CN114364787B - 铜绿假单胞菌疫苗在呼吸系统疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种铜绿假单胞菌疫苗在制备防治呼吸系统疾病的药物中的应用。铜绿假单胞菌疫苗可以通过激活机体特应性免疫反应，能防治多药耐药铜绿假单胞菌导致的肺部感染，以及COPD合并铜绿假单胞菌感染。通过既定的免疫程序，降低接受免疫机体感染的细菌荷载量，可以预防肺部感染铜绿假单胞菌，在一定程度上规避了现有技术中采用抗生素不佳、难以根治、并且容易产生耐药性等技术问题。

Description

铜绿假单胞菌疫苗在呼吸系统疾病中的应用
本申请要求2019年8月22日提交的中国发明专利1)201910777479.2“细菌膜囊泡及其制备方法与应用”；2)201910777473.5“金黄色葡萄球菌膜囊泡及其制备方法与应用”；3)201910777606.9“铜绿假单胞菌膜囊泡及其制备方法与应用”；4)201921369450.2“一种细菌膜囊泡的生产系统和分离纯化系统”；5)201910777595.4“一种细菌膜囊泡的生产系统和分离纯化系统及方法”的优先权，这五件优先权专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗在呼吸系统疾病领域的应用。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)简称COPD,常简称为慢阻肺。是一种以持续性的气流受限为特征的阻塞性肺疾病。COPD是一种进行性疾病，即病情随时间会逐渐恶化。以呼吸短促、咳嗽、咳痰为主要症状。COPD病因复杂，临床上多见于香烟、空气污染和遗传等引起，吸烟是最主要的病因。COPD已成为21世纪一个重大的影响国民健康的重大问题，据统计全球每年约有3.29亿患者受到该病的困扰，目前是全球第四大死亡原因。WHO预估在2030年COPD将会成为全世界第三大死亡因素。迄今COPD的发病机制尚未完全明确，现有发病机制包括以下几种假说：“感染假说”、“氧化-抗氧化失衡假说”、“弹性蛋白-抗弹性蛋白假说”。以及近几年相继提出的“肺炎衣原体慢性感染假说”、“免疫失衡假说”及“自主神经功能失调”等。然而，这些学说不能全部解释清楚所有COPD患者的所有表现。
COPD急性加重(AECOPD)是指患者呼吸窘迫症状的恶化，表现为咳嗽，咳痰，呼吸困难比平时加重，或痰量增多，咳黄痰，或者是需要改变用药方案。AECOPD是导致COPD患者急性入院治疗的一个重要原因，占总入院率的2.4％，据统计，首次入院患者7天内的死亡率约11.6％；二次入院患者7天的死亡率高达37％。入院患者30天的死亡率在15％左右。AECOPD患者并发症常见有：呼吸衰竭，慢性肺源性心脏病，自发性气胸等。研究证明感染是AECOPD的重要因素，占第一位约80％。一项系统性回顾分析表明，感染中合并细菌感染占第一位，约50％，且下呼吸道细菌的负荷与预后息息相关。其次是病毒感染约为43％。
铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，可发生在人体任何部位和组织，如呼吸道、中耳、角膜和尿道，也常见于烧伤或创伤部位。铜绿假单胞菌常定植在中、重度COPD患者下呼吸道，并且与COPD的恶化有关，现有研究显示，COPD合并铜绿假单胞菌感染的概率是15.5％，COPD急性加重患者合并感染铜绿假单胞菌的概率13％。COPD患者反复发作合并感染铜绿假单胞菌的概率为23.1％。
铜绿假单胞菌是目前美国最常见的院内感染病原体，也是呼吸机相关性肺炎的第二大病原体。之前的一项研究表明，AECOPD患者出院后30天内再次入院者有10.2％，在90天内再次入院者有17.8％，铜绿假单胞菌的检出率与患者再次入院率成正相关。
肺部感染的铜绿假单胞菌在治疗上相对比较困难。首先,铜绿假单胞菌具有复杂的耐药机制，目前临床上多药耐药，返耐药铜绿假单胞菌检出率高；；第二，铜绿假单胞菌具有较大的基因组(5.5-7Mbp)，具有多种表型，能适应不同定植环境和强大的突变能力；不仅如此，该菌能产生多种次生代谢物和聚合物，有更强的群体感应能力，这使得细菌之间的获得性抗性得以传播；第三，铜绿假单胞菌分泌毒力因子，破坏免疫系统，难以清除。结果使得患者抗生素的使用时间更长，住院时间更长，常常导致二次医院感染和抗生素副作用。
囊性纤维化的病人最常死亡原因是绿脓杆菌的感染，患者遭受感染、炎症反应和气道阻塞的循环复发，使小气道持续损伤。雾化吸入抗生素是最常见的治疗方式，是大剂量抗生素直接到达感染部位最直接的方法，即使临床微生物学证明病原体对高剂量的抗生素敏感，但这种治疗也常常不能根除铜绿假单胞菌感染。铜绿假单胞菌在囊性纤维化患者肺中形成对抗生素耐受的生物膜，可能是抗菌药物治疗困难的原因之一。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗在制备防治呼吸系统疾病的药物中的应用。
进一步地，所述呼吸系统疾病包括原发性呼吸系统疾病和继发性呼吸系统疾病。
进一步地，所述呼吸系统疾病为慢性肺功能不全合并细菌感染。
进一步地，所述慢性阻塞性肺功能不全为慢性阻塞性肺疾病。
进一步地，所述慢性阻塞性肺疾病包括慢性支气管炎和肺气肿。
进一步地，所述慢性阻塞性肺疾病为急性加重慢性阻塞性肺疾病。
进一步地，所述细菌感染由铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核杆菌中的一种或多种引起。
进一步地，所述细菌感染为铜绿假单胞菌感染。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗的免疫程序包括：注射时间间隔为(i)0、3、7天，(ii)0、1、2周，(3)0、2、4周和(iv)1、2、3、四周。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗包括灭活铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌膜囊泡。
如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述灭活铜绿假单胞菌经辐照灭活，所述铜绿假单胞菌膜囊泡从经辐照灭活的所述铜绿假单胞菌中分离获得。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗预防铜绿假单胞菌感染，以及降低所述呼吸系统疾病中的细菌荷载量。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗含有铜绿假单胞菌全菌体的含量包括：1×104-1×1011/针。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗含有铜绿假单胞菌全菌体的含量包括：1×104/针、1×105/针、1×106/针、1×107/针、1×108/针、1×109/针和1×1011/针。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗还含有免疫佐剂。
进一步地，所述免疫佐剂为氢氧化铝。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗的给药部位为皮下、肌肉、和/或粘膜。
进一步地，所述药物还可以包含任何药学上可接受的载体和/或助剂。
进一步地，所述载体为脂质体。
本发明还提供了一种治疗呼吸系统疾病的药物组合物，其特征在于，包括铜绿假单胞菌疫苗和至少一种抗生素。
进一步地，所述至少一种抗生素为氨曲南。
进一步地，所述铜绿假单胞菌疫苗包括灭活铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌膜囊泡。
本发明有益效果
本发明实验结果显示，采用本发明铜绿假单胞菌疫苗可以通过激活机体特应性免疫反应，能有效防治多药耐药铜绿假单胞菌导致的肺部感染，以及COPD合并铜绿假单胞菌感染。通过既定的免疫程序，降低接受免疫机体感染的细菌荷载量，从而提供了一种可以有效预防肺部感染铜绿假单胞菌的技术方案，在一定程度上规避了现有技术中采用抗生素不佳、难以根治、并且容易产生耐药性等技术问题。
本发明实验结果还显示，一方面，本发明铜绿假单胞菌疫苗通过激发的特异性免疫保护，从作用原理上，规避了铜绿假单胞菌耐药的问题，并且可能发挥比抗生素更快速的病原菌清除效果。另外一方面，本发明铜绿假单胞菌疫苗还可以与抗生素(例如，氨曲南)联用，产生协同抗感染作用。因此，本发明铜绿假单胞菌疫苗在呼吸系统疾病领域有广阔的应用场景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1经辐照的铜绿假单胞菌膜囊泡透射电镜图(比例尺：200nm)。
图2CD4+T细胞在与不同处理方式后的DC发生作用后的增殖百分比。
图3CD4+T细胞在与不同处理方式后的DC发生作用后的增殖流式图。
图4辐照处理的膜囊泡增强DC细胞与T细胞相互作用(GC：growth control，树突状细胞生长对照组(未刺激组)；Cell+MVs(全菌体+囊泡处理组)；MVs(囊泡处理组))。
图5正常对照组小鼠肺组织(左：×40倍；右：×200倍)。
图6COPD模型组小鼠肺组织(左：×40倍；右：×200倍)。
图7铜绿假单胞菌SKLBPA1感染24h后COPD小鼠的肺组织细菌荷载量。
图8免疫保护-抗SKLBPA1感染。
图9免疫保护-抗CRPA感染。
图10疫苗与抗生素联用抗感染实验流程。
图11疫苗与抗生素联用抗感染实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的铜绿假单胞菌疫苗包含(i)经辐照灭活的铜绿假单胞菌菌体和/或(ii)铜绿假单胞菌膜囊泡。图1为纯化后的膜囊泡透射电镜照片。
实施例1–3介绍了制备囊泡的一些分离方法，囊泡既可以是从没有经过辐照的细菌中分离出来的，也可以是从经过辐照的细菌中分离出来的，还可以是通过其它方法途径获得的。
实施例1细菌膜囊泡分离方法
在一些实施例中，从铜绿假单胞菌中分离膜囊泡的方法包括以下步骤：1)将培养细菌的菌液中的菌体和培养液进行分离，收集获得上清液1；2)将所述上清液1用高速离心机离心，收集上清液2；3)将所述上清液2用超高速离心机离心，沉淀为膜囊泡。
进一步，所述步骤1)中分离方法包括离心、过柱或膜包浓缩。
进一步，在所述步骤2)中收集获得的所述上清液2在进入所述步骤3)之前，先经膜包浓缩。在一些实施例中，所选择的膜包可以浓缩大于100KD的物质。
进一步，将所述膜囊泡用缓冲液重悬，所述缓冲液按1L体积计算，包括50mM Tris,5mM NaCl,1mM MgSO4,并且pH值为7.4。
在一些实施例中，将菌体与膜囊泡制备为一种生物组合物，制备方法包括：收集上述分离膜囊泡方法中步骤1)分离的所述菌体，将所述菌体与步骤3)所得的所述膜囊泡混合形成所述生物组合物。
进一步，所述步骤1)中，将所述上清液1用0.3-0.5μM滤器过滤去杂质。
优选的，将所述上清液1用045μM滤器过滤去杂质。
进一步，所述步骤1)中的分离方法为离心，所述离心的离心速率为100-10000g；离心时间为10-60min。
优选的，步骤1)的离心的速率为400-8000g；离心时间为10-30min。
进一步，所述步骤2)中的高速离心速率为5000-25000g；离心时间为10-100min。
优选的，步骤2)中的高速离心速率为10000-20000g；离心时间为30-60min。
进一步，所述步骤3)中的所述超高速离心速率为5000-150000g；离心时间为60-600min。
优选的，步骤3)中的超高速离心速率为15000-150000g；离心时间为60-180min。
实施例2细菌膜囊泡增量与纯化
进一步，在一些实施例中，制备细菌膜囊泡的方法还包括以下步骤：1)膜囊泡增量：培养细菌至对数生长期；收集菌体，将所述菌体重悬后用电离射线辐照处理，得辐照细菌；2)膜囊泡分离纯化：用实施例1中所述的分离膜囊泡的方法对辐照菌体和辐照菌体产生的膜囊泡进行分离，得到膜囊泡。
进一步，所述电离射线辐照处理的方式为X-ray射线，辐照剂量为500-3000Gy。所述辐照剂量具体包括：500-600Gy，600-700Gy，700-800Gy，800-900Gy，900-1000Gy，1000-1100Gy，1100-1200Gy，1200-1300Gy，1300-1400Gy，1400-1500Gy，1500-1600Gy，1600-1700Gy，1700-1800Gy，1800-1900Gy，1900-2000Gy,2100-2200Gy,2200-2300Gy,2300-2400Gy,2400-2500Gy,2500-2600Gy,2600-2700Gy,2700-2800Gy,2800-2900Gy,2900-3000Gy。
优选的，所述辐照剂量为500-1000Gy。所述辐照剂量具体包括：500-600Gy，600-700Gy，700-800Gy，800-900Gy，900-1000Gy。
进一步，所述步骤1)中所述对数生长期的细菌的OD600值为0.3-0.8。
优选的，所述步骤1)中所述对数生长期的细菌的OD600值为0.5-0.7。
进一步，所述步骤1)中用磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水重悬所述菌体。
优选的，所述步骤1)中用磷酸盐缓冲液重悬所述菌体。
进一步，所述步骤1)中将所述菌体重悬至OD600值为20-80。
优选的，所述步骤1)中将所述菌体重悬至OD600值为40-60。
上述方法制得的膜囊泡，同未经电离射线辐照的细菌相比，所述膜囊泡中核酸的含量和蛋白质的含量提升了10-20倍。。
本发明制得的膜囊泡具有多种应用场景：例如，(i)可以作为免疫原；(ii)可以作为免疫反应促进剂；(iii)可以作为治疗细菌感染疾病的疫苗；(iv)可以作为疫苗佐剂(在一些实施例中，所述疫苗佐剂为非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答)；(v)可以作为抗原递呈细胞功能促进剂。
上述抗原递呈细胞包括树突状细胞(即DC细胞)，巨噬细胞和B细胞。经过辐射再分离纯化得到的膜囊泡可以作为DC细胞成熟的促进剂，具体地，可以作为促进骨髓来源树突状细胞细表面分子CD80、CD86及MHCII分子显著上调的促进剂。
在一些实施例中，本发明制得的膜囊泡可以联合DC细胞应用在制备CD4+T细胞的增殖剂中。具体地，促进CD4+T细胞增殖的方法包括以下步骤：将辐照处理制备的膜囊泡与吞噬OVA抗原的DCs与CFSE标记的CD4+T淋巴细胞在体外共培养。
实施例3一种分离制备细菌膜囊泡的方法
在一些实施例中，分离制备细菌膜囊泡的方法包括如下步骤：
1.培养细菌至对数生长期，对数生长期的细菌的OD600值为0.3-0.8；最好是选择OD600值为0.5-0.8(此处还可以进行发酵，使菌体进一步富集)；收集菌体，将所述菌体用适量的磷酸盐缓冲液重悬，所加磷酸盐缓冲液的量与菌体总量的比例为每1ml溶液含有的菌量为OD600值20-80；最好是选择OD600值为40-60；重悬后用电离射线辐照处理，得辐照细菌；最好用X-ray射线辐照处理，辐照剂量为500-3000Gy，具体包括：500-600Gy，600-700Gy，700-800Gy，800-900Gy，900-1000Gy，1000-1100Gy，1100-1200Gy，1200-1300Gy，1300-1400Gy，1400-1500Gy，1500-1600Gy，1600-1700Gy，1700-1800Gy，1800-1900Gy，1900-2000Gy,2100-2200Gy,2200-2300Gy,2300-2400Gy,2400-2500Gy,2500-2600Gy,2600-2700Gy,2700-2800Gy,2800-2900Gy,2900-3000Gy。
2.收集菌液，菌液离心并收集上清液，上清液用03-0.5μM滤器过滤除菌；离心速率为400-8000g；离心时间为10-30min。
3.将过滤后的上清液用高速离心机离心，收集上清液，去除鞭毛；高速离心速率为10000-20000g；离心时间为30-60min。
4.将去除鞭毛后的上清液用超高速离心机离心，沉淀膜囊泡；超高速离心速率为15000-150000g；离心时间为60-180min。
5.收集膜囊泡，得纯化后的膜囊泡。
电离射线辐照铜绿假单胞杆菌PAO1制备、分离纯化膜囊泡：
1.从-80℃复苏铜绿假单胞菌PAO1划线至LB平板，37℃培养箱培养16-18h。
2.从LB平板上挑取单克隆菌落接种于20mL LB液体培养基中，37℃，250rpm恒温培养16-18h。
3.取过夜菌液接种至1L LB培养基中，至起始浓度为0.05OD600/mL，37℃，250rpm培养至对数生长期，测OD600值。
4.将上述3)的菌液转移至离心桶中，5,000g离心20min，收集菌体用生理盐水重悬，调整菌体浓度为50OD左右。
5.取上述菌液置于辐照仪中，辐照剂量为1000Gy。
6.将辐照后的菌液8,000×g，20min，离心两次，收集上清液；上清液用0.45μM滤器过滤除菌再次收集得到的上清，同时取少量上清液涂在LB平板上，37℃培养24-72h，以确认无活菌存在。
7.将步骤6)上清液高速离心机离心，除去上清液中的鞭毛。
8.将步骤7)上清液超高速离心机离心，沉淀膜囊泡。
9.弃去上清，沉淀用MVbuffer重悬，-80℃保存。
10.将提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡进行透射电镜观察。同时测定提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡的内容物含量，包括测定其DNA含量、RNA含量和蛋白质含量。最后再测量提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡粒径大小。
实验结果：
由电镜结果可知，电离射线能够刺激绿脓杆菌PAO1产生膜囊泡。膜囊泡见图1。
内容物含量测定结果：实验组(即进行了电离射线刺激)制备的膜囊泡的核酸含量和蛋白质含量与正常对照组(即没有进行电离射线刺激)相比提高10-20倍(表1)。
表1膜囊泡内容物含量测定
辐照剂量Gy DNAng/μL RNAng/μL 蛋白μg/mL 内毒素(EU/ml)
- 24.8 19.7 262.7 1.28×105
980 469.0 364.0 4551.0 1.07×106
实施例4辐照处理的细菌膜囊泡的免疫调节作用-促进树突状细胞的成熟
树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)是机体的主要的抗原递呈细胞，其主要功能是吞噬、处理加工抗原分子，并递呈给T细胞。是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。树突状细胞的成熟状况决定机体产生免疫应答或免疫耐受。DCs表面的共刺激分子B7(B7-1＝CD80和B7-2＝CD86)可以和T细胞表面的CD28或CD152分子结合，加强或者减弱DCs与T细胞之间MHC-TCR的信号传导。在成熟的DCs上主要表现为表明共刺激分子CD80、CD86表达变化，吞噬抗原能力减弱而处理递呈抗原能力增强(MHCII分子表达增高)，以及与T淋巴细胞的相互作用等。
1.小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)细胞诱导培养：取6-8周C57雌性小鼠，无菌分离小鼠股骨，将股骨上的肌肉剔干净后剪开股骨两端，PBS冲洗骨管腔直至发白，将PBS悬液过滤后1200rpm离5min，去上清，加入5ml红细胞裂解液重悬细胞。静置15min后1200rpm离心5min，去上清，加入50ml 1640完全培养基(20ng/ml GM-CSF、10％FBS、50mM 2-巯基乙醇)重悬细胞。混匀后分至5个培养皿中置培养箱中培养，每2天换液，第7天收集细胞。
2.BMDC刺激：取诱导7天的BMDC细胞，6孔板中反复吹打使贴壁细胞脱落，收集细胞悬液，1100rpm离心5min，去上清，加入1ml培养基重悬细胞、活细胞计数，调整细胞浓度至1×106/ml，接种2ml至新的6孔板。加入各刺激物并混匀，分别为：全菌，全菌+囊泡，囊泡，使得终浓度为15μg/mL(以蛋白质为标准)，继续培养24小时，生长对照组加入等体积的PBS。
3.流式检测成熟marker：24h后取出6孔板，反复吹打细胞使其脱落，收集细胞悬液至流式管，1500rpm离心3min，去上清，加入1ml PBS继续1500rpm离心3min后去上清，反复清洗3遍。加入CD11c/CD80/CD86/MHCII抗体室温避光孵育30min，同时阴性对照组应设立一个同型对照组加入CD11c/CD80/CD86/MHCII的同行对照。孵育完成后加入PBS清洗2遍后加入200μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。
4.结果处理：流式细胞仪软件分析CD11c细胞中CD80/CD86/MHCII比例。
实验结果：与全菌体相比，X射线处理的实验组(MVs)囊泡能使刺激后DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII等显著上调，而这些表面分子是树突状细胞成熟的标志。综上证明囊泡能显著促进DCs的分化和成熟。
通过检测FITC标记的葡聚糖荧光强度来检测DC细胞的吞噬能力：DC细胞具有极强的抗原内吞和加工处理能力。在未接触到抗原物质时处于非成熟状态，其吞噬能力强，在接触到抗原激活后变为成熟，其吞噬能力变弱，抗原提呈能力增强。本实验通过检测FITC标记的葡聚糖荧光强度来确定DC的吞噬葡聚糖的多少从而检测DC的吞噬能力是否增强。
1.BMDC细胞诱导培养(同上一实施例)。
2.刺激：第7天收集细胞，将细胞全部吹下后离心重悬计数，然后接种到6孔板，每孔接种1×106个细胞，再分别加入刺激物：GC(Growth Control，生长对照)组加入等体积的PBS，Control对照组及Treatment治疗组加入相同浓度的膜囊泡(按蛋白质水平)后37℃培养24h。
3.吞噬与检测：加入葡聚糖(5μg/ml)，继续培养1h后，吸出细胞到流式管，用PBS洗涤3次后加入CD11c抗体室温避光孵育30min，再用PBS清洗3次后流式检测FITC荧光。
4.结果处理：流式细胞仪软件分析CD11c细胞中FITC比例。
实验数据：为了检测DCs的吞噬功能，本发明采用FITC-葡聚糖作为模式抗原供DCs吞噬，检测CD11c+DCs的FITC平均荧光强度值。实验结果显示，DCs在接受膜囊泡刺激后，FITC平均荧光强度值相比于GC组(生长对照)明显降低。这个实验结果再次证明囊泡能够促进DCs成熟，从而降低其对抗原的摄取能力。
实施例5X射线处理组细菌膜囊泡刺激后的成熟DC与T细胞相互作用：
A.成熟DC与CD4+T细胞相互作用：
DCs对胞外蛋白有效的交叉抗原递呈在诱导特异性细胞免疫反应中具有重要作用。因此检测膜囊泡刺激后DCs对OVA抗原的交叉递呈作用。在DCs-T细胞共培养后的72h，通过CFSE流式细胞术来检测OT-IICD4+T淋巴细胞的增殖情况。荧光染料CFSE(CFDA-SE)，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂。它进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的一半。因此，可以利用流式细胞术对CFSE荧光较弱的细胞百分比进行统计，从而得到增殖细胞的比例。
1.BMDC细胞诱导培养(同上实施例)。
2.抗原吞噬：将培养7天的DCs在含10μg/ml OVA培养基中培养24h作为GC(growthcontrol，生长对照组)，MVs组别另外加入膜囊泡，接下来离心收集吞噬过抗原的DCs并重悬在正常培养基中，以2×104细胞/孔的密度铺板于96孔板中，每孔100μl，每组3个复孔。
3.T细胞提取：在第二天，OT-II小鼠脾脏OVA特异性的CD4+T淋巴细胞使用StemCell Technologies公司的阴性磁珠筛选试剂盒分离富集。
4.DC与T细胞共培养：对分选出的CD4+T细胞按照试剂盒说明书使用1μM CFSE进行标记。标记后用PBS洗涤3次，以105细胞/孔的密度加入到96孔板中，使其培养终体积为200μl(CD4:DC＝5:1)。
5.在共培养后的第3天，利用流式细胞术通过CFSE递减来检测CD4+T细胞群的增殖情况。
实验结果：将经过膜囊泡刺激并吞噬了OVA抗原的DCs与CFSE标记的OT-II小鼠CD4+T淋巴细胞在体外共培养。流式分析CFSE荧光强度结果表明，增殖CD4+T细胞的比例增加。膜囊泡(14.05％)能显著增加吞噬OVA抗原的DCs(6.80％)对于特异性CD4+T细胞的促进增殖作用。详见图2、图3。
B.膜囊泡处理后的DC促进T细胞增殖：
DCs对胞外蛋白有效的交叉抗原递呈在诱导特异性细胞免疫反应中具有重要作用。因此检测囊泡刺激后DCs对OVA抗原的交叉递呈作用。在DCs-T细胞共培养后的72h，通过CFSE流式细胞术来检测T淋巴细胞的增殖情况。荧光染料CFSE(CFDA-SE)，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂。它进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的一半。因此，可以利用流式细胞术对CFSE荧光较弱的细胞百分比进行统计，从而得到增殖细胞的比例。
1.BMDC细胞诱导培养(同上实施例)。
2.抗原吞噬：将培养7天的DCs在培养基中培养24h作为GC(growth control，生长对照组)，MVs组别另外加入囊泡，接下来离心收集吞噬过抗原的DCs并重悬在正常培养基中，以4×104细胞/孔的密度铺板于96孔板中，每孔100μl，每组3个复孔。
3.T细胞提取：在第二天，使用MVs免疫一次后一周的小鼠脾脏Stem CellTechnologies公司的阴性磁珠筛选试剂盒分离富集小鼠的T细胞。
4.DC与T细胞共培养：对分选出的T细胞按照试剂盒说明书使用1μM CFSE进行标记。标记后用PBS洗涤3次，以4×105细胞/孔的密度加入到96孔板中，使其培养终体积为200μl(CD3:DC＝10:1)。
5.在共培养后的第3天，利用流式细胞术通过CFSE递减来检测CD3+，CD8+，CD4+T细胞群的增殖情况。
实验结果：将囊泡刺激并吞噬OVA抗原的DCs与CFSE标记的OT-II小鼠CD4+T淋巴细胞在体外共培养。流式分析CFSE荧光强度结果表明，增殖CD4+T细胞的比例增加。如图所示，菌体加囊泡刺激组荧光强度为63.5％，囊泡刺激组为71％。说明，囊泡处理后DCs，能显著刺激CD4+T细胞的增殖。见图4。
实施例6铜绿假单胞菌疫苗对COPD合并铜绿假单胞菌肺部感染的体内保护实验
1.实验分组
将实验小鼠(C57BL/6小鼠，体重17～19g，雌性，共计60只)进行分组，本实验设8组，包括正常对照组(未经过任何实验处理)、COPD模型组(弹性蛋白酶处理，构建COPD模型)、COPD+免疫组(进行弹性蛋白酶处理，及不同程序的免疫)、COPD+感染组(弹性蛋白酶处理建立COPD模型，然后感染)、COPD+感染+免疫组(弹性蛋白酶处理建立COPD模型、免疫以及感染)(详见表2)。
表2实验分组表
2.免疫
于小鼠腋下皮下注射疫苗(108CFU/ml)免疫，100μl/只，免疫3次，免疫间隔3天或1周，均于末次免疫后1周(即7天)感染攻毒。
3.COPD模型小鼠建立
末次免疫前3天(即感染攻毒前10天)取第2-8组的小鼠，用异氟烷麻醉后，气道灌注弹性蛋白酶(Sigma-Aldrich)0.44U/25L/只，建立COPD模型。正常对照组(即第一组)灌注等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。
4.肺功能及病理检查
于气道灌注弹性蛋白酶后第10天取1-5组小鼠腹腔注射戊巴比妥(30mg/kg)麻醉，行气管插管后测肺功能。随后处死，取肺组织制备切片，HE染色，观察小气道阻塞、细胞浸润和肺气肿症状及其程度。
5.铜绿假单胞菌感染攻毒
5.1铜绿假单胞菌菌种复苏
从超低温冰箱中取出铜绿假单胞菌SKLB PA1复苏至TSA平板，37℃培养过夜。
5.2摇菌过夜
从TSA平板上挑取单克隆于TSB中，37℃，220rpm摇菌过夜。
5.3扩大再培养
取5.2步骤所得的过夜培养细菌液测OD600，再接种至20ml TSB中(250ml锥形瓶)，37℃，220rpm摇菌至对数生长期。
5.4离心洗涤
收集5.3步骤所得的菌液至50ml离心管中，4100rpm(3000×g)室温离心10min，弃上清液，然后在2mLNS(生理盐水)重悬(约5OD/ml)，调整菌液至0.02OD600(约5×106CFU/ml)。
5.5攻毒
末次免疫后1周(即末次免疫后第7天、于气道灌注弹性蛋白酶后第10天)，在小鼠腹腔注射10％水合氯醛40μl/10g体重麻醉，手术切开小鼠气道旁皮肤及肌肉，暴露气道，并且在气道注射50μl菌液(1-7×105CFU)，然后缝合伤口。
5.6涂板计数
取调整后的菌液，NS稀释104倍，用螺旋涂布仪涂TSA板，37℃培养过夜，用菌落计数仪计数CFU。
6.感染后24小时肺组织活菌计数
感染后24小时脱颈椎处死各组小鼠，无菌操作取肺组织，匀浆涂TSA板，37℃培养过夜，计数CFU。
7.数据处理：采用Graphpad Prism作图软件制作肺组织LOG10CFU散点图，计算LOG10CFU。
实验结果：
1.肺功能检查：于气道灌注弹性蛋白酶第10天，取1-5组小鼠腹腔注射戊巴比妥(30mg/kg)麻醉，行气管插管后测肺功能，结果见表3。肺功能检查结果显示，小鼠灌注了弹性蛋白酶0.44U/25L/只后，offset(传感器漂移量)、MV(分钟气量)、AV(累积气量)、VolBal(吸气呼气比)、pExp(呼气段压差)等指标高于或明显高于正常小鼠，dVPEF(％)(达峰容积比)、FIav(流速)、F(呼吸数率)、EF25(第25s呼气容积)等指标低于或明显低于正常小鼠，表明COPD模型建立成功。
表3COPD模型小鼠的部分肺功能指标
(注：*与正常对照组比，p<0.05，有显著性差异；**与正常对照组比，p<0.01，有非常显著性差异。#与COPD模型组比，p<0.05，有显著性差异；##与COPD模型组比，p<0.01，有非常显著性差异)
3.病理组织检查结果
小鼠的肺组织病理检查结果见图5、图6。
正常对照组小鼠肺组织(图5)，可见局部肺泡中有少量红细胞漏出(属于取材操作常见现象)，可见少量炎细胞浸润(淋巴细胞)，余未见异常。
COPD模型组小鼠肺组织(图6)，可见沿细支气管和微血管分布中量炎细胞(淋巴细胞为主)，血管间质周围组织水肿，肺泡中可见少量红细胞漏出；并可见部分区域肺间隔变薄，断裂明显，肺大疱形成(放射性肺泡数)。表明COPD模型建立成功。
4.小鼠肺部的铜绿假单胞菌感染量
实验中所用铜绿假单胞菌SKLBPA1菌悬液浓度为0.01OD/ml，将气道灌注后剩余的菌悬液计数菌落数，结果是感染菌液浓度为4.5×105CFU/ml。
5.铜绿假单胞菌感染24h后小鼠的肺组织细菌荷载量
于感染后24h处死小鼠，无菌取肺组织，计数菌落数。每组比较其均数和标准差。结果表明，疫苗PA1以0、3、7天(图7中向上三角)和0、1、2周(图7中向下三角)两种程序免疫均对COPD合并铜绿假单胞菌肺部感染均具有明显的体内保护作用，可使肺组织细菌荷载量下降2个Log左右。见图7、表4。
表4铜绿假单胞菌感染24h后COPD小鼠的肺组织细菌荷载量
(注：*与模型组比，p<0.05，有显著性差异；**与模型组比，p<0.01，有非常显著性差异)
实施例7抗多重耐药菌感染实验(抗CRPA)
实验步骤：本实验共设3个组(模型组Model、免疫组SKLB-V1、氨曲南治疗组)。免疫组小鼠腹股沟皮下免疫SKLB-V1，1×107CFU/100μL，免疫3针，免疫间隔1周(0、1、2w)。末次免疫后1周分别以本菌SKLBPA1和临床碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(CRPA)C58(来自痰液，临床C58药敏信息见表7，异于疫苗菌种血清型)攻毒挑战。氨曲南治疗组感染后2、4、6、8h腹腔给氨曲南100mg/kg/次，共4次。感染后4h(即给第一次氨曲南后2h)，24h分别取肺组织计细菌荷载量(CFU)。
实验结果见图8和图9。免疫组小鼠细菌荷载量和模型组相比：24h细菌荷载量下降2个log值，显示本发明疫苗降低细菌荷载量有效(图8和图9)。免疫组小鼠细菌荷载量和氨曲南治疗组相比：24h细菌荷载量下降3个log值，显示本发明疫苗相较氨曲南更为优越(图8、图9)。结果提示，本发明疫苗在小鼠身上建立的特异性免疫所发挥的细菌清除效率，优于氨曲南的细菌清除效率。
表5免疫保护-抗SKLBPA1本菌肺部感染
表6免疫保护-抗CRPA临床分离株C58肺部感染
表7临床菌株C58药敏信息
实施例8疫苗单独或与抗生素联用的抗感染作用
本实验共设8个组(模型组Model、V1免疫组、V1免疫+氨曲南治疗组、氨曲南治疗组ATM)，免疫组小鼠腹股沟皮下免疫SKLB-V1，1×107CFU/100μL，共免疫3针，3针免疫程序可以采用(i)0、2、4w(周)；(ii)0、1、2w(周)或(iii)0、3、7d(日)。末次免疫后24h分别以本菌SKLBPA1攻毒挑战。治疗组感染后2、4、6、8h腹腔给氨曲南100mg/kg/次，共4次。感染后2h模型组(无感染)取肺组织计细菌荷载量(CFU)；感染后24h各组取肺组织计细菌荷载量(CFU)。上述实验程序示意图见图10。
本实验结果显示本发明疫苗单独或与抗生素联用有抗感染效果(图11、表8)，具体地：
在本模型条件下，3个免疫程序0、1、2w；0、2、4w；0、3、7d，与模型组相比，均有效降低了细菌荷载量。说明这三个免疫程序都能有效降低感染的细菌荷载量。其中，免疫程序0、1、2w；0、2、4w效果略好于免疫程序0、3、7d，并且优于单用氨曲南。值得注意的是，0、3、7d的免疫程序，同样可以快速产生有效免疫反应，那么本发明疫苗不仅可以用来预防COPD合并感染(即作为预防性疫苗)，也有可以用在感染发生后抑制感染、缓解感染的可能(即作为治疗性疫苗的可能)。
与氨曲南联合后，3个免疫程序的SKLB-V1与抗生素氨曲南联用抗感染效果明显优于单用疫苗或单用氨曲南，显示SKLB-V1与抗生素氨曲南有协同抗感染作用。
表8疫苗单独或与抗生素联用的抗感染作用
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (12)

1.铜绿假单胞菌疫苗在制备防治呼吸系统疾病合并铜绿假单胞菌感染的药物中的应用，其特征在于，所述呼吸系统疾病为慢性阻塞性肺疾病；所述铜绿假单胞菌疫苗用于减少肺组织中的细菌荷载量；所述铜绿假单胞菌疫苗包括经辐照灭活的铜绿假单胞菌，和从辐照灭活的铜绿假单胞菌中分离获得的膜囊泡；所述辐照灭活是经X-ray射线辐照灭活，辐照剂量为900-1000Gy。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢性阻塞性肺疾病包括慢性支气管炎和肺气肿。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述慢性阻塞性肺疾病为急性加重慢性阻塞性肺疾病。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌疫苗含有铜绿假单胞菌全菌体的含量包括：1×104-1×1011/针。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌疫苗含有铜绿假单胞菌全菌体的含量包括以下：1×104/针、1×105 /针、1×106/针、1×107/针、1×108/针、1×109/针和1×1011/针。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌疫苗还含有免疫佐剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫佐剂为氢氧化铝。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述铜绿假单胞菌疫苗的给药部位为皮下、肌肉和/或粘膜。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包含任何药学上可接受的载体和/或助剂。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述载体为脂质体。
11.一种治疗呼吸系统疾病合并铜绿假单胞菌感染的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1中所述的铜绿假单胞菌疫苗和至少一种抗生素。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述抗生素为氨曲南。
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