CN115918608A - 手持式气溶胶吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种手持式气溶胶肺递送吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型的构建方法及其应用。本发明提供的模型构建方法，包括如下步骤：通过手持式液体气溶胶的方式将病原菌经气管内喷雾递送至动物的气道内、肺部，得到动物肺部感染模型。所述病原菌为嗜麦芽窄食单胞菌；或所述动物为小鼠。本发明直接将受试物以手持式气溶胶形式经气管内喷雾递送至小鼠气道气道、肺部，构建了一种新的吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型。该模型具有相对无创、定量及操作过程可视，重复性好，气溶胶沉积率高，细菌能直接进入气道、肺组织，且较均匀分布左右各肺叶，较真实模拟气溶胶吸入肺部感染情况，为理想嗜麦芽窄食单胞菌吸入感染模型。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种手持式气溶胶吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型的构建方法及其应用。
背景技术
嗜麦芽窄食单胞菌(Stotrophomonas malophhilia,SMA)是一种重要的革兰氏阴性多药耐药细菌病原体，广泛分布在环境中，对世界各地的人类健康都有影响。嗜麦芽窄食单胞菌是一种机会性病原体，可引起人类多种严重的医院感染，包括呼吸道感染、菌血症、心内膜炎、胃肠道感染、肝脏感染、尿路感染、神经系统和脊髓感染、眼部感染、软组织和骨骼感染以及医疗植入物感染。肺炎和菌血症是这种感染最常见的临床表现，据报道，菌血症患者的总死亡率为30％至51％，重症监护室内医院获得性肺炎患者的死亡率接近50％，出血性肺炎患者的死亡率为100％。
嗜麦芽窄食单胞菌感染的发病机制涉及多种毒力因子，可能激活不同类型宿主细胞的选择性基因表达模式，并对特定细胞类型产生不同的影响，嗜麦芽窄食单胞菌-宿主相互作用是复杂的。嗜麦芽窄食单胞菌感染由于广泛的抗生素耐药性和它们引起组织损伤的能力，治疗起来很有挑战性。目前还没有有效的疫苗。小鼠已被用作嗜麦芽窄食单胞菌引起的呼吸道感染、菌血症、腹膜炎等感染的实验模型，以期望识别关键的毒力因子、候选疫苗抗原或免疫疗法。
已经报道了几种用于嗜麦芽窄食单胞菌感染的小鼠肺炎模型的接种方法，包括小鼠鼻腔接种、气管内滴注和暴露系统的气溶胶吸入。一般来说，鼻接种可能导致不稳定的模型构建，因为不能精确控制感染的剂量以及肺部微生物沉积的高度可变性。气管内滴注不容易模拟自然发生的气溶胶传播的感染。暴露系统的气溶胶吸入性肺炎模型大多遵循口鼻接触和全身暴露的途径，但给药剂量的准确量化可能会受到影响。
与之前的接种不同，本发明所涉及的嗜麦芽窄食单胞菌的吸入感染模型使用手持式液体气溶胶肺部递送装置将已知量的微生物直接经气管内喷雾递送小鼠的气道内、肺部。它的特点是成功率高，精确定量攻毒剂量，易于复制和动物死亡率低，同时操作简便，样本节约，不需要容量较大的暴露塔或暴露舱等设备，因此经气管吸入攻毒或给药是细菌毒力与宿主相互作用的不错手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种手持式气溶胶吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型的构建方法及其应用。
本发明所提供的手持式气溶胶吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型的构建方法，包括下述步骤：通过手持式液体气溶胶吸入的方式将嗜麦芽窄食单胞菌经气管内喷雾递送至小鼠的气道、肺部，即得。
上述方法中，所述递送为定量递送。
上述方法中，所述嗜麦芽窄食单胞菌以嗜麦芽窄食单胞菌菌液的方式递送。
上述方法中，所述嗜麦芽窄食单胞菌是将嗜麦芽窄食单胞菌悬浮在PBS(磷酸缓冲盐溶液)中得到的菌液。所述PBS的pH值可为7.2。
上述方法中，所述嗜麦芽窄食单胞菌的递送量为4.5×108-5.0×108CFU/只，雄性小鼠体重为18-20g。
上述方法中，所述嗜麦芽窄食单胞菌菌液的递送量为每只小鼠50μl。
上述方法中，所述通过液体气溶胶的方式将嗜麦芽窄食单胞菌递送至小鼠的肺部具体是将嗜麦芽窄食单胞菌菌液通过液体气溶胶肺递送装置气管内喷雾递送至小鼠的气道、肺部。更具体的，所述液体气溶胶肺递送装置可为手持式气管内给药喷雾器。
上述方法中，所述小鼠具体可为C57BL/6J Nfdic小鼠。
所述方法还可包括如下步骤：嗜麦芽窄食单胞菌递送后，通过攻毒后的小鼠生存情况和/或病理损伤程度和/或肺部组织基因的转录水平进行评价，确认模型构建成功。
具体的，可于递送嗜麦芽窄食单胞菌菌液攻毒后，小鼠14天内存活率进行所述生存情况的评价。
具体的，可于递送嗜麦芽窄食单胞菌菌液攻毒后4-72小时进行所述病理损伤程度的评价。更具体的，可于递送嗜麦芽窄食单胞菌菌液攻毒后，4小时、12小时和/或24小时和/或72小时进行所述病理损伤程度的评价。
具体的，可于递送嗜麦芽窄食单胞菌菌液攻毒后4小时进行所述肺部组织基因的转录水平的评价。
所述生存情况可通过存活曲线判断。
所述病理损伤程度具体可通过HE染色观察。
所述肺部组织基因的转录水平通过转录组测序(RNA-seq)评估。
本发明中，从存活曲线、病理损伤、转录组测序的基因转录水平三个方面检测多项可量化的指标，对构建的吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型进行了评价。结果表明，该模型构建方法准确性高、重复性好，可准确定量研究受试物对小鼠的感染情况。
本发明还保护以上任一所述方法构建的吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型在药物筛选和/或药效评估中的应用。
所述药物为嗜麦芽窄食单胞菌相关疾病的治疗药物。
所述药物为嗜麦芽窄食单胞菌相关疾病的预防药物。
上述手持式液体气溶胶肺递送装置在制备吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型中的应用也属于本发明保护的范围。
本发明中使用手持式气溶胶吸入肺递送的方式，通过小鼠肺递送装置定量(一般50μl)气管内喷雾，精确定量攻毒剂量。将麻醉后的小鼠固定于专用操作台，借助小鼠喉镜暴露声门，喉镜灯光下直接观察、确认小鼠声门开口及主气管道位置，将肺递送装置的针头轻轻插进小鼠主气管中，迅速按压注射杆，将攻毒的菌液递送至小鼠气道、肺部。注意操作时动作轻柔、迅速，所有器械用后注意及时消毒除菌。
本发明直接将受试物以手持式气溶胶吸入形式递送至小鼠气道内、肺部，构建了一种新的吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型。该模型操作过程可视，不易伤及小鼠气道周围组织及误插入食道等操作并发症，具有相对无创、安全，准确性高、重复性好，熟练后需数秒钟即可完成递送，准确定量研究受试物对小鼠的感染情况。
附图说明
图1为嗜麦芽窄食单胞菌手持式气溶胶吸入肺炎攻毒下小鼠生存曲线。
图2为嗜麦芽窄食单胞菌手持式气溶胶吸入肺炎感染后，小鼠肺组织不同时间肉眼形态。
图3为嗜麦芽窄食单胞菌手持式气溶胶吸入肺炎感染后，小鼠肺组织病理学不同时间病理HE染色。
图4为嗜麦芽窄食单胞菌手持式气溶胶吸入肺炎感染后，小鼠肺组织的4小时RNA-seq分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中实验动物采用C57BL/6J Nfdic小鼠，雄性，6-7周龄，SPF级，体重18-20g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。
下述实施例中菌株为嗜麦芽窄食单胞菌K279a菌株(许广杨，嗜麦芽窄食单胞菌保护性抗原的识别[D]，安徽医科大学，2015，(硕士学位论文，安徽医科大学))，由军事科学院微生物与流行病研究所细菌室保存。
下述实施例中试剂：溶菌肉汤(LB)培养基购自OXOID公司；总RNA提取试剂盒购于上海生工生物工程公司；RNA Nano 6000检测试剂盒(Agilent Technologies，CA，USA)。
PBS为磷酸缓冲盐溶液，pH为7.2。
实施例1、一种手持式液体气溶胶肺递送吸入嗜麦芽窄食单胞菌菌感染小鼠模型的构建方法
一、嗜麦芽窄食单胞菌菌培养及菌液制备
(1)活化：将-80度冰箱保存的甘油菌种嗜麦芽窄食单胞菌K279a化冻后吸取50μl接种于5ml的新鲜LB液体培养基中，37℃摇床180rpm过夜培养，使嗜麦芽窄食单胞菌生长至平台期。此为第一代菌。
(2)按1％的过夜生长的菌株加入5ml新鲜LB液体培养基中，37℃摇床180rpm培养菌液对数期中期(5h)，此为第二代菌。
(3)菌液制备收集适量(2)得到的菌液至无菌EP管中，8000rpm离心5min集菌，吸弃培养基上清，用无菌PBS缓冲液洗菌2次，调整OD600至1.0左右，按预先实验计算的菌量4.5-5.0×108CFU/ml左右，稀释菌液至所需浓度进行后续实验，50μl的无菌PBS重悬1ml菌液，得到攻毒的嗜麦芽窄食单胞菌K279a菌液。
同时将菌液10倍倍比稀释后涂LB固体平板，平板在37℃倒置培养1d后，计数不同稀释度的菌落数，计算出实际菌量。
二、手持式液体气溶胶肺递送嗜麦芽窄食单胞菌吸入感染小鼠
1、攻毒
本实验攻毒小鼠为C57BL/6J Nfdic，购自北京斯贝福生物技术有限公司，SPF级。
攻毒方法如下：按照事先估计细菌数量约4.5-5.0×108CFU/ml(最终菌数以第2日LB固体平板上生长的菌数为准)。先用装有异氟烷的小动物气体麻醉机吸入麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠以仰卧固定于专用固定台。借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将上述得到的K279a菌液递送至小鼠气道、肺部；肺递送为每只小鼠50μl(无菌PBS重悬1ml菌液)；攻毒剂量估计为4.5-5.0×108CFU/ml，以第2日实际菌数为准，每只小鼠体重为18-20g。50μl无菌PBS吸入肺递送为对照组。
2、检测
观察并记录了攻毒后14天内小鼠症状及小鼠生存情况，使用GraphPad软件绘制小鼠生存曲线，使用Kaplan Meier方法和Log rank检验比较两组间生存率差异。
1)生存曲线绘制
每组取10只小鼠(攻毒后3h内死亡的小鼠，考虑麻醉意外事件、窒息等死亡，需剔除)，在攻毒后每天记录小鼠死亡只数，绘制生存曲线。
结果如图1所示，可以看出肺递送实验组小鼠在5.0×108CFU/只菌数攻毒下，大部分死亡发生在4天内，感染和对照小鼠之间的存活差异具有统计学意义(p<0.01，Log rank检验)。在重复实验中，获得了类似的结果。
2)临床症状观察
同时在攻毒后每天观察并记录小鼠病症(皮肤温冷度、耸毛、呼吸困难、聚集、被触摸或外部刺激后反应迟钝)。
经观察记录，肺递送实验组小鼠在攻毒后6h左右有耸毛现象、聚集，1天症状严重小鼠可见身体皮肤发冷感、呼吸困难、外部刺激后反应迟钝等症状，伴小鼠死亡，大部分死亡发生在3天。如果未死亡，小鼠至7天后攻毒后症状基本消失，能恢复进食等正常生理活动，继续观察至14天。PBS对照组小鼠无明显症状。
3)动物解剖及样本处理
取上述第二代菌，5.0×108CFU/只菌数攻毒。在攻毒4h、12h、24h、72h和死亡时间点，每个时间点取4只小鼠，进行解剖、取小鼠肺，肉眼观察，部分用4％多聚甲醛固定液溶液固定后用于病理学检测。另外取50μl PBS做0h对照(3只)
(1)肉眼病理形态学
取小鼠肺，将肺置于白色背景下肉眼观察、拍照。12h开始小鼠肺组织较正常肺颜色成深红色，局部有点状黑色病灶，72h较显著，死亡小鼠肺部颜色为暗红色。
结果如图2所示：a、b、c、d、e、f图对应0h、4h、12h、24h、72h和死亡小鼠肺部肉眼形态，选取有代表性的图片。
(2)组织病理分析
拍照后浸泡于4％多聚甲醛固定液至少48h。固定结束后，对肺组织脱水后进行石蜡包埋采用组织切片机切片3-5μm。接着按照染色程序，将切片放于载玻片后采用苏木精和伊红染色液进行染色，然后脱水封片通过光学显微镜镜检(200X)。HE染色可见：4h时肺组织中有中性粒细胞浸润，随后在12-72h时中性粒细胞和单核细胞浸润显著增加。在72h时，肺泡结构大量破坏，肺泡隔增厚和出血。死亡的小鼠显示严重的肺出血和大量中性粒细胞浸润。上述变化与小鼠症状、肺部肉眼形态一致。
结果如图3所示：a、b、c、d、e、f图对应0h、4h、12h、24h、72h和死亡小鼠肺脏病理HE染色，选取有代表性的图片。
(3)感染后4h肺部转录组测序分析
取0h PBS对照组(标记为PBS_0hpi组)和4h攻毒的小鼠(标记为SMA_4hpi组)，取肺部组织研磨，按照试剂盒步骤提取总RNA。通过使用Bioanalyzer 2100系统的RNA Nano6000检测试剂盒测定样品中总RNA的量和完整性。文库的构建和测序由北京诺禾致源科技股份有限公司实施。使用DESeq2 R软件包(1.20.0)分析两组之间的不同表达。使用Benjamini和Hochberg的方法调整p值以降低错误发现率。使用调整后的p值(adjusted pvalue，padj)<＝0.05和|log2FoldChange|>＝1作为临界值，确定差异表达基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)，并使用火山图进行可视化。使用KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)进行KEGG途径富集。
结果如图4所示：使用对照组(PBS_0hpi)作为参照，在嗜麦芽窄食单胞菌感染后的在4h检测到3165个上调的差异表达基因(图4a中-log10(padj)>1.301且log2FoldChange>＝1的位于右上部分)和2231个下调的差异表达基因(图4a中-log10(padj)>1.301且log2FoldChange<＝-1的位于左上部分)。通过KEGG通路分析4h的差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号传导途径、NOD样受体信号传导途径、TNF信号传导途径、NF-kappa B信号传导途径和IL-17信号通路(图4b)。
转录组分析显示肺中的基因转录表达谱，在感染后4h编码促炎反应(趋化因子、细胞因子和炎症通路)的基因表达迅速增加，表明急性炎症反应的开始，宿主正发生快速和强烈炎症反应。
上述结果证明，经气管以手持式气溶胶吸入方式肺递送给予小鼠K279a菌液成功建立了嗜麦芽窄食单胞菌感染C57BL/6J Nfdic小鼠肺炎的动物模型，为嗜麦芽窄食单胞菌的相关研究奠定了基础。
嗜麦芽窄食单胞菌感染C57BL/6J Nfdic小鼠肺炎的动物模型的应用：嗜麦芽窄食单胞菌致病机制研究、疫苗效果评价、筛选嗜麦芽窄食单胞菌治疗药物、选择治疗方案等。
以上对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不局限于上述实施例。对于本领域技术人员而言，在不违背发明创造精神的前提下可以对本发明进行等同修改和替代，这些等同的修改和替代均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种手持式气溶胶肺递送吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺炎模型的构建方法，包括下述步骤：通过手持式液体气溶胶吸入的方式将嗜麦芽窄食单胞菌递送至小鼠的气道、肺部。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述嗜麦芽窄食单胞菌嗜麦芽窄食单胞菌以嗜麦芽窄食单胞菌菌液的方式递送；所述嗜麦芽窄食单胞菌菌液是将嗜麦芽窄食单胞菌悬浮在PBS中得到的菌液。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述嗜麦芽窄食单胞菌菌液的递送量为每只小鼠50μl。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述嗜麦芽窄食单胞菌的递送量为4.5×108-5.0×108CFU/只，所述小鼠为C57BL/6J Nfdic雄性小鼠，体重为18-20g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述递送为定量递送、操作过程可视。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述通过手持液体式气溶胶吸入的方式将嗜麦芽窄食单胞菌递送至小鼠的肺部，具体是将嗜麦芽窄食单胞菌菌液通过手持式液体气溶胶肺递送装置递送至小鼠的气道内、肺部。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：嗜麦芽窄食单胞菌递送后，通过攻毒后的小鼠存活曲线和/或病理损伤程度和/或肺部组织基因的转录水平进行评价，确认模型构建成功。
8.权利要求1-7中任一所述方法构建的模型在药物筛选和/或药效评估中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述药物为嗜麦芽窄食单胞菌相关疾病的治疗药物；所述药物为嗜麦芽窄食单胞菌相关疾病的预防药物。
10.手持式液体气溶胶经气管内喷雾递送装置在制备吸入嗜麦芽窄食单胞菌的小鼠肺部感染模型中的应用。
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GUANGYANG XU 等: "Time-course transcriptome analysis of lungs from mice infected with inhaled aerosolized Stenotrophomonas maltophilia", 《JOURNAL OF THORACIC DISEASE》, vol. 15, no. 9, 21 September 2023 (2023-09-21), pages 4987 - 5005 * |
| POMPILIO A 等: "Stenotrophomonas maltophilia virulence and specificvariations in trace elements during acute lung infection: implications incystic fibrosis", 《PLOS ONE》, vol. 9, no. 2, 31 December 2014 (2014-12-31), pages 1 - 2 * |
| XINYING ZHENG 等: "Time-Course Transcriptome Analysisof Lungs From Mice Infected WithHypervirulent Klebsiellapneumoniae via AerosolizedIntratracheal Inoculation", 《FRONTIERS》, vol. 12, 27 April 2022 (2022-04-27), pages 1 - 7 * |
| 陈晨;范华昊;袁守军;童贻刚;: "嗜麦芽窄食单胞菌肺部感染模型的建立与评估", 军事医学, no. 03, 25 March 2013 (2013-03-25) * |
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