エフ、ダブリュ、、アール、シー、ジョンソン、ティ ー、ジェイ。

ホワイト、及びシー、イー、シュルバーン、１９８９年。

［ボレリア　ブルグドルフェリに感染したマウス及び人間の尿中の抗原の検出、 ライム病の治療剤Ｊ　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７　＋　５８−６１　、及びウィルスケ、ビー。

ヴイ、プリークームルシック、ジー、シールッ、アール。

クーベック、エイ、ジー、バーボー、及びエム、クラマー、１．９８８年、「ボ レリア　ブルグドルフェリの抗原の変動性、第１２６−１４３頁参照参照。ジェ イ、エル。

ベナッハ、及びイー、エム、ボスラー編、「ライム病及び関連Ｍ状Ｊ、　アンナ ールス　才ブ　ザ　ニュー　ヨーク　アカデミ−オブ　サイエンス５３９・１２ ６−１４３参照〕。

最近の実験は、０ｓｐＡ及び幾つかの他の蛋白質が膜小胞中のボレリア　ブルグ ドルフエリから得られるということを示した〔シー、エフ、ギヤロン、ディー、 ダブリュ。

ドーワード（Ｄ、Ｗ、Ｄｏｒｗａｒｄ　）　、及びエム、ディー、コーライン（ Ｖ、Ｄ、Ｃｏｒｗｉｎ）　、１９８９年、　「ボレリア　ブルグドルフェリーラ イム病スピロヘータの構造的特徴：核酸に対する銀染色」、走査顕微鏡別冊（Ｓ ｃａｎｎｉｎｇ　Ｍｉｃｒ。

５ｃｏｐｙ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）　３．第１０９−１１５頁；製造における ドーワード及びギヤロンの手法参照〕。間接的な証拠は、前記小胞がイン　ビボ においてスピロヘータの制限された母集団を維持している宿主に対して耐久性抗 原の挑戦を提供するスピロヘータによって製造され得るということを示す〔フォ ックス、ジエイ、エル、、１９８９年、　「ライム病が発現する際の重要事項Ｊ 、ＡＳＭニュース５５・６５−６６参照〕。ボレリア　ブルグドルフェリ小胞が 実験的に感染させたマウス中に生じるかどうかを決定するために、ポリクローン 性ラビット血清を小胞及び８３キロダルトン（ｋＤａ）（主要な細胞外蛋白質（ ＭＥＰ））に対して生成させた。ｎ２試薬を使用して、２段階免疫電子顕微鏡分 析が最初に捕捉のために次いで細胞外ボレリア　プルグドルフェリ抗原を同定す るために実施された。研究は次いでマダニ、マウス、犬、及びヒトの試料中の抗 原の検出を包含するために拡張あれた。したがって、本発明はボレリア　ブルグ ドルフェリ感染の抗原指標の分析系並びに正確且つ高感度の検出法に関するもの である。

本発明に最も近い公知技術は、ヒトの尿試料中のライム抗原を検出するためにモ ノクローン性抗体を使用する３Ｍ社によって製造された診断キット〔ファスト　 ライム（Ｆａｓｔ　Ｌｙｍｅ　）　、カタログＮｃ７００−５００）である。

前記キットは尿試料に限定され、地理的に異なる試料に対しては偽陰性の結果を 与える可能性があり、且つ限界的に敏感である〔ハイド、エフ、ダブリュ、他、 １９８９年、　「ボレリア　プルグドルフエリに感染したマウス及び人間の尿中 の抗原の検出、ライム病の治療剤」、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。２７：５８−６１参照〕。

発明の要約 本発明は、ボレリア　ブルグドルフェリに関連する新規抗原〔これはイン　ビボ で得られ（又は放たれ）且つその検出がライム病を診断するための手段である〕 に関するものである。前記抗原は細胞外の膜小胞及び主要な細胞外の蛋白質を包 含する他の生物学的生成物である。

本発明の他の目的は、モノクローン性及び／又はポリクローン性で、標識化及び ／又は非標識化され、前記抗原に対して生じる抗体を提供することである。本発 明の別の目的は、慣用の免疫分析法の手法により抗体を使用して宿主から採取さ れた生物学的試料中の抗原を検出することによってライム病を診断する方法を提 供することである。本発明の他の目的は、抗体及び付属試薬からなるライム病の 診断のためのキットを提供することである。

本発明において使用される抗体の利点は、それらはボレリア　プルグドルフェリ の地理的に異なる株から得られた抗原と反応するがしかし関連するボレリア　ス ピロヘータから得られた抗原とは反応しないということである。

図面の簡単な説明 図１は、ボレリア　ブルグドルフェリ抗原の捕捉及び検出のために使用される抗 体のイムノプロット分析を示す。

図２Ａないし２Ｃは、主要な細胞外の蛋白質（ＭＥＰ）に対して指向されたＩｇ Ｇによって認識されたエピトープの限局化を示す。

図３人ないし３Ｆは、哺乳類の尿及び血液中のボレリア　ブルグドルフエリ抗原 の免疫電子顕微鏡による検出を示す。

図４人ないし４Ｈは、浸軟されたマダニ及びマウス組織におけるボレリア　ブル グドルフエリ抗原の検出を示す。

図５は、感染したマウス及びヒトの尿から沈澱されたボレリア　ブルグドルフエ リ抗原のイムノプロット分析を示す。

図６及び６Ａは、ボレリア　ブルグドルフエリ抗原の免疫捕捉及び検出を示す。

発明の詳細な説明 ボレリアブルグドルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）感染 を診断するための最近の生物学的および血清学的技術は、しばしば確定的でない 、ライム病をモニターするために、感染された宿主におけるボレリアブルグドル フェリ抗原についての急速かつ鋭敏な分析法は、開発された。多クローン性ウサ ギ抗血清は、膜小胞に対して、また、インヴイトロ　ボレリアブルグドルフエリ 培養液より精製された、８３キロダルトン　（ｋＤａｌ小胞タ小胞タンパ対質て 生じた。免疫グロブリンＧ　ｆＩｇＧｌをこれら血清より回収しそして地理学的 に異なるいくつかのボレリア単離物との種−特異的反応について試験した。バル ロデイオン被覆（Ｐａｒｌｏｄｉｏｎ−ｃｏａｔｅｄ）された電子顕微鏡グリッ ドは、抗−小胞　Ｆ（ａｂ’ｌｘフラグメントにより活性化し、その後ダニ、ネ ズミ、イヌおよびヒトからの液または解離組織で培養した。捕捉された抗原を免 疫電子顕微鏡により抗−８３ｋＤａ抗体（即ち、８３　ｋＤａ　ＭＥＰに対して 生じた抗体）およびタンパク質Ａ−コロイド金抱合体を使用して分析した。結果 は、ライムスピロヘータが、尿、血液および感染宿主からの種々の器官において たやすく検出可能である表面抗原を脱ぎ捨てることを示した。陽性マウス尿の力 価は、Ｉ　Ｘ　１０’を超えた。完全なスピロヘータは、血液、肺臓または膀胱 標本で培養されたグリッドにおいてしばしば観察され、そしてボレリアブルグド ルフェリは、全ての実験的に感染されたマウスから再単離した。イムノプロット （ｉ腸ｌ１ｕｎｏｂｌｏｔ）分析は、陽性マウスおよびヒト尿素試料において細 胞外抗原の存在を確認した。これらの結果は、ボレリアブルグドルフエリ抗原が 多様な宿主物質中に生き残ることを再確認するものである。かかる抗原は、もし ライムボレリアブルグドルフエリを診断しまた研究するための鋭敏な分析をすれ ば、特異な多クローン性抗体を用いて捕捉しそして同定することができる。

それゆえ、本発明は、ダニ、マウス、イヌおよびヒトにおけるボレリアブルグド ルフェリー特異的抗原の検出のための鋭敏な免疫分析および診断試験キットに関 するものである。分析が固定化されたＦ（ａｂ′）ｚフラグメントを用いた抗原 の免疫捕捉を伴う場合には、多クローン性ＩｇＧを使用する特異的抗原検出がそ れに続く、多クローン性ＩｇＧと反応することが可能な試薬（例えば、標識化タ ンパク質Ａまたは標識化抗−多りローン性ＩｇＧ抗体）は、分析の間使用するこ とができる。この分析を使用して、ボレリアブルグドルフエリ抗原および時たま 完全なスブロヘータは、ダニおよび哺乳動物の尿、血液および器官において検出 された。

検出方法がタンパク質Ａの使用を伴う場合には、捕捉抗体は、Ｆｆａｂｉ−また はＦ　ｔａｂ）抗体フラグメントでなければならない。タンパク質Ａは完全なｒ ｇＧと結合する。

完全な抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを使用することができる。タ ンパク質Ａを使用する場合のみ捕捉抗体はフラグメントでなければならない。

抗原は、細胞外膜小胞濃厚物より生じたＦ（ａｂｉ−フラグメントを用いて捕捉 された。イムノプロット分析および免疫電子顕微鏡による抗−小胞血清の初期の 特徴付けは、血清ＩｇＧが多細胞でありそして０ｓｐＡおよび０ｓｐＢを含む表 面成分であると認められると示したが、該血清はまたいくつかの他の宿主抗原で あると認められた。抗−小胞Ｆ（ａｂ′ｌｘは、複合混合物から抗原を効率的に 濃縮しそして固定し、そして被覆された電子顕微鏡グリッドへの宿主物質および 分析試薬の非特異的吸着を阻止するように見えた。これら抗体はい（つかの宿主 抗原と交差反応したので、第二の抗体をボレリアブルグドルフエリ抗原の特異的 検出のために使用した。

検出抗体は、８３　ｋＤａ　ＭＥＰに対して生じた。驚（べきことに、イムノプ ロットは、生じた多クローン性血清は、３１　ｋＤａにて０ｓｐＡであると認め られるが、当初の免疫源と相対的に弱い活性を有していた。最近の研究は、０ｓ ｐＡおよびＭＥＰは種々の炭水化物とグリコジル化するようにみえることを示し てきた（　ＤｏｒｗａｒｄおよびＧａｒｏｎ　、標本における原稿）。グリコジ ル化または可能なタンパク質相同がこれらの結果を説明するかどうかは、不明の ままである。抗−ＩｇＧ　ＭＥＰはマウス尿素において８３　ｋＤａにて、そし てヒト尿素において１１．１４．２２．３１および３４　ｋＤａにてボレリアブ ルグドルフエリ抗原であると認められるという発見は、すべてに共通のエピトー プがいくつかの移出さ第１たタンパ、り質において、まｌ−〇はサブユニツｌ− または崩壊性産生物への旺Ｐ易解離物によ５いて表わｉｑることを示唆するもの である。

抗−・０ｓｐＡ単一クロ一ン性抗体の以前の特徴付けについて、Ｈａｒｂｏｕｒ 、Ａ、Ｇ、、Ｒ，Ｈ，Ｈｅ１ｌａｎｄ　、ａｎｄ　Ｔ、ＲＨｏｗｅ、１９８５． 　Ｈｅｔ、ｅｒｒ＋ｇｅｎｊ、ｔｙ　ｏｆ　ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉ ｎ　１．ｙｖａｅｄｉｓｅａｓｅ　ｂｏｒｒｅｌｉａｅ　：　ａ　ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　ａｎａｌｙｑｉｓ　ｏｆ　ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ　ａｎｄ　Ｅｕ ｒｎｐｅａｎ　１ｓｏｌａｔ、ｅｓ、Ｊ、Ｙｎｆｅｃｆ７．　Ｄｉｓｉ５２：４ ７８−１＋４；　Ｈｙｄｅ、Ｆ、胃、、Ｒ，Ｃ，Ｊｎｈｎ！１ｎｎ、Ｔ、Ｊ、１ ｌｂｉｔ、ｅ。

ａｎ４　Ｃ，Ｅ、５ｈｅｌｂｕｒｎ、）９８９．　ｒ）ｅｔｃｃｔｉｎｎ　ｏｆ 　ａｎｉｉｇｅｎ　１ｎｕｒｉｒ＋ｐ　ｏｆ　ｍ１ｃｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｓ 　ｉｒ＋ｆｅＣｔｅｄ　ｗｉｔ、ｈ　Ｒｏｒｒｅ］、ｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ ｉ、ｅｔｉｏｌｏｇｉｅ　ａｇｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｙｅｅ　ｄｉｓｅａｓｅ、、ノ 。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２７：　５Ｌ−６１ａｎｄ　ＷＨｓｋｅ、　Ｂ 、、Ｖ、−１’ｒｃａｅ−Ｍｕｒｓｉｃ　、　Ｇ、　５ｃｈｉｅｒｚ　、　Ｒ， Ｋｕｈｂｅｅｋ　、　Ａ、　Ｇ。

Ｂａｒｂｏｕｒ　、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｋｒａｍｅｒ−１９８８，Ａｎｔｉ、ｇｅ ｎｊｃ　ｖａｒｉ−ａｈｉｌｉｔｙ　ｎｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｈｕｒｇｄｏｒ ｆｅｒｉ、　ｐ、１２６ｉ４３．　Ｊ、　Ｌ。

Ｂｅｎａｅｈ、　ａｎｄ　Ｅ、ｌＪ、Ｂｏｓｌｅｒ　（編集１．　Ｌｙｍｅ　ｄ ｉｓｅａｑｅ　ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｏｃｄｅｒｓ、Ａｎｎａｉｓ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａ、ｄＣｍｙｎｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　５ ３９：１２６−１４３においては、抗−ＭＥＰ多クワクロー性ＮｇＧは、種特異 的なものであった。さらに、抗−〇ｓｐＡ単一　クローン性抗体がいくつかの菌 株と常に結合し２ないのに対して、この多クローン性抗体は、いく一つかの地理 学的に異なる単離物を含む、試験されたボレリアブルグドルフェリの全ての菌株 であると認められる。我々は、多クローン性丁ｇＧはＯｇｐＡおよびＭＥＰにつ いての多くのエピトープと結合すると仮定した。これゆえに、ボレリアブルグド ルフＪ、す菌株間の、これらタンパク質内のアミノ酸配列変化を反映した相違は 、抗体認知の完全な損失無く起きるであろう。

これら試薬を、実験的に感染されたマウスを電子顕微鏡により調べるのに使用し た場合に、ボレリアブルグドルフｆり一誘導物質が、尿、血液、および浸軟され た尿膀胱、肺臓、肝臓、および畦組織において検出された。

凝集した抗原は腎ｍ岨織において観察されなか１）なか、し７かし、腎臓標本に おける金の相対的に濃い沈着は、ボレリアブルグドルフエリ抗原が存在すること を示唆するものであっＩト。抗原を欠く対照グリッドおよび非感染マ・クスおよ びヒトからの物質で培養されたグリッドについての最小のバックグラウンド標識 化は、この分析における全沈着がボレリアブルグドルフェリ抗原について特異的 であることを示したい 完全なスピロｌ＼−夕は、マウス血液で、そしてマウスからの膀胱および肺臓組 織試料で培養されたグリッドに−）いて観察された。またスピロヘータはヒト尿 の試料ＩＬ１．１においても観察され、これは、この検出系が、感染宿主中のス ピロヘータを論証することの困難さにより複雑となっている組織包含物の研究を 容易にすることを示唆するものである（　Ｆａｘ　、　Ｊ、　！、、　１９８９ ．　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　ｉｎｌ、ｙＩｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｇｒｎ胃ｓ、　Ａ ＳＷ　Ｎｅｗｓ　５５　：　６５−６６）　。

抗−小胞Ｆ（ａｂ”ｌ＊フラグメントを用いたグリッドのブ１／培養は、特に血 液および浸軟組織のような複合体試料における、抗原検出の感度を画期的に増大 せしめた。綿状抗原はこれら試料においてブし・培養することなく観察されたが 、しかし、グリッドは相当量の非標識化宿主物質を含んで・いた。明らかに、ｌ ”（ａｈ’）＋＋フラグメントは、グリッド上のボレリア抗原を濃縮することに より、そして真核物質の非特異的吸着を阻止するごとにより、機能した。

小胞は、感染された組織で培養されたグリッドにくつ一つくスピロへ−一りの表 面上で分解され、これはこれら小胞がボレリアブルグドルフェリによりインヴイ ヴオで産生ずることを示す。また金−標識化された膜様小胞は、尿および血液に おいて観察された。大部分の特異的全標識化は、ボレリアブルグドルフェリ培養 物および全ての感染された動物において検出された綿状物質について起きた。構 造的に類似の物質は、しばしば細胞表面について観察されたけれども、その正確 な性質は、現在知られていない。ウェスタンプロットは、抗−ＭＥＰ　ＩｇＧお よび抗−０ｓｐＡ　単一クローン性抗体が同様の反応性を有することを示した。

以前の研究は、ボレリアブルグドルフエリが細胞の表面より　０ｓｐＡを脱ぎ捨 てることを示Ｌ７た（　Ｂａｒｂｏｕｒ、Ａ、Ｇ、、Ｓ、Ｌ、Ｔｅ５ｓｉｅｒ、 ａｎｄ　胃、　Ｊ、Ｔｏｄｄ。

１９８３、Ｌｙａｉｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｅｈｅｔｅｓ　ａｎｄ　１ ｘｏｄｉｄ　ｔｉｃｋｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　５ｈａｒｅ　ａ　ｃｏ＋＋ｕ＋ ｏｎ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉＣｄｅｔｅｒｖｉｎａｎｔ　ｄｅｆｉ ｎｅｄ　ｂｙ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙＩｎｆｅｃｔ、　 Ｉｍｗｕロ　４１　ニア９５−８０４　）　、これらの結果はともに、０ｓｐＡ およびＭＥＰが相同を持ち合いそして表面または細胞表面から放出し得るＳ一層 の成分であり得ることを示唆するものである。

嘔クローン性抗体を使用した尿中の抗原の検出は、近年報告されている（　Ｈｙ ｄｅ、　Ｆ、　Ｗ、、　Ｒ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｔ、Ｊ、Ｗｈｉｔｅ、ａｎ ｄ　Ｃ，Ｅ、５ｈｅｌｂｕｒｎ、１９８９．　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆａｎｔ ｉｇｅｎ　ｉｎ　ｕｒｉｎｅ　ｏｆ　ｍ１ｃｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｓ　１ｎｆ ｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈＢｏｒｒｅｌｊ、ａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　、　ｅｔ ｉｏｌｏｇｊ、ｃ　ａｇｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｙｍｅｄｉｓｅａｓｅ、　Ｊ、　（： ｌｉｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７　：５８−６１）　ｍ以下の実施例１は 、その発見を確認し、そして報告された検出感度を高め得る方法を提供するもの である（Ｈｙｄｅ、　Ｆ、　Ｗ、。

Ｒ０仁Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｔ、　Ｊ、１１ｈｉｔｅ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｅ、　５ｈ ｐｌ　ｂｕｒｎ。

１９８９、　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｎ　ｕｒｉｎｅ　 ｏｆ　５ｍ１ｃｅ　ａｎｄｈｕｍａｎｓ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｂｏｒ ｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　。

ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ　ａｇｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｙｌｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、　２７＋５８−６１）　、実施例１はまた、 細胞外ボレリアブルグドルフエリ抗原がスブロヘータがしばしば報告されている 組織中に生じることを示している（Ｄｕｒａｙ＋　Ｐ、■。

ａｎｄ　Ａ、　Ｃ，５ｔｅｅｒｅ、　１９８８．　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｐａｔｈ ｏｌｏｇｉｅ　ｃｏ−ｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｌｙｍｅ　ｄｉａｓｅａｓ ｅ　ｂｙ　ｓｔａｇｅ、　ｐ、　６５−７９Ｉｎ　Ｊ、Ｌ、　Ｂｅｎａｃｈ、　 ａｎｄ　Ｅ、１４．Ｂｏｓｌｅｒ　（編集）、　Ｌｙｍｅ　ｄｉ−ｓｅａｓｅ　 ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　 ＮｅｗＹｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　５３９　：６５− ７９　）　、かかる結果は、大量の循環抗原がこれら組織中に沈着してし）るか 、または該抗原が限られた数の移住スピロヘータにより秘蔵されそして抗原がそ の壜に存在しているかのいずれかを示唆するものである。この物質の可能な病理 学的効果は知られていないが、しかし、その性質とそれの沈着の機構を決定する ことは、ボレリアブルグドルフエリ病理学のより良い理解を導くものである。以 下に述べるように実施例１で開発された試薬は、かかる決定を容易にするであろ う。

Ｆ（ａｂ′）ｉ標本およびＩｇＧ標本は両方とも、凍結乾燥粉末として貯蔵した とき安定であると証明された。これらの実験において、試薬は使用の直前に再水 和され、これは適当な標本が必要とされる用途のためのアリコート中に貯蔵され そして配布されうることを示している。多クローン性抗原検出と組み合わせた免 疫捕捉は、最小の抗原多様性から生じる、ボレリアブルグドルフエリの偽りの陰 性検出を減少し、そしてベクター、レザバー宿主、家畜、およびヒトの尿、血液 または組織試料中のこのスピロヘータおよびその産生物の信頼できる論証を可能 にするべきである。当初は捕捉された抗原についての電子顕微鏡による注意深い 探査のために設計されていたけれども、本装置は、より共通の臨床分析プロトコ ルに容易に適合し得るものである。

この臨床分析プロトコルは、当業者にとって周知である。抗体、特にＭＥＰに対 して生じるものは、全ての慣用の免疫分析フォーマットにおいて生物学的試料中 の抗原を検出するために、そして従ってボレリアブルグドルフェリの存在を検出 するために使用することができる。相同および異質免疫分析の両方とも、使用す ることができる。抗−ＭＥＰ抗体は、通常の標識、例えば、酵素、放射性同位体 、蛍光体、金属（金）コロイドを用いて直接標識化することができるか、または 、これら標識は、抗体結合タンパク質（抗−抗−ＭＥＰ抗体、タンパク質Ａ等） に付着して間接的に抗−ＭＥＰ抗体を標識化することができる。移出された抗原 を検出するより好ましい方法は、以下の通りである。抗−小胞抗体は、不活性固 形支持体に結合している。生物学的試料は、抗−小胞抗体と試料中のボレリアブ ルグドルフエリ抗原と会合する全ての抗原との間の免疫複合体の形成を導くよう な条件のもと、この支持体と接触するように運ばれる。該抗原には、完全なボレ リアブルグドルフエリスピロヘータ、細胞外膜小胞、そして、８３　ｋＤａ　Ｍ ＥＰを含む、スピロヘータの表面からの移出タンパク質、そして実施例１に記載 されたような、ヒト尿において見出された１１．１４．２２．３１および３４　 ｋＤａ移出タンパク質が含まれる。支持体は洗浄されそしてその後、抗−小胞（ 抗原）抗−ＭＥＰ複合体よりなる３成分サンドイッチ免疫複合体の形成を導くよ うな条件のもと、抗−ＭＥＰ抗体と接触するように運ばれる。抗−ＭＥＰ抗体は 、サンドイッチ免疫複合体が直接検出される場合に、直接標識化することができ る（上記参照）。あるいは、３成分サンドイッチ免疫複合体をもつ支持体は洗浄 することができ、そしてその後該複合体の抗−ＭＥＰ抗体部分は、当業者によ（ 知られた手段によって検出される。例えば、標識化された抗−抗−ＭＥＰ抗体を 使用することができる。；抗−旺Ｐ抗体が、種Ａ（ウサギ例えば）において生じ るならば、その後翼なる種において生じた標識化された抗−Ａ抗体（即ち、マウ ス抗−ウサギ抗体）は、３成分複合体において抗−ＭＥＰを検出するのに使用す ることができるであろう。抗−旺Ｐ抗体に結合する他の標識化された特異的結合 タンパク質、例えばタンパク質Ａが使用することができる。移出抗原を検出する 最も好ましい方法は、不活性固形支持体、非標識化抗−ＭＥＰ　ＩｇＧ抗体およ び検出のためのタンパク質Ａと結合する抗−小胞抗体から作られたＦ（ａｂｌ− フラグメントを使用するものである。実施例１の結果は、上記に述べてきた議論 および結論を支持するものである。

本発明は、鴫乳想からの尿、血液、そして組織生検材料を用いた使用に、そして 潰したダニを用いた使用に有効であると証明するものである。単一クローン性の 代わりに、貯溜された多クローン性抗体の使用は、ボレリアブルグドルフエリ単 難物についての遺伝的および抗原性変異により引き起こされる認識の損失を減少 する。さらに、滴定された尿素中の抗原検出のためのこの装置の感度は、スリー エム社の研究により報告されたものよりも少な（とも１０４倍より高い、この結 論は、尿を１：２百万に希釈したときそして１：６４の希釈液につし１ての報告 の際の本発明者の発見に基づくものである（　Ｈｙｄｅ。

Ｆ、　胃０等、　１９８９．　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉ ｎ　ｕｒｉｎｅ　ｏｆｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｓ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｗ ｉｔｈ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、　ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ　 ａｇｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　２７：５８−６１　）。

それゆえ、本発明は、試料中の特異化された微生物の存在を検出するための方法 において、Ｆ［ａｂ′）ｚフラグメント、Ｆ　（ａｂｌ　フラグメントを用いて 、または、ボレリアブルグドルフェリから移出された細胞外膜小胞に対して生じ る完全なもしくは未処理の抗体分子（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を用いて、 前記試料中のボレリアブルグドルフェリ抗原を捕捉し、そして捕捉された抗原を ８３　ｋＤａＭＥＰに対して生じる多クローン性抗体に接触させることよりなる 検出方法に関する。捕捉そして抗原と抗体との接触は、生理学的食塩水、例えば ｄＰＢＳ中で起きる。加えて、前記試料中のボレリアブルグドルフエリ抗原は、 固定化されたｌ”（ａｂ′ｌｉフラグメント、固定化されたＦ（ａｂｌフラグメ ント、または、ボレリアブルグドルフエリ抗原と結合可能な固定化された完全な 抗体分子を用いて捕捉することができる。多クローン性抗体は放射性標識化する ことができそして生じた抗原／ｒｇＧ複合体は放射性免疫分析により容易に検出 することができる（　Ｇｅｅ、　Ａ、　Ｐ。

ａｎｄ　Ｊ、Ｊ、　Ｌａｎｇｏｎｅ　（１９８３１，ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　 ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｓｔｉｃ　ｔｕｂｅ　ｏｎ 　ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　ｏｒ　ｅｎｚｙｖｅｌａｂｅｌｅｄ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ａ　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ霞ｏ１．　９２：　４０３−４１３；Ｕ ｅ＊ａｔｑ＋１．Ｄ、Ｔ、、Ｒ，Ｓ、Ｇｅｈａ　（１９８７１，Ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ　ａｒｉｔ、１ｂｏｄｙ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｒ＋ｓ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ、ｂｌｏｏｄｌｙｍｐｂｏｃ ｙｔｅｓ、　Ｍｅｔｂｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５０：３０９−３１６　） 　ｔ＋あるいは、多クローン性抗体は、多クローン性抗体と反応することができ る試薬（例えば、標識化）と接触することができ、そしてその後抗体／試薬複合 体が検出される。

例えば、抗体／試薬複合体は顕微鏡を通じて視覚的に検出することができる。よ り好ましくは、多クロー　ン性抗体はｒｇＧ種類のものであり、また、多クロー ン性ＩｇＧと反応可能な試薬はタンパク質抱合体、例えばミズーリ州セントルイ スのシグマ　ケミカル　カンパニー（Ｓｉｇｍ３Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ）により製造されたもの（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｒ＋　Ａ　ｇｏｌｄ、　ｃ ａｔ、ａｌｏｇ　Ｎｏ、Ｐ１０３９）である、　ＩｇＧと反　５応可能な他の適 する試薬には、市販にて入手可能なタンパクｉＧ抱合体または同様の抗−ＩｇＧ 抗体抱合体が該当する。タンパク質Ｇ金抱合体は、ミズーリ州セントルイスのシ グマ　ケミカル　カンパニーより、ｃａｔ、ａｌｏｇ　Ｎｏ、Ｐ１６７１にて入 手できる。

本発明の多クローン性抗体がより好ましいけれども、多クローン性組織として機 能する種々の単一クローン性抗体を含む組織もまた本発明の範囲内である。

ボレリアブルグドルフエリ抗原の特異的捕捉のための試薬を記載する場合に、用 語“Ｆ（ａｂ’ｌ、Ｉフラグメント”を使用することは、この目的のために“Ｆ ［ａｂ）フラグメント”または完全な抗体を使用することをも包含するものであ る。

本発明により、種々の試料は、未知の生物学的試料中のライム病スピロヘータの 存在を表示するバイオ産生物の存在のために試験することができる。ライム病の 診断のために、感染していると疑わしい患者からの体の試料は、普通、適当な溶 液例えば生理学的食塩水中に希釈され、そし７てその後この溶液は、支持体と固 定化されたＦ（ａｂ′）よフラグメントとを含む診断装置に接触させられる。そ の後、抗原は、８３　ｋＤａ　ＭＥＰに対して生じた多クローン性１ｇＧとタン パク質Ａ抱合体のような多クローン性ＩｇＧと反応可能な試薬とを用いて検出さ れる０例えば、試験すべき患者の血液中のライム病スピロヘータの存在を表示す るバイオ産生物の存在について試験する場合には、血液は、患者から常法により 抽出されそしてその後血液は所望により無菌溶液中に置かれる。その後この溶液 は細菌の存在について試験される。生物学的試料は哺乳類の尿、血液または器官 よりなる。器官は、浸軟された尿膀胱、肺臓、肝臓、心臓、腎臓および能組織よ りなる群から選択することができる。

Ｆ（ａｂｌｙフラグメントが結合し得る種々の不溶性支持体を使用することがで きる。支持体は、導入すべき診断試験と干渉することなく　、Ｆ　（ａｂ　′） 　＊フラグメントと容易に結合することが可能であるべきである。可能な支持体 には、ガラス；薄層クロマトグラフィ材料例えばシリカゲル；合成プラスチック 材料例えばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレン が含まれる。支持体は、平坦板、ガラスピーズ、他の支持体上の薄層、マイクロ タイター板、ベトリ皿、ラテックスビーズ、アガロースまたは他の種類のビーズ 、濾紙、ナイロン濾過膜、細菌または他の種類の細胞、ガラス板、ガラス管、プ ラスチック管等の形態であってよい。また支持体は、多孔性または非多孔性の膜 またはフィルムの形態であり得る。好ましくは、Ｆ（ａｂ’１．フラグメントは 、ＰａｒｌｏｄｉＯｎ−被覆の電子顕微鏡グリッド、ニトロセルロース濾過膜、 ガラスカバースリップおよびマイクロタイター壁よりなる群から選択された固形 表面に固定化することができる。

Ｆ（ａｂ′ｌ−フラグメントは支持体に、検出すべき抗原のＦｆａｂ’）ｇフラ グメントへの結合を可能にするのに十分な量でかつ可能にする方法により結合す べきである。実用の観点から、Ｆ（ａｂ′）−フラグメントは通常、支持体の表 面積について少なくとも０．１　ｎｇ／鵬璽２、より好ましくは少なくとも　１ −１．７　ｎｇ／■ｍｌの量で存在するであろう。支持体上のＦ（ａｂ′）ｘフ ラグメントの濃度の上限だけは、Ｆ［ａｂ’ｌｘフラグメントは支持体の飽和濃 度まで結合することができる。例えば、ポリスチレン上のＦ（ａｂ′）ｔフラグ メントの飽和濃度は、上述の製造者の支持体について常法により確立している（ Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｐｅｒ１ｍａｎｎｆ１９７２１．　Ｅｎ ｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳ ＡＩＩＩ、　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｙｅｎｚｙｍｅ−１ａｂｅｌｅｄ　ａｎｔｉ−ｉｍ＋ｗｕｎ ｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｒ＋ｃｏａｔｅｄ　ｔｕｂｅｓ、Ｊ、 ｌｍ５ｕｎｏ、１口９：１２９−１３５；　Ｖｏｌｌｅｒ　Ａ、、Ｄ。

Ｂｉｄｗｅｌｌ、Ｇ、Ｈｕｌｄｔ、ａｎｄ　Ｅ、Ｅｎｇｖａｌｌ　ｆ１９７４１ ．　Ａ　ｍ１ｃｒｏ−ｐｌａｔｅ　１Ｉｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｅｎｚｙ−ｅ−１ｉ ｎｋｅｄ　１ｍ５ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙａｎｄ　ｉｔ、ｓ　ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｍａｌａｒｉａ、Ｂｕｌｌ、ｌｉｄ、Ｈｌｔｈ。

Ｏｒｇ、　５１：２０９−２１１１゜Ｆ（ａｂ′ｌｉフラグメントは、支持体の 表面積を実質的に完全に覆う分子単層として結合することができる。支持体と結 合する分子単層のＦ（ａｂ′ｌｔフラグメント以上の使用は、材料の無駄の結果 になりまた支持体とのＦｆａｂ′ｌｉフラグメントの不十分な結合の結果となる 。好ましくは、与えられた支持体を用いた使用につき最適量のＦｆａｂｌｔフラ グメントを実験的に決定した後に、支持体はＦ（ａｂ′ｌ’＝フラグメントで飽 和される。

Ｆ（ａｂ′１ｍフラグメントは、適当ないかなる方法によっても支持体に結合す ることができる。共有または非共有（例えば、疎水性）結合は、Ｆ（ａｂ′ｌ＊ フラグメントを支持体に結合するのに使用することができる。あるいは、Ｆ（ａ ｂ′ｌｔフラグメントは、支持体に共有結合することができる。結合の他の形態 、例えばイオン結合を使用することもできる。完全な抗体分子またはＦ（ａｂｌ 　フラグメントは、置換された試薬がボレリアブルグドルフエリ抗原を支持体上 に、ここに記載した検出試薬との非特異的交差反応を引き起こすことなく、保持 することができるという条件で、Ｆ（ａｂ”ｌ＊フラグメントに置き換えること ができる。

またＦ（ａｂ′ｌ冨フラグメントは、粒子、例えばラテックス粒子に結合するこ とができ、その後これは、多孔性膜中に埋め込むかまたは膜に結合することによ り固定化される。ラテックス粒子は、圧力によって多孔性膜の孔に埋め入れるこ とができる大きさのものでよい。従って、例えば、ラテックス粒子の平均粒子径 は、前記多孔性膜の平均表面孔サイズとほぼ同じか、または僅かにより小さいも のであってよい。あるいは、粒子は、いかなる多孔性または液透過性材料、例え ばスクリーン、網等と結合することができる。結合剤のような材料は、結合剤が Ｆ［ａｂ′ｌｘフラグメントの微生物に結合する能力を妨げない限り、粒子を支 持体に結合するのに使用することができる。

ボレリアブルグドルフエリまたはその移出抗原を含むものと思われる試料は、上 記したところのＦ（ａｂ′ｌｘフラグメントを含む支持体と接触させる。より好 ましくは、溶液は支持体と、平衡に至るまでにまたはそれ以前に、例えば、１０ ないし１２０分間、より好ましくは３０ないし６０分間、２０ないし３７℃、よ り好ましくは２５ないし３７℃の温度にて接触させる。正確な時間および温度条 件は、細菌抗原がＦ（ａｂｌｘフラグメントに精密な試験を可能とするのに十分 な程度に吸着するのに十分な時間を提供するように選択される。試験すべき試料 は、種々の液体例えば生理学的食塩水等に溶解／希釈することができる。

溶液がＦ（ａｂ′）、フラグメントを含む支持体に、細菌または細菌により移出 された抗原がＦ（ａｂ′）、フラグメントと結合するのに十分な時間の間接触し た後、支持体は所望により全ての非結合材料を除去すべく洗浄される。

その後試験は、支持体上のＦ（ａｂ′ｌ−フラグメントに結合する、細菌または 細菌により移出された抗原の存在を決定すべく行われる。この目的を達成するた めの種々の試験、例えば酵素結合免疫吸着剤分析（ｅｎｚｙｍｅ　ｌｊｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ＋　ＥＬＩＺＡ）　、直接または間接 蛍光抗体試験などは、当業者に知られている。基本的には、ｐ（ａｂ’ｌｘフラ グメントを含みそしてそこの結合する細菌抗原を含むと思われる支持体は、試験 すべき細菌抗原に結合する材料と接触させる。そのような材料には、例えば、細 菌抗原に対して生じる抗体（例えば、多クローン性ＩｇＧ）が該当する。支持体 ／Ｆ（ａｂ’１ｍフラグメント／抗原／多クローンりＩｇＧ複合体は、多クロー ン性ＩｇＧと反応可能な試薬、例えばタンパク質Ａ抱合体、タンパク質Ｇ抱合体 などで標識化される。

タンパク質Ａのような試薬は、容易に検出し得る支持体でａ！識化することがで きる０例えば、タンパク質Ａは酵素、放射性物質または元素または蛍光物質と抱 合することができる。タンパク質Ａが酵素と抱合するとき、支持体はその後、好 ましくは酵素との接触の際着色しこれによって陽性反応を示すところの酵素のた めの支持体と接触させる。使用すべきタンパク質Ａは、多クローン性ＩｇＧと反 応するが支持体に結合するＦ（ａｂ′ｌｉフラグメントとは反応せず、これによ って偽りの陽性の読みを防止できるところのものであるべきである。タンパク質 Ａが放射性標識化されるとき、その後支持体上の放射能の存在を測定すべきであ る。またタンパク質Ａは蛍光的に標識化されることも可能である。この状態にお いて、処理された支持体は、紫外光に曝露して、支持体に結合する蛍光標識化物 質の存在を決定すべきである。より好ましくは、タンパク質Ａ抱合体は、コロイ ド金、蛍光物質例えばフルオレセインイソチオシアネート、ロダミン、ラテック スビーズまたは他の適当なビーズ、ビオチン、アヴイジン、酵素例えば西洋わさ びペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼよりなる群から選択するこ とができる。多クローン性ＩｇＧと反応可能な他の適当な試薬には、タンパク質 Ｇ抱合体、同様の抗−ＩｇＧ抗体抱合体および抗−ＷＥＰ　ＩｇＧ　、または抗 −ＭＥＰ　ＩｇＧより作られたＦ　（ａｂｌ　もしくはＦ（ａｂ′１．フラグメ ントとの直接抱合体が該当する。

本発明の検出装置は、ｄＰＢＳ　（生理学的食塩水）中に１７２．１）［１（１ ，０００に希釈されたマウス尿において抗原を検出するのに有効であることを証 明した。

本発明は、さらに、ボレリアブルグドルフエリ抗原を捕捉しそして保持すること が可能な、Ｆ（ａｂ′ｌｉフラグメント、Ｆ（ａｂｌ　フラグメントまたは完全 もしくは未処理の抗体分子と、８３　ｋＤａ　ＭＥＰに対して生じる多クローン 性抗体よりなり、これら抗体は直接標識化することができるか、または多クロー ン性抗体と特異的に結合する標識化された特異的結合タンパク質は、多クローン 性ＩｇＧ　（例えば、タンパク質Ａ抱合体）とともに使用されそして抗原−抗体 複合体の存在を検出可能である、ボレリアブルグドルフエリまたは移出抗原の存 在を検出するための診断キットに関するものである。例えば、Ｆ（ａｂ′ｌｉフ ラグメント、Ｆ（ａｂｌ　フラグメントまたは完全な抗体分子は、所望により試 験キットで供給される支持体上に固定化することが可能である。

それゆえ、ライム病を診断するためのキットは、ａ）抗−ＩＩＩＥＰ抗体または ｂ）標識化された抗−ＭＥＰ抗体、Ｃ）抗−ＭＥＰ抗体および標識化された抗− ＭＥＰ抗体または標識化されたタンパク質Ａまたはｄ）抗−小胞抗体および抗− ＭＥＰ抗体、などより成る。

ボレリアブルグドルフェリ抗原と結合することが可能な、Ｆ（ａｂ’ｌｉフラグ メント、Ｆ（ａｂｌ　フラグメントまたは完全な抗体分子、ＩｇＧｆｉ本および 多クローン性ＩｇＧと反応することが可能な試薬例えばタンパク質Ａ抱合体は、 粉末の形態であってもよい。

また本発明は、喘乳類（例えば、ヒト）宿主よりボレリアブルグドルフェリ抗原 を含むと思われる生物学的試料を採取すること、Ｆ［ａｂ′１ｍフラグメント、 Ｆ　（ａｂｌ　フラグメントを用いてまたは細胞外膜様小胞に対して生じる完全 な抗体分子を用いて前記試料中のボレリアブルグドルフェリ抗原を捕捉すること 、および８３　ｋｒ）ａ　ＭＥＰに対し。

て生じる多クローン性抗体を用いて該抗原を検出するごどの段階より成る、哺乳 類（例えば、ヒトおよび家畜例えばイヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等） におけるライム病を診断する方法に関する。生物学的試料は、例えば、哺乳類の 尿、血液または器官より成る。その器官は、浸軟された尿膀胱、肺臓、肝臓、能 組織、心臓および腎臓よりなる群から選択される。

加えて、本発明はマダニがボレリアブルグドルフエリを含むかどうかを決定する のに使用することができる。

例えば、ダニは、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのホスフェート緩衝５ａｌｉｎｅｐＨ７，２ ｆｄＰＢｓｌ中に潰されそして本発明の方法において検出すべき試料として使用 することができる。

さらに、本発明は、ボレリアブルグドルフエリより単離された、精製された、大 部分細胞外のタンパク質よりなる抗原に関する。細胞外膜様小胞は、Ｇａｒｏｎ 、　ｅｔ　ａｌ。

（１９８９１５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｆｅａｔｕｒｅＳｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ 　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ−−ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏ ｃｈｅｔｅ　：　５ｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａ ｃｉｄｓ、Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　５ｕｐｐｌｅ＋ｗｅｎｔ ３、　ｐａｇｅｓ　１０９−１１５−により記載されているようにボレリアブル グドルフエリのｌｏｇ　ｐｈａｓｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓより回収した。細胞は、 ２０℃にて２０分間、ＩＱ、０ＯＯＸ　ｇでの遠心分離により培養物から除去し た。細胞の除去は、ｚｏ、ｏｏｏｘ　ｇで１５分間の更なる遠心分離により、そ して０．２２μｍフィルタを通す濾過により確実なものとした。小胞は、この濾 液より、２０℃にて２５７，０００　ｘ　ｇで１時間の遠心分ｍにより回収した 。小胞べ［／ット・け、ｄＰＢＳ中に再懸濁させ、その後ｄＰＢＳ中のｔｏ−７ ０％段階蔗糖勾配の上に層にし、そして４℃にて２５９，０００　Ｘ　ｇで２時 間遠心分離をした。その後、染色された膜様は除去し、ｄＰＢＳ中に１＝１で希 釈し、そして４℃にて４３５，０００　Ｘ　ｇで１５分間の遠心分離により収集 した。

かかる小胞は、ｄＰＢＳ　１■１当り１ｕｇに懸濁したとき、ウサギにおける免 疫源として使用した。小胞で免疫化されたウサギにより産生された抗体は“抗− 小胞Ｆ（ａｂ′ｌｔフラグメント”を産生ずるのに使用された。またこれら小胞 は、”ＭＥＰ”抗原が精製されるところの源として使用した。

したがって、本発明は、さらに、分別により、例えば遠心分離によりボレリアブ ルグドルフエリ培養物から細胞を除去すること、細胞を濾過すること、そして濾 液を収集すること、小胞を濾液より回収すること、小胞を蔗糖勾配の上に層にす ること、および染色された膜を蔗糖勾配より除去することの段階によって単離さ れた細胞外小胞の抗原に関する。

大部分の細胞外タンパク質（ＭＥＰＩ抗原は、細胞外小胞抽出物より電気泳動で 精製され、ナトリウム　ドデシルスルフェート−ポリアクリルアミド　ゲル電気 泳動により分離された（　Ｊｕｄｄ、　Ｒ，Ｃ，（１９８８１Ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ｏｆｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａＣｔｅｒｉｕｍ　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ。

１７３　：３０７−３１６）　、　ＭＥＰは、明らかに、８３キロダルトン（ｋ Ｄａ）の分子量をもったタンパク質であり、そしてそれは図１に示した。それは 、精製された細胞外小胞（上記の通り）の主要なタンパク質成分を構成する。Ｍ ＥＰの機能は、知られていないが、しかし、予備データは、ボレリアブルグドル フェリのＳ一層の表面が主としてＭＥＰで作られていることを示唆している。

ＭＥＰの精製は実施例１に記載し、そしてそれは実施例１で記載するようにウサ ギを免疫化するのに使用した。

ウサギにより産生された多クローン性ＩｇＧは、このタンパク質に関して診断試 薬の検出試薬として使用した。

本発明はさらに、上記した抗原に対して生じる抗体に関する。例えば、本発明は 、および９５　ｋＤａの分子量を有する抗−小胞Ｆ（ａｂ’ｌｉフラグメントに 関する。それは、２の抗原−結合価を有し、これは、それがＦ（ａｂ′ｌｚ１モ ル当り２モルの抗原と結合（免疫化）できることを意味している。例えば、Ｆ（ ａｂｉ、フラグメントの１μｇ／ｍｌ溶液は、およそ　１０．５ピコモルを含ん でおり、抗原２１ピコモルまで結合可能である。

Ｆ（ａｂ’ｌオフラグメントは、実施例１に記載するようにペプシンによる抗− 小胞ＩｇＧの消化、続いて親和力クロマトグラフィにより作った。従ってＩｇＧ は、実施例１に記載したようにタンパク質Ａ−アガロースを用いた親和力クロマ トグラフィにより抗−小胞血清から精製した９Ｆ（ａｂ′ｌ＊フラグメントは、 ボレリアブルグドルフエリにより産生された細胞表面および細胞外抗原を結合し そして固定化することができ、そしてそれらは、本発明においてかかる目的のた めに使用した。

その上、本発明はさらに、８３　ｋＤａ　ＩＪＥＰに対して生じる多クローン性 抗体に関する。これら抗体は、ウサギにより精製されたＭＥＰを用いた免疫化に ついて産生され、そして実施例１に記載したように、親和力クロマトグラフィに より精製した。

抗−１４ＥＰ　ＩｇＧは、ＭＥＰに、モしてイムノプロット上で（図Ｌ　）　、 ３１　ｋＤａ（ＯｓｐＡｌのタンパク質に結合し、そしてそれは、細胞表面抗原 、およびボレリアブルグドルフエリにより産生された細胞外抗原に結合する。そ れは、関連するスブロヘータ、例えばボレリア属のその他の種、およびレプトス ピラ　インテッロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）によ り産生された抗原と結合しない、抗−ＭＥＰ　ＩｇＧは、本発明において、ボレ リアブルグドルフェリにより産生された抗原で、抗−小胞Ｆ（ａｂ′ｌ＊フラグ メントによって捕捉されそして固定化されている抗原を検出するのに使用される 。

実施例　１ 材料および方法 バクテリア、　本研究で使用されたバクテリアを表１゜、＼　、＼ 表１の全てのバクテリアは、バーボア、　Ａ、　Ｇ、　（Ｂａｒｂｏｕｒ　Ａ、 　Ｇ、）、１９８４．　ｆライム病スピロヘータの単離および培養（Ｉｓｏｌａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｙｍｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅ ｔｅｓ）　Ｊ　Ｙａｌｅ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。Ｍｅｄ、　５７：５２１−５２５　 に記載のＢＳＫｆｆ培養液に保持される。ドーウｔ−ド、Ｄ、Ｗ。

（Ｄｏｒｗａｒｄ、　Ｄ、　Ｌ　）およびＲ，Ｃ，シュド（Ｒ，Ｃ，Ｊｕｄｄ） 　１９８８　ｒＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅの自然進化した外 膜ブレ１の単離および部分的特徴付け（Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　 ｐａｒｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｌａｔｕｒａｌ ｌｙ　ｅｖｏｌｖｅｄ　ｏｕｔｅｒ　ｌｌｌｅｍｂｒａｎｅ　ｂｌｅｂｓ　ｏｆ 　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　ｊ　ｐ、３４９−３５６に 記載されているように細胞全体（ＷＣ）および細胞外膜小胞をろ過および分縮遠 心で取り出した。「淋菌および髄膜炎菌（Ｇｏｎｏｅｏｃｃｊ　ａｎｄ　Ｍｅｎ ｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）Ｊ　、Ｊ　、　Ｔ　、ブールｖ：ｚ（Ｊ、Ｔ、Ｐｏｏｌｍ ａｎ）　、Ｈ，Ｃ，ザンエン（Ｈ，Ｃ，Ｚａｎｅｎ）、Ｔ、Ｊ、メイヤー（Ｔ、 Ｊ、Ｍｅｙｅｒ）　、Ｊ、Ｅ、へブケル（Ｊ、Ｅ、Ｈｅｃｋｅｌｓ）、Ｐ、　Ｒ ，Ｈ，マケーラ（Ｐ、　Ｒ，Ｈ，Ｍａｋｅｌａ）、Ｈ，スミス（Ｈ，！１ＩＩＩ ｉｔｈ）　、およびＥ、Ｃ，ビューヴエリ　（８，Ｃ，Ｂｅｕｖｅｒｙ）　（１ り　、　Ｋ　１　ｕｗｅ　ｒ　Ａｃ　ａ　ｄ　ｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ 、ドードレヒト（Ｄｏｒｄｒｅｈｔ）、ネーブルランド　および　ガロン、Ｃ， Ｆ、（Ｇａｒ。

ｎ、Ｃ，Ｐ、）　、Ｄ、Ｗ、ドーウｔ−ド（Ｄ、１１．Ｄｏｒｗａｒｄ）　、お よびＭ、Ｄ、コーライン（Ｍ、Ｄ、Ｃｏｒｗｉｎ）　１９８９．　（ｒボレリア ブルグドルフェリー　ライム病スピロヘータの構造的特徴：核酸に対する銀染色 。（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆＢａｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒ ｇｄｏｒｆｅｒｉ−−ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔ ｅ：　５ｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ 、）走査顕微鏡使用法補遺３．１０９−１１５頁〕。

抗体。ポリクローナルのウサギ血清を膜小胞に対して増加させ、そして８３ｋＤ ａ　ＭＥＰ、電気泳動で小胞から精製した〔ドーウォード、　Ｄ、Ｗ、（Ｄｏｒ ｗａｒｄ、ＤＪ。

）およびＲ，Ｃ，シュド（Ｒ，Ｃ，Ｊｕｄｄ）　１９８８　ｒＮｅｉｓｓｅｒｉ ａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの自然進化した外膜ブレ１の単離および部分的特徴付 け（Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｅｖｏｌｖｅｄ　ｏｕｔｅｒ　 ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｂｌｅｂｓ　ｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅ）　ｊ　ｐ、３４９−３５６　、ｒ淋菌および髄膜炎＋１１（Ｇｏｎｏｃｏ ｃｃｉ　ａｎｄ　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）Ｊ　、Ｊ、　Ｔ、ブールマン（Ｊ 、Ｔ、Ｐｏｏｌｍａｎ）　、Ｈ，Ｃ，ザンエン（Ｈ，Ｃ，Ｚａｎｅｎ）、Ｔ、Ｊ 、　メイヤー（Ｔ、Ｊ、Ｍｅｙｅｒ）　、Ｊ、　Ｅ、　ヘ−ｙケル（Ｊ、Ｆｌ、 Ｈｅｃｋｅｌｓ）　、Ｐ、　Ｒ，Ｈ，？ケーラ（Ｐ、　Ｒ，Ｈ，Ｍａｋｅｌａ） 、Ｈ，スミス（Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ）　、およびＥ、Ｃ，ビューヴエリ　（Ｅ、Ｃ， Ｂｅｕｖｅｒｙ）　（纒）、に１ｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｒｓ、ドードレヒト（Ｄｏｒｄｒｅｈｔ）、ネーブルランド　および　Ｒ，Ｃ ，シュド（Ｒ，Ｃ，Ｊｕｄｄ）　１９８８　、ｒグラム陰性バクテリアＮｅ１ｓ ｓａｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅの外膜蛋白質の精１！（Ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｔｅｉｎｓ　ｆｏ　ｔｈ ｅ　Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｅｒｉｕｍ　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇ ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、）　Ｊ　八ｎａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３　：　３０７ −３１６　）。ｒ抗原の乳濁液、および−燐酸化した脂質Ａおよびトレハロース 　シミコレート（Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　ｍｏｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　１ｉｐｉｄ　Ａ　ａｎｄ　ｔｈ。

ｒｅｈａｒｏｓｅ　ｄｉｍｙｅｏｌａｔｅ）Ｊ　（Ｒｉ　ｂ　ｉ　ｌ　ｍ　ｍ　 ｕ　ｎ　ｏ　Ｃｈｅｍ、Ｉｎｃ、、ハミルトン、モンタナ州）はメーカー説明書 に従って調整し、最初の免疫源として使用した。

免疫化されたウサギは周期的にｄＰＢＳに懸濁した抗原で増加された。血清はｉ ｏ：Ａｍかけて集められた。

免疫グロブリン　Ｇ（ＩｇＣ；）を血清から、プロティンＡアガロース（Ｓ　ｉ 　ｇｍａ　社、セントルイス、ミズーリー州）を使用したアフィニティクロマト グラフィーにより精製する。溶離されたＩｇＧを一夜水で透析し、貯蔵のため凍 結乾燥した。

幾つかの実験のために、ラモイ、Ｅ、（Ｌａｍｏｙｉ　Ｅ、）およびＡ、ニスノ フ（Ａ、　Ｎ１５ｎｏｆｆ）、　１９８３．１種々のサブクラスのマウスＩｇＧ からのＦ　（ａｂ’　）ｚフラグメントの製造方法（Ｐｒｅｐｅｒａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｆ（ａｂ’）　ｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｆｒｏｏ＋　−ｍｏｕｓｅ　［ ｇＧ　ｏｆ　ｖｅｒｉｏｕｓ　５ｕｂｃｌａｓｓｅｓ）Ｊ　＋　Ｊ　、　Ｉ　ｍ 　ｍ　ｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　５６：２３５−２４３に記述されたように、Ｆ 　（ａｂ’　）、フラグメントを、小胞に向けてＩｇＧから、ペプシンアガロー ス（Ｓｉｇｍａ製）中への通過によって製造した。開裂されたＩｇＧを次にプロ ティンＡ−アガロース中に通過させ、ボイドボリュームを保持した。Ｆ（ａｂ） フラグメントはペプシン−アガロースの代わりに、パパイン−アガロース（Ｓｉ Ｈ＋ａ　ｍり　中に通過させることにより上述と同様に製造できた。

実験的なマウスへの感染。自足（Ｗｈｉｔｅ−ｆｏｏｔｅｄ）マウス（Ｐｅｒｏ ｍｙｓｃｕｓ　Ｉｅｕｃｏｐｕｓ）を実験的にＯＤ　１００ａａ＋が０゜４であ るｄＰＢＳ中のスピロヘータ懸濁液０．１ｍｌの腹腔膜注射によってＢ、プルグ ドルフェリ　に感染させた（シュ’７ン、　Ｔ、　Ｇ、（Ｓｃｈｗａｏ、Ｔ、Ｇ ）、Ｗ、プルグドーフｙ　−（Ｗ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ）およびＣ，Ｆ、ガロ ン（Ｃ−Ｆ、　Ｇａｒ。

ｎ）　１９８８．　ｒ生体外培養の結果としてのライム病スピロヘータ、ボレリ アＢｕｒｇｄａｒｆｅｒｊの感染力の変化およびプラスミドプロフィール（Ｃｈ ａｎｇｅｓ　ｉｎ　１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｏｎ）Ｊ、Ｉｎｆｅｃ ｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５６：１８３１−１８３６およびシュワン、　Ｔ、　Ｇ、 （Ｓｅｈｗａｎ、Ｔ、Ｇ）、Ｗ、　プルグドーフｙ−（Ｗ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｒ）、Ｍ、Ｅ、シュルムフ（Ｍ。

Ｅ、　Ｓｃｈｒｕｍｐｆ）およびＲ，Ｈ，Ｋａｒｓｔｅｎｓ（Ｒ，Ｈ，Ｋａｒｓ ｔｅｎｓ）、　１９８８．　ｒ尿膀胱、実験的に感染させた自足マウス　（Ｐｅ ｒｏｍｙｓｃｕｓ　１ｅｕｃｏｐｕｓ）におけるボレリア　ブルグドルフエリの 一致した源（Ｔｈｅ　ｕｒｉｏａｒｙ　ｂｌａｄｄｅｒ、ａ　ｃｏｎｓｉｓｔｅ ｎｔ　５ｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　ｉｎ 　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｆｌｙ　１ｎｆｅｃｅｄ　ｗｈｉｔｅ−ｆｏｏｔｅｄ 　ｍ１ｃｅ（Ｐｅｒｏｏ＋ｙｓｃｕｓ　１ｅｕｃｏｐｕｓ）Ｊ　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６：８９３−８９５〕。尿、血液、および膀胱、肺臓、 肝臓、人造、心臓および脳のような器官を感染させたならびに感染させてない動 物から集めた。シュワンＴ　、　Ｇ　、（Ｓｃｈｗａｎ、　Ｔ。

Ｇ）、　Ｗ　、　プルグドーフ−ｒ　−（Ｗ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ）およびＣ １Ｆ、ガロン（Ｃ，Ｆ、Ｇａｒｏｎ）　１９８８．　ｒ生体外培養の結果と感染 力の変化およびプラスミドプロフィール（Ｃｈａｎｇｅｓｉｎ　１ｎｆｅｃｔｉ ｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ 　ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｊｒｏｃｈｅｔｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒｇｄｏｒ ｆｅｒｉ、ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ　。

ｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）　Ｊ　、Ｉ　ｎ　ｆ　ｅ　ｃ 　ｔ　、　Ｉ　ｍｍｕ　ｎ　、　５６　：　１８３１−１８３６およびシュワン 、Ｔ、Ｇ。

（Ｓｃｈｗａｎ、　Ｔ、　Ｇ）、　Ｗ　、　プルグドーフｙ　−（Ｗ、８ｕｒｇ ｄｏｒｆｅｒ）。

Ｍ、Ｅ、シュルムフ（Ｍ、　Ｅ−Ｓｃｈｒｕｍｐｆ）およびＲ，Ｈ，Ｋａ　ｒ　 ｓ　ｔ　ｅ　ｎ　ｓ　（Ｒ，Ｈ，Ｋａｒｓｔｅｎｓ）、　１９８８．　ｆ尿膀胱 、実験的に感染させた自足マウス　（Ｐｅｒｏｍｙｓｃｕｓ　１ｅｕｃｏｐｕｓ ）におけるボレリア　Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの一致した源（Ｔｈｅ　ｕｒｉｎ ａｒｙｂｌａｄｄｅｒ、ａ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　５ｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｂｏ ｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｍｙｓｃｕｓ　１ｅｕｃｏｐｕｓ）Ｊ　Ｊ 、　ＣＩ　ｉ　ｎ、　Ｍ　ｉ　ｃ　ｒ　ｏ　ｂ　ｉ　。

１　、　２６　：　８９３−８９５で記載されているように、感染は粉砕された 尿膀胱からのＢ、プルグドルフエリ　を培養してすることにより確認された。

ヒト、イヌおよびダニ材料。ジ−ノウカントリー、ライスコシンから集められた 臨床的ヒトの尿および、Ｉｘｏｄｅｓ　ｄａｍｍｉｎｉダニは親切にもドクター 　ボール　デュレイ（Ｄｒ、Ｐａｕｌ　Ｄｕｒａｙ）により提供された。ヒト尿 試料はまた研究所のボランティアより提供された。ニューヨーク、サウザンブト ンからの急性のヒト血清はドクター、アラン　マクドナルド（Ｄｒ、Ａｌａｎ　 ＭａｃＤｎａｌｄ）から供された。

可能な限り、ヒト検体上の検定は血清学的データおよび／または患者病歴と比較 された。ブリッジ中を一ター、ニュージャージで自然感染したイヌからの尿およ び血液はサラ　スティーヴンス、　Ｄ、　Ｖ、　Ｍ、（Ｓａｒａ　５ｔｅｐｈｅ ｎｓ、　Ｄ、　Ｖ、　Ｍ、　）、モンタナ、ミズーラによって提供された。

イムノプロット分析。尿から抗−ＭＥＰ抗体で沈澱された抗原、ＷＣｌおよび小 胞を可溶化しそしてラエムリの不連続バッファー系を使用して〔ラエムリ、Ｕ、 Ｋ。

（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｏ，に、）１９７０．　Ｔバクテリオファージ　Ｔ４の頭部 の集合中の構造蛋白質の開裂（Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ 　ｐｒｏｔｅｔｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｐｈａｇｅ　Ｔ４）Ｊ　、Ｎ　ａ　ｔ　ｕ 　ｒ　ｅ　（ｔ７ンドン）２２７：６８０−６８５　Ｊ　）およびシュド、Ｒ， Ｃ（Ｊｕｄｄ、Ｒ，Ｃ）　、　１９８２゜ｒＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒ ｈｏｅａｅの４つの菌種から単離された蛋白質ＩＩＩのＩｔｓ　１−ペプチド？ 、ピング（”Ｊ−ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｒｉｎ　 ＩＩＩ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｆｏｕｒ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｎｅ １ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）Ｊ　＋　Ｉ　ｎ　ｆ　ｅ　ｃ　ｔ　 、Ｉ　ｍｍ　ｅ　ｎ、３７　：　６２２−６３１に記載の改良によりドデシル硫 酸ナトリウム−ポリ−アクリルアミドゲル電気泳動にかける。バッタイガ−、Ｒ ，（Ｂａｔｔａｅｉｇｅｒ、Ｒ，）、　Ｗ、Ｊ。

ニューホール（Ｗ、Ｊ、Ｎｅｗｈａｌｌ）　Ｒ，Ｂ、ジョーンズ（Ｒ，Ｂ。

Ｊｏｎｅｓ　）　、　１９８２．　ｒニトロセルロース膜に移された蛋白質の免 疫学的検出における阻止剤としてのトゥイーン２０の使用方法（Ｔｈｅ　ｕｓｅ 　ｏｆ　Ｔｗｅｅｎ　２０　ａｓ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈ ｅ　ｉｍｍｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ 　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｍｅｍｂｒ ａｎｅｓ）Ｊ　、　Ｊ　、　Ｊ　ｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５　：２９ ７−３０７に記載されているように、分けられた蛋白質はニトロセルロース上２ の電気プロットされ、ｄＰＢＳ中の０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ、）　２ ０またはｄＰＢｓ中の５％無脂乾燥乳で阻止され、血清またはＩｇＧを使用して 調べられた。生じた免疫複合体をプロティン　Ａ−セイヨウワサビペルオキシダ ーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ） で標識し、そして色素検定により検出した。

電子顕微鏡。銅グリッドをバーロジオン（Ｐａｒｌｏｄｉｏｎ）でコートし、次 に室温で、抗−小胞１”（ａｂ’）２フラグメント１μｇ／μｍ　ｄＰＢＳの小 滴６μｍ上で１０分分間イノキュベートする。グリッドを１０分間ｄＰＢＳで２ 回洗浄し、次に以下のものとして製造された抗原の小滴６μｍ上で１０分間イン キュベ・−卜する・尿、１：１０に希釈されたものまたは同様にしてｄＰＢＳで 特徴。

付けられたもの：血液、ｄＰＢＳで１：ｌＯに希釈されたちの；ならびにダニま たはガラス組織粉砕機中の同体積のｄＰＢＳで浸軟したマウス器官例えば膀胱、 肺臓、肝臓、腎臓、心臓、および脳。続いて２回、ｄＰＢＳで１０分間洗浄し、 グリッドを抗−ＭＥＰ　ＩｇＧの小滴６μｍ上の移し、室温で２０分間インキュ ベートする。

さらに２回ｄＰＢＳで洗浄終了後、抗原−抗体複合体を２０分間、ロビノソンお よび共同研究者らｃロビンソン。

Ｅ、　Ｎ、　（Ｒｏｂｊｎｓｏｎ、ｆＥ、Ｎ、）　、Ｚ、Ａ、　マツクギ−（Ｚ 、　Ａ、　ＭｃＧｅｅ）　、　Ｊ　、カブラン（Ｊ、Ｋａｐｌａｎ）、　Ｍ　、 　Ｅ　、　ハモンド（Ｍ、Ｆ！、Ｈａｍｍｏｎｄ　）　、Ｊ　、Ｋ、ラルソン（ Ｊ、に、Ｌａｒｓｏｎ）　。

Ｔ、Ｍ、ブキャナン（Ｔ、Ｍ、Ｂｕｃｈａｎａｎ　）　、およびＧ、Ｋ。

スクールニク（Ｇ、に、５ｃｈｏｏ１ｎｉｋ）、１９８４．　ｒ抗体−金　球形 免疫学的プローブとの特定の淋菌巨大分子の超微細構造的局在（Ｕｌｔｒａｓｔ ｒｕｅｔｕｒａｌ　１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｇ。

ｎｏｃｏｅｅａｌ　ｍａＣｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄ ｙ−ｇｏｌｄ　ｓｐｈｅｒｅｉｌｌｌｌｕｎｏｌａｇｉｃａｌ　ｐｒｏｂｅｓ） 　Ｉ　ｎ　ｆ　ｅ　ｃ　ｔ　、　Ｉ　ｍｍ　１１　ｎ、４６　：　３６１−３６ ６　）の方法によって製造されたプロティンへ−金複合体６μｍで標識した。グ リッドを５分間２回おのおのｄＰＢＳで洗浄し、５分間２回おのおの０．２５Ｍ 酢酸アンモニウムで洗浄し、ｐＨ６，５の０．５％モリブデンアンモニウムで逆 に染色した。グリッドは空気で乾燥させ、７５ｋＶにおいてＨＵ−１１Ｅ−１型 透過型電子顕微鏡（日立製作所、東京４日本）で観察した。

結果 膜小胞が生体内でＢ、プルグドルフェリにより開放されるかどうか説明するため に、ポリクローナルなウサギ抗体を小胞および８３ｋＤａ　ＭＥＰに対して増加 させた。

集められた血清からのものを精製後、ウサギからのＩｇＧはイムノプロット分析 によりＷＣおよび小胞との反応性に対するふるい分けを行った（図１）。図１に おいては、電気プロットされた全細胞（ＷＣ）および小胞蛋白質はバッフアロ　 ブラック（ｂｕｆｆａｌｏ　ｂｌａｃｋ　（Ｂ、　Ｂｌａｃｋ）〕によって着色 され、細胞外小胞または８３キロダルトン主細胞外蛋白質（ＭＥＰ）に対して発 生したポリクａ−ナルなウサギＩｇＧで調査されまたは抗−〇ｓｐＡモノクロー ナル抗体、ＴＳ−２で調査される。抗−小胞■ｇＧは幾つかのＷＣおよび０ｓｐ Ａおよび０ｓｐＢを含む小胞蛋白質を認めた。抗−ＭＥＰ　ＩｇＧはＷＣおよび 小胞レーン（ｌａｎｅ）における０ｓｐＡに相当する３１キロダルトン蛋白であ ると認めた。従ってプロットされた蛋白質はバッファロブラックで着色されるか または抗−小胞、ポリクローナル抗−ＭＥＰもしくはモノクローナル抗−０ｓｐ Ａ抗体によって調査された。多数のＷＣおよび小胞蛋白質のは抗小胞ＩｇＧによ って認知された。

ウサギからのポリクローナルＩｇＧは、最初に０ｓｐＡに相当する３１ｋＤａ蛋 白質と電気泳動により反応させた、ＭＥＰによって免疫化された。８３ｋＤａ免 疫原の最小標識のみが発生した。モノクローナル抗体ＴＳ−２（ロツキーマウテ ンラボラトリーズコレクション）との反応ではＷＣおよび小胞中に０ｓｐＡの存 在が確認された。

これらポリクローナル血清が濃縮および特別に完全なＷＣおよび同化された小胞 の検出に使用できるかどうか決定するためにパーロジオンーコートされた電子顕 微鏡グリッドを、抗−小胞１ｇＧから作られたＦ　（ａｂ’　）、フラグメント に吸収する。この【活性化された１グリツドを８．プルグドルフェリの生体外培 養または培地のみでインキュベートする。グリッドに付着している抗原は抗−Ｍ ＥＰＩｇＧおよびプロティンＡ−コロイド性金複合体で検出される（図２）。図 ２ａないし２Ｃはパロジオンーコートされたグリッドが抗−小胞Ｆ（ａｂ’）ｓ フラグメントで活性化され、次に培養された８、２±Ｌエルフエリ細胞（２ａお よび２ｂ）とまたは培養培地（２Ｃ）とインキュベートしたものを示す。グリッ ドは次に抗−ＭＥＰＩｇＧ（２ａおよび２ｃ）でまたは免疫化前の血清（２ｂ） で調査し、プロティンＡ−コロイド性金複合体で標識し、電子顕微鏡により検査 した。金粒子は細胞および小胞表面および細胞を取り囲むの絨毛性の材料に付着 した。金のバックグラウンドレベルのみが培地とインキュベートされたグリッド または免疫化前の血清で調査されたグリッドに見られる。棒線は２００　ｎｍで ある。ＷＣおよび小胞の両方は活性化されたグリッドに付着した。密な標識は細 胞および小胞の表面上に、そしてこれらの表面を取り囲む絨毛性の材料に明らか にあった。抗原の欠いた、または免疫化前の血清でインキュベートした、コント ロールグリッド上の金の疎らな沈積は特性のないバックグラウンドと考えられた 。

Ｂ、プルグドルフェリの抗−ＭＥＰポリクローナルＩｇＧ７菌種を決定するため 、他のボレリア種５１種およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ　ｉｏｔｅｒｒｏｇａｎｓ （表１）を検定した。他のスピロヘータは金のバックグラウンドレベルに止まる のに対して、合衆国およびヨーロッパ由来の単離されたＬ１ルグドルフェリー７ 菌種全ては明確に標識された。

活性化されたグリッドは次に本システムを臨床試料に採用する可能性を評価する ためＢ、プルグドルフエリ抗原の可能な体内供給源とインキュベートした。試験 された試料は浸軟されたＩｘｏｄｅｓ種ダニ、尿標本、血液、またはマウス、イ ヌおよびヒト（図３ａないし図３ｆおよび４ａないし４ｈ）由来の浸軟された組 織を含む。図３ａな一トされたグリッドは抗−小胞Ｆ（ａｂ）’　により活性化 され、尿または血液の試料とインキュベートされ、抗−ＭＥＰ　ＩｇＧで調査さ れそしてプロティンＡ−コロイド性金複合体で標識化された。感染されたマウス 、イヌおよびヒト由来の尿（それぞれ３ａ、３Ｃおよび３ｄ）とならびに感染さ れたマウスからの血液（３ｂ）と培養されたグリッド上で密に標識された絨毛抗 体は凝集する。

標識された膜小胞は時々観察された（３ａ、挿入部分）。明確な標識は感染され てないマウス由来の尿および血液から観察されなかった。棒線は２００　ｎ　ｒ ｎ。

絨毛抗原の捕獲および標識は５個体の実験的に感染させたマウスの尿および血液 中に確認された（３ａおよび３ｂ）。幾つかの部分では標識された小胞に類似し ている膜構造を含んでいた（図３ａ、挿入部分）。類似の絨毛材料は自然に感染 されたイヌ（３Ｃ）および臨床のヒト患者（３ｄ）由来の尿で確認された。標識 された絨毛抗原はｄＰＢＳで２Ｘ１０−”まで希釈したマウスの尿中で検出され た。金により特に標識された、材料の証拠は感染されてないマウスまたはヒト由 来の検体中からは検出されなかった（３ｅおよび３ｆ）。総計３９人分のヒトの 尿検体が試験された。これらは、研究所員から提供された検体２つの陰性の検体 を含み、および患者からの３７の臨床検体からはライム病を持っていると推測で きた。他の３６は絨毛抗体の凝集体を示したが、１つの臨床検体は陰性であった 。

試験された浸軟された組織はダニ、尿膀胱、肺臓、肝臓、心臓、脳、および腎臓 である（それぞれ、図４ａないし４ｇ）。図４ａないし４ｈは、浸軟された［ｘ ｏｄｉｄ種ダニおよびマウス中のＢ、プルグドルフェリ抗原の検出を示している 。電子顕微鏡グリッドは活性化され、浸軟された組織でインキュベートされそし て沈澱化された抗原は抗−ＭＥＰ　ＩｇＧおよびプロティンＡ−コロイド性金複 合体で標識化される。検査が行われた際、絨毛抗原は感染されたＩｘｓｏｄｅｓ 　ｄａｍｍｉｎｉダニと、および感染されたＰｅｒｏｏ＋ｙｃｕｓ　１ｅｕｃｏ ｐｕｓ由来の尿膀胱、創り肝臓、心臓および脳とインキュベートされたグリッド 上で観察される（それぞれ４ａないし４ｆ）、感染されたＰ、　１ｅｕｃｏｐｕ ｓの腎臓は比較的密集して標識を持つが抗原凝集体はこのグリッドでは観察され ない（４ｇ）。抗原のないコントロールグリッド上で金は殆ど見られない。棒線 は２００ｎｍである。

腎臓検体のすべてはしかし絨毛抗原を含む。しかし腎臓細胞はコントロールグリ ッドよりはより密集して標識されたが抗原凝集体は再溶解されなかった。しかし 、完全なスピロヘータが５個体のマウスのうち４つからの膀胱組織でインキュベ ートしたグリッド上で見出された（４ｂ、挿入部分）。スピロヘータはまた感染 後１２日の１個体のマウスの血液および肺臓でも観察された（データ未掲出）。

抗原を欠いているコントロールグリッド上では単に金のバックグラウンドレベル が観察された。

ヒトおよびマウスからの尿中に同様の抗原を検出するために、検体は抗−ＭＥＰ 　ＩｇＧでインキュベートされ、得られた沈澱を再生しそしてイムノプロット分 析（図５）によりＷＣおよび小胞抗原と比較する。図５は感染されたマウスおよ びヒトの尿からの沈澱された匠ルグドルフェリ抗原の免疫プロット分析を示す。

急性のヒト血清により検出された全細胞（ＷＣ）および小胞抗原のバンドのパタ ーンは、抗＝ＭＥＰ　ＩｇＧで沈澱されたヒトおよびマウス尿由来の抗原を含ん だイムノプロットと抗−ＭＥＰ　ＩｇＧによる固体相ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより検出 されたものとを比較する。８３キロダルトンにおける１本のバンドは感染された マウス調整物で検出されるが、少なくとも３４．３１．２２．１４および１１キ ロダルトンにおける５つのバンドはヒト尿沈澱物中で示さる。プロットされたＷ Ｃおよび小胞抗原は急性のヒト血清で調査され、多くのバンドは再溶される。２ つの感染していないヒトからの尿中には抗原は検出されなかった（データは不掲 出）。しかし、感染されたヒトからの尿沈澱物中の抗−ＭＥＰ抗体は少な（とも １１ないし３４ｋＤａの範囲で少な（とも５つのバンド認められ、そしてマウス 尿検体中には８３ｋＤａバンドのものが検出された。これらのバンドは電気泳動 によりすべて、急性のヒト血清により観察されたＷＣおよび小胞抗体に一致反応 物の初期の供給源と同様にボレリア　ブルグドルフェリ菌株５Ｈ−２−８２をＢ ＳＫＩ［培地の低いレベルの通過で保持する。抗体発生に使用するため、細胞外 膜小胞を培地のろ過および分画遠心で取り出した。

ライム抗原の濃縮および検出に使用するため、ポリクロ−カルウサギ血清を膜小 胞および小胞から電気泳動的に精製された８３ｋＤａタンパク質に対して増加さ せる。

免疫化されたウサギは周期的にダルベツコ燐酸−緩衝化生理食塩水（Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏ’ｓ　ｐｈｏｓｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）、ｐＨ７， ２（ｄＰＢＳ）に懸濁した抗原で高められる。

おのおのの免疫原にたいして高められた血清を集め、溜めておく。免疫グロブリ ン　Ｇ（ＩｇＧ）は溜めた血清からプロティンＡ−アガロースを使ったアフイニ テイクロマトグラフィーによって精製される。溶離したＩｇＧはそれぞれ水中で 透析し、貯蔵のために凍結乾燥し、または直接に使用する。

抗−小胞１ｇＧはさらに以下のように製造される：Ｆ　（ａｂ’　）フラグメン トはＩｇＧから小胞に向けて、ペプシン−アガロース中への通過によって製造さ れる。

分解されたＪｇＧを次にプロティン　Ａ−アガロースに通過させモしてボイドボ リュームを保持する。生物的検体との次のインキュベーションに適当な抗小胞Ｆ （ａｂ’）フラグメントは次に固体表面に吸着される。このような表面は、それ に限らないが、パーロジオンコーＦ・化したＩＥＴ−顯ａ鏡グリッド、ニニトロ セルロースフィルター膜、ガラスカバースリップおよび微小滴定ウェルを含む。

これらの段階は試験試料からのボレリア抗原の捕獲および濃縮のための１活性化 された１支持体を提供する。

これらの段階はまた抗−小胞　ＩｇＧから、以下に記述した抗原検出手順を妨げ る、Ｆｃ小片を除去する。

新鮮なまたは冷蔵された血液または尿を１・１０ないしｉ：ｔｏｏにダルベツコ 燐酸−緩衝化生理食塩水（Ｄｕ。

１ｂｅｅｅｏ°ｓ　ｐｈｏｓｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）、ｐ Ｈ７，２（ｄＰＢＳ）で希釈する。組織生検またはダニを検体ダラム当たりｄ　 Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｘ−１０ｍ　Ｉ中で組織粉砕機を使用して浸軟する。試験試料を次 に１（１−３０分間室温でＦ（ａｂ’）−ｆｆｌ−１１，た支持体に接触させて インキュベートする。このインキュベーション中、もし存在するならばボレリア 抗原を試料から除去し活性化した支持体上に残す。その後、支持体を２回ｄ　Ｐ 　Ｂ　Ｓ中で１０分間洗浄する。

試験検体またはコントロール検体を含有する支持体に接触させて置いた抗−８３ ｋＤａ　ＩｇＱを５０μｇ／ｒｎｌ　ｄＰＢＳで再構成しそして室温で１．　Ｏ −３０分間インキュベートする。未結合１ｇＧｅｄＰＢＳで２回１０分間洗浄し て取り除く。支持体」二の抗原−抗体複合体の存在をその結合は特にＩｇＧのＦ ｃ部分に結合するタンパクＡ複合体で検出する。市販されている複合体は以下の ものを含んだ多様な検定システムに適当である・電子紹微鏡用のコロイド状金、 蛍光顕微鍵用のフルオＩノセインイソチオシアネートまたはロダミン、光学顕微 鏡用のラテックスビーズ、および視覚的もしくは光学顕微鏡用に篩分けを伴った 酵素結合免疫吸着検定（Ｅ　Ｔ、　Ｉ　ＳＡ）用のセイヨウカラシヵベルオキシ ダーゼおよびアルカリホスファターゼ。

実施例３ 細胞外膜小胞を精製する方法。

酸に対する銀染色、走査電子顕微鏡補遺３　（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｆｅａｔｕ ｒｅｓ　ｏｆ　Ｂａｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ−−ｔｈｅ　Ｌｙｍ ｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓｐｏｒｉｅｈｅｔｅ　５ｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　 ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｉｅ　ａｃｉｄｓ、ｓｅａｎｎｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ ｙ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　３）、　１０９−１１５に記述されｇで２０℃で２ ０分間、遠心分離することによって培地から除去される。、細胞除去はさらに２ ０．００１７Ｘｇ、１５分間の遠心分離により、および０．２２μｍ７７　、（ ルグーを通ずろ過により確実になる。小胞はこれから２５７．０００Ｘｇで２０ ℃、１時間の遠心分離によるろ過によって取り出される。小胞ベレットをｄＰＢ ｓに再度懸濁し、次にｄＰＢＳ中１０−７０％段階のスクロース！　ラ、ニア１ 　ントＬに置き、２５９，０００ｘｇ、４℃で２時間、遠心分離する。縞状の膜 を次に取り除きｄＰＢＳｌ・１で希釈し、４３５，０００Ｘｇ、４℃で１５分間 遠心分離して集める。

この小胞を１μｇ／ｍ１ｄＰＢｓで懸濁した場合、ウサギにおける免疫原として 使用される。小胞で免疫化されたウサギにより製造された抗体はｒ抗−小胞Ｆ（ ａｂ′）、フラグメント１に使用される。これら小胞はまたｒＭＥＰ１抗原が精 製される供給源として使用もできる。

実施例４ ＭＥＰの精製方法。

精製された細胞外小胞のドデシル硫酸ナトリウム抽出物を、準備したポリアクリ ルアミドゲル１２．５％に乗せ、７．５ワツト、一定出力で、２゜５時間電気泳 動させる。

ゲルを次にコマーシープリリャントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａ ｎｔ　ｂｌｕｅ）　０　、　２５％水溶液で染色し、そしテＭＥＰタンパク質を 同様に電気泳動（ＭＥＰ蛋白質バンドは断然最も大きくそして暗い。）により確 認しおよびゲルから切り取る。切り取ったゲルフラグメントを次に準備したポリ アクリルアミドゲル７．５％上に乗せ、そして上記の方法と同様電気泳動する。

第ニゲル中に含まれたタンパク質はニトロセルロース腰上で電気プロットされ、 バッファロブラック１％水溶液で染色される。ＭＥＰを含存するおのおの膜の部 分を励起しそしてタンパク質を溶離するため１０％ＳＤＳ　２００μｍの２回交 換中で煮沸する。蛋白質を次にアセトンで沈澱させ、１゜Ｏ，０００Ｘｇおよび ４℃で３０分間の遠心分離によって取り出される。

上記に示したすべての公表は文献によってここに取り込まれる。

このように記載された発明は、同様のものは幾つかの方法で変化してよいのは明 らかであろう。この様な多様性は本発明の意図および見地から出発としては見な されず、そしてすべてのこのような当業者にとって明らかであろうものとしての 改良は上述の請求の範囲に含むことを意図するものである。

図１ 図２Ａ ４”　Ｃ １・ しぐ　４Ａ じζ　４Ｂ 図４０ 図４０ Ｂζ４Ｈ 図５ イムノアロット ヒト血５１！　抗−ＭＥＰ ヒト、永　マフズ、尿 図６ 活性化表面 図６Ａ 免疫複合体 要約書 本発明は、生体内において輸出され（または放出され）、およびその検出がライ ム病（Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）を診断する方法である、ボレリア　ブルグド ルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）に関する新規な抗原に 関する。抗原は細胞外膜小胞および主に細胞外蛋白質を含んでいる他の生体生成 物である。本発明は、更に抗原と反応する、モノクローナルおよび／またはポリ クローナルな、標識されたおよび／または標識されてない、抗体に注目し、慣用 の免疫検定方法において、抗体を使用した宿主から得られた生物学的試料中の抗 原の検出によるライム病を診断する方法に注目するものである。本発明はさらに 抗体および補助試薬からなるライム病の診断ためのキットに関する。本発明で使 用する抗体の有利な点はこれらが地理的に多種のボレリア　ブルグドルフェリ種 からの抗原と反応するが、ボレリア　スピロヘータ関するものからの抗原とは反 応しないことである。

手続補正書 平成４年８月２７日 ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０１３６１ 、発明の名称 抗体 ＆補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　アメリカ合衆国 ４６代理人 住所　東京都千代田区神田駿河台１の６お茶の水スクエアＢ館 氏名　（６８６１）萼　経夫（ほか１名）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （別　紙） 請求の範囲 ｒｌ、試料中のボレリア　ブルグドルフェリ、又はボレリア　ブルグドルフェリ 抗原の検出方法であって、 Ａ）ｉ）液体又は組織試料、 五）ボレリア　プルグドルフェリから得られた細胞外の膜小胞に対して生じたポ リクローン性抗体又は該ポリクローン性抗体の抗原結合性フラグメント、及び 血）分子量約８３ｋＤａを有するボレリアブルグドルフェリの主要な細胞外の蛋 白質ゲルバンドに対して生じた抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメント：を供 給し二Ｂ）工程Ａ　（五）及びＡ、（ｍ）の前記抗体と前記試料中に存在し得る ボレリア　ブルグドルフェリに関連する何れかの抗原との閏で三元免疫複合体が 生成するであろう条件下で、前記試料を工程Ａ、（ｉｉ）の前記ポリクローン性 抗体及び工程Ａ　（ｉｉｉ）の前記抗体と接触させ；次いでＣ）ボレリア　プル グドルフェリ、又はボＩノリア　ブルグドルフェリ抗原を検出するための手段と して前記三元免疫複合体の存在を検出する、ことからなる方法。

２、ボレリア　ブルグドルフェリ抗原を検出するための請求項１記載の方法。

３、前記試料が哺乳−又はダニから採取された液体又は組織試料である請求項１ 記載の方法。

４、ボレリア　ブルグドルフェリ抗原の検出がライム病の指標である、哺乳類の ライム病を診断する際に使用するための請求項１記載の方法。

５、工程Ａ（ｉｉ、）の前記ポリクローン性抗体又は抗体フラグメントが固体基 材に結合されている請求項４記載の方法。

６、工程Ａ（ＩｉｌＬ）の前記抗体又は抗体フラグメントが検出可能な標識を用 いて標識化されている請求項５記載の方法。

７、前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属か らなる群から選択される請求項６記載の方法。

８、工程Ａ　（ｆｆｉ）の前記抗体が検出可能な標識を用いて標識化されておら ず、且つ工程Ｃが、前記三元免疫複合体を工程Ａ　（ｆｆｉ）の前記抗体に特異 的に結合する特異結合性蛋白質と接触させ、前記特異結合性蛋白質は検出可能な 標識を用いて標識化されていることからなる請求項５記載の方法。

９、前記特異結合性蛋白質が抗体又は蛋白質Ａである請求項８記載の方法。

１０、前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項９記載の方法。

１１、前記特異結合性蛋白質が蛋白質Ａであり、且つ工程Ａ　（ｉｉ）の前記ポ リクローン性抗体又は抗体フラグメントがＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントであ る請求項１０記載の方法。

１２、Ａ）分子量約８３ｋＤａを有するボレリア　ブルグドルフエリの主要な細 胞外の蛋白質ゲルバンドに対して生じた抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメン ト、及び Ｂ）ボレリア　ブルグドルフェリから得られた細胞外の膜小胞に対して生じたポ リクローン性抗体又は該ポリクローン性抗体の抗原結合性フラグメント、からな る診断キット。

１３、要素Ｂ）の前記抗体が固体基材に結合されている請求項１２記載のキット 。

１４、要素人）の前記抗体が検出可能な標識を用いて標識化されている請求項１ ３記載のキット。

１５、前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項１４記載のキット。

１６、要素Ａ）の前記抗体に特異的に結合する特異結合性蛋白質を更に含み、前 記特異結合性蛋白質は検出可能な標識を用いて標識化されている請求項１２記載 のキット。

１７、前記特異結合性蛋白質が抗体又は蛋白質Ａである請求項１６記載のキット 。

１８、前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項１７記載のキット。

１９０分子量８３キロダルトン（ｋＤａ）を有するボレリア　ブルグドルフェリ の精製された主要な細胞外の蛋白質ゲルバンドに対して生じる単離された抗体又 は該抗体の抗原結合性フラグメント。

２０、前記抗体がポリクローン性である、請求項１９記載の精製された抗体又は 抗原結合性フラグメント。

２１、抗体がポリクローン性である、ボレリアプルグドルフェリから得られる精 製された細胞外の膜小胞に対して生じた単離抗体又は該抗体の抗原結合性フラグ メント。

２２、哺乳類におけるライム病の診断方法であって、 ｉ）前記哺乳類から液体又は組織試料を得、五）抗体と前記試料中に存在するで あろうボレリア　ブルグドルフェリに関連する何れかの抗原との間で免疫複合体 が生成するであろう条件下で、前記試料を請求項１９の抗体又は抗体フラグメン トと接触させ、次いで 伍）前記哺乳類のライム病を診断するための手段として前記免疫複合体の存在を 検出する、ことからなる方法。

２３、前記抗体が検出可能な標識を用いて標ざ化されている請求項２２記載の方 法。

２４、前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項２３記載の方法。」国際調査報告 １Ｍｌ＋＋ｊＩｎａｍｌ□６．１１１１１．。＋Ｎ＋　ＰＣ’−、ＪＳ９１１０ １３６１ＰＣＴ１１１Ｓ９１１０１３６１ ”′−−＝　Ｐ口■（呪Ｑ１１０１３６１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分子量８３キロダルトン（ｋＤａ）を有するボレリア　ブルグドルフェリ（ Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｌｉ）から得られる精製された主要な細 胞外の蛋白質。 ２．ボレリアブルグドルフェリから得られる精製された細胞外の膜小胞。 ３．請求項１の蛋白質に対して生じた抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメント 。 ４．前記抗体がポリクローン性である請求項３記載の抗体又は抗体フラグメント 。 ５．前記抗体がモノクローン性である請求項３記載の抗体又は抗体フラグメント 。 ６．前記抗体が検出可能な標識を用いて標識化されている請求項３記載の抗体又 は抗体フラグメント。 ７．前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属か らなる群から選択される請求項６記載の抗体又は抗体フラグメント。 ８．請求項２の小胞に対して生じた抗体であってポリクローン性の抗体又は該抗 体の抗原結合性フラグメント。 ９．哺乳類におけるライム（Ｌｙｍｅ）病の診断方法であって、 ｉ）前記哺乳類から液体又は組織試料を得、ｉｉ）抗体と前記試料中に存在する であろうボレリア　ブルグドルフェリに関連する何れかの抗原との間で免疫複合 体が生成するであろう条件下で、前記試料を請求項３の抗体又は抗体フラグメン トと接触させ、次いでｉｉｉ）前記免疫複合体の存在を検出する、ことからなる 方法。 １０．前記抗体が検出可能な標識を用いて標識化されている請求項９記載の方法 。 １１．前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項１０記載の方法。 １２．哺乳類におけるライム病の診断方法であって、Ａ）ｉ）前記哺乳類からの 液体又は組織試料、ｉｉ）ボレリア　ブルグドルフェリから得られた細胞外の膜 小胞に対して生じたポリクローン性抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメント、 及びｉｉｉ）分子量約８３ｋＤａを有するボレリア　ブルグドルフェリから得ら れた主要な細胞外の蛋白質に対して生じた抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメ ント；を供給し； Ｂ）工程Ａ（ｉｉ）及びＡ（ｉｉｉ）の前記抗体と前記試料中に存在し得るボレ リア　ブルグドルフェリに関連する何れかの抗原との間で三元免疫複合体が生成 するであろう条件下で、前記試料を、何れかの順序又は同時に、工程Ａ（ｉｉ） の前記ポリクローン性抗体又は工程Ａ（ｉｉｉ）の前記抗体と接触させ；次いで Ｃ）前記三元免疫複合体の存在を検出する、ことからなる方法。 １３．工程Ａ（ｉｉ）の前記ポリクローン性抗体又は抗体フラグメントが固体基 材に結合されている請求項１２記載の方法。 １４．工程Ａ（ｉｉｉ）の前記抗体又は抗体フラグメントが検出可能な標識を用 いて標識化されている請求項１３記載の方法。 １５．前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項１４記載の方法。 １６．工程Ａ（ｉｉｉ）の前記抗体が検出可能な標識を用いて標識化されておら ず、且つ工程Ｃが、前記三元免疫複合体を工程Ａ（ｉｉｉ）の前記抗体に特異的 に結合する特異結合性蛋白質と接触させ、前記特異結合性蛋白質は検出可能な標 識を用いて標識化されていることからなる請求項１３記載の方法。 １７．前記特異結合性蛋白質が抗体又は蛋白質Ａである請求項１６記載の方法。 １８．前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項１７記載の方法。 １９．前記特異結合性蛋白質が蛋白質Ａであり、且つ工程Ａ（ｉｉ）の前記ポリ クローン性抗体又は抗体フラグメントがＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントである 請求項１８記載の方法。 ２０．Ａ）分子量約８３ｋＤａを有するボレリア　ブルグドルフェリから得られ た主要な細胞外の蛋白質に対して生じた抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメン ト、及び Ｂ）ボレリア　ブルグドルフェリから得られた細胞外の膜小胞に対して生じたポ リクローン性抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメント、からなる診断キット。 ２１．要素Ｂ）の前記抗体が固体基材に結合されている請求項２０記載のキット 。 ２２．要素Ａ）の前記抗体が検出可能な標識を用いて標識化されている請求項２ １記載のキット。 ２８．前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項２２記載のキット。 ２４．要素Ａ）の前記抗体に特異的に結合する特異結合性蛋白質を更に含み、前 記特異結合性蛋白質は検出可能な標識を用いて標識化されている請求項２２記載 のキット。 ２５．前記特異結合性蛋白質が抗体又は蛋白質Ａである請求項２４記載のキット 。 ２６．前記検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、蛍光体及びコロイド状金属 からなる群から選択される請求項２５記載のキット。 ２７．試料中のボレリア　ブルグドルフェリの検出方法であって、 Ａ）ｉ）液体又は組織試料、 ｉｉ）ボレリア　ブルグドルフェリから得られた細胞外の膜小胞に対して生じた ポリクローン性抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメント、及びｉｉｉ）分子量 約８３ｋＤａを存するボレリア　ブルグドルフェリから得られた主要な細胞外の 蛋白質に対して生じた抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメント；を供給し： Ｂ）工程Ａ（ｉｉ）及びＡ（ｉｉｉ）の前記抗体と前記試料中に存在し得るボレ リア　ブルグドルフェリに関連する何れかの抗原との間で三元免疫複合体が生成 するであろう条件下で、前記試料を、何れかの順序又は同時に、工程Ａ（ｉｉ） の前記ポリクローン性抗体及び工程Ａ（ｉｉｉ）の前記抗体と接触させ；次いで Ｃ）前記三元免疫複合体の存在を検出する、ことからなる方法。 ２８．前記試料が哺乳類又はダニから採取された液体又は組織試料である請求項 ２７記載の方法。