KR101421779B1 - 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아시네토박터 속 (genus Acinetobacter) 세균에서 유래한 세포밖 소포체를 이용한 질병 동물 모델에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용하여 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 약물을 효율적으로 탐색하는 방법, 및 아시네토박터 속 세균에 의한 감염 또는 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 백신에 관한 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 응용하여 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병의 원인인자를 진단하는 기술 개발 등이 가능하다.
Description
본 발명은 아시네토박터 속 세균에서 유래한 세포밖 소포체를 이용한 질병 동물 모델, 후보약물 탐색방법, 및 백신 등에 관한 것이다.
중환자실에 입원해 있는 중증 질병 환자는 감염에 매우 취약하다. 중환자실에 있는 장비 및 환자는 일반 건강한 사람에게는 무해하고 여러 항생제에 내성을 갖는 기회감염성 미생물을 보유하고 있다. 이러한 기회감염성 미생물의 대표적인 세균이 그람 음성균에 속하는 아시네토박터 속 세균이다. 현재까지 아시네토박터 속 세균에는 17개의 종 (species)이 알려져 있고, 이중 원내감염 (hospital-acquired infection)과 관련해서 가장 흔한 원인균이 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) 균이다.
1960년대에 전자현미경을 통해 그람 음성균이 세포밖 소포체[extracellular vesicles (EV), 또는 outer membrane vesicles (OMV)]를 분비한다는 사실이 밝혀졌다. 세포밖 소포체는 구형이고 인지질 이중층으로 되어있으며 그 크기가 20-200nm이다. 그람 음성균유래 세포밖 소포체는 LPS 뿐만 아니라 여러 가지 외막 단백질(outer membrane protein)을 가지고 있다. 최근 노인인구와 면역억제제, 항암제 등의 사용 증가로 인해 세균감염에 대한 방어가 약화되면서 패혈증의 유병률이 전세계적으로 증가하고 있다. 패혈증은 세균, 곰팡이 등의 국소 감염에 따른 합병증으로 전신전인 염증반응이 유도되는 질환이다. 감염 시 국소적으로 병원균에서 분비되는 물질이 혈관으로 유입되거나, 또는 혈관으로 유입된 병원균에서 분비되는 물질이 혈관 내 염증세포를 활성화시켜 전신성 염증반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome)이 발생하고, 동시에 혈관내피세포를 활성화시켜 범발성혈관내혈액응고 (disseminated intravascular coagulation), 혈전(thrombosis) 등이 발생하고, 병원균유래 물질이 폐 등과 같은 중요 장기에 분포하여 염증과 이에 따른 조직손상을 일으켜서, 발병자의 30% 이상이 사망에 이르게 된다. 전신성염증반응증후군이 병원균에 의해 발생한 경우로 패혈증을 정의하지만, 반 이상의 패혈증 환자에서 혈액 내 병원균을 검출할 수 없다. 이는 패혈증을 일으키는데 세균이 직접 혈액 내로 유입되는 것이 필수사항이 아님을 의미하며, 세균 등에서 유래하는 물질이 혈액 내로 유입되어 패혈증이 발생할 수 있다. 중증 패혈증으로 사망한 환자의 혈액에서 수막염구균유래 소포체가 존재한다는 보고가 있었고, 최근 본 발명자들은 장내 공생세균에서 유래하는 세포밖 소포체가 혈액으로 흡수되었을 때 패혈증을 유도함을 발견하였다. 그러나, 아직까지 아시네토박터 속 세균이 세포밖 소포체를 분비하고, 소포체가 체내에 들어갔을 때 어떠한 질병을 일으키는지에 대해선 알려져 있지 않은 상태이다.
인체에 발생하는 질병의 진단, 예방, 및 치료기술을 개발하기 위해서는 인체 질병을 모사하는 적절한 동물 모델을 구축하는 것이 중요하다. 패혈증 동물 모델을 만들기 위해서 현재까지 아래의 세가지 방법이 사용되었다. 첫째, LPS(lipopolysaccharide)를 실험 동물의 복강 내로 주사하여 패혈증 모델을 만들 수 있다. 둘째, 세균을 복강 내로 주사하여 패혈증 모델을 만들 수 있다. 셋째, 맹장을 결찰한 후 천자 (cecal ligation and puncture, CLP)하여 패혈증 모델을 만들 수 있다. 그러나, 이러한 패혈증 동물 모델은 재현성, 실험자간의 오차, 또는 사람에게 일어나는 패혈증의 표현형을 제대로 나타내지 못하는 단점이 있다. 따라서, 패혈증에 대한 진단, 예방, 및 치료기술을 개발하기 위해서는 실험자간의 오차가 적고, 재현성이 높으며, 사람에서 발생하는 패혈증의 표현형을 제대로 반영하는 동물 모델 개발이 필요하다.
염증성 매개체 (특히, IL-6)가 혈액내에 증가되는 것은 패혈증의 전형적인 지표이다. 세균에 의해 분비되는 염증성 매개체를 측정하여 세균성 감염에 대한 치료 후보 물질의 효과를 평가한 예가 알려져 있다 (국제특허공개 WO2009/030093 Functions and uses of human protein phosphatase 1 inhibitor-2). 그러나 체외에서 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 세포에 투여하여 염증성 매개체 분비를 조절하는 후보 약물 탐색 방법, 및 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 패혈증 동물 모델에서 후보 약물을 체내에 투여하여 염증성 매개체 분비를 조절하는 후보 약물 탐색 방법은 알려지지 않았다.
수십년 전부터 세균에서 분비되는 외독소(exotoxin) 단백질을 응용한 백신이 개발되어 사용되고 있다. 그람 양성 세균에 대한 백신은 세포벽 성분 (capsular polysaccharide)에 대한 백신이 개발되었으나, T 세포에 무관하게 항체가 형성된다는 단점이 있었다. 또한, 이를 개선하기 위하여 세포벽 성분에 단백질을 접합(conjugation)한 형태의 백신이 개발되었으나, 이러한 형태의 백신 또한 특정 세균의 아형에만 특이적으로 작용하는 한계가 있었다. 그람 음성 세균에 대한 백신은 현재까지 임상에서 사용한 사례가 없고, 최근 그람 음성 세균인 수막염구균에 대한 백신으로써 세균에 세제 (detergent)를 처리해 얻은 인공 소포체를 통해 백신을 개발한 사례가 있다. 또한 살모넬라균유래 소포체가 숙주의 선천면역 및 후천면역 반응을 향상시켜 백신으로서의 효능을 검증한 연구가 있다 (R. C. Alaniz et al., Membrane vesicles are immunogenic facsimiles of Salmonella typhimurium that potently activate dendritic cells, prime B and T cell responses, and stimulate protective immunity in vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692-701). 그러나 아직까지 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병 및 아시네토박터 속 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 백신은 보고되지 않았다.
본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 질병 동물 모델을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용하여 질병예방/치료에 대한 후보약물의 탐색방법 및 질병예방/치료용 백신 등을 제공하고자 한다. 이에 더하여, 본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용하여 질환의 원인인자를 진단하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 제조된 질병 모델을 제공한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 주니 (Acinetobacter junii), 아시네토박터 존스니 (Acinetobacter johnsonii), 아시네토박터 리워피 (Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 라디오레시스텐스 (Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 우르신지 (Acinetobacter ursingii), 아시네토박터 쉰들러리 (Acinetobacter schindleri), 아시네토박터 파르부스 (Acinetobacter parvus), 아시네토박터 베이리 (Acinetobacter baylyi), 아시네토박터 보우베티 (Acinetobacter bouvetii), 아시네토박터 토우너리 (Acinetobacter towneri), 아시네토박터 탄도이 (Acinetobacter tandoii), 아시네토박터 그리몬티 (Acinetobacter grimontii), 아시네토박터 셰른버지아 (Acinetobacter tjernbergiae), 및 아시네토박터 게르너리(Acinetobacter gerneri) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 아시네토박터 속 세균 배양액에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 자연적으로 분비되는 것 및 인공적으로 분비되는 것을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 동물은 마우스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 투여는 복강 투여, 정맥 투여, 구강 투여, 항문 투여, 비강 투여, 기도 투여 등을 포함한다.
상기 본 발명의 질병은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염, 부비동염, 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 및 뇌질환 등을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 질병 예방 또는 치료에 대한 후보 약물의 탐색 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 아시네토박터 속 세균, 세포밖 소포체, 및 질병은 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 세포에 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포는 염증세포, 상피세포, 혈관내피세포, 줄기세포 등을 포함한다. 또한 상기 염증세포는 단핵구, 호중구, 호산구, 호염구, 단핵구가 조직에서 분화된 세포 등을 포함하며, 상기 줄기세포는 골수조직 또는 지방조직에서 유래한 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후, 염증 관련 매개체의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 염증 관련 매개체는 인터루킨(Interleukin, IL)-6 를 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후, 염증 관련 신호전달과정을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하여 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 포함하는, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병 예방 또는 치료용 백신을 제공한다. 상기 본 발명의 아시네토박터 속 세균, 세포밖 소포체, 질병 등은 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것, 세균에 화합물을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있으며, 상기 변형은 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용하거나 면역보강제를 병용투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은, 아시네토박터 속 세균에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 포함하는 백신을 제공한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아시네토박터 속 세균에 의한 감염은 상처감염, 패혈증, 폐렴, 요로감염, 골관절 및 중추신경계 감염 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 아시네토박터 속 세균은 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것, 세균에 화합물을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있으며, 상기 변형은 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용하거나 면역보강제를 병용투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 치사량 미만으로 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 아시네토박터 속 세균 및 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 아시네토박터 속 세균에 의한 감염 혹은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생 또는 악화되는 질병을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 감염은 상처감염, 패혈증, 폐렴, 요로감염, 골관절 및 중추신경계 감염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 질병은 패혈증, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐렴, 비염, 부비동염, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 투여는 피하주사, 정맥주사, 비강투여, 설하투여, 기도흡입, 경구복용, 항문투여, 피부투여, 점막투여 등을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것, 세균에 화합물을 처리하는 것, 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 투여는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하거나 면역보강제를 병용투여할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 탐색 방법에 의하여 선별된 물질을 포함하는, 질병 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 응용하여 질병의 원인인자를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 아시네토박터 속 세균은 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 패혈증, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염, 부비동염, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 응용은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 포함된 유전물질의 염기서열을 분석하는 것일 수 있으며, 상기 유전물질은 16S rRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 응용은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 포함된 단백질을 측정하거나 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 대한 면역반응을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역반응 측정은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 대한 항체를 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 진단은 혈액, 가래, 소변, 콧물, 기관지폐포세척액, 뇌척수액, 관절액, 흉수, 또는 복수 등에서 유래한 시료을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii)에서 유래한 세포밖 소포체가 기도에 염증을 특징으로 하는 국소질환뿐만 아니라 혈액에 흡수되어 전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증과 같은 전신질환을 유발한다는 발견을 통해 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 질병모델, 질병을 예방 또는 치료하는 후보 약물 탐색기술, 및 상기 세포밖 소포체를 응용한 질병 예방 혹은 치료용 백신기술을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서 아시네토박터 속 세균에서 유래하는 세포밖 소포체를 분리하여 이를 세포에 투여하였을 때 염증성 매개체가 분비되고, 국소적으로 투여하였을 때 점막에 염증이 발생하고, 복강으로 투여하였을 때, 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되어 전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증과 함께 혈액응고, 폐기종, 고혈압, 골다공증 등의 질병이 발생한다는 사실을 이용하여 질병 동물 모델 및 후보 약물을 효율적으로 선별하는 탐색 방법을 제공할 수 있다. 또한, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 탐색 방법으로 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질환을 예방 혹은 치료할 수 있는 약물을 효율적으로 발굴할 수 있다. 아울러, 본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체 자체 혹은 이를 변형하여 투여하여 면역반응을 조절함으로써 아시네토박터 속 세균에 의한 감염 혹은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방 및/또는 치료하는 백신 개발에 이용될 수 있을 것이며, 나아가 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 응용하여 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병의 원인인자를 진단하는 기술 개발이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균 배양액에서 분리한 세포밖 소포체의 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균 배양액에서 분리한 세포밖 소포체의 dynamic light scattering (DLS) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균과 세균 유래 세포밖 소포체의 단백질 패턴 분석을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 RAW 264.7 대식세포주에 농도 의존적으로 15시간 동안 처리한 뒤 세포배양액에서 염증성 매개체 TNF-α의 발현을 ELISA 방법으로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 Raw 264.7 대식세포주에 농도 의존적으로 15시간 동안 처리한 뒤 세포배양액에서 염증성 매개체 IL-6 의 발현을 ELISA 방법으로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 마우스 비강에 각각 10, 100, 1000 ng을 투여하여 기관지폐포세척액내 염증세포 세포수 (BAL cells)측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 마우스 비강에 각각 10, 100, 1000 ng을 투여하여 IL-6의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 C57BL/6 (male, 6주) 마우스에 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 0.1, 1, 10, 25 μg을 각각 한 번 복강 주사한 후 12 시간 마다 마우스의 생존률을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 1, 5 μg을 12시간씩 3번 주사 후 12시간 간격으로 체온을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 1, 5 μg을 12 시간씩 3 번 주사 후 0, 6, 12, 24 시간 후에 백혈구 수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 0.1, 1, 10 μg을 1주일 간격으로 3회 복강 투여한 후, 72시간 후에 마우스 혈액 내에 소포체 특이 항체의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IFN-γ 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-17 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-4 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-10 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 유래 세포밖 소포체 (EV)를 접종한 마우스에 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 유래 세포밖 소포체 (25 μg)를 복강 투여한 후 3일동안 생존률을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 유래 세포밖 소포체 (EV)를 접종한 마우스에 아시네토 바우마니 (A. baumannii) 균주 (6 x 108) 를 복강 투여한 후 45시간 동안 생존률을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균 배양액에서 분리한 세포밖 소포체의 dynamic light scattering (DLS) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균과 세균 유래 세포밖 소포체의 단백질 패턴 분석을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 RAW 264.7 대식세포주에 농도 의존적으로 15시간 동안 처리한 뒤 세포배양액에서 염증성 매개체 TNF-α의 발현을 ELISA 방법으로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 Raw 264.7 대식세포주에 농도 의존적으로 15시간 동안 처리한 뒤 세포배양액에서 염증성 매개체 IL-6 의 발현을 ELISA 방법으로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 마우스 비강에 각각 10, 100, 1000 ng을 투여하여 기관지폐포세척액내 염증세포 세포수 (BAL cells)측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV)를 마우스 비강에 각각 10, 100, 1000 ng을 투여하여 IL-6의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 C57BL/6 (male, 6주) 마우스에 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 0.1, 1, 10, 25 μg을 각각 한 번 복강 주사한 후 12 시간 마다 마우스의 생존률을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 1, 5 μg을 12시간씩 3번 주사 후 12시간 간격으로 체온을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 1, 5 μg을 12 시간씩 3 번 주사 후 0, 6, 12, 24 시간 후에 백혈구 수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 0.1, 1, 10 μg을 1주일 간격으로 3회 복강 투여한 후, 72시간 후에 마우스 혈액 내에 소포체 특이 항체의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IFN-γ 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-17 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-4 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 (EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-10 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 유래 세포밖 소포체 (EV)를 접종한 마우스에 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 유래 세포밖 소포체 (25 μg)를 복강 투여한 후 3일동안 생존률을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 유래 세포밖 소포체 (EV)를 접종한 마우스에 아시네토 바우마니 (A. baumannii) 균주 (6 x 108) 를 복강 투여한 후 45시간 동안 생존률을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법 등을 제공한다.
본 발명에서 "아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체" 란 아시네토박터 속 세균이 주변환경, 체내, 혹은 배양액에서 자연적으로 분비하거나 혹은 인공적으로 수득한, 또는 세균이 체내에 흡수되어 숙주세포가 분비하는 소포체를 포함하며, 크기가 원래의 세포보다 작은 것을 특징으로 하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체가 점막에 염증을 유도하고, 특히 암의 병인에 중요한 호중구성 염증을 특징으로 하는 Th17 (type 17 helper T cell) 면역반응을 유도한다는 사실을 처음으로 밝혀냈고, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 국소적으로 투여하여 상기의 국소 질환에 대한 질병 모델을 개발하였다.
전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증의 병인과 관련해서 세균에서 유래하는 물질이 혈관으로 흡수되어 이를 일으킨다고 알려져 있으나, 원인물질의 실체에 대해선 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은 처음으로 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되었을 때, 혈중에서 염증성 매개체 분비를 통한 전신적인 염증반응을 특징으로 하는 패혈증, 혈관내혈액응고, 폐기종 등의 질병이 발생함을 밝혀냈다. 이는 패혈증의 발생뿐만 아니라 혈관내 혈액응고에 의한 혈전형성을 특징으로 하는 급성관상동맥증후군, 뇌졸증 등의 혈관질환, 폐기종, 급성호흡부전증후군 등의 폐질환의 발생에 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체가 중요한 원인인자임을 의미하고, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 전신적으로 투여하여 상기의 전신질환에 대한 질병 모델을 개발하였다.
한편, 감염 이후에 관절염이 발생한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 비만, 당뇨 등의 대사질환과 세균과의 관련성이 최근 주목을 받고 있다. 본 발명자들은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 저용량으로 장기간 전신적으로 투여하여 고혈압, 골다공증 등의 질병이 발생함을 밝혀냈다. 이는 원인인자가 불분명한 만성질환의 원인물질로써 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체가 중요하고, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용하여 상기 질병 모델의 개발을 가능하게 한다.
질병을 예방 또는 치료하는 약물을 개발하기 위해서 정확한 원인물질을 파악하는 것은 매우 중요하다. 예를 들어, 원인물질을 체외에서 세포에 투여하는 과정에서 후보 약물을 처리하여 효능을 검증할 수 있고, 상기에 기술한 동물모델에 후보 약물을 투여하여 효능을 검증할 수 있다. 본 발명자들은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 예방 또는 치료하는 약물을 개발하기 위하여 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 후보 약물을 선별하는 탐색 방법을 확립하여, 이를 통해 약물을 발굴하였다. 이는 본 발명에서 개발한 후보 약물 탐색 방법을 통해 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 매우 효과적으로 발굴할 수 있음을 의미한다.
질병의 원인인자를 정확히 파악하는 것은 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 백신 개발에 필수적이다. 바이러스성 감염질환인 경우에 원인 바이러스를 약독화한 형태로 체내로 투여함으로써 바이러스에 대한 면역반응을 유도하여 예방 백신을 개발하여 사용되고 있고, 현재 바이러스에 의해 발생하는 질환을 예방 백신으로 효율적으로 예방할 수 있게 되었다. 본 발명자들은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 체내에 투여하여 소포체에 대한 면역반응을 유도함으로써 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 밝혀냈다. 이는 패혈증, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환 등의 질병의 발생에 대하여, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체와 관련성이 있는 질병에 대한 백신으로 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체 자체를 사용하거나, 또는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 소포체를 변형 투여하거나 약물 혹은 면역보강제를 병용 투여함으로써 효율적으로 상기 질병을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다.
세균에서 분비되는 외독소에 의한 질병을 예방하기 위하여 외독소 단백질을 이용한 예방 백신은 수십년전에 개발되어 사용되고 있다. 그러나 아직까지 세균 자체에 대한 효과적인 백신은 개발되지 않았다. 세균 자체에 대한 예방 백신의 예로, 그람 양성 세균인 경우 세포벽 성분을 이용한 백신이 개발되었으나 T 세포에 비의존적으로 항체가 생성되고, 세균의 아형에만 특이적으로 작용하는 항체만 생성되어 효능에 한계가 있었다. T 세포에 의존적인 항체 생성을 위해 세포벽 성분에 단백질을 접합한 형태의 백신이 개발되었으나, 가격이 비싸고, 세균의 아형에만 작용하는 단점이 있다. 세균유래 소포체를 백신으로 사용하는 경우 소포체가 세균에서 유래하는 여러 종류의 단백질을 함유하고 있으므로 세균의 아형에 특이적인 면역반응을 유도하는 기존 세균 백신의 단점을 극복할 수 있고, 세균에 대한 항체 형성뿐만 아니라 T 세포반응을 유도하는 면역보강제가 같이 있어 효율적으로 면역반응을 유도할 수 있는 장점이 있다. 본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 투여하여 세균 단백질에 대한 항체 형성뿐만 아니라 세균에 대한 방어에 중요한 T 세포 면역반응인 Th1 및 Th17 면역반응을 효율적으로 유도함으로써 아시네토박터 속 세균에 의한 감염을 효율적으로 예방할 수 있음을 밝혀냈다. 이는 아시네토박터 속 세균에 의한 상처감염, 패혈증, 폐렴, 요로감염, 골관절 및 중추신경계 감염 등에 대한 백신으로 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체 자체를 사용하거나, 또는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 소포체를 변형 투여하거나 약물 혹은 면역보강제를 병용 투여함으로써 효율적으로 상기 감염을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미한다.
아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체가 천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐암, 비염, 부비동염, 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 뇌질환 등의 질환의 원인물질이라는 사실은 원인물질이 불분명한 상기 질환의 원인을 정확히 진단하는데 매우 중요하다. 본 발명자들은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체의 유전물질에 대한 염기서열을 분석하였고, 단백질을 동정하였으며, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 대한 특이 항체가 형성됨을 밝힘으로써 상기 질병의 원인인자을 정확히 진단하는 방법을 개발하였다.
또한, 본 발명은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 이용한 탐색 방법에 의하여 선별된 물질을 포함하는, 질병 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제 등을 사용할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여방법에는 제한이 없으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
) 세균 배양액에서
세포밖
소포체 분리 및 구조 분석
아시네토박터 바우마니 (A. baumannii) 세포밖 소포체를 분리하기 위해 아시네토박터 바우마니 균주를 액체 영양배지 7.2 L에 흡광도 1.0 까지 37°C 에서 배양한 후 이 배양액을 4°C, 10,000 x g에서 20 분 간 원심분리한 다음, 상층액을 취하여 0.45 mm 구멍 크기를 가진 필터에 통과시켰다. 이렇게 박테리아가 제거된 통과액은 100 kDa 분자량 이하의 단백질을 제거할 수 있는 막 (membrane)을 장착한 퀵스탠드 시스템 (QuixStand Benchtop System)을 사용하여 70 ml로 약 30 배 농축하였다. 상기 농축액을 재차 4°C, 100,000 x g 에서 3 시간 원심분리하여 침전물을 얻은 후 이를 PBS (phosphate buffered saline) 로 희석 하였다. 이렇게 얻은 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 전자 현미경을 통하여 가시적 확인을 하였고, DLS (Dynamic Light Scattering) 를 통하여 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체의 정성적 크기 분석을 하였다.
구체적으로, 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 50 μg/ml 농도로 JEM 1011 electromicroscopy (Jeol, Japan) 전자 현미경으로 관찰하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 확인 할 수 있었다.
또한, DLS를 찍기 위하여 5 μg/ml의 농도로 zetasizer nano ZS (Malverk, UK)를 통하여 세포밖 소포체의 크기를 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 DLS 결과에 나타난 바와 같이, 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체의 크기가 10~100 nm 임을 알 수 있다.
실시예
2.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
) 세균 배양액에서 분리한
세포밖
소포체의 단백질 분석
실시예 1의 방법으로 얻은 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포밖 소포체의 프로테옴 분석을 위해 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포용해물을 먼저 추출하였다. 아시네토박터 바우마니 균주를 액체 영양배지 10ml에 흡광도 1.0 까지 37°C에서 배양한 후 이 배양액을 4°C, 10,000 g에서 20 분 간 원심분리한 후 얻어진 침전박테리아를 비퍼(b-per)용액 을 이용하여 세포막을 파괴하고, 초고주파를 이용하여 한번 더 박테리아를 완전히 파괴하였다. 박테리아 파괴용액을 10,000 g에서 다시 20분간 원심분리한 후 상층액을 따로 모아 세포용해물을 얻었다. 이렇게 얻어진 세포용해물과 세포밖 소포체를 브레드포드(Bradford)정량법을 이용하여 정량 한 후 똑같은 용량(10μg)을 SDS-PAGE(10% resolving gel)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 이렇게 분리된 SDS-gel을 CBB 염색 용액에 8시간 염색한 후 4시간 동안 탈염색용액에 다시 담구어 탈염색한 다음 단백질 패턴을 분석하였다.
실시예 1의 방법으로 얻은 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포밖 소포체의 단백질 분석을 위해 아시네토박터 바우마니(A. baumannii) 세포용해물을 먼저 추출하였다. 아시네토박터 바우마니 균주를 액체 영양배지 10ml에 흡광도 1.0까지 37°C에서 배양한후 이 배양액을 4°C, 10,000 x g에서 20 분 간 원심분리한 후 얻어진 침전박테리아를 비퍼(b-per)용액을 이용하여 세포막 파괴후 소니케이트 시스템을 이용하여 한번더 박테리아를 완전히 파괴하였다. 박테리아 파괴용액을 10,000 x g에서 다시 20분간 원심분리한 후 상층액을 따로 모아 세포용해물을 얻었다. 이렇게 얻어진 세포용해물과 세포밖 소포체를 브레드포드(Bradford)정량법을 이용하여 정량 한 후 똑같은 용량(10μg)을 SDS-PAGE(10% resolving gel)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 이렇게 분리된 SDS-gel을 CBB 염색 용액에 8시간 염색한 후 4시간 동안 탈염색용액에 다시 담구어 탈염색후 단백질 패턴을 분석하였다.
도 3은 아시네토박터 바우마니 균주와 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체의 단백질 패턴 분석 결과이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 세포용해물(WCL)의 단백질 패턴과 비교하였을 때 아시네코박터 세포밖 소포체(EV)의 단백질 패턴이 특정 부분(64KDa~36KDa)에 좀 더 집중되게 나타난 것을 알 수 있다. 또한, 단백질의 종류 역시 다양하게 나타나는 세포용해물과 달리 아시네토박터 세포밖 소포체의 경우, 그 단백질의 종류는 더 적지만 더 많은 양으로 집중되어 발현되는 것으로 나타났다.
실시예
3.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
) 세균 배양액에서 분리한
세포밖
소포체에 의한
in
vitro
염증성 매개체 분비
1 x 105 개의 마우스 대식세포 (Raw 264.7)를 각각 24 well 플레이트에 씨딩 (seeding)한 후, 24 시간 후에 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/ml) 를 세포에 처리하여 37°C 인큐베이터에 배양하였다. 15 시간 후에 상층액을 거둔 후, 4°C, 500 x g에서 10 분 동안 원심분리하고, 다시 4°C, 3000 x g에서 20분 동안 원심분리를 시행하였다. 분리된 상층액에 들어 있는 사이토카인의 양을 ELISA 방법을 통해 측정하였다.
도 4 및 도 5는 사이토카인의 양을 나타낸 결과로 세포밖 소포체의 양에 비례하여 염증성 매개체인 TNF-α (도 4 참조), 및 IL-6 (도 5 참조)가 증가함을 알 수 있다. 이는 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체가 염증세포에 작용하여 아주 낮은 농도에서도 염증성 매개체 분비를 유도할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예
4.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
)
세균유래
세포밖
소포체 국소 투여에 의한 기도점막 염증 및
IL
-6 분비
C57BL/6 (female, 6 주) 마우스 실험군과 대조군 각 5마리를 준비하고 실험군에 속한 마우스에 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 10, 100, 1000 ng을 비강으로 투여하였다. 투여 후 24 시간에 기도점막의 염증을 측정하였다. 케타민 (ketamine)과 자알라인 (xylazine)을 혼합한 마취액을 마우스 복강에 투여하여 마취한 후, 흉부를 절개하고 기관을 노출시켜 카테터를 기도에 삽입하고 결찰시켰다. PBS를 1 ml씩 2회 주입하고 기도를 세척하여 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage, BAL fluid)을 얻었다. 기관지폐포세척액을 4oC에서 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 뒤, 침전된 세포 (cell pellet) 를 PBS 용액에 풀었다. 상기의 세포 펠렛을 광학현미경으로 관찰하여 세포 수를 세었다. 또한 기관지폐포세척액에서 Th17 면역반응을 유도하는 염증성 매개체인 IL-6를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 6은 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 비강 투여 후 24 시간에 기도점막의 염증을 기관지폐포세척액 내 염증세포(BAL cells)의 수로 나타낸 그림이다. 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 투여하기 전에 비하여 세포밖 소포체를 투여한 24시간에 기관지폐포세척액에 염증세포 수가 현저히 증가하였고, 이는 투여한 세포밖 소포체 농도와 관련이 있었다.
도 7은 기관지폐포세척액 내 IL-6의 양을 ELISA 방법으로 측정한 그림이다. 아시네토박터 바우마니유래 세포밖 소포체를 투여하기 전에 비하여 세포밖 소포체를 투여한 후 24 시간에 기관지폐포세척액 내 IL-6의 양이 현저히 증가하였고, 이는 투여한 소포체의 농도와 관련이 있었다.
상기 결과는 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체가 국소적으로 작용하여 점막에 염증을 유도하고, 이는 Th17 면역반응을 유도 할 수 있음을 시사한다.
실시예
5. 고용량의
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
)
세균유래
세포밖
소포체 복강 투여에 의한 패혈증
실시예 1의 방법으로 분리한 세포밖 소포체를 C57BL/6 (male, 6주) 마우스 5 마리에 각각 0.1, 1, 10, 25 μg을 한 번 복강 주사하여 12 시간 마다 사망하는 마우스의 수를 확인하였다.
도 8은 세포밖 소포체에 의한 마우스 생존곡선을 나타낸 것이다. 25 μg의 세포밖 소포체 복강내 투여에 의해 80%의 마우스가 사망함을 알 수 있다.
세포밖 소포체가 패혈증을 유도하는지 평가하기 위해 실시예 1의 방법으로 분리한 마우스 장내 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 (1, 5 μg)를 12 시간마다 3번 복강에 주사한 후, 패혈증 관련 지표를 분석하였다. 또한, 패혈증의 특징인 전신성 염증반응 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS)을 온도, 백혈구 수 등의 지표를 통해 평가하였다.
도 9는 세포밖 소포체 (1, 5 μg)를 주사 후 12 시간마다 3 일 동안 체온을 측정한 결과이다. 체온은 직장체온계를 마우스의 항문에 주사하여 체온계의 디지털화면에 나온 수치를 기록하였다. 그 결과 세포밖 소포체에 의해 전신성 염증반응의 지표인 체온이 감소하는 현상 (저체온증)이 관찰되었다.
도 10은 세포밖 소포체 (5 μg)를 주사 후 0, 6, 12, 24 시간 후에 백혈구 수를 측정한 결과이다. 백혈구 수는 심장에서 혈액을 채취하여 이디티에이 (EDTA)가 들어있는 튜브에 담아 4°C에 보관한 후, 그 중 10 μl의 피를 90 μl의 1% 염산 (HCl)에 섞어 25°C, 6 분 동안 반응시키고, 그 반응액에 들어있는 백혈구 수를 헤마토사이토미터 (hematoctometer)를 통해 측정하였다. 그 결과 세포밖 소포체에 의해 전신성 염증반응의 지표인 혈액 내 백혈구 수가 감소되는 백혈구감소증 (leucopenia)이 관찰되었다.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 세균에서 유래하는 세포밖 소포체가 혈관으로 유입되었을 때, 세포밖 소포체가 패혈증을 유도함이 명백하다.
실시예
6.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
)
세균유래
세포밖
소포체 백신의 면역학적 효과
실시예 1의 방법에 따라 분리한 아시네토박터 바우마니유래 세포밖 소포체 0.1, 1, 10 μg 를 일주일 간격으로 3 주 동안 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5마리)의 복강에 주입하였다. 마지막 주입 72 시간 후 마우스 혈액을 얻어 혈액 내 존재하는 IgG1 항체와 세포밖 소포체 특이적인 항체를 측정하였다. 아시네토박터 바우마니 유래 소포체 100 ng이 코딩된 검정색 96 웰 플레이트에 1% BSA/PBS로 1:500 희석된 마우스 혈청을 넣어 상온에서 두 시간 배양한 후, peroxidase가 결합된 마우스 항체를 통해 관찰하였다.
도 11은 마우스 혈액 내 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 특이적인 항체 양을 주입 농도에 따라 관찰한 결과이다. 세포밖 소포체 주입 농도가 증가함에 따라 세포밖 소포체 특이 항체의 양도 증가함을 보였다.
상기의 방법으로 세 번의 아시네토박터 바우마니유래 세포밖 소포체 접종이 완료된 3 일 후 마우스에서 비장세포와 림프절 세포를 분리하였다. 미리 96-well 플레이트에 CD3/CD28 항체를 코팅한후 분리된 비장세포와 림프절 세포를 각각 (2 x 106) 씨딩(seeding)하였다. 12시간 배양 후, 비장세포와 림프절 세포가 분비하는 면역 반응 관련 사이토카인인 IFN-γ, IL-17, IL-4, IL-10 의 양을 각각 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 12는 마우스 비장세포(Splenocytes)와 림프절 세포(Lymph node cells)가 CD3/CD28 항체 자극을 받았을 때 분비되는 IFN-γ 양을 나타낸 결과이다. 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포와 림프절 세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포와 림프절 세포에서 IFN-γ 의 분비가 증가하였다.
도 13은 마우스 비장세포와 림프절 세포가 CD3/CD28 항체 자극을 받았을 때 분비되는 IL-17 양을 나타낸 결과이다. 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포와 림프절 세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포와 림프절 세포에서 IL-17 의 분비가 증가하였다.
도 14는 마우스 비장세포와 림프절 세포가 CD3/CD28 항체 자극을 받았을 때 분비되는 IL-4 양을 나타낸 결과이다. 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포에서 IL-4 의 분비가 증가하였다. 반면 림프절 세포의 경우 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 접종한 경우와 접종 하지 않은 경우 림프절 세포가 분비하는 IL-4의 양은 변함이 없었다.
도 15는 마우스 비장세포와 림프절 세포가 CD3/CD28 항체 자극을 받았을 때 분비되는 IL-10 양을 나타낸 결과이다. 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포와 림프절 세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포와 림프절 세포에서 IL-10 의 분비가 증가하였다.
상기 결과로부터, 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 접종시 세균 감염에 대한 방어기전인 B 세포에서 생성되는 항체 반응과 T 세포 면역반응이 유도됨을 확인하였다. 특히, T 세포 면역반응과 관련하여, 세균감염에 대한 방어에 중요한, IFN-γ 를 분비하는 Th1 면역반응과 IL-17을 분비하는 Th17 면역반응이 아시네토박터 바우마니유래 세포밖 소포체 접종에 의해 효율적으로 유도됨을 확인할 수 있었다.
실시예
7.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
) 유래
세포밖
소포체에 의한 패혈증 발생에 대한
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
)
세균유래
세포밖
소포체 백신의 효능
실시예 1의 방법에 따라 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 1 μg을 일주일 간격으로 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 8 마리)의 복강으로 주입 한 후, 실시예 5의 방법에 따라 확립된 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증 발생에 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 관찰하였다. 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 예방 접종이 완료된 3 일 후, 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 25 μg을 복강으로 주입하여 패혈증에 의한 사망률을 관찰 하였다.
도 16의 결과를 보면 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 1 μg을 미리 투여한 경우(EV 25μg + vaccine), 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체에 의한 패혈증으로 인한 사망률이 감소함을 보여준다.
상기 결과는 아시네토박터 바우마니에서 유래하는 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.
실시예
9.
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
) 감염에 의한 패혈증 발생에 대한
아시네토박터
바우마니
(A.
baumannii
)
세균유래
세포밖
소포체 백신의 효능
실시예 1의 방법에 따라 아시네토박터 바우마니 유래 세포밖 소포체 1 μg을 일주일 간격으로 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5 마리)의 복강으로 주입 한 후, 72 시간 후 아시네토박터 바우마니 균주를 6 x 108 CFU 를 복강으로 투여 하고 아시네토박터 바우마니 균주에 의한 패혈증 사망률을 관찰 하여 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 미리 아시네토박터 바우마니 세균 유래 세포밖 소포체를 통한 백신을 하지 않은 마우스의 경우(A. baumannii) 36 시간 내에 전체 마우스가 사망함을 보였고, 반면 아시네토박터 바우마니 세균 유래 세포밖 소포체를 통한 백신을 한 경우(A. baumannii + vaccine) 80 %의 마우스가 생존하였다.
상기 결과는 장내 공생 세균인 아시네토박터 바우마니에서 유래하는 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 아시네토박터 바우마니 균주에 의해 발생하는 질병을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
Claims (70)
- 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체만을, 인간을 제외한 동물에게 투여하여 제조된 질병 모델.
- 제 1 항에 있어서,
상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 주니 (Acinetobacter junii), 아시네토박터 존스니 (Acinetobacter johnsonii), 아시네토박터 리워피 (Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 라디오레시스텐스 (Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 우르신지 (Acinetobacter ursingii), 아시네토박터 쉰들러리 (Acinetobacter schindleri), 아시네토박터 파르부스 (Acinetobacter parvus), 아시네토박터 베이리 (Acinetobacter baylyi), 아시네토박터 보우베티 (Acinetobacter bouvetii), 아시네토박터 토우너리 (Acinetobacter towneri), 아시네토박터 탄도이 (Acinetobacter tandoii), 아시네토박터 그리몬티 (Acinetobacter grimontii), 아시네토박터 셰른버지아 (Acinetobacter tjernbergiae), 및 아시네토박터 게르너리(Acinetobacter gerneri)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 질병 모델. - 제 1 항에 있어서,
상기 세포밖 소포체는 상기 아시네토박터 속 세균 배양액으로부터 분리한 것인, 질병 모델. - 제 1 항에 있어서,
상기 세포밖 소포체는 자연적 또는 인공적으로 분비되는 세포밖 소포체를 분리한 것인, 질병 모델. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 동물은 마우스인, 질병 모델. - 제 1 항에 있어서,
상기 투여는 복강 투여, 정맥 투여, 피부 투여, 비강 투여, 및 기도 투여로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 질병 모델. - 제 1 항에 있어서,
상기 질병은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염, 부비동염, 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 및 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 질병 모델. - 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체만을 이용한 질병 예방 또는 치료에 대한 후보 약물의 탐색 방법.
- 제 9 항에 있어서,
상기 아시네토박터 속 세균은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 주니 (Acinetobacter junii), 아시네토박터 존스니 (Acinetobacter johnsonii), 아시네토박터 리워피 (Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 라디오레시스텐스 (Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 우르신지 (Acinetobacter ursingii), 아시네토박터 쉰들러리 (Acinetobacter schindleri), 아시네토박터 파르부스 (Acinetobacter parvus), 아시네토박터 베이리 (Acinetobacter baylyi), 아시네토박터 보우베티 (Acinetobacter bouvetii), 아시네토박터 토우너리 (Acinetobacter towneri), 아시네토박터 탄도이 (Acinetobacter tandoii), 아시네토박터 그리몬티 (Acinetobacter grimontii), 아시네토박터 셰른버지아 (Acinetobacter tjernbergiae), 및 아시네토박터 게르너리(Acinetobacter gerneri)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 탐색 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 세포밖 소포체는 아시네토박터 속 세균 배양액에서 분리한 것인, 탐색 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 세포밖 소포체는 자연적 또는 인공적으로 분비되는 세포밖 소포체를 분리한 것인, 탐색 방법. - 삭제
- 제 9 항에 있어서,
상기 질병은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염, 부비동염, 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 및 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 탐색 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 탐색 방법은 상기 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 탐색 방법. - 제 15 항에 있어서,
상기 세포는 염증세포인, 탐색 방법. - 제 16 항에 있어서,
상기 염증세포는 단핵구, 호중구, 호산구, 호염구, 및 단핵구가 조직에서 분화된 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 탐색 방법. - 제 15 항에 있어서,
상기 세포는 상피세포, 혈관내피세포, 또는 줄기세포인, 탐색 방법. - 제 18 항에 있어서,
상기 줄기세포는 골수조직 또는 지방조직에서 유래한 세포인, 탐색 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 탐색 방법은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후 염증 관련 매개체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 탐색 방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 염증 관련 매개체는 인터루킨(Interleukin, IL)-6인, 탐색 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 탐색 방법은 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후 염증 관련 신호전달과정을 평가하는 단계를 포함하는, 탐색 방법. - 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체만을 포함하는, 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체에 의한 질병 예방 또는 치료용 백신.
- 제 23 항에 있어서,
상기 질병은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염, 부비동염, 패혈증, 동맥경화증, 급성관상동맥증후군, 뇌졸증, 폐기종, 급성호흡부전증후군, 골다공증, 고혈압, 비만, 당뇨, 관절염, 및 뇌질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 백신. - 제 23 항에 있어서,
상기 백신은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 주니 (Acinetobacter junii), 아시네토박터 존스니 (Acinetobacter johnsonii), 아시네토박터 리워피 (Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 라디오레시스텐스 (Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 우르신지 (Acinetobacter ursingii), 아시네토박터 쉰들러리 (Acinetobacter schindleri), 아시네토박터 파르부스 (Acinetobacter parvus), 아시네토박터 베이리 (Acinetobacter baylyi), 아시네토박터 보우베티 (Acinetobacter bouvetii), 아시네토박터 토우너리 (Acinetobacter towneri), 아시네토박터 탄도이 (Acinetobacter tandoii), 아시네토박터 그리몬티 (Acinetobacter grimontii), 아시네토박터 셰른버지아 (Acinetobacter tjernbergiae), 및 아시네토박터 게르너리(Acinetobacter gerneri)로 이루어진 군에서 유래하는 세포밖 소포체를 포함하는 것인, 백신. - 제 23 항에 있어서,
상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용하는 것인, 백신. - 제 26 항에 있어서,
상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것인, 백신. - 제 26 항에 있어서,
상기 변형은 세균 또는 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것인, 백신. - 제 28 항에 있어서,
상기 화합물은 약물인 것인, 백신. - 삭제
- 삭제
- 제 23 항에 있어서,
상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물 또는 면역보강제를 병용 투여하여 사용하는 것인, 백신. - 삭제
- 아시네토박터 속 세균유래 세포밖 소포체만을 포함하는, 아시네토박터 속 세균에 의한 감염 예방 또는 치료용 백신.
- 제 34 항에 있어서,
상기 감염은 상처감염, 패혈증, 폐렴, 부비동염, 요로감염, 골관절, 및 중추신경계 감염으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 백신. - 제 34 항에 있어서,
상기 백신은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스 (Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 주니 (Acinetobacter junii), 아시네토박터 존스니 (Acinetobacter johnsonii), 아시네토박터 리워피 (Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 라디오레시스텐스 (Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 우르신지 (Acinetobacter ursingii), 아시네토박터 쉰들러리 (Acinetobacter schindleri), 아시네토박터 파르부스 (Acinetobacter parvus), 아시네토박터 베이리 (Acinetobacter baylyi), 아시네토박터 보우베티 (Acinetobacter bouvetii), 아시네토박터 토우너리 (Acinetobacter towneri), 아시네토박터 탄도이 (Acinetobacter tandoii), 아시네토박터 그리몬티 (Acinetobacter grimontii), 아시네토박터 셰른버지아 (Acinetobacter tjernbergiae), 및 아시네토박터 게르너리(Acinetobacter gerneri)로 이루어진 군에서 유래하는 세포밖 소포체를 포함하는 것인, 백신. - 제 34 항에 있어서,
상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용하는 것인, 백신. - 제 37 항에 있어서,
상기 변형은 형질변환된 세균을 사용하는 것인, 백신. - 제 37 항에 있어서,
상기 변형은 세균 또는 세포밖 소포체에 화합물을 처리하는 것인, 백신. - 제 39 항에 있어서,
상기 화합물은 약물인 것인, 백신. - 삭제
- 삭제
- 제 37 항에 있어서,
상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물 또는 면역보강제를 병용 투여하여 사용하는 것인, 백신. - 삭제
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