KR101430283B1 - 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체, 및 이를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장내 공생 세균(gut microbiota or gut flora)에서 유래한 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 질병 동물 모델에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 약물을 효율적으로 탐색하는 방법 및 장내 공생 세균에 의한 감염 또는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 백신에 관한 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 응용하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병의 원인인자를 진단하는 기술 개발 등이 가능하다.

Description

장내 공생 세균유래 세포밖 소포체, 및 이를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법 {Extracellular vesicles derived from gut microbiota, and disease models, vaccines, drug screening methods, and diagnostic methods using the same}

본 발명은 장내 공생 세균(gut microbiota or gut flora)에서 유래한 세포밖 소포체를 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 질병 동물 모델, 장내 공생 세균유래 소포체에 의한 질병에 대한 예방 및/또는 치료백신 등에 관한 것이다.

장내 공생 세균은 사람을 포함한 동물의 소화관(digestive tract)에 서식하고 있는 미생물로 이루어져 있고, 약 100조 개의 장내 공생 세균이 사람의 소화관에 서식하고 있는데, 이 숫자는 사람 세포의 약 10배에 해당한다.

1960년대에 전자현미경을 통해 그람 음성 세균이 세포밖 소포체[extracellular vesicles (EV), 또는 outer membrane vesicles (OMV)]를 분비한다는 사실이 밝혀졌다. 세포밖 소포체는 구형이고 인지질 이중층으로 되어있으며 그 크기가 20-200nm이다. 그람 음성 세균유래 세포밖 소포체는 LPS 뿐만 아니라 여러 가지 외막 단백질(outer membrane protein)을 가지고 있다(E. Y. Lee et al., Proteomics in gram-negative bacterial outer membrane vesicles. Mass. Spectrom. Rev. 2008;27(6):535-555). 중증 패혈증으로 사망한 환자의 혈액에서 수막염구균유래 소포체가 존재한다는 보고가 있었고 (E. Namork and P. Brandtzaeg, Fatal meningococcal septicaemia with "blebbing" meningococcus. Lancet. 2002;360(9347):1741), 수막염구균유래 세포밖 소포체가 체외에서 염증성 매개체를 분비한다는 보고 (M. R. Mirlashari et al., Outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis: effects on cytokine production in human whole blood. Cytokine. 2001;13(2):91-97; A. Bjerre et al., Complement activation induced by purified Neisseria meningitidis lipopolysaccharide (LPS), outer membrane vesicles, whole bacteria, and an LPS-free mutant. J. Infect. Dis. 2002;185(2):220-228)가 있었지만, 장내 공생 세균에서 유래하는 세포밖 소포체가 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 대장암 등의 점막의 염증을 특징으로 하는 국소질환 또는 패혈증, 동맥경화증, 당뇨병 등의 전신 염증질환을 일으킨다는 연구 결과는 전무하다.

최근 노인인구와 면역억제제, 항암제 등의 사용의 증가 등으로 인해 세균감염에 대한 방어가 약화되면서 패혈증의 유병률이 전세계적으로 증가하고 있다. 패혈증은 세균, 곰팡이 등의 국소 감염에 따른 합병증으로 전신전인 염증반응이 유도되는 질환이다 (M. M. Levi et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit. Care. Med. 2003;31(4):1250-1256). 감염 시 국소적으로 병원균에서 분비되는 물질이 혈관으로 유입되거나, 또는 혈관으로 유입된 병원균에서 분비되는 물질이 혈관 내 염증세포를 활성화시켜 전신성 염증반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome)이 발생하고, 동시에 혈관내피세포를 활성화시켜 범발성혈관내혈액응고 (disseminated intravascular coagulation), 혈전(thrombosis) 등이 발생하고, 병원균유래 물질이 폐 등과 같은 중요 장기에 분포하여 염증과 이에 따른 조직손상을 일으켜서, 발병자의 30% 이상이 사망에 이르게 된다 (E. Lolis and R. Bucala, Therapeutic approaches to innate immunity: severe sepsis and septic shock. Nat. Rev. Drug. Discov. 2003;2(8):635-645).

전신성염증반응증후군이 병원균에 의해 발생한 경우로 패혈증을 정의하지만, 반 이상의 패혈증 환자에서 혈액 내 병원균을 검출할 수 없다 (R. S. Munford, Severe sepsis and septic shock: the role of gram-negative bacteremia. Annu. Rev. Pathol. 2006;1:467-496). 이는 패혈증을 일으키는데 세균이 직접 혈액 내로 유입되는 것이 필수사항이 아님을 의미하며, 세균 등에서 유래하는 물질이 혈액 내로 유입되어 패혈증이 발생할 수 있다. 예를 들어, 그람 음성 세균으로부터 유래한 내독소 (endodotoxin)인 리포폴리싸카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)가 혈액 내로 유입되어 패혈증이 발생하고, 이를 기반으로 하여 패혈증 치료제를 개발하고자 하는 연구가 널리 시행되었다 (S. M. Opal, The host response to endotoxin, antilipopolysaccharide strategies, and the management of severe sepsis. Int. J. Med. Microbiol. 2007;297(5):365-377). 하지만, LPS를 표적으로 하는 치료제 개발은 아직까지 성공한 경우가 없다 (J. Hellman, Bacterial peptidoglycan-associated lipoprotein is released into the bloodstream in gram-negative sepsis and causes inflammation and death in mice. J. Biol. Chem. 2002;19;277(16):14274-14280).

인체에 발생하는 질병의 진단, 예방, 및 치료기술을 개발하기 위해서는 인체 질병을 모사하는 적절한 동물 모델을 구축하는 것이 중요하다. 패혈증 동물 모델을 만들기 위해서 현재까지 아래의 세가지 방법이 사용되었다 (J. A. Buras et al., Animal models of sepsis: setting the stage. Nat. Rev. Drug. Discov. 2005;4(10):854-865). 첫째, LPS를 실험 동물의 복강 내로 주사하여 패혈증 모델을 만들 수 있다. 둘째, 세균을 복강 내로 주사하여 패혈증 모델을 만들 수 있다. 셋째, 맹장을 결찰한 후 천자 (cecal ligation and puncture, CLP)하여 패혈증 모델을 만들 수 있다. 그러나, 이러한 패혈증 동물 모델은 재현성, 실험자간의 오차, 또는 사람에게 일어나는 패혈증의 표현형을 제대로 나타내지 못하는 단점이 있다. 따라서, 패혈증에 대한 진단, 예방, 및 치료기술을 개발하기 위해선 실험자간의 오차가 적고, 재현성이 높으며, 사람에서 발생하는 패혈증의 표현형을 제대로 반영하는 동물 모델 개발이 필요하다.

염증성 매개체 (특히, IL-6)가 혈액내에 증가되는 것은 패혈증의 전형적인 지표이다. 세균에 의해 분비되는 염증성 매개체를 측정하여 세균성 감염에 대한 치료 후보 물질의 효과를 평가한 예가 알려져 있다 (국제특허공개 WO2009/030093 Functions and uses of human protein phosphatase 1 inhibitor-2). 그러나 체외에서 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 세포에 투여하여 염증성 매개체 분비를 조절하는 후보 약물 탐색 방법, 및 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 패혈증 동물 모델에서 후보 약물을 체내에 투여하여 염증성 매개체 분비를 조절하는 후보 약물 탐색 방법은 알려지지 않았다.

수십년 전부터 세균에서 분비되는 외독소(exotoxin) 단백질을 응용한 백신이 개발되어 사용되고 있다. 그람 양성 세균에 대한 백신은 세포벽 성분 (capsular polysaccharide)에 대한 백신이 개발되었으나, T 세포에 무관하게 항체가 형성된다는 단점이 있었다. 또한, 이를 개선하기 위하여 세포벽 성분에 단백질을 접합(conjugation)한 형태의 백신이 개발되었으나, 이러한 형태의 백신 또한 특정 세균의 아형에만 특이적으로 작용하는 한계가 있었다. 그람 음성 세균에 대한 백신은 현재까지 임상에서 사용한 사례가 없고, 최근 그람 음성 세균인 수막염구균에 대한 백신으로써 세균에 세제 (detergent)를 처리해 얻은 인공 소포체를 통해 백신을 개발한 사례가 있다 (M. P. Girard et al., A review of vaccine research and development: meningococcal disease. Vaccine. 2006;24(22):4692-4700). 미국특허 US7384645 "Outer membrane vesicles from Gram negative bacteria and use as a vaccine"은 수막염구균에서 소포체를 추출하여 백신으로 사용하는 것을 특징으로 하고 있다. 미국 공개특허 US 2007/0166333 "Method of antigen incorporation into neisseria bacterial outer membrane vesicles and resulting vaccine formulations"은 수막염구균 소포체에 단백질 항원을 삽입하는 방법에 관한 것으로서, 상기의 방법에 의해 소포체의 면역 자극 특성을 유지하고 면역반응의 향상을 가져옴으로써 수막염구균 감염에 대한 예방과 치료를 위한 백신으로 적용될 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 수막염구균 백신의 제조와 사용에 관해, 백신의 생산에 적합한 수막염구균 균주를 만드는 과정에 관한 특허도 출원되었다 (국제특허공개 WO 2007/144316 및 WO 2004/014417). 또한 살모넬라균유래 소포체가 숙주의 선천면역 및 후천면역 반응을 향상시켜 백신으로서의 효능을 검증한 연구가 있다 (R. C. Alaniz et al., Membrane vesicles are immunogenic facsimiles of Salmonella typhimurium that potently activate dendritic cells, prime B and T cell responses, and stimulate protective immunity in vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692-701). 그러나 아직까지 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병 및 장내 공생 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 백신은 보고되지 않았다.

본 발명은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 질병 동물 모델을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 약물을 효율적으로 탐색하는 방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 백신을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 장내 공생 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 백신을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 백신을 이용하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질환 및/또는 장내 공생 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질환의 원인인자를 진단하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 공생 세균은 장내에 공생하는 그람 음성 세균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 장내 공생 그람 음성 세균은 대장균 (Escherichia coli), 클렙시엘라균 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스속 (Pseudomonas) 세균, 박테로이데스속 (Bacteroides) 세균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 장내 공생 세균 배양액에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 자연적으로 분비되는 것 및 인공적으로 분비되는 것을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 포유동물의 대변, 장내, 위액, 소장액, 또는 구강액 등에서 분리한 것일 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 제조된 질병 모델을 제공한다.

상기 본 발명의 장내 공생 세균 및 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 마우스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 투여는 복강 투여, 정맥 투여, 구강 투여, 항문 투여, 비강 투여, 기도 투여 등을 포함한다.

상기 본 발명의 질병은 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 및 뇌질환 등을 포함한다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 구강염, 구강암, 식도염, 식도암, 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 과민성장증후군, 대장암, 담도염, 담낭염, 췌장염, 담도암, 및 췌장암 등을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 질병 예방 또는 치료에 대한 후보 약물의 탐색 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 장내 공생 세균, 세포밖 소포체, 및 질병은 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 세포에 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포는 염증세포, 상피세포, 혈관내피세포, 줄기세포 등을 포함한다. 또한 상기 염증세포는 단핵구, 호중구, 호산구, 호염구, 단핵구가 조직에서 분화된 세포 등을 포함하며, 상기 줄기세포는 골수조직 또는 지방조직에서 유래한 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후, 염증 관련 매개체의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 염증 관련 매개체는 인터루킨(Interleukin, IL)-6 를 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후, 염증 관련 신호전달과정을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 포함하는 백신을 제공한다. 상기 본 발명의 장내 공생 세균, 세포밖 소포체, 질병 등은 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것, 세균에 화합물을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있으며, 상기 변형은 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용하거나 면역보강제를 병용투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면은, 장내 공생 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 포함하는 백신을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 공생 세균에 의한 감염은 복막염, 패혈증, 폐렴, 요로감염, 골관절 및 중추신경계 감염 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 장내 공생 세균은 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것, 세균에 화합물을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있으며, 상기 변형은 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용하거나 면역보강제를 병용투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 치사량 미만으로 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 장내 공생 세균 및 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생 또는 악화되는 질병을 포함한다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 구강염, 구강암, 식도염, 식도암, 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 과민성장증후군, 대장암, 담도염, 담낭염, 췌장염, 담도암, 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 복막염, 패혈증, 폐렴, 요로감염, 골관절 및 중추신경계 감염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 투여는 피하주사, 정맥주사, 비강투여, 설하투여, 기도흡입, 경구복용, 항문투여, 피부투여, 점막투여 등을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것, 세균에 화합물을 처리하는 것, 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 투여는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하거나 면역보강제를 병용투여할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 탐색 방법에 의하여 선별된 물질을 포함하는, 질병 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 물질은 키나제억제제 (kinase inhibitor) 일 수 있다. 상기 카나제억제제는 Damnacanthal (3-hydroxy-1-methoxy-9,10-dioxoanthracene-2-carbaldehyde), H-7 (5-(2-methylpiperazin-1-yl)sulfonylisoquinoline dihydrochloride), LY294002 (2-morpholin-4-yl-8-phenylchromen-4-one), GF109203X (3-[1-[3-(dimethylamino)propyl]indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)pyrrole-2, 5-dione), ML-7 (1-(5-iodonaphthalen-1-yl)sulfonyl-1,4-diazepane hydrochloride), ML-9 (1-(5-chloronaphthalen-1-yl)sulfonyl-1,4-diazepane hydrochloride), ZM449829 (1-(2-Naphthalenyl)-2-propen-1-one), DRB ((2S,3S,4R,5R)-2-(5,6-dichlorobenzimidazol-1-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol), Indirubin-3’-monoxime (3-[3-(hydroxyamino)-1H-indol-2-yl]indol-2-one), Kenpaullone (9-bromo-7,12-dihydro-5H-indolo[3,2-d][1]benzazepin-6-one), BML-259 (N-(5-Isopropylthiazol-2-yl)phenylacetamide), 및 Apigenin (5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one) 등을 포함한다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 물질은 포스파타제억제제 (phosphatase inhibitor)일 수 있다. 상기 포스파타제억제제는 PD-144795 (5-methoxy-3-(1-methylethoxy)benzo(b)thiophene-2-carboxamide-1-oxide)를 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 물질은 프로드러그 (prodrug)일 수 있다. 상기 프로드러그는 Amitriptyline, Cyclobenzaprine, Desipramine, Doxepin, Fluphenazine dichloride, Haloperidol, Imipramine, Maprotiline, Orphenadrine, Terfenadine, Tolfenamic acid, Trazodone HCl, Trichlormethiazide, Verapamil 등을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생 또는 악화되는 질병을 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 구강염, 구강암, 식도염, 식도암, 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 과민성장증후군, 대장암, 담도염, 담낭염, 췌장염, 담도암, 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 응용하여 질병의 원인인자를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 장내 공생 세균은 전술한 바와 같다.

상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 구강염, 구강암, 식도염, 식도암, 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 과민성장증후군, 대장암, 담도염, 담낭염, 췌장염, 담도암, 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 응용은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 포함된 유전물질의 염기서열을 분석하는 것일 수 있으며, 상기 유전물질은 16S rRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 응용은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 포함된 단백질을 측정하거나 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 대한 면역반응을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역반응 측정은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 대한 항체를 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 진단은 혈액, 대변, 소변, 뇌척수액, 관절액, 흉수, 또는 복수 등에서 유래한 시료을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 장내에 공생하는 대장균에서 유래한 세포밖 소포체가 점막에 염증을 특징으로 하는 국소질환뿐만 아니라 혈액에 흡수되어 전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증과 같은 전신질환을 유발한다는 발견을 통해 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 질병모델, 질병을 예방 혹은 치료하는 후보 약물 탐색 기술, 및 세포밖 소포체를 응용한 질병 예방 혹은 치료용 백신기술 등을 제공한다.

본 발명에서 장내 공생 세균에서 유래하는 세포밖 소포체를 분리하여 이를 세포에 투여하였을 때 염증성 매개체가 분비되고, 국소적으로 투여하였을 때 점막에 염증이 발생하고, 복강으로 투여하였을 때 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되어 전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증과 함께 혈액응고, 폐기종, 고혈압, 골다공증 등의 질병이 발생한다는 사실을 이용하여 질병 동물 모델 및 후보 약물을 효율적으로 선별하는 탐색 방법을 제공할 수 있다. 또한, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 탐색 방법으로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질환을 예방 혹은 치료할 수 있는 약물을 효율적으로 발굴할 수 있다. 또한, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체 자체 혹은 이를 변형하여 투여하여 면역반응을 조절함으로써 장내 공생 세균에 의한 감염 혹은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방 혹은 치료하는 백신 개발에 응용 가능하다. 또한, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 응용하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병의 원인인자를 진단하는 기술 개발이 가능하다.

도 1은 마우스 대변 유래 세포밖 소포체의 단백질 질량 분석을 통해 체내 공생 세균을 동정한 결과이다.
도 2는 정상 마우스의 소장액에서 추출한 세포밖 소포체의 투과전자현미경 사진이다.
도 3은 정상 마우스의 소장에서 추출한 세포밖 소포체(siEV)를 RAW 264.7 대식세포주에 농도 의존적으로 6시간 동안 처리한 뒤 세포배양액에서 염증성 매개체 IL-6의 발현을 ELISA 방법으로 정량한 것이다.
도 4는 DSS에 의해 유도된 염증성장염 마우스의 소장에서 추출한 세포밖 소포체(DSS_siEV)를 RAW 264.7 대식세포주에 농도 의존적으로 6시간 동안 처리한 뒤 세포배양액에서 염증성 매개체 IL-6의 발현을 ELISA 방법로 정량한 것이다.
도 5는 정상 마우스와 DSS에 의해 유도된 염증성장염 마우스의 소장에서 추출한 세포밖 소포체(각각 siEV, DSS_siEV)를 RAW 264.7 대식세포주에 처리할 때 LPS의 길항체인 polymyxin B(PMB)를 세포밖 소포체에 6시간 동안 처리한 후, 세포배양액에서 염증성 매개체 IL-6의 발현을 ELISA 방법으로 정량한 것이다.
도 6은 추출한 마우스 장내 대장균의 16s rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 각각 추출한 마우스 장내 대장균을 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)과 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 관찰한 이미지이다.
도 9는 장내 대장균에서 유래하는 세포밖 소포체의 모양과 크기를 투과전자현미경으로 분석한 이미지이다.
도 10은 장내 대장균유래 세포밖 소포체의 투과전자현미경 사진 10장을 토대로 세포밖 소포체의 크기 별 분포를 나타낸 것이다.
도 11 및 도 12는 장내 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)와 장내 대장균으로부터 추출한 LPS를 다양한 농도로 처리하여 RAW 264.7 대식세포에 배양하고 사이토카인(TNF-a IL-6)의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.
도 13 및 도 14는 장내 대장균 유래 세포밖 소포체(EC_EV)를 마우스 비강에 각각 1, 10, 100 ng을 투여하여 기관지폐포세척액내 염증세포 세포수(BAL cells)와 IL-6의 양을 측정한 결과이다.
도 15는 C57BL/6 (male, 6주) 마우스에 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 15, 25, 50μg을 각각 한 번 복강 주사한 후 12시간 마다 마우스의 생존률을 표시한 것이다.
도 16은 대장균 유래 세포밖 소포체 5μg을 12시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 채취한 마우스의 혈액의 혈청에서 염증성 매개체인 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-12, IFN-γ, IL-10, IL-17, VEGF의 농도를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.
도 17은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 24시간마다 호흡수를 측정한 결과이다.
도 18은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 8시간마다 3일 동안 체온을 측정한 결과이다.
도 19는 대장균유래 세포밖 소포체 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24시간 후에 백혈구 수를 분석한 결과이다.
도 20은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 12시간 후에 백혈구의 총 수와 종류마다의 수를 분석한 결과이다.
도 21은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 24시간마다 혈압을 측정한 결과이다.
도 22는 대장균유래 세포밖 소포체 5μg을 12시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 D-dimer의 양을 측정한 결과이다.
도 23은 대장균유래 세포밖 소포체 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24시간 후에 혈소판 수를 측정한 결과이다.
도 24는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 각각 0.1, 1, 5, 10, 20 ng/ml를 혈관 내피세포에 처리하여 ICAM-1 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 25는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 1 ng/ml를 혈관 내피세포에 처리하여 혈액 응고인자인 tissue factor의 분비를 측정한 결과이다.
도 26은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 10 μg을 시아닌-7 (cyanin-7, cy7)으로 염색한 후, 마우스의 복강에 주사하고 6시간 후, 코닥 이미지 스테이션 (Kodak image station)으로 얻은 마우스 몸 전체의 형광 사진이다.
도 27은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 각각 10, 20μg을 DiO로 염색한 후, 마우스의 복강에 주사하고 6시간 후에 추출한 혈액과 폐로부터 RBC (red blood cell) lysis buffer를 이용하여 적혈구를 제거한 후, 유세포분리기 (FACS)를 통해 세포밖 소포체를 포함한 혈액세포과 폐 조직세포의 비율을 분석한 결과이다.
도 28은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24시간 후에 혈액이 혈관에서 폐 조직으로의 투과력 (wet-to-dry ratio) 정도를 나타낸 것이다.
도 29는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24시간 후에 기관지폐포세척액에서 염증 세포의 수를 나타낸 그림이다.
도 30은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 폐를 적출하여 4% 포름알데히드 (formaldehyde)에 넣어 고정 (fixing)시킨 후, 절편을 만들어 헤마토실린-이오신　(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 31은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 각각 0.1, 1μg을 1주일에 2번 18주 동안 주사 후 혈압을 측정한 그래프이다.
도 32는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 1μg을 1 주일에 2번 18주 동안 주사 후 엑스레이 기술을 통해 관찰한 장골의 이미지이다.
도 33은 정상 마우스 (C57BL/6, male 6주)와 IL-6 결핍 마우스 (C57BL/6, male, 6주)에 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 25μg을 복강 주사하고 12시간마다 마우스의 생존률을 나타낸 것이다.
도 34는 정상 마우스 (C57BL/6, male 6주)와 IL-6 결핍 마우스 (C57BL/6, male, 6주)에 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 12 시간씩 3번 주사 후 6, 12, 24시간 후에 폐를 4% 포름알데히드 (formaldehyde)에 넣어 고정 (fixing)시킨 후, 절편을 만들어 헤마토실린-이오신　(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 35는 장내 공생 세균 유래 세포밖 소포체(EV)를 사용하여 약물 후보 물질을 발굴하는 방법에 대한 모식도이다.
도 36은 대장균유래 세포밖 소포체 (100 ng/ml)와 키나제 억제제를 동시에 마우스 대식세포에 처리하여 배양액에 존재하는 IL-6의 양을 세포밖 소포체만 단독으로 처리한 양성 대조군의 측정값을 기준으로 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 37은 키나제 억제제를 단독으로 처리한 경우와 두 가지 이상 조합으로 처리한 경우 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)에 의해 유도되는 마우스 대식세포 IL-6 분비 양을 양성 대조군에 대한 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 38은 대장균유래 세포밖 소포체 (100 ng/ml)와 포스파타제 억제제 (10μM, 1; Cantharidic acid, 2; Cantharidin. 3; Endothall, 4; Benzylphosphonic acid, 5; L-p-Bromotetramisole oxalate, 6; RK-682, 7; RWJ-60475, 8; RWJ-60475 (AM)3, 9; Levamisole HCl, 10; Tetramisole HCl, 11; Cypermethrin, 12; Deltamethrin, 13; Fenvalerate, 14; Tyrphostin 8, 15; CinnGEL, 16; CinnGEL 2 Me, 17; BN-82002, 19; NSC-663284, 20; Cyclosporin A, 21; Pentamidine, 22; BVT-948, 24; BML-268, 26; BML-260, 27; PD-144795, 28; BML-267, 29; BML-267 Ester, 30; OBA, 31; OBA Ester, 33; Alendronate)를 동시에 마우스 대식세포에 처리하여 배양액에 존재하는 IL-6의 양을 세포밖 소포체만 단독으로 처리한 양성 대조군의 측정값을 기준으로 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 39는 PD-144795를 0.1, 1, 5, 10 μM 농도로 포함하고 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)가 포함된 배양액을 마우스 대식세포에 처리하여 IL-6 분비를 나타낸 그래프이다.
도 40은 대장균유래 세포밖 소포체 (100 ng/ml)와 프로드러그를 동시에 마우스 대식세포에 처리하여 배양액에 존재하는 IL-6의 양을 세포밖 소포체만 단독으로 처리한 양성 대조군의 측정값을 기준으로 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 41은 프로드러그를 10μM 농도로 포함하고 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)가 포함된 배양액을 마우스 복강 유래 대식세포에 처리하여 IL-6 분비를 나타낸 그래프이다.
도 42는 마우스 복강에 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 5μg을 복강 투여하여 전신성 면역반응을 일으킨 마우스에 프로드러그인 haloperitol과 doxepin을 각각 10 mg/kg로 복강에 투여하여 혈청 내 IL-6 분비를 측정한 결과이다.
도 43은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 1μg을 1주일 간격으로 3회 복강 투여하는 과정에서 마우스 혈액 내에 소포체 특이 항체의 양을 측정한 그래프이다.
도 44는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IFN-g 양을 나타낸 그래프이다.
도 45는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-17 양을 나타낸 그래프이다.
도 46은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-4 양을 나타낸 그래프이다.
도 47은 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증으로 마우스 치사율을 나타난 결과이다.
도 48은 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증 발생에 대장균유래 세포밖 소포체 백신(EC_EV)의 효능을 나타낸 그래프이다.
도 49는 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증 모델에서 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 접종 유무에 따른 혈액 및 복강에 대장균 수(CFU)를 나타난 그래프이다.
도 50은 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증 모델에서 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 접종 유무에 따라, 대장균을 감염 6시간 후에 혈청 내 존재하는 IL-6 양을 측정한 결과이다
도 51은 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증 모델에서 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 접종 유무에 따라, 대장균을 감염 6시간 후에 마우스에서 폐를 추출하여 폐 조직을 관찰한 이미지이다.
도 52는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)를 접종한 마우스에 대장균유래 세포밖 소포체 (5μg)를 3회 복강 투여한 후 6시간에 마우스 혈청에서 IL-6를 측정한 결과이다.
도 53은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)를 접종한 마우스에 대장균유래 세포밖 소포체 (5μg)를 3회 복강 투여한 후 6 시간에 패혈증과 관련된 전신성 염증반응의 지표인 체온을 측정한 결과이다.
도 54는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)를 접종한 마우스에 대장균유래 세포밖 소포체 (5μg)를 3회 복강 투여한 후 6시간에 범발성혈관내혈액응고의 지표인 혈액 내 혈소판 감소를 관찰한 결과이다
도 55는 여러 농도의 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체(KP_EV)를 복강으로 접종한 마우스에서 혈액 내에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 특이 항체의 양을 측정한 그래프이다.
도 56은 여러 농도의 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체(KP_EV)를 복강으로 접종한 마우스에서 비장에서 채취한 T 세포에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 체외에서 처리한 후, CD3⁺CD4⁺IFN-g⁺ T 세포의 수를 나타낸 결과이다
도 57은 여러 농도의 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체(KP_EV)를 복강으로 접종한 마우스에서 비장에서 채취한 T 세포에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 체외에서 처리한 후, CD3⁺CD4⁺IL17⁺ T 세포를 나타낸 결과이다.
도 58은 클렙시엘라균(KP) 복강 투여에 의한 패혈증으로 마우스 치사율을 나타난 결과이다.
도 59는 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체(KP_EV) 1μg을 3회 복강으로 접종한 마우스에서 클렙시엘라균(KP) 감염에 의한 패혈증 발생에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 관찰한 그래프이다.
도 60은 대장균과 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체(각각 EC_EV, KP_EV) 백신을 병합 복강 접종 시, 대장균유래 세포밖 소포체 특이 항체 형성을 혈액에서 측정한 그래프이다.
도 61은 대장균과 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체(각각 EC_EV, KP_EV) 백신을 병합 복강 접종 시, 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 특이 항체 형성을 혈액에서 측정한 그래프이다.
도 62는 C57BL/6 마우스 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 유전물질 염기서열를 시퀀싱한 결과이다.
도 63은 BALB/c 마우스 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 유전물질 염기서열를 시퀀싱한 결과이다.
도 64는 장내 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)를 bacteria-universal primer를 가지고 RT-PCR하여 16S rRNA의 유전자 또는 그에 유래한 RNA transcript가 있음을 나타낸 결과이다.
도 65는 장내 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 25μg을 마우스 복강으로 주사한 그룹과 PBS를 주사한 그룹에서 각종 장기 및 체액을 채취하여 대장균유래 세포밖 소포체의 단백질 존재 여부를 평가한 결과이다.

본 발명은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체, 및 이를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법 등을 제공한다.

본 발명에서, "장내(gut)"란 포유동물 소화관(digestive tracts)의 내부 및 상피세포층 표면을 포함하는 의미이며, 예를 들어, 인간을 비롯한 포유동물의 소화관인 구강, 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 항문, 담도, 담낭, 췌장관 등의 내부 및 상피세포층 표면일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "장내 공생 세균(gut microbiota or gut flora)"이란 포유동물의 소화관의 내부 또는 표면에 서식하는 세균을 의미하며 정상상태에선 질병을 일으키지 않으나 방어능력이 떨어져 있는 상태거나 소화관를 벗어났을 때 질병을 일으키는 특징이 있으며, 당업자에게 공지의 장내 공생 세균이 이에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "장내 공생 세균유래 세포밖 소포체"란 포유동물의 장내 공생 세균이 장내에서 분비하거나, 또는 체내에 흡수되어 분비하는 소포체를 포함하며, 크기가 원래의 세포보다 작은 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

장내 공생 세균은 일반적으로 질병을 일으키는 병원성 세균으로 주목을 받지 못하였다. 세균에 의한 장내 감염은 주로 병원성 세균에 오염된 음식물 등을 섭취하여 발생하는 급성 감염성 질환에 관심을 두었다. 최근 위염, 소화성궤양, 위암 등의 발생에 있어서 위에 공생하는 헬리코박터균이 주목을 받고 있다. 또한, 염증성장염, 대장암의 발생과 관련해서 대장에 공생하는 세균이 주목을 받고 있다. 그러나, 아직까지 상기의 위장관 질환을 일으키는 원인물질로서 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체의 중요성에 대해선 잘 알려져 있지 않았다.

본 발명자들은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 점막에 염증을 유도하고, 특히 암의 병인에 중요한 호중구성 염증을 특징으로 하는 Th17 면역반응을 유도한다는 사실을 처음으로 밝혀냈고, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 국소적으로 투여하여 상기의 국소 질환에 대한 질병 모델을 개발하였다.

전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증의 병인과 관련해서 세균에서 유래하는 물질이 혈관으로 흡수되어 이를 일으킨다고 알려져 있으나, 원인물질의 실체에 대해선 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은 처음으로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되었을 때, 혈중에서 염증성 매개체 분비를 통한 전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증, 혈관내혈액응고, 폐기종 등의 질병이 발생함을 밝혀냈다. 이는 패혈증의 발생뿐만 아니라 혈관내 혈액응고에 의한 혈전형성을 특징으로 하는 급성관상동맥증후군, 뇌졸증 등의 혈관질환, 폐기종, 급성호흡부전증후군 등의 폐질환의 발생에 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 중요한 원인인자임을 의미하고, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 전신적으로 투여하여 상기의 전신질환에 대한 질병 모델을 개발하였다.

장내 세균 감염 이후에 관절염이 발생한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 비만, 당뇨 등의 대사질환과 장내 세균과의 관련성이 최근 주목을 받고 있다. 본 발명자들은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 저용량으로 장기간 전신적으로 투여하여 고혈압, 골다공증 등의 질병이 발생함을 최초로 밝혀냈다. 이는 원인인자가 불분명한 만성질환의 원인물질로서 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 중요하고, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용하여 상기 질병 모델을 개발할 수 있다.

질병을 예방 또는 치료하는 약물을 개발하기 위해서 정확한 원인물질을 파악하는 것은 매우 중요하다. 예를 들어, 원인물질을 체외에서 세포에 투여하는 과정에서 후보 약물을 처리하여 효능을 검증할 수 있고, 상기에 기술한 동물모델에 후보 약물을 투여하여 효능을 검증할 수 있다. 본 발명자들은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 예방 또는 치료하는 약물을 개발하기 위하여 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 후보 약물을 선별하는 탐색 방법을 확립하여, 이를 통해 약물을 발굴하였다. 즉, 상기의 탐색 방법으로 80종의 키나제 억제제 중에서 염증성 매개체 분비를 억제하는 11 종의 후보 약물, 30종의 포스파타제억제제 중에서 1종의 후보 약물, 100종의 프로드러그 중에서 14종의 후보 약물을 발굴하여 상기에 기술한 질병 동물 모델에서 효능을 검증하였다. 이는 본 발명에서 개발한 후보 약물 탐색 방법을 통해 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 매우 효과적으로 발굴할 수 있음을 의미한다.

질병의 원인인자를 정확히 파악하는 것은 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 백신 개발에 필수적이다. 바이러스성 감염질환인 경우에 원인 바이러스를 약독화한 형태로 체내로 투여함으로써 바이러스에 대한 면역반응을 유도하여 예방 백신을 개발하여 사용되고 있고, 현재 바이러스에 의해 발생하는 질환을 예방 백신으로 효율적으로 예방할 수 있게 되었다. 본 발명자들은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 체내에 투여하여 소포체에 대한 면역반응을 유도함으로써 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 밝혀냈다. 이는 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환 등의 전신질환 및 구강염, 구강암, 식도염, 식도암, 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 과민성장증후군, 대장암, 담도염, 담낭염, 췌장염, 담도암, 췌장암 등의 국소질환 등과 같이 질병의 발생에 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체와 관련성이 있는 질병에 대한 백신으로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체 자체를 사용하거나, 또는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 소포체를 변형 투여하거나 약물을 병용 투여함으로써 효율적으로 상기 질병을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다.

세균에서 분비되는 외독소에 의한 질병을 예방하기 위하여 외독소 단백질을 이용한 예방 백신은 수십년전에 개발되어 사용되고 있다. 그러나 아직까지 세균 자체에 대한 효과적인 백신은 개발되지 않았다. 세균 자체에 대한 예방 백신의 예로, 그람 양성 세균인 경우 세포벽 성분을 이용한 백신이 개발되었으나 T 세포에 비의존적으로 항체가 생성되고, 세균의 아형에만 특이적으로 작용하는 항체만 생성되어 효능에 한계가 있다. T 세포에 의존적인 항체 생성을 위해 세포벽 성분에 단백질을 접합한 형태의 백신이 개발되었으나, 가격이 비싸고, 세균의 아형에만 작용하는 단점이 있다. 세균유래 소포체를 백신으로 사용하는 경우 소포체에 세균에 유래하는 여러 종류의 단백질을 함유하고 있어 세균의 아형에 특이적인 면역반응을 유도하는 기존 세균 백신의 단점을 극복할 수 있고, 세균에 대한 항체 형성뿐만 아니라 T 세포반응을 유도하는 면역보강제가 같이 있어 효율적으로 면역반응을 유도할 수 있는 장점이 있다. 본 발명은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 투여하여 세균 단백질에 대한 항체 형성뿐만 아니라 세균에 대한 방어에 중요한 T 세포 면역반응인 Th1 및 Th17 면역반응을 효율적으로 유도함으로써 장내 공생 세균에 의한 감염을 효율적으로 예방할 수 있음을 밝혀냈다. 이는 장내 공생 세균에 의한 복막염, 패혈증, 폐렴, 요로감염, 골관절 및 중추신경계 감염 등에 대한 백신으로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체 자체를 사용하거나, 또는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 소포체를 변형 투여하거나 약물을 병용 투여함으로써 효율적으로 상기 감염을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다.

장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환 등의 전신질환 및 위염, 소화성궤양, 위암, 염증성장염, 과민성장증후군, 대장암 등의 국소질환 등의 원인물질이라는 사실은 원인물질이 불분명한 상기 질환의 원인을 정확히 진단하는데 매우 중요하다. 본 발명자들은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체의 유전물질에 대한 염기서열을 분석하였고, 단백질을 동정하였으며, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 대한 특이 항체가 형성됨을 밝힘으로써 상기 질병의 원인인자을 정확히 진단하는 방법을 개발하였다.

본 발명에서는 마우스 대변에서 세포밖 소포체를 분리하여 프로테옴 분석을 시행하였다. 그 결과 총 295개의 단백질을 동정하였고, 이 중 73개의 단백질은 마우스 숙주세포, 77개는 그람 음성 세균, 145개는 그람 양성 세균에서 유래한 단백질이었다. 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 단백질 분석을 통해 세포밖 소포체를 분비하는 세균을 동정하였는데, 그람 음성 세균으로 박테로이데스균 (Bacteroides thetaiotaomicron), 대장균 (Esherichia coli), 크렙시엘라균 (Klebsiella pneumoniae) 등이었고, 그람 양성 세균으로 비피도박테리움균 (Bifidobacterium longum), 클로스트리디움균 (Clostridium perfringens), 엔테로코커스균 (Enterococcus faeacalis), 유박테리움균 (Eubacterim rectale), 락토바실러스균 (Lactobacillus reuteri), 프로피오박테리움균 (Propiobacterium acnes), 스트렙토코커스균 (Streptococcus agalactiae) 등이 동정되었다.

염증성장염은 대장의 만성 염증을 특징으로 하는 질환으로서 최근 Th17 면역반응에 의한 염증이 주목을 받고 있다. 특히, 염증성장염은 대장암의 위험인자로서 동물실험에서 Th17 면역반응에 의해 대장암이 발생된다고 알려져 있다. 덱스트란소디움설페이트 (dextran sodium sulfate, DSS)를 경구로 투여하여 염증성장염 동물 모델을 만드는 방법이 보편적인 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서는 1% DSS를 6일간 경구로 투여한 후, 7일째 소장액에서 세포밖 소포체를 분리하였다. 분리한 세포밖 소포체를 체외에서 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 처리하였을 때, 정상 마우스 소장액에서 분리한 소포체는 인터루킨(Interleukin, IL)-6 분비를 유도하지 않았으나, 질병상태 마우스 소장액에서 분리한 소포체는 IL-6 분비를 유도하였다. IL-6가 Th17 면역반응을 유도하는 중요한 매개체임을 감안하면, 질병상태의 소장액에서 분리한 세포밖 소포체가 Th17 면역반응을 유도할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 질병상태의 소장액에서 분리한 세포밖 소포체에 그람 음성 세균의 세포외막 성분인 LPS를 길항하는 polymyxin B와 같이 투여하였을 때, IL-6가 분비되지 않았는데, 이는 염증성장염을 일으키는데 장내 공생 세균 중에서 그람 음성 세균에서 유래한 세포밖 소포체가 중요함을 의미한다.

마우스의 맹장을 결찰한 후 천자하는 수술 (cecal ligation and puncture, CLP)을 통해 패혈증 동물 모델을 만드는 방법이 보편적이다. 본 발명에서는, CLP 후, 복강 세척을 통해 복강에서 패혈증과 관련된 장내 공생 세균을 분리하였는데, 16S rRNA 염기서열을 통해 분리된 세균이 대장균으로 동정되었고, 전자현미경 사진을 통해 대장균 표면에 20-40 nm 크기를 가진 구형 모양의 세포밖 소포체를 분비한다는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 별도의 물리화학적인 자극 없이 장내 공생 세균 배양액에서 생리적으로 분비되는 세포밖 소포체를 분리하였다. 예를 들어, 대장균을 배지에서 장시간 키운 다음에 상층액을 거두어 세포밖 소포체보다 큰 물질을 필터를 통해서 거른 후에 농축한 용액을 초원심분리하여 세포밖 소포체를 분리하였다. 대장균유래 세포밖 소포체는 염증반응을 유도할 수 있는 LPS와 외막 단백질 (outer membrane protein)을 포함하고 있다. 대장균 배양액에 자연적으로 분비한 세포밖 소포체는 질량 대비 75%의 LPS와 대장균 외막 및 외막 단백질로 이루어져 있었다.

자연적으로 분비되는 세포밖 소포체 분리 이외에도 여러 가지의 기계적, 전기적, 화학적 방법으로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 분리할 수 있다. 삼투압을 이용한 세포 용해, 전기 천공 (electroporation), 초음파 분해 (sonication), 균질화 (homogenization), 세제 (detergent) 처리, 냉동-해동 (freeze-thaw), 압출 (extrusion), 기계적 분해 등의 방법으로 인공적으로 세포밖 소포체를 제조한 후 분리할 수도 있다. 이하, 본 발명에서는 별도의 표기가 없는 세포밖 소포체는 배양 세균이 자연적으로 분비하는 세포밖 소포체를 말한다.

상기의 방법으로 분리한 대장균유래 세포밖 소포체가 염증성 매개체 분비를 유도할 수 있는지 평가하기 위해 마우스 대식세포 (RAW 264. 7)에 세포밖 소포체를 처리하였다. 그 결과, 세포밖 소포체의 농도에 비례하여 대식세포에서 TNF-α와 IL-6 등의 염증성 매개체 분비가 증가하였다.

대장에는 수 많은 공생세균이 서식하고 있어, 특정 세균에 의한 병인을 평가하기 위하여 장내 세균이 없는 쥐 (germ free mouse)를 사용한다. 대장에 비하여 기도에는 공생 세균이 없어 특정 세균에 의한 병인을 평가하기에 최적의 환경을 갖고 있다. 본 발명에서는 대장균유래 세포밖 소포체가 점막에 국소적으로 작용하여 염증을 유도하는지를 평가하기 위하여 대장균유래 세포밖 소포체를 기도로 투여하였다. 그 결과, 세포밖 소포체의 농도에 비례하여 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BAL fluid) 내에 염증세포 수가 증가하였다. 또한, Th17 면역반응과 암 발생과 관련이 있는 IL-6의 분비가 소포체의 농도에 비례하여 증가하였다. 이는 장내 공생 그람 음성 세균유래 세포밖 소포체가 점막에 국소적으로 작용하여 Th17 면역반응을 특징으로 하는 염증을 유도할 수 있음을 의미한다.

대장균유래 세포밖 소포체가 전신적으로 흡수되었을 때, 전신 염증반응이 유도되는지를 평가하기 위하여 세포밖 소포체를 복강 내로 투여하였다. 그 결과, 세포밖 소포체의 농도에 비례하여 마우스의 사망률이 증가하였다.

패혈증은 국소적인 세균감염과 함께 전신적인 염증반응 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS)을 특징으로 하는데, SIRS는 빈호흡, 저체온 또는 고체온, 심박수 증가, 백혈구 감소 또는 증가의 지표로 구성되어 있고 이 지표들 중 2개 이상 충족시키면 패혈증이라 정의한다. 본 발명에서 대장균유래 세포밖 소포체를 치사량 미만의 용량으로 마우스 복강 내로 주입하였을 때, 혈중에 염증성 매개체인 TNF-a IL-6, IL-12, IL-17 등이 증가하였고, 빈호흡, 저체온, 백혈구 감소가 유도되었다. 이는 대장균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 흡수되어 염증성 매개체를 분비하고, 이를 통해 패혈증을 유도함을 알 수 있다.

패혈증이 임상적으로 중요한 이유는 사망률이 매우 높다는 점인데, 패혈증의 경과에서 중증 패혈증 (severe sepsis)으로 발전하게 되면, 사망할 가능성이 매우 높게 된다. 본 발명에서는 세포밖 소포체를 복강 내로 주입하였을 때 중증 패혈증의 지표인 저혈압이 유도되었다. 이는 패혈증의 경과에서 중증으로 이행하는 데에도 세균유래 세포밖 소포체가 중요한 역할을 함을 의미한다.

혈관 내에서 혈액이 응고(coagulation)되면 혈관이 막히게 되어 급사(sudden death)의 주 원인이 된다. 특히, 뇌혈관과 관상동맥이 혈액응고에 의한 혈전(thrombosis)으로 막히게 되는 경우, 각각 뇌졸증(stroke)과 급성관상동맥증후군(acute coronary syndrome)으로 사망하는 경우가 빈번하다.

본 발명에서는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되었을 때 혈액응고를 유도하는지 평가하기 위하여 대장균유래 세포밖 소포체를 복강으로 투여하였다. 그 결과, 세포밖 소포체를 투여한 군에서 혈액내에 파종성혈관내혈액응고 (disseminated intravascular coagulation, DIC)의 지표인 혈소판이 감소하였고, D-dimer 양이 증가하였다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되어 혈액응고를 일으키고, 뇌혈관과 관상동맥에 혈액응고가 발생하면 각각 뇌졸증, 급성관상동맥증후군을 일으킬 수 있음을 의미한다.

장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관 내피세포에 작용하여 이를 활성화시키고, 혈액응고를 일으키는지 평가하기 위하여, 혈관 내피세포 (HUVEC)에 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 처리하였다. 그 결과 염증 반응 및 관상동맥 질환을 포함한 각종 질병 상황에서 증가한다고 잘 알려진 ICAM-1의 양이 증가하였으며 혈액 응고인자인 조직요소 (tissue factor)의 분비가 증가함을 알 수 있었다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 혈관내피세포가 활성화되고, 혈액응고가 발생하여 혈전 (thrombosis) 또는 색전 (embolism)에 의해 혈관이 막히는 허혈성 혈관질환을 유도함을 의미한다.

장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되었을 때, 또 다른 문제가 여러 장기로 분포할 수 있다는 점이다. 실제로, 대장균유래 세포밖 소포체를 복강으로 주입하였을 때, 세포밖 소포체가 전신적으로 분포함을 알 수 있었고, 특히 폐조직으로 침윤됨을 확인하였다. 폐조직으로 침윤된 세포밖 소포체가 폐염증을 유도하는 지를 평가하였다. 그 결과, 폐염증의 지표인 wet-dry ratio가 세포밖 소포체를 투여한 경우 유의하게 증가하였고, 기관지폐포세척액 내 염증세포 수 또한 증가하였다. 또한, 염증에 따른 조직손상 여부를 평가하였는데, 세포밖 소포체를 투여한 경우에 폐포의 파괴를 특징으로 하는 폐기종이 발생하였다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 흡수되면, 폐뿐만 아니라, 뇌, 골관절, 콩팥 등과 같은 여러 장기에 분포하여 염증과 조직손상을 유도하여 다양한 질병을 유도할 수 있음을 의미한다.

장내 공생 세균은 지속적으로 세포밖 소포체를 분비하고, 이는 혈관으로 유입되어 여러 가지 문제를 야기할 수 있다. 본 발명에서는 대장균유래 세포밖 소포체를 저 용량으로 장기간 투여하였을 때, 체내에서 일어나는 변화를 관찰하였다. 그 결과, 세포밖 소포체에 의해 고혈압이 발생하였고, 또한 골다공증도 발생하였다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 현재까지 원인인자가 불분명한 만성 염증 질환의 발생에 중요한 원인인자임을 의미한다.

IL-6는 다양한 작용을 통해 염증질환 및 암 발생에 관여한다. IL-6는 STAT3를 통한 신호전달을 통해 암 발생에 관련된 세포증식 (cell proliferation), 혈관신생 (angiogenesis), 침윤 (invasion), 면역회피 (immune evasion)에 관련된 유전자 발현을 유도하고, 암 발생에 중요한 Th17 면역반응을 통한 호중구성 염증에 의해 암 발생을 유도한다고 알려져 있다. 또한, 혈중 IL-6의 농도는 동맥경화증 및 폐기종을 포함한 만성폐쇄성폐질환 환자에서 사망과 관련된 예후와 밀접한 관련성을 갖고 있다. 특히, 혈중에서 염증세포에서 분비되는 IL-6는 혈관내피세포에 작용하여 혈액응고에 관련된 인자의 발현을 증가시켜 혈액응고에 관여한다고 알려져 있다. 본 발명에서는 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증 동물 모델에서 질병의 병인에 대한 IL-6의 역할을 평가하기 위하여 대장균유래 세포밖 소포체를 정상 및 IL-6 결핍 마우스의 복강에 주입하였다. 그 결과, 80% 이상의 정상 마우스에서 대장균유래 세포밖 소포체에 의해 사망하였으나, IL-6 결핍 마우스에선 소포체 투여에 의해 모두 생존하였다. 또한, 대장균유래 세포밖 소포체 복강 투여에 의한 폐기종 발생도 정상 마우스에선 소포체에 의해 발생하였으나, IL-6 결핍 마우스에선 관찰되지 않았다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 체내에서 분비되는 IL-6가 세포밖 소포체에 의한 질병의 병인에 매우 중요한 바이오마커임을 의미한다.

상기의 연구결과를 바탕으로, 본 발명자들은 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 후보 약물을 선별하기 위한 탐색 방법을 개발하고자 하였다. 이를 위해, 원인인자로 대장균유래 세포밖 소포체를 사용하였고, 효능으로 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에서 분비되는 IL-6를 평가하였다. 대식세포에 세포밖 소포체와 함께 80종의 키나제 억제제 (kinase inhibitor library, BIOMOL No.2832: PD-98059, U-0126, SB-203580, H-7, H-9, AG-494, AG-825, Lavendustin A, RG-14620, Tytphostin 23, Tytphostin 25, Tytphostin46, Tytphostin47, Tytphostin 51, Tytphostin 1, Tytphostin 9, Tytphostin AG 1288, Tytphostin AG 1478, Tytphostin AG 1295, HNMPA, Damnacanthal, Piceatannol, AG-490, AG-126, AG-370, AG-879, LY 294002, Wortmannin, GF 109203X, Hypericin, Sphingosine, H-89, H-8, HA-1004, HA-1077, HDBA, KN-62, KN-93, ML-7, ML-9, 2-Aminopurine, N9-Isopropyl-olomoucine, Olomoucine, iso-olomoucine, Roscovitine, LFM-A13, SB-202190, ZM 336372, SU 4312, AG-1296, Rottlerin, Genistein, Daiazein, Erbstatin analog, Quercetin dehydrate, SU 1498, ZM 449829, DRB (5,6-Dichloro-1-b-D-ribofuranosylbenzimidazole), HBDDE (2,2',3,3',4,4'-Hexahydroxy-1,1'-biphenyl-6,6'-dimethanol dimethyl ether), Indirubin, Indirubin-3'-monoxime, Y-27632, Kenpaullone, Terreic acid, BML-257, BML-259, Apigenin, BML-265 (Erlotinib analog), Rapamycin), 30종의 포스파타제억제제 (phosphatase inhibitor library, BIOMOL No.2834: Cantharidic acid, Cantharidin. Endothall, Benzylphosphonic acid, L-p-Bromotetramisole oxalate, RK-682, RWJ-60475, RWJ-60475 (AM)3, Levamisole HCl, Tetramisole HCl, Cypermethrin, Deltamethrin, Fenvalerate, Tyrphostin 8, CinnGEL, CinnGEL 2 Me, BN-82002, Shikonin, NSC-663284, Cyclosporin A, Pentamidine, BVT-948, B4-Rhodanine, BML-268, Dioxophenanthrene, BML-260, PD-144795, BML-267, BML-267 Ester, OBA, OBA Ester, Gossypol, Alendronate), 100종의 프로드러그 (prodrug; acetaminophen, acetylcysteine, allopurinol, alprenolol HCl, amitriptyline HCl, atropine, bretylium tosylate, bromopheniramine, budesonide, buspirone HCl, cefuroxime, chloral hydrate, chlorpromazine HCl, cimetidine, clomipramine HCl, clotrimazole, cyclobenzaprine, desipramine HCl, diclofenac, diflunisal, diltiazem, diphenhydramine HCl, disopyramine, disulfiram, D-mannitol, doxepin, doxycycline hydrate, doxylamine succinate, edrophonium chloride, enalapril maleate, famotidine, fenbufen, fenofibrate, fenoprofen calcium salt hydrate, flunarizine dihydrochloride, fluphenazine dichloride, flurbiprofen, furosemide, gemfibrozil, gliclazide, glipizide, haloperidol, hydrochlorothiazide, hydroflumethiazide, hydroxyzine HCl, ibuprofen, imipramine HCl, indapamide, indole-2-carboxylic acid, indomethacin, ipratropium, ketoprofen, ketorolac tris salt, maprotiline HCl, meclofenamic acid, melatonin, metformin, methapyrilene HCl, methimazole, methocarbamol, metoclopramide HCl, metronidazole, nabumetone, naproxen, neostigmine Br, niacin, nicardipine HCl, nifedipine, nitrofurantoin, nizatidine, norethindrone, nortriptyline, orphenadrine HCl, oxybutynin, phenformin HCl, phenylbutazone, phenytoin, piroxicam, prednisone, probenecid, propranolol HCl, pyridostigmine Br, ranitidine HCl, spironolactone, sulfameth, sulpiride, tenoxicam, terfenadine, theophylline, ticlopidine HCl, tolazamide, tolazoline, tolbutamide, tolfenamic acid, tramadol HCl, tranylcypromine, trazodone HCl, triamterene, trichlormethiazide, tripelennamine HCl, verapamil, warfarin)를 투여하였다. 키나제 억제제 중 11가지 후보 물질, 포스파타제 억제제 중 1가지 후보 물질, 프로드러그 중 14가지 후보 물질이 세포밖 소포체에 의한 IL-6 분비를 억제하였다.

체내에서 IL-6의 분비에 대한 상기 후보 약물의 효능을 평가하였다. 그 결과 장내 대장균유래 세포밖 소포체를 마우스에 5μg 복강 주사하여 전신성 면역 반응을 유도한 마우스 모델에서 상기 후보 약물을 함께 복강 주사 시 세포밖 소포체에 의해 증가되는 혈청 내 IL-6의 양을 감소시킴을 확인하였다. 이는 본 발명의 방법으로 염증성 질환 치료제 후보 약물을 효율적으로 선별할 수 있음을 보여준다.

세균 감염에 대한 방어기작으로 T 세포 면역반응과 B 세포에서 생성되는 항체반응이 중요하다. 세균에 대한 항체는 크게 LPS 등과 같은 비단백질 성분에 대한 항체와 단백질 성분에 대한 항체로 구별할 수 있고, 전자인 경우에는 생성에 T 세포의 영향을 받지 않는 반면, 후자인 경우에는 생성에 T 세포의 영향을 받는다. T 세포 면역반응은 사이토카인의 분비양상에 따라 감마인터페론 (IFN-g)을 분비하는 Th1, IL-17을 분비하는 Th17, IL-4/IL-5/IL-13 등을 분비하는 Th2 세포로 분류할 수 있고, 이 중 세균에 대한 방어에 중요한 것은 Th1 및 Th17 면역반응으로 알려져 있다. 세균에서 유래하는 세포밖 소포체에는 세균이 갖고 있는 여러 가지 단백질뿐만 아니라 면역반응을 항진시키는 면역보강제를 포함하고 있어 세균에 대한 백신으로 유용할 수 있다. 본 발명에서는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 투여하였을 때, 세균에 대한 면역반응을 유도할 수 있는지를 평가하였다. 이를 위해 대장균(EC) 및 크렙시엘라균(KP) 유래 세포밖 소포체를 복강으로 일주일 간격으로 3회 주사하여 면역반응을 평가하였다. 그 결과, 세포밖 소포체를 투여한 경우 각각의 세균특이 단백질에 대한 항체가 투여 횟수에 따라 증가하였고, 각각의 세균에 존재하는 단백질에 의해 T 세포에서 감마인터페론과 IL-17 분비능이 유의하게 증가하였다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 투여하면 소포체를 분비하는 세균 단백질에 대한 항체형성뿐만 아니라 단백질특이 Th1 및 Th17 면역반응을 유도하여 효율적으로 세균감염 및 세포밖 소포체에 의한 질병을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다.

실제로 소포체 백신을 미리 투여하여 면역반응을 유도함으로써 세균감염 및 세포밖 소포체에 의한 질병 발생에 대한 예방효과가 있는지를 평가하였다. 이를 위해, 장내 공생 세균인 대장균과 크렙시엘라균을 복강으로 주사하여 패혈증 동물 모델을 확립한 후, 상기 세균을 복강으로 주입하기 전에 각각 대장균과 크렙시엘라균 유래 세포밖 소포체로 면역반응을 유도하였다. 소포체 백신으로 면역반응을 유도한 후, 대장균과 크렙시엘라균을 각각 복강으로 투여하여 패혈증에 의한 사망률 발생에 백신의 효능을 평가하였다. 그 결과, 각각 대장균과 크렙시엘라균대장균 유래 소포체 백신을 투여한 경우, 대장균과 크렙시엘라균 감염에 의한 패혈증으로 인한 사망률이 효율적으로 억제되었다. 또한, 대장균유래 소포체 백신을 투여한 경우, 대장균 유래 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되어 혈중에서 분비되는 IL-6의 양이 현저히 줄어들었다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 백신으로 면역반응을 유도하는 경우에 장내 공생 세균 감염뿐만 아니라 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.

본 발명을 통해 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 각종 질병의 발생이 가능함을 전술하였으며, 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 원인인자가 불분명한 질병의 발생에 중요한 원인인자임을 의미한다. 질병의 원인인자를 진단하는 방법을 제공하기 위해 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 유전물질이 존재하는지를 확인한 결과 16S rRNA가 존재함을 확인하였으며 마우스 대변 유래 세포밖 소포체의 경우 대변에 서식하는 대표적인 세균 10종 중에서 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae의 유전물질이 존재함을 확인하였다. 아울러 마우스 복강에 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 주입한 결과 마우스의 각종 장기 및 소변, 혈액에서 세포밖 소포체 단백질이 존재함을 확인하였다. 이는 채취가 용이한 소변, 대변, 및 혈액 등에서 유전물질 및 세포밖 소포체 단백질의 존재 여부를 확인하여 질병의 원인인자를 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 정상 마우스 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 프로테옴 분석

마우스 대변 유래 세포밖 소포체를 분리하기 위해 5 주령 수컷 C57BL/6 마우스로부터 얻은 대변 25g을 생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS) 2 L에 넣고, 4℃에서 16시간 동안 현탁 (resuspension)하였다. 이 현탁액을 4℃, 10,000×g에서 20분간 원심분리한 후, 상층액을 취하여 0.45 mm 구멍 크기를 가진 필터에 통과시켰다. 이렇게 박테리아가 제거된 통과액은 100 kDa 분자량 이하의 단백질을 제거할 수 있는 막 (membrane)을 장착한 퀵스탠드 시스템 (QuixStand Benchtop System)을 사용하여 70 ml로 약 30 배 농축하였다. 농축액을 재차 4℃, 10,000 × g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액을 0.5 ml의 2.5 M 슈크로스 용액 (2.5 M sucrose/20 mM HEPES/150 mM NaCl, pH7.4)과 1 ml의 0.8 M 슈크로스 용액 (0.8 M sucrose/20 mM HEPES/150 mM NaCl, pH7.4)이 담긴 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 담고 4℃, 100,000×g에서 4시간 동안 초원심분리한 후, 2.5 M 과 0.8 M 슈크로스 용액 사이에 위치한 세포밖 소포체 포함층을 취하였다. 이를 PBS로 10 배 희석한 후, 0.15 ml의 2.5 M 슈크로스 용액과 0.35 ml의 0.8 M 슈크로스 용액이 담긴 초원심분리 튜브에 담고 4℃, 200,000×g에서 2 시간 동안 초원심분리하였다. 2.5 M 과 0.8 M 슈크로스 용액 사이에 위치한 세포밖 소포체 포함층을 PBS로 10배 희석한 후, 4℃, 150,000×g에서 3 시간 동안 초원심분리하여 침전시켰다. 침전물을 2.2 ml의 50% 옵티프렙 (Optiprep) 용액에 현탁하고 초원심분리 튜브에 담은 후, 그 위에 2 ml의 40% 옵티프렙 용액과 0.8 ml의 10% 옵티프렙 용액을 차례로 담았다. 이후 4℃, 200,000×g에서 2 시간 동안 초원심분리하고, 40% 옵티프렙 용액과 10% 옵티프렙 용액 사이의 층에서 세포밖 소포체를 얻었다.

마우스 대변 유래 세포밖 소포체의 프로테옴 분석을 위해 인-솔루션 (in-solution) 트립신 단백질 분해 방법을 이용하였다. 마우스 대변에서 상기 실시예의 방법으로 분리한 세포밖 소포체 50 mg을 분해용액 (7 M urea, 2 M Thiourea, 100 mM NH₄HCO₃)으로 녹인 후, 10 mM DTT를 이용하여 60℃에서 45 분간 환원 (reduction)시켰다. 이후 샘플을 상온에서 식힌 후 55 mM 요오드아세트아미드 (iodoacetamide)를 넣고, 빛을 차단한 상태로 상온에서 30 분간 단백질을 알킬화 (alkylation)시켰다. 이 후 10 ㎍의 트립신을 처리하고 초음파분해 (sonication)로 트립신의 활성을 높인 후, 37℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 분해된 펩타이드는 오프젤 분리 시스템 (OFFGEL fractionators system, Agilent)을 이용하여 분리하였다. 우선 24 cm 의 IPG strip (pH 3-10)을 IPG 가수화 (IPG-rehydration) 버퍼로 가수반응시켰다. 분해된 펩타이드를 2.8 ml의 오프젤 (off-gel) 버퍼에 녹이고, 그 중 150 ㎕를 한 레인(lane)에 로딩한 후 50 mA 8000 V 전압으로 40 시간 동안 전기영동하여 펩타이드를 각각의 등전점 (pI)에 따라 분리하였다. 분리 후 얻은 샘플을 PepClean C18 spin column을 이용하여 제염(desalting)하였다.

나노 이온화 질량 분석 (Nano-LC-ESI-MS/MS)을 이용하여 질량 분석을 수행하였다. 인-솔루션 분해 방법으로 준비한 마우스 대변 유래 세포밖 소포체의 분해 펩타이드를 5 mm 크기의 C18 레진 (resin)이 충전된 컬럼 (75 mm x 12 cm)에 로딩하여 다음과 같은 방법으로 분리하였다: 3-40% 버퍼 B 70 분; 혈류 속도 0.3 ml/min (버퍼 A 조성: 0.1% formic acid in H₂O, 버퍼 B 조성: 0.1% formic acid in acetonitrile). 분리된 펩타이드는 LTQ-ion-trap 질량 분석기 (Thermo Finnigan)을 이용하여 분석하였다. 이온화 전기분무 (electrospary)의 전압은 1.9 kV로 하고, 35%의 규격화된 충돌 에너지 (normalized collision energy) 조건으로 질량 분석 (MS/MS)을 수행하였다. 모든 스펙트럼은 데이터-종속 (data-dependent) 스캔 (scan)으로 획득하였다. LTQ의 매개변수 (parameter)는 풀 매스 스캔 (full MS scan)에서 5개의 최다 스펙트럼 (most abundant spectrum)을 단편화 (fragmentation)하였고, 동적 배제 (dynamic exclusion)의 반복 수 (repeat count)는 1로, 반복 시간 (repeat duration)은 30 초로, 동적 배제 시간 (dynamic exclusion duration)은 180 초로, 배제 질량 너비 (exclusion mass width)는 1.5 Da, 동적 배제의 리스트 크기 (list size)는 50으로 설정하였다.

마우스 장 세포에서 유래된 세포밖 소포체에 존재하는 단백질의 분석을 위해 기존에 아미노산 염기서열이 구축된 마우스의 데이터베이스 (Uniprot)를 이용함과 동시에 장내 박테리아에서 유래된 세포밖 소포체에 존재하는 단백질의 분석을 위해서 장내에 다수로 존재하는 속 (genus)을 대표하는10 종 (species)의 박테리아 데이터베이스 (Uniprot)를 이용하였다. 각각의 데이터베이스를 이용하여 총 11 번의 데이터 분석을 수행하였다. MASCOT 단백질 분석 엔진 version 2.2 (http://www.matrixscience.com)를 이용하여 질량분석에서 나온 모든 스펙트럼 (MS spectrum and MS/MS spectrum)을 분석하였다. 분석에 대한 검증은 펩타이드 프로펫/단백질 프로펫 (peptide prophet/protein prophet) 95%/99% 이상으로 신뢰도 높은 단백질들을 선별하였고, 각각의 단백질에서 동정된 펩타이드가 한 개인 스펙트럼은 직접 아미노산 서열을 분석(manual validation)하여 신뢰도를 높였다.

도 1은 상기의 방법으로 마우스의 대변에 존재하는 세포밖 소포체의 프로테옴 분석 결과로서, 총 295 개의 단백질 중 222 개가 박테리아 유래 단백질이었으며 이중 그람 음성 세균유래 단백질이 77개, 그람 양성 박테리아 유래 단백질이 145 개 동정되었다. 그람 음성 세균의 경우 Bacteroides thetaiotaomicron , Escherichia coli K-12, Klebsiella pneumonia 유래 단백질이 주를 이루었으며, 그람 양성 세균의 경우 Clostridium perfringens , Lactibacillus reuteri 유래 단백질이 주를 이루었다.

실시예 2. 정상 및 질병상태의 마우스 소장액에서 세포밖 소포체에 의한 염증성 매개체 분비

정상 및 DSS에 의해서 유도된 염증성장염 마우스의 소장액에서 세포밖 소포체를 분리하기 위해서 마우스를 해부하여 소장을 적출하였다. 적출된 소장에서 peyer`s patch와 lipid를 제거한 뒤 소장을 약 5 cm의 길이로 잘라내고 횡으로 절개하여 생리 식염수에 씻어 소장내 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 소장은 사방 1 cm크기로 잘라내고 30 ml의 생리 식염수에 넣고 vortex로 5 초간 5 번 vortexing하였다. 소장 조직 및 불순물은 윈심분리하여 제거하고 상층액에서 초원심분리를하여 세포밖 소포체를 분리해내었다.

도 2는 상기의 방법으로 분리된 세포밖 소포체를 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)을 통해서 대략의 크기와 모양을 나타낸 결과로서, 약 100 nm 크기의 구형의 세포밖 소포체를 확인할 수 있었다.

도 3 및 도 4는 정상 및 DSS에 의해서 유도된 염증성장염 마우스의 소장액에서 분리한 세포밖 소포체에 의해 염증성 매개체인 IL-6의 분비능을 평가하기 위하여, 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 여러 가지 농도의 세포밖 소포체를 처리한 결과이다. 그 결과, 정상 마우스에서 분리된 세포밖 소포체는 IL-6를 유도하지 못하였지만, DSS에 의해서 유도된 염증성장염 마우스의 소장에서 분리된 세포밖 소포체는 농도의존적으로 IL-6의 발현을 유도하는 것을 엘리자 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 방법을 통해 확인하였다.

도 5는 DSS에 의해서 유도된 염증성장염 마우스에서 분리된 세포밖 소포체에 그람 음성 세균유래 세포밖 소포체가 포함되어 있는지를 평가한 결과이다. 그 결과, DSS에 의해서 유도된 염증성장염 마우스에서 분리된 세포밖 소포체에 그람 음성 세균의 세포외막의 구성성분인 LPS를 길항하는 polymyxin B를 와 처리하였을 때, 질병 상태의 소장액에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 IL-6의 분비가 억제되었다.

이상의 결과는 염증성 장질환의 발생에 장에 존재하는 그람 음성 세균유래 세포밖 소포체가 중요하게 작용함을 의미한다.

실시예 3. CLP 패혈증 동물 모델의 복강액에서 분리한 장내 공생 세균인 대장균에서 유래하는 세포밖 소포체의 특성 분석

C57BL/6 (male, 6 주) 마우스 1마리의 맹장 끝부분에 18 gauge 주사기 바늘을 2번 찔러 CLP (ceacal ligation and puncture) 수술을 하였다. 40 시간 후에 PBS 3 ml을 5 ml 주사기를 이용하여 마우스 복강에 주사한 후, 잘 섞은 뒤 다시 복강으로부터 1 ml을 회수하여 그 중 10 μl를 LB (Luria Bertani) 용액 90 μl와 섞은 후 10,000배 희석하여 LB 아가 플레이트 (Agar plate)에 도말하여 37°C 인큐베이터 (incubator)에 8시간 배양하였다. 여러 개의 콜로니 (colonoy)중 한 개를 골라 5 ml LB 용액이 들어 있는 시험관에 넣고 37°C 인큐베이터에 8시간 배양한 후, 이 중 10 μl를 LB 용액 90 μl와 섞은 후 10,000 배 희석하여 LB 아가 플레이트에 도말 하여 37°C incubator에 8 시간 배양하였다. 위의 콜로니 픽킹 (picking)과정을 똑같이 한번 더 수행하여 결국 하나의 콜로니를 얻어 장내 대장균을 추출하였다.

도 6은 추출한 장내 대장균의 16S rRNA를 분석한 결과로, E. coli C4로 동정되었으며 이는 인간의 대변에서 관찰되는 공생 세균이다.

도 7 및 도 8은 각각 추출한 마우스 장내 대장균을 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)과 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 관찰한 결과로 그 표면 밖으로 30 nm 크기의 세포밖 소포체를 분비함을 알 수 있다.

장내 대장균을 3 ml LB 용액이 들어있는 시험관에 37°C, 4 시간 동안 배양한 후에 그 중 10 μl씩을 500 ml LB 용액이 들어 있는 2L 삼각 플라스크 8 개에 옮겨 37°C, 4 시간 동안 배양하였다. 배양액을 350 ml 용량 고속원심분리 튜브 12 개에 나눠 담은 후, 4°C, 5,000 x g에서 15 분 동안 연속으로 2 번 수행하였다. 4 L 가량의 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터 (membrane filter)를 1회 통과 시킨 후, 100 kDa 이하의 분자만 통과시킬 수 있는 퀵스탠드 시스템을 (Quixstand system) 사용하여 300 ml 양까지 농축하였다. 농축액을 0.22 μm의 구멍 크기를 가진 멤브레인 필터에 1회 통과 시킨 후, 50 ml 용량의 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 나눠 담은 후 4°C, 150,000 x g에서 3시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)를 하였다. 상층액은 버리고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 장내 대장균 유래 세포밖 소포체를 추출하였다.

도 9는 장내 대장균의 세포밖 소포체의 모양과 크기를 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 분석한 결과이다. 세포밖 소포체가 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 20-100 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.

도 10은 세포밖 소포체의 투과전자현미경 사진 10 장을 토대로 세포밖 소포체의 크기 별 분포를 나타낸 것이다. 20-40 nm 크기의 세포밖 소포체가 전체의 반을 차지하는 것을 알 수 있다.

실시예 4. 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 in vitro 염증성 매개체 분비

1 x 10⁵ 개의 마우스 대식세포 (RAW 264. 7)를 각각 24 well 플레이트에 씨딩 (seeding)한 후, 24 시간 후에 세포밖 소포체 (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/ml) 또는 페놀 (phenol)을 이용하여 장내 대장균으로부터 추출한 LPS (100, 200, 500, 1000, 2000 ng/ml)를 세포에 처리하여 37°C 인큐베이터에 배양하였다. 15 시간 후에 상층액을 거둔 후, 4°C, 500 x g에서 10 분 동안 원심분리 한 후, 4°C, 3000 x g에서 20분 동안 원심분리를 시행하였다. 분리된 상층액에 들어 있는 사이토카인의 양을 ELISA 방법을 통해 측정하였다.

도 11 및 도 12는 사이토카인의 양을 나타낸 결과로 세포밖 소포체의 양에 비례하여 염증성 매개체인 TNF-α (도 11 참조), IL-6 (도 12 참조)가 증가함을 알 수 있다. 또한, LPS를 단독으로 처리한 경우보다 훨씬 적은 양의 세포밖 소포체에 의해 상기의 염증성 매개체가 분비되는 것을 알 수 있다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 염증세포에 작용하여 아주 낮은 농도에서도 염증성 매개체 분비를 유도할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 5. 대장균유래 세포밖 소포체 국소 투여에 의한 점막 염증 및 IL -6 분비

C57BL/6 (female, 6주) 마우스 실험군과 대조군 각 5마리를 준비하고 실험군에 속한 마우스에 대장균유래 세포밖 소포체 1, 10, 100 ng을 비강으로 투여하였다. 투여 후 6 시간, 24 시간에 기도점막의 염증을 측정하였다. 케타민 (ketamine)과 자알라인 (xylazine)을 혼합한 마취액을 마우스 복강에 투여하여 마취한 후, 흉부를 절개하고 기관을 노출시켜 카테터를 기도에 삽입하고 결찰시켰다. PBS를 1 ml씩 2회 주입하고 기도를 세척하여 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage, BAL fluid)을 얻었다. 기관지폐포세척액을 4^oC에서 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 뒤, 세포 펠렛 (cell pellet)을 PBS 용액에 풀었다. 상기의 세포 펠렛을 광학현미경으로 관찰하여 세포 수를 세었다. 또한 기관지폐포세척액에서 Th17 면역반응을 유도하는 염증성 매개체인 IL-6를 ELISA 방법으로 측정하였다.

도 13은 대장균유래 세포밖 소포체를 비강 투여 후 6 시간과 24 시간에 기도점막의 염증을 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수로 나타낸 그림이다. 대장균유래 세포밖 소포체를 투여하기 전에 비하여 세포밖 소포체를 투여한 6시간 및 24시간에 기관지폐포세척액에 염증세포 수가 현저히 증가하였고, 이는 투여한 세포밖 소포체 농도와 관련이 있었다.

도 14는 기관지폐포세척액 내 IL-6의 양을 ELISA 방법으로 측정한 그림이다. 대장균유래 세포밖 소포체를 투여하기 전에 비하여 세포밖 소포체를 투여한 후 6시간에 기관지폐포세척액 내 IL-6의 양이 현저히 증가하였고, 이는 투여한 소포체의 농도와 관련이 있었다.

상기 결과로부터, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 국소적으로 작용하여 점막에 염증을 유도하고, 이는 Th17 면역반응을 특징으로 함을 알 수 있다.

실시예 6. 고용량의 대장균유래 세포밖 소포체 복강 투여에 의한 패혈증

실시예 3의 방법으로 분리한 세포밖 소포체를 C57BL/6 (male, 6주) 마우스 20마리에 각각 15, 25, 50 μg을 한 번 복강 주사하여 12 시간마다 죽은 마우스의 수를 확인하였다.

도 15는 세포밖 소포체에 의한 마우스 생존곡선을 나타낸 것이다. 25 μg의 이상의 세포밖 소포체 복강내 투여에 의해 95%의 마우스가 사망함을 알 수 있다.

세포밖 소포체가 패혈증을 유도하는지 평가하기 위해 실시예 3의 방법으로 분리한 마우스 장내 대장균 유래 세포밖 소포체 (5 μg)를 12 시간마다 3번 복강에 주사한 후, 패혈증 관련 지표를 분석하였다. 세포밖 소포체를 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 마우스의 심장에서 혈액을 채취한 후, 4°C, 3,500 x g에서 10 분간 원심분리한 뒤, 상층액인 혈청을 취하였다.

도 16은 혈청에서 패혈증 발생과 관련된 매개체의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과로 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-12, IFN-γ, IL-10, IL-17 등이 증가하였다.

또한, 패혈증의 특징인 전신성 염증반응 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS)을 호흡 수, 온도, 몸무게, 백혈구 수 등의 지표를 통해 평가하였다.

도 17은 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 24 시간마다 호흡수를 측정한 결과이다. 호흡수는 마우스를 챔버 (chamber)에 넣고 네블라이져 (nebulizer)를 사용하여 3분간 f (frequency of breathing)값을 통해 측정되었다. 그 결과 세포밖 소포체에 의해 SIRS의 지표 중 하나인 호흡수가 늘어나는 현상 (빈호흡)이 관찰되었다.

도 18은 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 8 시간마다 3 일 동안 체온을 측정한 결과이다. 체온은 직장체온계를 마우스의 항문에 주사하여 체온계의 디지털화면에 나온 수치를 기록하였다. 　그 결과 세포밖 소포체에 의해 전신성 염증반응의 지표인 체온이 감소하는 현상 (저체온증)이 관찰되었다.

도 19는 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 백혈구 수를 측정한 결과이다. 백혈구 수는 심장에서 혈액을 채취하여 이디티에이 (EDTA)가 들어있는 튜브에 담아 4°C에 보관한 후, 그 중 10 μl의 피를 90 μl의 1% 염산 (HCl)에 섞어 25°C, 6 분 동안 반응시키고, 그 반응액에 들어있는 백혈구 수를 헤마토사이토미터 (hematoctometer)를 통해 측정하였다. 그 결과 세포밖 소포체에 의해 전신성 염증반응의 지표인 혈액 내 백혈구 수가 감소되는 백혈구감소증 (leucopenia)이 관찰되었다.

도 20은 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 12 시간 후에 총 백혈구 수와 각각의 백혈구 수를 측정한 결과이다. 세포밖 소포체 주사 후 12시간 후에 심장에서 혈액을 체취하여 이디티에이가 들어 있는 튜브에 담아 4°C에 보관한 후, 혈액 10 μl를 슬라이드에 도말하고 디프퀵 (Diff Quick) 염색을 시행하여 광학현미경 1000배 시야에서 300개 이상의 염증 세포를 관찰하여 호염구, 림프구, 호중구, 호산구로 분류하여 각 염증 세포의 수를 측정하였다. 　그 결과, 총 백혈구 수가 감소하였고, 특히 림프구 수가 감소한 반면, 호중구 수는 오히려 증가하였다. 　

세포밖 소포체에 의한 중증 패혈증이 유도되는 지를 평가하기 위하여 혈압을 측정하였다.

도 21은 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 24 시간마다 혈압을 측정한 결과이다. 마우스를 플랫폼 (platform)에 올려놓은 후 꼬리의 혈압을 센서 (sensor)가 인식하여 컴퓨터 화면으로 출력된 혈압 수치를 분석하였다. 그 결과 세포밖 소포체에 의해 혈압이 현저하게 감소됨을 관찰하였다.

상기 결과로부터, 대장균과 같은 장내 공생 세균에서 유래하는 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되었을 때, 세포밖 소포체가 패혈증을 유도하는 중요한 원인인자임이 명백하다.

실시예 7. 고용량의 대장균유래 세포밖 소포체 복강 투여에 의한 혈액 응고

중증 패혈증 상황에서 관찰되는 혈액 응고 현상이 세포밖 소포체에 의해 유도되는지 분석하였다. 범발성혈관내혈액응고가 발생하면, 혈소판이 감소하고 D-diemr의 양이 증가된다.

도 22는 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 D-diemr의 양을 측정한 결과이다. 세포밖 소포체 복강에 주사한 후 6, 12, 24 시간 후에 심장에서 채혈하여 소디움 사이트레이트 (sodium citrate)가 들어있는 튜브에 넣어 4℃에 보관하였다. 혈액의 D-dimer양을 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 그 결과, 12 시간 후에 D-dimer의 양이 가장 많이 증가됨을 확인하였다.

또한, 혈소판 수를 측정하기 위해 세포밖 소포체를 복강에 주사한 후, 6, 12, 24 시간 후에 심장에서 채혈하여 이디티에이 튜브에 담아 4°C에 보관하였다. 혈액을 1% 암모늄 옥살레이트 (ammonium oxalate)에 1/200 희석한 후 10 분간 습윤판에 반응시킨 후, 헤마토사이토미터를 통해 혈소판 수를 측정하였다. 　

도 23은 범발성혈관내혈액응고의 지표인 혈소판 감소가 세포밖 소포체 투여 6시간 이후부터 나타남을 보여주는 결과이다.

상기 결과는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 흡수되었을 때, 범발성혈관내혈액응고가 발생되고, 이는 혈액응고의 원인인자로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 중요함을 의미한다.

실시예 8. 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 혈관 내피세포의 활성화 및 응고 증진 물질 ( procoagulant molecule ) 발현

장내 공생 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 혈관 내피세포의 활성화를 평가하기 위해 5 x 10⁵ 세포수를 가진　혈관 내피세포 (HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)를 6 well 플레이트에 씨딩 (seeding)한 후, 24 시간 후에 세포밖 소포체 (0.1, 1, 5, 10, 20 ng/ml)를 세포에 처리하여 37°C 인큐베이터에 배양하였다. 8 시간 후에 배양액을 제거 후 PBS로 1 회 씻어 낸 후 세포 lysis 용액을 처리하여 10 분 incubation후 4°C, 13,000 x rpm에서 10 분 동안 원심분리를 시행하여 세포 전체 단백질을 얻었다. 이를 5x 로딩 염색제(loading dye, 250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% glycerol)를 최종적으로 1x가 되도록 넣고, 100^oC에서 10 분간 처리하였다. 10% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 준비하고, 샘플을 로딩하였다. 100 V에서 2 시간 전기영동 한 후, 300 mA에서 2 시간 동안 단백질을 PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼(transfer)하였다. Skim milk를 PBS에 3%가 되도록 녹인 후, 멤브레인을 이 용액에서 2 시간 블로킹(blocking)하였다. ICAM-1과 베타-액틴 항체를 4^oC에서 12 시간 처리하였다. 0.05% Tween 20/PBS로 3 번 세척한 후, 각각 페록시다아제(peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. 0.05% Tween 20/PBS로 30 분 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Co.No.RPN2106) 기질(substrate)로 확인하여 세포밖 소포체를 처리한 경우 농도의존적으로 세포 전체 단백질 수준에서 베타-액틴 대비 ICAM-1이 증가함을 확인하였다. ICAM-1은 면역 세포 부착 단백질로 각종 면역 반응 발생 및 관상 동맥 질환 등과 같은 혈관 내피세포의 활성화 시 혈관 내피세포에서 증가하여 면역 세포의 조직 내로의 침윤을 유도함이 잘 알려져 있다.

도 24를 통해 세포밖 소포체에 의해 혈관 내피세포가 활성화되고 ICAM-1이 증가함을 확인하였다.

장내 공생 대장균유래 세포밖 소포체에 의해 혈액 응고 증진 물질이 유도되는지를 평가하기 위해 5 x 10⁵ 세포수를 가진　혈관 내피세포 (HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)를 6 well 플레이트에 씨딩 (seeding)한 후, 24시간 후에 세포밖 소포체 (1 ng/ml)를 세포에 처리하여 37°C 인큐베이터에 배양하였다. 12 시간 후 상층액을 거둔 후, 4°C, 500 x g에서 10 분 동안 원심분리 한 후, 4°C, 3000 x g에서 20 분 동안 원심분리를 시행하였다. 분리된 상층액에 들어 있는 혈액 응고 증진 물질인 tissue factor를 측정하기 위해 ELISA 플레이트에 상층액을 100 μl 넣고 4°C에서 12 시간 동안 코팅한 후, tissue factor 항체를 실온에서 2 시간 처리하였다. 0.05% Tween 20/PBS로 3 회 세척 후 페록시다아제(peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 실온에서 1 시간 처리하였다. 0.05% Tween 20/PBS로 30 분 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Co.No.RPN2106) 기질(substrate)로 확인하여 도 25와 같이 세포밖 소포체를 처리한 경우 혈액 응고 증진 물질인 tissue factor의 분비가 현저히 증가함을 확인하였다.

실시예 9. 고용량의 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 폐염증 및 폐기종

장내 대장균 유래 세포밖 소포체 (10 μg)를 시아닌-7 (cyanin-7, cy7)으로 염색한 후, 마우스의 복강에 주사하였다. 6 시간 후, 마우스 몸 전체를 분석할 수 있는 코닥 이미지 스테이션 (Kodak image station)을 사용하여 장내 대장균 유래 세포밖 소포체의 위치를 확인하였다. 　

도 26은 마우스 형광사진으로 세포밖 소포체가 몸 전체에 퍼져 있고 폐에도 존재함을 알 수 있다.

장내 대장균 유래 세포밖 소포체 (10, 20 μg)를 DiO로 염색한 후, 마우스의 복강에 주사하고 6 시간 후에 혈액과 폐를 추출하였다.

도 27은 이 혈액과 폐로부터 RBC (red blood cell) lysis buffer를 이용하여 적혈구를 제거한 후, 유세포분리기 (FACS)를 통해 세포밖 소포체를 포함한 혈액세포과 폐 조직세포의 비율을 분석한 결과이다. 그 결과 형광을 띈 세포의 비율이 증가하였다. 이는 도 26의 결과처럼 세포밖 소포체가 폐를 포함한 몸 전체에 퍼지는데 있어서 세포밖 소포체가 세포에 흡수되어 몸 주위에 퍼짐을 의미한다.

폐 염증반응을 분석하기 위해 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 마우스의 폐를 적출하여 무게를 잰 후, 65^oC 인큐베이터에서 48 시간 동안 방치한 후, 변화된 폐의 무게와의 비율 (wet-to-dry ratio) 분석을 통해 폐염증을 평가하였다.

도 28은 폐염증의 지표인 wet-to-dry ratio를 나타낸 그림으로써, 세포밖 소포체 복강 투여 시 6 시간 이후에 폐염증이 발생함을 보여준다.

또한, 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 마우스의 기관지폐포세척액를 취하여 염증세포 수를 측정하였다. 케타민 (ketamin)을 포함한 마취액을 마우스 복강에 투여하여 마취한 후, 흉부를 절개하고 기관을 노출시켜 카테터를 기도에 삽입하고 결찰시켰다. PBS를 1 ml씩 2 회 주사하고 기도를 세척하여 기관지폐포세척액를 얻었다. 기관지폐포세척액를 4°C, 3000 rpm으로 10 분간 원심분리한 뒤,　침전된 세포를 PBS에 풀어 세포수를 측정하였다. 광학현미경을 사용하여　총 염증 세포 수를 측정한 후, 침전된 세포를 사이토스핀 (cytospin)하여 슬라이드에 도말하고 디프퀵 염색을 시행하여 광학현미경 1000 배 시야에서　300 개 이상의 염증 세포를 관찰하여 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구로 분류하여 각 염증 세포 수를 측정하였다.

도 29는 기관지폐포세척액 내 염증세포 수를 나타낸 그래프로서 세포밖 소포체에 의해 염증세포 수가 증가하고, 특히 대식세포 수가 현저하게 증가됨을 알 수 있다.

세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 폐를 적출하여 4% 포름알데히드 (formaldehyde)에 넣어 고정 (fixing)시킨 후, 절편을 만들어 헤마토실린-이오신　(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 이미지를 도 30에 나타내었다. 세포밖 소포체에 의해 폐포가 현저히 파괴된 소견이 관찰되었다. 이는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 폐염증과 함께 폐기종이 발생함을 의미한다.

상기 결과는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 혈관을 통해 여러 장기에 분포하여 염증과 함께 조직손상을 유도하는 결과로서, 원인인자가 불분명한 염증질환의 원인인자로 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 중요함을 의미한다.

실시예 10. 장기간 저용량의 대장균유래 세포밖 소포체 복강 투여에 의한 고혈압 및 골다공증 유도

저용량의 장내 대장균 유래 세포밖 소포체에 반복 노출에 의해 만성 질환이 유도될 수 있는지 평가하기 위해 세포밖 소포체 (0.1, 1 μg)을 1 주일에 2 번씩 18 주 동안 복강에 주입 하였다.

도 31은 저용량의 장내 대장균 유래 세포밖 소포체에 반복 노출되었을 때의 혈압의 변화를 나타낸 그림으로, 세포밖 소포체에 의하여 고혈압이 발생함을 보여준다.

저용량의 장내 대장균 유래 세포밖 소포체에 반복 노출되었을 때 골다공증이 발생하는 지를 평가하기 위해 세포밖 소포체 (1 μg)을 1 주일에 2 번씩 18 주 동안 복강 주입 한 후에, 쥐의 다리에서　장골 (long bone)을　얻었다. 하루 동안 고정액에 고정 시킨 후, 고정액에 있던 뼈를 식염수를 두 번 씻은 뒤에 30, 50, 70, 90, 100% 에탄올에 1 시간씩 순차적으로 담궈 탈수하였다. 탈수 과정을 거친 뼈는 프로필렌옥사이드 (propylene oxide)라는 치환제에 1 시간씩 두번 담궈 폴리머와의 치환을 준비하였다. 치환제와 폴리머의 비율은 3:1, 1:1, 1:3으로 점차 늘려 폴리머와의 치환을 진행하였다. 마지막으로 남아있는 치환제는 후드에서 공기중으로 날린뒤에 폴리머만으로 구성된 용액에 뼈를 담근 뒤에 65^oC 오븐에서 하루 동안 중합과정을 진행하였다. 뼈 샘플의 엑스레이 토모그래피 이미지는 모두 포항 가속기 7B2 빔라인 (7B2 beamline at Pohang Light Source, PLS)의 방사광엑스레이현미경 (Synchroton radiation X-ray microscopy)을 통해 획득하였다. 폴리머 내장 (polymer embedding)된 뼈를 방사광 엑스레이 현미경의 샘플 스테이지에 올린 뒤에 180^o 회전을 통해 모두 1200 장의 이미지를 얻었다. 샘플 스테이지와 신틸레이터 (scintillator)와의 거리는 10 cm로 방사광 엑스 페이현미경의 흡수 효과 (absorption contrast effect)를 주로 이용하여 이미지를 얻었다. 얻은 이미지는 Octopus와 Amira 프로그램을 통해 3차원 이미지 구축 (3D reconstruction)하였으며 1200 장 중에서 대표적인 절단면의 이미지 (tomographic slice image)의 비교를 수행하였다.

도 32는 장기간 저용량의 세포박 소포체에 의해 뼈의 연결 구성이 깨지는 것을 특징으로 하는 골다공증이 발생한 것을 보여준다.

상기 결과는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 장기간 반복적으로 혈관에 흡수되어 전신적으로 분포하였을 때, 고혈압, 골다공증 등의 만성질환을 유도할 수 있음을 의미한다.

실시예 11. 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증 및 폐기종의 발생에 대한 IL -6의 역할

실시예 3의 방법으로 분리한 마우스 장내 대장균 유래 세포밖 소포체 (25 μg)를 각각 정상 마우스 (C57BL/6, male 6주)와 IL-6 결핍 (knock out) 마우스(C57BL/6, male, 6주)에 한번 복강 주사하여 12 시간 마다 죽은 마우스의 수를 확인하고 생존률을 도 33에 나타내었다. IL-6 결핍 마우스에서는 정상 마우스와는 달리 25 μg의 세포밖 소포체에 의해 사망이 유도되지 않았다.

세포밖 소포체 (5 μg)을 12 시간 동안 3 번씩 주사 후 6, 12, 24 시간 후에 폐를 적출하여 실시예 9의 방법으로 폐의 병리소견을 분석하였다. 도 34는 폐 절편의 사진으로 정상 마우스와 달리 IL-6 결핍 마우스에서 세포밖 소포체에 의해 폐 조직세포가 전혀 파괴되지 않음을 알 수 있다.

상기 결과는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증의 발생뿐만 아니라 여러 장기에 발생하는 염증질환에 IL-6가 중요한 매개체임을 의미한다.

실시예 12. 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병에 대한 예방 또는 치료 후보 약물 in vitro 스크리닝 시스템 확립

상기 실시예들을 바탕으로 마우스 장내 공생세균 유래 세포밖 소포체에 의해 유도되는 염증성 사이토카인이 각종 질병에 크게 관여함을 확인하였으며, 이를 바탕으로 염증성 매개체, 특히 IL-6의 분비를 억제할 수 있는 물질을 발굴하는 것이 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병에 대한 예방 또는 치료 후보 약물을 선별하는데 중요함을 의미한다.

도 35는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 IL-6의 분비를 억제하는 물질을 발굴하기 위한 모식도로 실시예 3의 방법으로 분리한 장내 공생 세균인 대장균 유래 세포밖 소포체 (100 ng/ml)를 단독으로 또는 약물후보 물질(10 μM)들과 함께 실시예 4와 같이 준비한 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 처리한 후 37°C 인큐베이터에 15 시간 배양하였다. 15 시간 후에 상층액을 거둔 후, 4°C, 500 x g에서 10 분 동안 원심분리 한 후, 4°C, 3000 x g에서 20 분 동안 원심분리를 시행하였다. 분리된 상층액에 들어 있는 IL-6의 양을 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 이는 in vitro에서 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 유도되는 IL-6의 분비를 억제하는 후보물질을 스크리닝하는 방법을 확립한 것으로 이를 통해 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병에 대한 예방 또는 치료 후보 약물을 제공할 수 있다.

실시예 13. In vitro 스크리닝 시스템에서 발굴한 키나제억제제의 in vitro 항염증 효과

실시예 12의 방법에 따라 마우스 대식세포(RAW 264.7)에 배양액만을 처리한 군 (음성 대조군), 장내 대장균 유래 세포밖 소포체 (0.1 ㎍/ml)만을 배양액에 섞어 처리한 군 (양성 대조군) 그리고 80종의 키나제 억제제 ((kinase inhibitor library, BIOMOL No.2832: PD-98059, U-0126, SB-203580, H-7, H-9, AG-494, AG-825, Lavendustin A, RG-14620, Tytphostin 23, Tytphostin 25, Tytphostin46, Tytphostin47, Tytphostin 51, Tytphostin 1, Tytphostin 9, Tytphostin AG 1288, Tytphostin AG 1478, Tytphostin AG 1295, HNMPA, Damnacanthal, Piceatannol, AG-490, AG-126, AG-370, AG-879, LY 294002, Wortmannin, GF 109203X, Hypericin, Sphingosine, H-89, H-8, HA-1004, HA-1077, HDBA, KN-62, KN-93, ML-7, ML-9, 2-Aminopurine, N9-Isopropyl-olomoucine, Olomoucine, iso-olomoucine, Roscovitine, LFM-A13, SB-202190, ZM 336372, SU 4312, AG-1296, Rottlerin, Genistein, Daiazein, Erbstatin analog, Quercetin dehydrate, SU 1498, ZM 449829, DRB (5,6-Dichloro-1-b-D-ribofuranosylbenzimidazole), HBDDE (2,2',3,3',4,4'-Hexahydroxy-1,1'-biphenyl-6,6'-dimethanol dimethyl ether), Indirubin, Indirubin-3'-monoxime, Y-27632, Kenpaullone, Terreic acid, BML-257, BML-259, Apigenin, BML-265 (Erlotinib analog), Rapamycin) 각각을 10 μM농도로 상기에 기술한 것과 동일한 양의 세포밖 소포체와 함께 배양액에 섞어 처리한 군으로 실험을 진행했다. 처리 15 시간 후에 배양액에서 IL-6의 양을 샌드위치 ELISA 방법으로 측정하였다.

각 키나제 억제제를 처리한 경우에 측정한 IL-6의 양을, 양성 대조군에서 측정한 IL-6의 양과 비교한 백분율을 도 36에 표시하였다.

그 결과, 80여 종의 키나제 억제제 중 11 가지 물질 (4; H-7, 29; LY294002, 31; GF109203X, 42; ML-7, 43; ML-9, 64; ZM449829, 66; DRB (5,6-Dichloro-1-b-D-ribofuranosylbenzimidazole), 70; Indirubin-3'monoxime. 72; Kenpaullone, 77; BML-259, 78; Apigenin)이 IL-6의 양을 양성 대조군 대비 50% 미만으로 감소시킴을 확인할 수 있다.

도 37은 상기의 키나제 억제제 중 Damnacanthal, LY294002, GF109203X를 단독 또는 두 가지 이상 조합으로 (이 때 처리한 각 drug의 농도는 10 mm을 유지함) 세포밖 소포체 (100 ng/ml)와 동시에 처리하는 경우 세포 배양액 내 IL-6의 양을 측정한 결과로 두 가지 이상을 동시에 처리 시 IL-6 분비 억제 효과가 현저하게 증대됨을 확인하였다.

실시예 14. In vitro 스크리닝 시스템에서 발굴한 포스파타제억제제의 in vitro 항염증 효과 　

도 38은 실시예 13의 방법으로 30종의 phosphatase inhibitor (phosphatase inhibitor library, BIOMOL No.2834: Cantharidic acid, Cantharidin. Endothall, Benzylphosphonic acid, L-p-Bromotetramisole oxalate, RK-682, RWJ-60475, RWJ-60475 (AM)3, Levamisole HCl, Tetramisole HCl, Cypermethrin, Deltamethrin, Fenvalerate, Tyrphostin 8, CinnGEL, CinnGEL 2 Me, BN-82002, Shikonin, NSC-663284, Cyclosporin A, Pentamidine, BVT-948, B4-Rhodanine, BML-268, Dioxophenanthrene, BML-260, PD-144795, BML-267, BML-267 Ester, OBA, OBA Ester, Gossypol, Alendronate)를 처리하여 IL-6의 양을 양성 대조군 대비 50% 미만으로 감소시키는 약물 후보 물질을 검색하여 PD-144795를 발굴한 결과이다.

도 39는 PD-144795를 0.1, 1, 5, 10 μM 농도로 포함하고 장내 대장균 유래 세포밖 소포체가 100 ng/ml 농도로 포함된 배양액을 준비하여 실시예 13의 방법과 같이 마우스 유래 대식세포에 처리하여 농도 의존적으로 IL-6 분비가 억제됨을 확인한 결과이다.

실시예 15. In vitro 스크리닝 시스템에서 발굴한 프로드러그의 in vitro 항염증 효과

도 40은 실시예 13의 방법으로 100 종의 프로드러그 (acetaminophen, acetylcysteine, allopurinol, alprenolol HCl, amitriptyline HCl, atropine, bretylium tosylate, bromopheniramine, budesonide, buspirone HCl, cefuroxime, chloral hydrate, chlorpromazine HCl, cimetidine, clomipramine HCl, clotrimazole, cyclobenzaprine, desipramine HCl, diclofenac, diflunisal, diltiazem, diphenhydramine HCl, disopyramine, disulfiram, D-mannitol, doxepin, doxycycline hydrate, doxylamine succinate, edrophonium chloride, enalapril maleate, famotidine, fenbufen, fenofibrate, fenoprofen calcium salt hydrate, flunarizine dihydrochloride, fluphenazine dichloride, flurbiprofen, furosemide, gemfibrozil, gliclazide, glipizide, haloperidol, hydrochlorothiazide, hydroflumethiazide, hydroxyzine HCl, ibuprofen, imipramine HCl, indapamide, indole-2-carboxylic acid, indomethacin, ipratropium, ketoprofen, ketorolac tris salt, maprotiline HCl, meclofenamic acid, melatonin, metformin, methapyrilene HCl, methimazole, methocarbamol, metoclopramide HCl, metronidazole, nabumetone, naproxen, neostigmine Br, niacin, nicardipine HCl, nifedipine, nitrofurantoin, nizatidine, norethindrone, nortriptyline, orphenadrine HCl, oxybutynin, phenformin HCl, phenylbutazone, phenytoin, piroxicam, prednisone, probenecid, propranolol HCl, pyridostigmine Br, ranitidine HCl, spironolactone , sulfameth, sulpiride, tenoxicam, terfenadine, theophylline, ticlopidine HCl, tolazamide, tolazoline, tolbutamide, tolfenamic acid, tramadol HCl, tranylcypromine, trazodone HCl, triamterene, trichlormethiazide, tripelennamine HCl, verapamil, warfarin) 를 처리하여 IL-6의 양을 양성 대조군 대비 80% 미만으로 감소시키는 후보 물질 14 종 (10; Amitriptyline, 39; Cyclobenzaprine, 41; Desipramine, 54; Doxepin, 72; Fluphenazine dichloride, 82; Haloperidol, 89; Imipramine, 101; Maprotiline, 132; Orphenadrine, 165; Terfenadine, 173; Tolfenamic acid, 179; Trazodone, 187; Trichlormethiazide, 188; Verapamil)을 발굴한 결과이다. . 　

도 41은 상기 in vitro 스크리닝 시스템을 통해 발굴한 14 종의 프로드러그를 마우스 복강 유래 대식세포에 ex vivo로 처리하여 IL-6 감소 효과를 보인 11 종의 프로드러그 (10; Amitriptyline, 39; Cyclobenzaprine, 41; Desipramine, 54; Doxepin, 72; Fluphenazine dichloride, 82; Haloperidol, 89; Imipramine, 101; Maprotiline, 132; Orphenadrine, 165; Terfenadine, 173; Tolfenamic acid, 179; Trazodone HCl)를 확인한 결과이다.

실시예 16. In vitro 스크리닝 시스템에서 발굴한 프로드러그의 in vivo 항염증 효과

실시예 15에서 발굴한 프로드러그가 체내에서 항염증효과를 나타내는 지를 평가하였다. 이를 위하여, 실시예 6과 같이 장내 대장균 유래 세포밖 소포체를 C57BL/6마우스 (male, 6 주, 그룹당 4마리)에 복강으로 5 μg 주사하여 패혈증을 유도한 마우스 모델에서 상기 발굴한 프로드러그 중에서 Haloperidol과 Doxepein을 각각 10 mg/kg의 용량으로 복강 주사하여 6시간 후 혈청을 얻었다.

도 42는 혈청에서 IL-6의 양을 ELISA 방법을 통해 정량한 결과로 장내 대장균 유래 세포밖 소포체에 의한 염증성 매개체인 IL-6의 분비가 혈액 내에서 in vitro 스크리닝 시스템을 통해 발굴한 Haloperidol과 Doxepein 투여에 의해 효율적으로 억제됨을 보여주는 결과이다. 　

상기 결과로부터, 실시예 12에서 기술한 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 in vitro 약물 스크리닝 시스템이 매우 효율적인 방법이고, 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체에 의해 유도되는 각종 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 약물을 효율적으로 선별할 수 있음이 명백하다.

실시예 17. 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 면역학적 특성

실시예 3의 방법에 따라 분리한 대장균유래 세포밖 소포체 1 mg 를 일주일 간격으로 3 주 동안 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 10마리)의 복강에 주입하였다. 매 주입 6 시간, 24 시간, 7 일 후 마우스 혈액을 얻어 혈액 내 존재하는 세포밖 소포체 특이적인 항체를 측정하였다. 대장균 유래 소포체 200 ng이 코딩된 검정색 96 웰 플레이트에 1% BSA/PBS로 1:500 희석된 마우스 혈청을 넣어 상온에서 두 시간 배양한 후, peroxidase가 결합된 마우스 항체를 통해 관찰하였다.

도 43은 마우스 혈액 내 대장균유래 세포밖 소포체 특이적인 항체 양을 시간에 따라 관찰한 결과이다. 세포밖 소포체 특이 항체는 1회 세포밖 소포체 투여 7 일 이후부터 형성되기 시작하며, 두 번째와 세 번째 세포밖 소포체 투여 후에 더욱 많은 항체가 형성되어 세 번째 소포체 백신 접종 완료 7 일 후에 가장 높은 항체 형성 정도를 보였다.

상기의 방법으로 세 번의 대장균유래 세포밖 소포체 접종이 완료된 7 일 후 마우스에서 비장세포를 분리하였다. 분리된 비장세포 (2 x 10⁴)에 대장균 유래 세포밖 소포체 100 ng을 넣어 72 시간 동안 배양 한 후, 비장세포가 분비하는 면역 반응 관련 사이토카인인 IFN-g, IL-17, IL-4의 양을 각각 ELISA 방법으로 측정하였다.

도 44는 마우스 비장세포에 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IFN-g 양을 나타낸 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포에서 IFN-g 의 분비가 증가하였다.

도 45는 마우스 비장세포에 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-17 양을 나타낸 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포에서 IL-17의 분비가 증가하였다.

도 46은 마우스 비장세포에 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-4 양을 나타낸 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체 접종은 비장세포의 IL-4의 분비에는 영향이 없었다.

상기 결과로부터, 대장균유래 세포밖 소포체 접종시 세균 감염에 대한 방어기전인 B 세포에서 생성되는 항체 반응과 T 세포 면역반응이 유도됨을 확인하였다. 특히, T 세포 면역반응은 세균감염에 대한 방어에 중요한, IFN-g 를 분비하는 Th1 면역반응과 IL-17을 분비하는 Th17 면역반응이 대장균유래 세포밖 소포체 접종에 의해 효율적으로 유도되었다.

실시예 18. 대장균 감염에 의한 패혈증 발생에 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능

대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 평가하기 위하여 대장균 감염에 의한 패혈증 동물모델을 확립하였다. 대장균 1 x 10⁶, 1 x 10⁸, 1 x 10¹⁰ CFU를 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 10마리)의 복강으로 주입하여 5 일 동안 8 시간 간격으로 마우스 생존율을 관찰하였다.

도 47은 대장균 감염에 의한 마우스 치사율을 나타난 결과이다. 즉, 대장균 1 x 10¹⁰ CFU 주입 시 마우스가 24 시간 안에 사망하였고, 대장균 1 x 10⁶, 1 x 10⁸ CFU 주입한 경우 마우스의 생존에는 영향이 없었다.

실시예 17의 방법에 따라 대장균유래 세포밖 소포체 0.5, 1 μg을 일주일 간격으로 3주 동안 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 10마리)의 복강에 주입하였다. 세 번의 대장균유래 세포밖 소포체 접종이 완료된 7일 후, 대장균 1 x 10¹⁰ CFU를 복강으로 주입하여 5 일 동안 8 시간 간격으로 마우스 생존율을 관찰하였다.

도 48은 도 47에서 확립된 대장균 감염에 의한 패혈증 발생에 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 관찰한 결과이다. 5일 후 대장균유래 세포밖 소포체가 접종되지 않은 마우스의 생존율 20%에 비해 대장균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스 그룹의 생존율을 80 ― 100 % 였다.

도 48의 방법에 따라, 대장균유래 세포밖 소포체 1 μg를 일주일 간격으로 세 번 복강으로 접종 한 후, 대장균 1 x 10¹⁰ CFU를 마우스 복강으로 주입하여 6 시간 후에, 복수와 혈액에 감염된 대장균 개수를 측정하여 도 49에 나타내었다. 또한, 혈청 내 IL-6 양을 ELISA로 측정하여 도 50, 폐 조직 이미지를 도 51에 나타내었다.

도 49는 대장균유래 세포밖 소포체 접종 시 감염된 대장균 CFU의 변화를 나타난 결과이다. 대장균 감염 시, 대장균유래 세포밖 소포체가 접종되지 않은 마우스에서 얻은 혈액과 복수에 비해 소포체가 접종된 마우스의 혈액 및 복수에서 대장균의 수가 현저히 감소되었다.

도 50은 대장균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스에 대장균 1 x 10⁸ CFU을 감염 6 시간 후, 혈청 내 존재하는 IL-6 양을 측정한 결과이다. 대장균이 감염된 마우스 혈청 내 염증성 사이토카인인 IL-6의 양이 현저히 증가하나, 대장균유래 세포밖 소포체로 예방 접종한 마우스의 혈청 내 IL-6의 양은 급격히 감소하였다.

도 51은 대장균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스에 대장균을 감염 6 시간 후, 마우스에서 폐를 추출하여 폐 조직 상태를 확인한 결과이다. 대장균 감염 시, 폐 조직 세포가 많이 파괴 되는 현상이 관찰되나, 대장균유래 세포밖 소포체로 예방 접종한 그룹의 폐 병리 조직은 정상 마우스와 유사한 형태를 보였다.

상기 결과는 장내 공생 세균인 대장균에서 유래하는 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 대장균에 의한 감염 및 병리를 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.

실시예 19. 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증 발생에 대한 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능

실시예 17의 방법에 따라 대장균유래 세포밖 소포체 1 μg을 일주일 간격으로 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5 마리)의 복강으로 주입 한 후, 실시예 6의 방법에 따라 확립된 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증 발생에 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 관찰하였다. 대장균유래 세포밖 소포체 예방 접종이 완료된 7 일 후, 대장균유래 세포밖 소포체 5 μg을 12 시간 간격으로 세 번 복강으로 주입하여 패혈증 관련 지표를 분석하였다.

도 52 내지 도 54는 실시예 6에서 확립된 대장균유래 세포밖 소포체의 의한 패혈증 발생에 있어서의 대장균유래 세포밖 소포체 백신 효능을 관찰한 결과이다.

도 52는 대장균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스에 대장균유래 세포밖 소포체 (5 μg, 세 번) 주입 6 시간 후, 마우스 혈액을 채취하여 혈청 내 사이토카인인 IFN-g 를 측정한 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에 비해 대장균유래 세포밖 소포체를 접종한 그룹의 혈청 내 IL-6 양은 현저히 감소하였다.

도 53은 패혈증과 관련된 전신성 염증반응 중에서 온도를 측정한 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체 5 μg, 세 번 주입으로 저체온증이 유도되나, 미리 대장균유래 세포밖 소포체 1 μg을 일주일 간격으로 세 번 접종을 하면 정상 마우스와 비슷한 체온을 유지하였다.

도 54는 중증 패혈증 상황에서 관찰되는 혈소판 감소 현상을 관찰한 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체 5 μg, 세 번 주입으로 혈소판 수가 감소하나, 미리 대장균유래 세포밖 소포체 1 μg을 일주일 간격으로 세 번 접종을 하면 혈소판 감소 정도가 줄어 들었다.

상기 결과는 장내 공생 세균인 대장균에서 유래하는 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 대장균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.

실시예 20. 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 백신의 면역학적 특성

실시예 3의 방법으로 분리한 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 100 ng, 1 mg 를 5 일 간격으로 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5마리)의 복강에 주입하였다. 마지막 접종 3 일 후 마우스 혈액을 채취하여 혈액 내 존재하는 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 특이적인 항체를 확인하여 도 55에 나타내었고, 비장을 채취한 후 비장 내 T 세포를 분리하여 사이토카인인 IFN-g, IL-17를 측정한 결과를 도 56에 나타내었다.

도 55는 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 채취한 혈액 내에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 특이적인 항체가 존재함을 보여주는 결과이다. 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체의 농도에 비례하여 소포체 특이 항체가 형성되었다.

도 56은 비장에서 채취한 T 세포에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 처리시 CD3⁺CD4⁺IFN-g⁺ T 세포를 나타낸 결과이다. 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에 비해 세포밖 소포체를 접종한 그룹에서 CD3⁺CD4⁺IFN-g⁺ T 세포가 증가하였다.

도 57는 비장에서 채취한 T 세포에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 처리시 CD3⁺CD4⁺IL17⁺ T 세포를 나타낸 결과이다. 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에 비해 세포밖 소포체를 접종한 그룹에서 CD3⁺CD4⁺IL17⁺ T 세포가 증가하였다.

도 55 내지 도 57에 나타난 바와 같이 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 접종시 세균 감염에 대한 방어기전인 B 세포에서 생성되는 항체 반응과 T 세포 면역반응이 유도되었다. 특히, T 세포 면역반응 중에서 세균감염에 대한 방어에 중요한, IFN-g 를 분비하는 Th1 면역반응과 IL-17을 분비하는 Th17 면역반응이 소포체 백신에 의해 효율적으로 유도되었다.

실시예 21. 클렙시엘라균 감염에 의한 패혈증 발생에 대한 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능

클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 평가하기 위하여 클렙시엘라균 감염에 의한 패혈증 동물모델을 확립하였다. 클렙시엘라균 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸ CFU를 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5마리)의 복강으로 주입하여 5 일 동안 8 시간 간격으로 마우스 생존율을 관찰하였다.

도 58은 클렙시엘라균 감염에 의한 마우스 치사율을 나타난 결과이다. 즉, 클렙시엘라균 1 x 10⁸ CFU 주입 시 마우스가 24 시간 안에 사망하였고, 대장균 1 x 10⁶, 1 x 10⁷ CFU 주입한 경우 마우스의 생존에는 영향이 없었다.

클렙시엘라균 감염에 대한 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체의 효능을 평가하기 위하여, 세포밖 소포체 1 μg을 5 일 간격으로 세 번 C57BL/6 (male, 6주, 그룹당 5마리)의 복강에 주입하였다. 세 번의 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 접종이 완료된 3일 후, 클렙시엘라균 1 x 10⁸ CFU를 복강으로 주입하여 5 일 동안 8 시간 간격으로 마우스 생존율을 관찰하였다.

도 59는 상기의 방법에서 확립된 클렙시엘라균 감염에 의한 패혈증 발생에 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 관찰한 결과이다. 클렙시엘라균 감염 5 일 후 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체가 접종되지 않은 마우스의 생존율 40%에 비해 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스 그룹의 생존율을 100 % 였다.

상기 결과는 장내 공생 세균인 클렙시엘라균에서 유래하는 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.

실시예 22. 대장균 및 클렙시엘라균 유래 세포밖 소포체 백신의 병합 투여시 면역학적 특성

실시예 3의 방법에 따라 분리한 대장균유래 세포밖 소포체, 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 1 mg, 대장균 및 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 각 1 mg을 5 일 간격으로 두 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5마리)의 복강에 주입하였다. 세포밖 소포체 접종 3 일 후 혈액을 채취한 후, 세포밖 소포체가 코팅된 검정색 96 웰 플레이트에 1:500으로 희석된 혈청을 넣어 상온에서 두 시간 배양하였다.

도 60은 대장균유래 세포밖 소포체 특이적인 항체 형성을 나타낸 결과이다. 대장균과 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 병합 투여 시 대장균유래 세포밖 소포체 특이 항체 형성이 대장균유래 세포밖 소포체 단독 투여에 비하여 증가되었다.

도 61은 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 특이적인 항체 형성을 나타낸 결과이다. 대장균과 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체를 병합 투여 시 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 특이 항체 형성이 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체 단독 투여에 비하여 증가되었다.

상기 결과는 장내 공생 세균인 대장균과 클렙시엘라균에서 유래하는 세포밖 소포체를 혼합하여 백신으로 미리 투여하였을 때, 대장균 및 클렙시엘라균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병뿐만 아니라 대장균 및 클렙시엘라균에 의한 감염을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.

실시예 23. 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체의 유전물질 염기서열 분석

C57BL/6 (6주, male)과 BALB/c (6주, male) 마우스의 대변을 채취하여 세포밖 소포체를 분리한 후, 각각 10 μg의 세포밖 소포체에 전체 8 μl의 부피가 되도록 3차 증류수를 추가하였다. 각 소포체에 2 μl의 random decamer (Ambion, 5722G)를 첨가한 후, 95°C에서 10 분, 75°C에서 10 분 배양한 후, 4°C에 보관하였다. Random decamer를 처리한 각 샘플에 AMV 역전사효소 (Promega, M510F) 3 μl, AMV 역전사효소 퍼버 (Promega, M515A) 4 μl, 10 mM dNTP 2 μl, RNase 억제제 (Promega, N211B) 1 μl를 처리한 후, 10 분간 25°C에서 반응시킨 후, 2 시간 동안 37°C에서 반응시켰다. AMV 역전사효소를 처리한 각 20 μl의 샘플 중 1 μ l를 이용하여 16S rRNA gene을 PCR으로 확인하였다. PCR를 위해 샘플 1 μl에 Taq 효소 (NEB, M0273S) 0.5 μl, Taq 효소 버퍼 (NEB, B9014S) 2 μl, 10 mM dNTP 1 μl, 10 pM bacterial universal forward primer 1 μl (5'aaggcgacgatccctagctg-3', 10 pM bacterial universal reverse primer 1 μl (5'ttgagcccggggatttcaca-3', 3차 증류수 13.5 μl를 넣어 혼합하였다. 혼합물을 95°C에서 2 분 반응시킨 후, 95°C에서 30초, 55°C에서 30 초, 72°C에서 45 초 반응시키는 과정을 45 회 반복하였다. 마지막으로 72°C에서 5 분 반응시킨 후 솔젠트㈜ (대전광역시 유성구 화암동 63-10) 에 의뢰하여 PCR 결과물을 시퀀싱하였고, C57BL/6을 대상으로 한 도 62의 결과 및 BALB/c를 대상으로 한 도 63의 결과를 얻었다.

도 62 및 도 63에 나타난 바와 같이, 100~120번째, 150-190번째 핵산 부분에서 다중 peak이 나타나는 것으로 보아 여러 가지 세균에서 유래한 16S rRNA가 섞여있음을 알 수 있다. 이를 통해 다수의 세균에서 유래한 세포밖 소포체가 대변 유래 세포밖 소포체에 존재함을 확인할 수 있다. NCBI 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) 에서 얻은 세균의 16S rRNA 염기서열과 다중 peak을 고려한 시퀀싱 결과를 비교해본 결과 도 1의 대변에 서식하는 대표적인 세균 10종 중에서 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae의 존재 가능성이 확인되었다.

장내 대장균 유래 세포밖 소포체에 16S rRNA 유전물질이 존재하는 것을 확인 하기 위해 세포밖 소포체 10 μg에 대해 위에 서술한 방법으로 RT-PCR를 수행하였다. Negative control은 3차 증류수를 사용하였으며 positive control로는 장내 대장균을 O.D. 값 1.0까지 배양한 후 1 μl를 사용하였다. RT-PCR 결과물 20 μl에 5X Green GoTaq Flexi Buffer (Promega, M891A) 5 μl를 섞은 후, 그 중 5 μl를 2% agarose gel에 loading 하였다. 100 V로 30 분 gel running 하고, gel을 10 분간 0.005% EtBr용액에 담구어둔 후 자외선에 노출시킨 상태에서 사진을 찍었다.

그 결과 도 64와 같이 positive control과 동일한 band를 결과로 얻었고, 이를 통해 장내 대장균 유래 세포밖 소포체에 16S rRNA 유전자 또는 그에 유래한 RNA transcript가 존재하고 있음을 알 수 있다.

실시예 24. 조직 및 체액에서 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체 단백질 확인

장내 공생 세균유래 세포밖 소포체를 C57BL/6 (6 주, male, 그룹당 3마리) 마우스에 25 μg 복강 주사하고 6 시간 후 마우스 장기 및 체액을 적출하여 세포밖 소포체 단백질 존재 여부를 세포밖 소포체에 대한 항체를 이용하여 ELISA 방법으로 확인하였다. 마우스 장기는 적출 후 액체 질소가 있는 상태로 막자 사발에서 간 후, RIPA 용액 (50 mM Tris (pH 7.5), 1% NP- 40, 0.25% Na-Deoxycholate, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, protease inhibitor)을 넣고 lysis시켜 4°C에서 13,000 rpm, 10 분 원심분리하여 단백질을 얻었으며 체액은 상기 실시예 5, 6과 동일한 방법으로 얻었다.

도 65는 복강으로 주사 한 세포밖 소포체가 각종 장기 및 복강 세척액 (peritoneal fluid; PF), 소변, 혈액에 존재함을 보여주는 결과이다. 이는 세포밖 소포체에 의한 염증성 질환을 소변 및 혈액 등 채취가 용이한 체액을 얻어 진단할 수 있음을 시사하는 결과이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (142)

1. 장내 공생 세균 유래의 세포밖 소포체를 포함하는 면역원성 조성물로서,
   상기 장내 공생 세균은 클렙시엘라균(Klebsiella spp.)이고,
   상기 세포밖 소포체는 포유동물의 대변, 대장액, 위액 및 소장액으로 구성된 군으로부터 선택된 것에서 분리한 것임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 대장균(Escherichia coli) 유래의 세포밖 소포체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
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5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포밖 소포체는 자연적 또는 인공적으로 분비되는 세포밖 소포체를 분리한 것인, 면역원성 조성물.
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32. 시험관내에서(in vitro) 장내 공생 세균 유래의 세포밖 소포체를 이용한 염증 예방 또는 치료에 대한 후보 약물의 탐색 방법으로서,
    상기 장내 공생 세균은, 클렙시엘라균(Klebsiella spp.)이고,
    상기 세포밖 소포체는, 포유동물의 대변, 대장액, 위액 및 소장액으로 구성된 군으로부터 선택된 것에서 분리한 것이고,
    상기 탐색 방법은, 상기 세포밖 소포체와 후보 물질을 함께 세포에 처리한 후, 염증 관련 매개체의 수준을 측정하는 단계 또는 염증 관련 신호전달과정을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 탐색 방법.
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45. 제 32 항에 있어서, 상기 장내 공생 세균은 대장균(Escherichia coli)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 탐색 방법.
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60. 장내 공생 세균 유래의 세포밖 소포체를 포함하는, 패혈증 예방 또는 치료용 백신으로서,
    상기 장내 공생 세균은, 클렙시엘라균(Klebsiella spp.)이고,
    상기 세포밖 소포체는, 포유동물의 대변, 대장액, 위액 및 소장액으로 구성된 군으로부터 선택된 것에서 분리한 것임을 특징으로 하는, 백신.
61. 제 60 항에 있어서, 상기 백신은 대장균(Escherichia coli) 유래의 세포밖 소포체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신.
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71. 제 60항에 있어서,
    상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용하는 것인, 백신.
    
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116. 제 32 항 또는 제 45 항의 탐색 방법에 의하여 선별된 물질을 포함하는, 염증 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서,
     상기 물질은 키나제 억제제(kinase inhibitor), 포스파타제 억제제(phosphatase inhibitor), 또는 프로드러그이고,
     상기 키나제 억제제는 H-7, LY294002, GF109203X, ML-7, ML-9, ZM449829, DRB(5,6-Dichloro-1-b-D-ribofuranosylbenzimidazole), Indirubin-3'-monoxime, Kenpaullone, BML-259, 또는 Apigenin이고,
     상기 포스파타제 억제제는 PD-144795이고,
     상기 프로드러그는 Haloperidol 또는 Doxepein인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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126. 장내 공생 세균 유래 세포밖 소포체를 응용한, 염증의 원인인자 진단을 위한 정보제공 방법으로서,
     상기 장내 공생 세균은, 클렙시엘라균(Klebsiella spp.)이고,
     상기 세포밖 소포체는, 포유동물의 대변, 대장액, 위액 및 소장액으로 구성된 군으로부터 선택된 것에서 분리한 것이고,
     상기 응용은 상기 세포밖 소포체에 포함된 16S rRNA의 염기서열을 분석하거나 또는 단백질을 측정하는 것임을 특징으로 하는, 진단을 위한 정보제공 방법.
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129. 제 126 항에 있어서, 상기 장내 공생 세균은 대장균(Escherichia coli)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단을 위한 정보제공 방법.
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