CN112646046A - 用于预防铜绿假单胞菌感染的多表位融合蛋白及其编码基因、表达载体和应用 - Google Patents

用于预防铜绿假单胞菌感染的多表位融合蛋白及其编码基因、表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于预防铜绿假单胞菌感染的融合蛋白，包含线性连接组合的第一肽段、第二肽段和第三肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:94，所述第二肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:95，所述第三肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:96的第三肽段。本发明还提供了编码该融合蛋白的重组基因，以及该融合蛋白在预防铜绿假单胞菌感染中的应用。本发明的融合蛋白能够有效预防多种血清型铜绿假单胞菌感染。

Description

用于预防铜绿假单胞菌感染的多表位融合蛋白及其编码基 因、表达载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种用于预防铜绿假单胞菌感染的融合蛋白及其编码基因、表达载体和应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，是临床上机械通气性肺炎(VAP)最为常见的条件致病菌。随着PA的耐药性不断增强，常规抗生素治疗手段效果有限，迫切需要其他手段，用来预防和控制PA的感染。疫苗是预防和控制感染性疾病最为有效的手段，从20世纪70年代研发至今，但国内外仍未有一个PA疫苗成功上市，已经进入临床实验的PA疫苗有四个，其中有三个已经宣告失败。传统的疫苗主要依赖于抗体，但PA的具有高度的多样性和变异性，可能是导致上述传统疫苗研发失败的主要原因。
Th17应答在抵抗肺部病原微生物感染的过程中发挥关键作用，此外这钟保护不依赖特异性抗体，因此具有一定的广谱性。在抵抗肺部PA感染的过程中，Th17应答也发挥着关键的作用。因此越来越多的新型疫苗希望通过激发抗原特异性的Th17应答来发挥保护效果，例如百日咳减毒疫苗、肺炎链球菌疫苗、口腔念珠菌疫苗等。
筛选出保护性抗原的免疫优势表位并进行合理地设计改造，组合而成的多表位疫苗具有以下三种优势：⑴多表位疫苗更安全的。多表位疫苗不存在感染风险，且大大降低了过度应答造成炎症或者与人体存在交叉表位造成免疫损伤的潜在风险。同时因其理化性质、生物学作用更加明确，所以更安全也更易开发成药物使用。⑵多表位疫苗可诱导高效免疫应答。与表位“隐藏”在整个抗原或病原体中相比，将免疫优势表位筛选出来制成疫苗能更高效的引发更强烈的免疫应答。⑶多表位疫苗能够根据需要进行设计组合。将多个抗原中高度保守的免疫优势表位进行组合，将更有效的攻克病原菌高度变异的难题；或将引发不同免疫应答类型的多个表位进行合理组合，从而引发更加全面的免疫应答，以达到彻底清除病原菌的目的。
发明内容
本发明针对现有疫苗设计策略的不足，提供了一种免疫原性好、可有效预防多种血清型铜绿假单胞菌感染的多表位融合蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的技术方案如下：
本发明首先提供了一种用于预防铜绿假单胞菌感染的融合蛋白，包含线性连接组合的第一肽段、第二肽段和第三肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO：94，所述第二肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO：95，所述第三肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO：96的第三肽段。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白中一个或多个氨基酸残基经乙酰化、羧基化或糖基化修饰。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白中还含有标签序列，所述标签序列选自Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ、c-myc或GST标签中的一种或多种。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明还提供了编码上述融合蛋白的重组基因；优选地，所述重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
本发明进一步提供了一种表达载体，包含上述的重组基因。
本发明还提供了一种用于表达上所述的融合蛋白的重组菌株，所述重组菌株含有上述的重组基因或者表达载体。所述重组菌株的宿主菌可以是细菌可真菌，可以是大肠杆菌、酿酒酵母菌、农杆菌等，优选为大肠杆菌。
本发明更进一步提供了上述的融合蛋白在制备用于预防铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
本发明的另一方面还提供了一种用于预防铜绿假单胞菌感染的药物组合物，所述药物组合物中活性成分含有上述的融合蛋白。
优选地，所述药物组合物实施为疫苗；更优选地，所述疫苗中还含有药学上可接受的佐剂，进一步优选地，所述佐剂为热凝胶多糖(Curdlan)。
本发明提供的技术方案具有以下有益效果：
本发明提供了一种多表位融合蛋白及其编码基因和应用，本发明的融合蛋白免疫原性好、可有效预防多种血清型铜绿假单胞菌感染。可制备成疫苗等药物，用于预防铜绿假单胞菌的感染。
附图说明
图1是本发明实施例1中鉴定PcrV中能够诱导Th17应答的表位的结果，横坐标为PcrV合成步移多肽序号，纵坐标为经相应肽段刺激后，肺淋巴细胞Th17应答强度。
图2是本发明实施例1中鉴定AmpC中能够诱导Th17应答的表位的结果，横坐标为AmpC合成步移多肽序号，纵坐标为经相应肽段刺激后，肺淋巴细胞Th17应答强度。
图3是本发明实施例3提供的重组质粒pGEX-6P-PVAC的双酶切鉴定结果示意图；
图中：泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6P-PVAC经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约1627bp。
图4是本发明实施例2提供的诱导表达的PVAC鉴定结果示意图；
图中：泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道2：诱导表达后工程菌全菌；泳道3：破菌后，菌体碎片沉淀；泳道4：破菌后上清；泳道5：与GST填料结合后的破菌上清；泳道6：结合PVAC目的蛋白后的GST填料；泳道7：PP酶切后的上清。
图5是本发明实施例3提供的纯化后的PVAC的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图中：泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道2：纯化的PVAC。
图6是实施例5中PVAC免疫小鼠后，小鼠肺部Th17应答的检测结果，横坐标为各实验分组，纵坐标为各组肺部淋巴细胞中CD4+IL17A+T细胞的比例。
图7是实施例5中检测PVAC免疫保护效果Th17依赖性的结果，横坐标为攻毒后的时间，纵坐标为对应时刻的生存率，图中实心圆形的折线代表PVAC免疫后的IL-17A敲除小鼠的生存曲线，实心正方形是PVAC免疫后的野生型小鼠的生存曲线，实心三角形为未免疫野生型小鼠的生存曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1抗原蛋白优势抗原表位的预测分析
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白，所述疫苗重组蛋白为(a)：
(a)如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的疫苗重组蛋白；
根据本发明，本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白还可以进行修饰，得到衍生的蛋白质。修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，可以在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签。所述标签不会影响本发明的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。
表1
Figure BDA0002890704370000051
根据本发明，上述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。
第二方面，本发明还提供了能够编码上述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的基因。
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)，得到本发明所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的氨基酸序列。
优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。
如上所述，相应地，核苷酸序列的5’端和/或3’端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。
根据本发明，本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。
一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。
此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
第三方面，本发明提供了一种含有第二方面所述的基因的重组载体。
根据本发明，重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pGEX载体。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。此外，重组载体的构建也可以委托生物公司按照要求完成，例如，提供给生物公司目的基因序列、需要连接的载体类型以及插入到载体中的位点等信息。所述生物公司可以为任意的具备完成上述操作能力的公司，例如，可以为上海生工生物工程有限公司。
第四方面，本发明提供了一种含有第三方面所述的重组载体的重组菌株。
根据本发明，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆状菌，如大肠杆菌(Escherichiacoli)，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌XL-1Blue。
第五方面，本发明提供了一种制备铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的方法，包括：
(1)培养第四方面所述的重组菌株，诱导编码铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的基因的表达；
(2)分离提纯所表达的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组菌株以及第五方面所述的制备铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白的方法在制备用于预防铜绿假单胞菌感染的疫苗中的应用。
第七方面，本发明提供了一种用于预防铜绿假单胞菌感染的疫苗，所述疫苗含有第一方面所述的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白作为活性成分。
根据本发明，所述疫苗根据给药途径的不同可以含有相应的药学上可接受的佐剂，这些均为本领域技术人员所公知。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.铜绿假单胞菌菌株
PA XN-1来自中国典型培养物保藏中心(保藏号：CCTCC M 2015730)。
2.试剂
质粒pGEX-6p-1购自GE Healthcare Life Sciences
大肠杆菌菌株XL-1Blue购自上海超研生物科技有限公司
DNA Marker、限制性内切酶BamH I和EcoR I购自大连TakaRa公司
蛋白Marker为Thermo fisher公司产品，EB购自上海俊晟生物科技有限公司
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；细菌基因组提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根生化科技有限公司产品；谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。
实施例1 PcrV中诱导Th17应答的表位鉴定
1、多候选表位肽的合成
委托江苏金斯瑞生物科技有限公司根据PcrV氨基酸序列(NCBI ReferenceSequence:NP_250397.1)合成步移多肽。下列为合成多肽对应氨基酸序列，见表2：
表2：PcrV肽库氨基酸组成
Figure BDA0002890704370000081
Figure BDA0002890704370000091
2、PcrV免疫小鼠及免疫后肺淋巴细胞分离
将浓度为5mg/ml的PcrV蛋白液与浓度为20mg/ml的Curdlan储存液等体积混合制剂。异氟烷气体麻醉小鼠后，滴鼻接种上述混悬液，每只小鼠10ul,接种时间点分别为0、14、21天。末次免疫后14天，进行肺淋巴细胞分离。
脱颈处死小鼠，75％酒精浸泡，放于干燥平皿。无菌取出肺部，置于PBS中，冰上保存。转移肺组织于5mL离心管中，剪刀剪碎。用8mL消化液悬浮剪碎的组织于15mL离心管中，盖紧离心管，以37℃，260转孵育2h。消化液的配制方法为1640培养基中添加2％胎牛血清，1‰CaCl2和MgCl2，以及终浓度为150U/ml的II型胶原酶。将消化后的组织置于200目细胞筛上磨碎，取过滤后的细胞悬液，2000rpm离心5min.弃上清，用percoll密度梯度离心分离其中淋巴细胞。
1、ELIspot筛选PcrV中能够诱导Th17应答的表位
按照试剂盒(3521-4HPW-2,MabTech)说明书先清洗并活化预先包被好的96孔板，将上述获得的肺部淋巴细胞铺于孔中，数量为2.5x105个/ml,多肽终浓度为5μM，在CO2含量为5％的孵箱重孵育72h.孵育完成后按照试剂盒说明书进一步检测读数。根据增强倍数＝(Nimmunuzed-Nunimmunized)/Nunimmunized，其中Nimmunuzed和Nunimmunized分别为免疫组来源的肺淋巴细胞和未免疫组来源肺淋巴细胞经各个多肽刺激后产生的斑点数量。经过计算得到PcrV中强烈诱导Th17应答的表位集中分部在其N端(如图1)，因此选择PcrV的N端作为融合抗原的一部分。
实施例2 AmpC中诱导Th17应答的表位鉴定
1、多候选表位肽的合成
委托江苏金斯瑞生物科技有限公司根据AmpC氨基酸序列(NCBI ReferenceSequence:NP_252799.1)合成步移多肽。下列为合成多肽对应氨基酸序列，见表3：
表3：AmpC肽库氨基酸组成
Figure BDA0002890704370000101
Figure BDA0002890704370000111
Figure BDA0002890704370000121
2、AmpC免疫小鼠及免疫后肺淋巴细胞分离
将浓度为5mg/ml的AmpC蛋白液与浓度为20mg/ml的Curdlan储存液等体积混合制剂。异氟烷气体麻醉小鼠后，滴鼻接种上述混悬液，每只小鼠10ul,接种时间点分别为0、14、21天。末次免疫后14天，按照实施例1步骤2进行肺淋巴细胞分离。
3.ELIspot筛选AmpC中能够诱导Th17应答的表位
按照试剂盒(3521-4HPW-2,MabTech)说明书先清洗并活化预先包被好的96孔板，将上述获得的肺部淋巴细胞铺于孔中，数量为2.5x105个/ml,多肽终浓度为5μM，在CO2含量为5％的孵箱重孵育72h.孵育完成后按照试剂盒说明书进一步检测读数。根据增强倍数＝(Nimmunuzed-Nunimmunized)/Nunimmunized，其中Nimmunuzed和Nunimmunized分别为免疫组来源的肺淋巴细胞和未免疫组来源肺淋巴细胞经各个多肽刺激后产生的斑点数量。经过计算得到AmpC中强烈诱导Th17应答的表位分散于整个蛋白(如图2)，考虑到如果单独截取部分序列可能会影响蛋白质的构象，因此，本发明选择全长AmpC作为融合蛋白的一部分。
实施例3 PVAC重组表达载体的构建、表达、纯化及鉴定
1、载体的构建
委托上海生工生物工程有限公司合成编码PVAC的DNA(SEQ ID NO:2)
2、重组质粒的转化
从-80℃冰箱取1管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，加入1μl合成的pGEX-6P-PVAC质粒。冰浴50min，42℃金属浴中热击60s，迅速冰浴1min。加入1000μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rpm振摇1h。各管以5000rpm室温离心3min.，弃去900μl上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
3、双酶切鉴定
取37℃摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒提取阳性克隆的质粒。使用BamH I和XhoI进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：
Figure BDA0002890704370000131
灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB0.5μg/ml，将上述酶切反应体系中各加入1μl 6×Loading buffer，通过凝胶80V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现转化有pGEX-6P-PVAC质粒的阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约4000bp为表达载体pGEX-6P-1部分，小片段约1600bp，为插入的编码PVAC的片段(图3)，证明重组载体构建成功，且能够在重组大肠杆菌中进行表达。
4、PVAC诱导表达及破菌上清处理
取实施例3步骤2中过夜培养的pGEX-6p-1-PVAC/XL-1blue菌液200μL加入20mLAmp+抗性的LB培养基中，180rpm 37℃过夜培养，取过夜培养的菌液200μL加入20mL Amp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃、220rpm培养至OD600为0.4时，温度调整为16℃，转速调整为150rpm，待OD600为0.8时，加入IPTG 4μL(1mol/L)，使其终浓度为200μM，再置于摇床16℃诱导表达过夜。
将诱导表达后的菌液取出，以5000rpm离心20min，弃去上清，加入1mL裂解缓冲液(PBS)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心10min，分离上清和沉淀。
取Glutathione Sepharose 4B 200μl，用PBS洗涤3次后，将如上获得的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以10000rpm离心3min后，使用PB(含1MNaCl)洗涤3次，PB(含0.5M NaCl)洗涤3次,PBS洗涤2次。取40μl结合后的GlutathioneSepharose 4B加入10μl 5×蛋白质上样buffer，100℃煮沸5min使样品变性，10000rpm离心3min，备用。
5、PVAC目的蛋白酶切及SDS-PAGE电泳
按照如上同样方法制备结合目的蛋白PVAC的Glutathione Sepharose 4B填料，在填料中加入100μL PBS和20μL PreScission protease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清，取40μL样品加入10μL 5×蛋白质上样buffer，100℃煮沸5min使样品变性，10000rpm离心3min备用。按照相同的方法在Glutathione Sepharose 4B中加入PP酶，酶切后的Glutathione Sepharose 4B用100μL PBS洗涤3次，然后取40μL样品，加入10μL 5×蛋白质上样buffer，100℃煮沸5min使样品变性，10000rpm离心3min备用。
使用达科为蛋白凝胶配制试剂盒(达优，8012011)配制凝胶，立即插上梳子，室温放置20min使其凝固备用。将处理好的样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先100v电泳将样品在浓缩胶中压为一条直线，再调至200v，电泳40min左右，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，pGEX-6p-1-PVAC在16℃中以可溶性的形式表达(图4，泳道7)。
6、PVAC抗原的制备
取实施例3步骤2中过夜培养的pGEX-6p-1-PVAC/XL-1blue菌液200μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，220rpm 37℃培养5～6h后，取20mL一次活化的菌液加入到2000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃，220rpm培养至OD600为0.4时，温度降为16℃，转速降为150rpm，继续培养至OD600为0.8时，加入200μLIPTG(终浓度为200μM)，置于16℃摇床中过夜诱导后，5000rpm离心20min收集菌体，再加50mL裂解缓冲液(同实施例3)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解15min(超声功率38％，开8s，关9s)，收集上清与10ml用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B结合，并入实施例3中洗涤处理。
向10mL已结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入10ml PBS和2mlPreScission protease(PP酶，GE公司)，4℃垂直旋转酶切过夜后，离心吸取上清后取40μL按照实施例3步骤4的方法进行变性及电泳，在呈像系统下观察结果，酶切得到的PVAC蛋白分子量约60kDa，与预期蛋白分子量大小相符合，见图5，泳道2。
实施例4 PVAC验证实验
1、PVAC免疫小鼠
将浓度为5mg/ml的PVAC蛋白液与浓度为20mg/ml的Curdlan储存液等体积混合制剂。异氟烷气体麻醉小鼠后，滴鼻接种上述混悬液，每只小鼠10ul,接种时间点分别为0、14、21天。末次免疫后14天，进行攻毒保护试验并观察保护效果。
2、铜绿假单胞菌肺部感染观察保护效果
PVAC重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：Wan C等Front Immunol，2019 Apr 24；10:781进行。简要地说，每组10只小鼠，PVAC第三次免疫后14天，用生理盐水将洗涤准备的PA XN-1菌并调节浓度至5×108CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后建立肺部感染模型，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照、Curdlan佐剂作为阴性对照。感染结束后每隔12h观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表4。
表4：
Figure BDA0002890704370000151
实施例5 Th17的应答检测
1、免疫后小鼠肺部Th17应答检测
按照实施例4步骤1免疫小鼠，末次免疫14天后按照实施例1步骤2分离小鼠肺部淋巴细胞，铺于96孔平地板中，加入淋巴细胞刺激因子及高尔基体阻断剂在细胞培养箱孵育培养5h.然后对上述细胞进行流式抗体染色，首先标记细胞表面CD3和CD4分子，再对细胞进行固定通透标记细胞内因子IL-17A,IL-4及IFN-γ.染色完成后上机检测。PVAC+Curdlan滴鼻(i.n)免疫小鼠后能够强烈诱导小鼠肺部的Th17应答，见图6。
2、免疫IL-17A KO小鼠攻毒保护
按照实施例4步骤1免疫小鼠，末次免疫14天后，按照实施例4步骤2进行攻毒，分组为免疫后的IL-17A KO小鼠，免疫后的野生型小鼠以及未免疫的野生型小鼠。
结果如图7所示，可见免疫后的IL-17A KO小鼠生存率显著低于免疫后的野生型小鼠，说明PVAC滴鼻免疫的保护效果依赖于Th17发挥作用，而PVAC能够有效激活Th17应答。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQ ID NO：1：
MetArgAspThrArgPheProCysLeuCysGlyIleAlaAlaSerThrLeuLeuPheAlaThrThrProAlaIleAlaGlyGluAlaProAlaAspArgLeuLysAlaLeuValAspAlaAlaValGlnProValMetLysAlaAsnAspIleProGlyLeuAlaValAlaIleSerLeuLysGlyGluProHisTyrPheSerTyrGlyLeuAlaSerLysGluAspGlyArgArgValThrProGluThrLeuPheGluIleGlySerValSerLysThrPheThrAlaThrLeuAlaGlyTyrAlaLeuThrGlnAspLysMetArgLeuAspAspArgAlaSerGlnHisTrpProAlaLeuGlnGlySerArgPheAspGlyIleSerLeuLeuAspLeuAlaThrTyrThrAlaGlyGlyLeuProLeuGlnPheProAspSerValGlnLysAspGlnAlaGlnIleArgAspTyrTyrArgGlnTrpGlnProThrTyrAlaProGlySerGlnArgLeuTyrSerAsnProSerIleGlyLeuPheGlyTyrLeuAlaAlaArgSerLeuGlyGlnProPheGluArgLeuMetGluGlnGlnValPheProAlaLeuGlyLeuGluGlnThrHisLeuAspValProGluAlaAlaLeuAlaGlnTyrAlaGlnGlyTyrGlyLysAspAspArgProLeuArgValGlyProGlyProLeuAspAlaGluGlyTyrGlyValLysThrSerAlaAlaAspLeuLeuArgPheValAspAlaAsnLeuHisProGluArgLeuAspArgProTrpAlaGlnAlaLeuAspAlaThrHisArgGlyTyrTyrLysValGlyAspMetThrGlnGlyLeuGlyTrpGluAlaTyrAspTrpProIleSerLeuLysArgLeuGlnAlaGlyAsnSerThrProMetAlaLeuGlnProHisArgIleAlaArgLeuProAlaProGlnAlaLeuGluGlyGlnArgLeuLeuAsnLysThrGlySerThrAsnGlyPheGlyAlaTyrValAlaPheValProGlyArgAspLeuGlyLeuValIleLeuAlaAsnArgAsnTyrProAsnAlaGluArgValLysIleAlaTyrAlaIleLeuSerGlyLeuGluGlnGlnGlyLysValProLeuLysArgGlySerGlyGlySerGlyGlySerGluGlnGluGluLeuLeuAlaLeuLeuArgSerGluArgIleValLeuAlaHisAlaGlyGlnProLeuSerGluAlaGlnValLeuLysAlaLeuAlaTrpLeuLeuAlaAlaAsnProSerAlaProProGlyGlnGlyLeuGluValLeuArgGluValLeuGlnAlaArgArgGlnProGlyAlaGlnTrpAspLeuArgGluPheLeuValSerAlaTyrPheSerLeuHisGlyArgLeuAspGluAspValIleGlyValTyrLysAspValLeuGlnThrGlnAspGlyGlyGlyGlySerLysGluThrGluAlaArgLeuThrAlaThrGluAspAlaAlaAlaArgAlaGlnAlaArgAlaAspGluAlaTyrArgLysAlaAspGluAlaLeuGlyAlaAlaGlnLysAlaGlnGlnThrAlaAspGluAlaAsnGluArgAlaLeuArgMetLeuGluLysAlaSerArgLysGluPhe
SEQ ID NO：2：
ATGCGTGATACCCGTTTTCCGTGTCTGTGTGGTATTGCAGCAAGCACCCTGCTGTTTGCAACCACACCGGCAATTGCAGGCGAAGCACCGGCAGATCGTCTGAAAGCACTGGTTGATGCAGCAGTTCAGCCGGTTATGAAAGCAAATGATATTCCTGGTCTGGCAGTTGCAATTAGCCTGAAAGGTGAACCGCACTATTTTAGCTATGGTCTGGCCAGCAAAGAAGATGGTCGTCGCGTTACACCGGAAACACTGTTTGAAATTGGTAGCGTTAGCAAAACCTTTACCGCAACACTGGCAGGTTATGCACTGACCCAGGATAAAATGCGTCTGGATGATCGTGCAAGCCAGCATTGGCCTGCACTGCAGGGTAGCCGTTTTGATGGTATTAGCCTGCTGGATCTGGCAACCTATACCGCAGGCGGTCTGCCGCTGCAGTTTCCGGATAGCGTTCAGAAAGATCAGGCACAGATTCGTGATTATTATCGTCAGTGGCAGCCGACCTATGCACCGGGTAGCCAGCGTCTGTATAGCAATCCGAGCATTGGTCTGTTTGGTTATCTGGCAGCACGTAGTCTGGGTCAGCCGTTTGAACGTCTGATGGAACAGCAGGTTTTTCCGGCACTGGGTTTAGAACAGACCCATCTGGATGTTCCGGAAGCAGCACTGGCACAGTATGCACAAGGTTATGGTAAAGATGATCGTCCGCTGCGTGTTGGTCCGGGTCCGCTGGATGCCGAAGGCTATGGTGTTAAAACCAGCGCAGCAGATTTACTGCGTTTTGTTGATGCAAATCTGCATCCGGAACGTCTGGATCGTCCGTGGGCACAAGCACTGGATGCAACCCATCGTGGTTATTACAAAGTTGGTGATATGACCCAAGGTTTAGGTTGGGAAGCCTATGATTGGCCGATTAGTCTGAAACGTCTGCAGGCAGGTAATAGCACCCCGATGGCACTGCAGCCGCATCGTATTGCACGTCTGCCAGCACCGCAGGCACTGGAAGGTCAGCGTCTGCTGAATAAAACCGGTAGCACCAATGGTTTTGGTGCCTATGTTGCATTTGTTCCGGGTCGTGATTTAGGTCTGGTTATTCTGGCCAATCGTAATTATCCGAATGCCGAACGTGTTAAAATTGCCTATGCAATTCTGAGCGGTCTGGAACAACAGGGTAAAGTTCCGCTGAAACGTGGTAGCGGTGGTTCAGGTGGTAGCGAACAAGAAGAACTGCTGGCACTGCTGCGTAGCGAACGTATTGTTCTGGCACATGCAGGTCAGCCGCTGAGCGAAGCACAGGTTCTGAAAGCCTTAGCATGGCTGCTGGCAGCAAATCCGAGCGCACCGCCTGGTCAAGGTCTGGAAGTTCTGCGTGAAGTGCTGCAGGCACGTCGTCAGCCTGGTGCACAGTGGGATCTGCGCGAATTTCTGGTTAGCGCGTATTTTAGCCTGCATGGTCGCCTGGATGAAGATGTTATTGGTGTTTATAAAGATGTGCTGCAGACACAGGATGGTGGTGGCGGTAGCAAAGAAACCGAAGCACGTCTGACCGCAACCGAAGATGCCGCAGCACGTGCACAGGCACGTGCAGATGAAGCATATCGTAAAGCCGATGAAGCACTGGGTGCCGCACAGAAAGCACAGCAGACAGCGGATGAAGCCAATGAACGTGCACTGCGTATGCTGGAAAAAGCAAGCCGTAAAGAATTT
SEQ ID NO：94PcrV的N端(28Glu-126Gly)
GluGlnGluGluLeuLeuAlaLeuLeuArgSerGluArgIleValLeuAlaHisAlaGlyGlnProLeuSerGluAlaGlnValLeuLysAlaLeuAlaTrpLeuLeuAlaAlaAsnProSerAlaProProGlyGlnGlyLeuGluValLeuArgGluValLeuGlnAlaArgArgGlnProGlyAlaGlnTrpAspLeuArgGluPheLeuValSerAlaTyrPheSerLeuHisGlyArgLeuAspGluAspValIleGlyValTyrLysAspValLeuGlnThrGlnAspGly
SEQ ID NO：95OprI(24Ser-83Lys)
SerLysGluThrGluAlaArgLeuThrAlaThrGluAspAlaAlaAlaArgAlaGlnAlaArgAlaAspGluAlaTyrArgLysAlaAspGluAlaLeuGlyAlaAlaGlnLysAlaGlnGlnThrAlaAspGluAlaAsnGluArgAlaLeuArgMetLeuGluLysAlaSerArgLys
SEQ ID NO：96AmpC(1Met-397Arg)
MetArgAspThrArgPheProCysLeuCysGlyIleAlaAlaSerThrLeuLeuPheAlaThrThrProAlaIleAlaGlyGluAlaProAlaAspArgLeuLysAlaLeuValAspAlaAlaValGlnProValMetLysAlaAsnAspIleProGlyLeuAlaValAlaIleSerLeuLysGlyGluProHisTyrPheSerTyrGlyLeuAlaSerLysGluAspGlyArgArgValThrProGluThrLeuPheGluIleGlySerValSerLysThrPheThrAlaThrLeuAlaGlyTyrAlaLeuThrGlnAspLysMetArgLeuAspAspArgAlaSerGlnHisTrpProAlaLeuGlnGlySerArgPheAspGlyIleSerLeuLeuAspLeuAlaThrTyrThrAlaGlyGlyLeuProLeuGlnPheProAspSerValGlnLysAspGlnAlaGlnIleArgAspTyrTyrArgGlnTrpGlnProThrTyrAlaProGlySerGlnArgLeuTyrSerAsnProSerIleGlyLeuPheGlyTyrLeuAlaAlaArgSerLeuGlyGlnProPheGluArgLeuMetGluGlnGlnValPheProAlaLeuGlyLeuGluGlnThrHisLeuAspValProGluAlaAlaLeuAlaGlnTyrAlaGlnGlyTyrGlyLysAspAspArgProLeuArgValGlyProGlyProLeuAspAlaGluGlyTyrGlyValLysThrSerAlaAlaAspLeuLeuArgPheValAspAlaAsnLeuHisProGluArgLeuAspArgProTrpAlaGlnAlaLeuAspAlaThrHisArgGlyTyrTyrLysValGlyAspMetThrGlnGlyLeuGlyTrpGluAlaTyrAspTrpProIleSerLeuLysArgLeuGlnAlaGlyAsnSerThrProMetAlaLeuGlnProHisArgIleAlaArgLeuProAlaProGlnAlaLeuGluGlyGlnArgLeuLeuAsnLysThrGlySerThrAsnGlyPheGlyAlaTyrValAlaPheValProGlyArgAspLeuGlyLeuValIleLeuAlaAsnArgAsnTyrProAsnAlaGluArgValLysIleAlaTyrAlaIleLeuSerGlyLeuGluGlnGlnGlyLysValProLeuLysArg
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 用于预防铜绿假单胞菌感染的多表位融合蛋白及其编码基因、表达载体和应用
<141> 2021-01-09
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 569
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 1
Met Arg Asp Thr Arg Phe Pro Cys Leu Cys Gly Ile Ala Ala Ser Thr
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Thr Thr Pro Ala Ile Ala Gly Glu Ala Pro Ala Asp
20 25 30
Arg Leu Lys Ala Leu Val Asp Ala Ala Val Gln Pro Val Met Lys Ala
35 40 45
Asn Asp Ile Pro Gly Leu Ala Val Ala Ile Ser Leu Lys Gly Glu Pro
50 55 60
His Tyr Phe Ser Tyr Gly Leu Ala Ser Lys Glu Asp Gly Arg Arg Val
65 70 75 80
Thr Pro Glu Thr Leu Phe Glu Ile Gly Ser Val Ser Lys Thr Phe Thr
85 90 95
Ala Thr Leu Ala Gly Tyr Ala Leu Thr Gln Asp Lys Met Arg Leu Asp
100 105 110
Asp Arg Ala Ser Gln His Trp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Arg Phe Asp
115 120 125
Gly Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ala Thr Tyr Thr Ala Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Leu Gln Phe Pro Asp Ser Val Gln Lys Asp Gln Ala Gln Ile Arg Asp
145 150 155 160
Tyr Tyr Arg Gln Trp Gln Pro Thr Tyr Ala Pro Gly Ser Gln Arg Leu
165 170 175
Tyr Ser Asn Pro Ser Ile Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Arg Ser
180 185 190
Leu Gly Gln Pro Phe Glu Arg Leu Met Glu Gln Gln Val Phe Pro Ala
195 200 205
Leu Gly Leu Glu Gln Thr His Leu Asp Val Pro Glu Ala Ala Leu Ala
210 215 220
Gln Tyr Ala Gln Gly Tyr Gly Lys Asp Asp Arg Pro Leu Arg Val Gly
225 230 235 240
Pro Gly Pro Leu Asp Ala Glu Gly Tyr Gly Val Lys Thr Ser Ala Ala
245 250 255
Asp Leu Leu Arg Phe Val Asp Ala Asn Leu His Pro Glu Arg Leu Asp
260 265 270
Arg Pro Trp Ala Gln Ala Leu Asp Ala Thr His Arg Gly Tyr Tyr Lys
275 280 285
Val Gly Asp Met Thr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Ala Tyr Asp Trp Pro
290 295 300
Ile Ser Leu Lys Arg Leu Gln Ala Gly Asn Ser Thr Pro Met Ala Leu
305 310 315 320
Gln Pro His Arg Ile Ala Arg Leu Pro Ala Pro Gln Ala Leu Glu Gly
325 330 335
Gln Arg Leu Leu Asn Lys Thr Gly Ser Thr Asn Gly Phe Gly Ala Tyr
340 345 350
Val Ala Phe Val Pro Gly Arg Asp Leu Gly Leu Val Ile Leu Ala Asn
355 360 365
Arg Asn Tyr Pro Asn Ala Glu Arg Val Lys Ile Ala Tyr Ala Ile Leu
370 375 380
Ser Gly Leu Glu Gln Gln Gly Lys Val Pro Leu Lys Arg Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gln Glu Glu Leu Leu Ala Leu Leu Arg Ser
405 410 415
Glu Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly Gln Pro Leu Ser Glu Ala Gln
420 425 430
Val Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Ala Pro
435 440 445
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu Val Leu Gln Ala Arg Arg
450 455 460
Gln Pro Gly Ala Gln Trp Asp Leu Arg Glu Phe Leu Val Ser Ala Tyr
465 470 475 480
Phe Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp Val Ile Gly Val Tyr Lys
485 490 495
Asp Val Leu Gln Thr Gln Asp Gly Gly Gly Gly Ser Lys Glu Thr Glu
500 505 510
Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg
515 520 525
Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln
530 535 540
Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met
545 550 555 560
Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Glu Phe
565
<210> 2
<211> 1707
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 2
atgcgtgata cccgttttcc gtgtctgtgt ggtattgcag caagcaccct gctgtttgca 60
accacaccgg caattgcagg cgaagcaccg gcagatcgtc tgaaagcact ggttgatgca 120
gcagttcagc cggttatgaa agcaaatgat attcctggtc tggcagttgc aattagcctg 180
aaaggtgaac cgcactattt tagctatggt ctggccagca aagaagatgg tcgtcgcgtt 240
acaccggaaa cactgtttga aattggtagc gttagcaaaa cctttaccgc aacactggca 300
ggttatgcac tgacccagga taaaatgcgt ctggatgatc gtgcaagcca gcattggcct 360
gcactgcagg gtagccgttt tgatggtatt agcctgctgg atctggcaac ctataccgca 420
ggcggtctgc cgctgcagtt tccggatagc gttcagaaag atcaggcaca gattcgtgat 480
tattatcgtc agtggcagcc gacctatgca ccgggtagcc agcgtctgta tagcaatccg 540
agcattggtc tgtttggtta tctggcagca cgtagtctgg gtcagccgtt tgaacgtctg 600
atggaacagc aggtttttcc ggcactgggt ttagaacaga cccatctgga tgttccggaa 660
gcagcactgg cacagtatgc acaaggttat ggtaaagatg atcgtccgct gcgtgttggt 720
ccgggtccgc tggatgccga aggctatggt gttaaaacca gcgcagcaga tttactgcgt 780
tttgttgatg caaatctgca tccggaacgt ctggatcgtc cgtgggcaca agcactggat 840
gcaacccatc gtggttatta caaagttggt gatatgaccc aaggtttagg ttgggaagcc 900
tatgattggc cgattagtct gaaacgtctg caggcaggta atagcacccc gatggcactg 960
cagccgcatc gtattgcacg tctgccagca ccgcaggcac tggaaggtca gcgtctgctg 1020
aataaaaccg gtagcaccaa tggttttggt gcctatgttg catttgttcc gggtcgtgat 1080
ttaggtctgg ttattctggc caatcgtaat tatccgaatg ccgaacgtgt taaaattgcc 1140
tatgcaattc tgagcggtct ggaacaacag ggtaaagttc cgctgaaacg tggtagcggt 1200
ggttcaggtg gtagcgaaca agaagaactg ctggcactgc tgcgtagcga acgtattgtt 1260
ctggcacatg caggtcagcc gctgagcgaa gcacaggttc tgaaagcctt agcatggctg 1320
ctggcagcaa atccgagcgc accgcctggt caaggtctgg aagttctgcg tgaagtgctg 1380
caggcacgtc gtcagcctgg tgcacagtgg gatctgcgcg aatttctggt tagcgcgtat 1440
tttagcctgc atggtcgcct ggatgaagat gttattggtg tttataaaga tgtgctgcag 1500
acacaggatg gtggtggcgg tagcaaagaa accgaagcac gtctgaccgc aaccgaagat 1560
gccgcagcac gtgcacaggc acgtgcagat gaagcatatc gtaaagccga tgaagcactg 1620
ggtgccgcac agaaagcaca gcagacagcg gatgaagcca atgaacgtgc actgcgtatg 1680
ctggaaaaag caagccgtaa agaattt 1707
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 聚精氨酸(Poly-Arg)
<400> 3
Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 多聚组氨酸(Poly-His)
<400> 4
His His His His His His
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 标记标签(FLAG)
<400> 5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 链球菌标签(Strep-tagⅡ)
<400> 6
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> c-myc(c-myc)
<400> 7
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 220
<212> PRT
<213> GST(GST)
<400> 8
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp
210 215 220
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> PC 9(PC 9)
<400> 9
Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln Pro Gly
1 5 10 15
Ala Gln
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> PC10(PC10)
<400> 10
Glu Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln Pro Gly Ala Gln Trp Asp Leu Arg
1 5 10 15
Glu Phe
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> PC11(PC11)
<400> 11
Arg Gln Pro Gly Ala Gln Trp Asp Leu Arg Glu Phe Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Phe
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> PC12(PC12)
<400> 12
Trp Asp Leu Arg Glu Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His Gly
1 5 10 15
Arg Leu
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> PC13(PC13)
<400> 13
Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp Val
1 5 10 15
Ile Gly
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> PC14(PC14)
<400> 14
Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp
1 5 10 15
Val Leu
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> PC15(PC15)
<400> 15
Asp Glu Asp Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp Val Leu Gln Thr Gln Asp
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> PC16(PC16)
<400> 16
Val Tyr Lys Asp Val Leu Gln Thr Gln Asp Gly Lys Arg Lys Ala Leu
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> PC17(PC17)
<400> 17
Gln Thr Gln Asp Gly Lys Arg Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu Lys Ala
1 5 10 15
Leu Thr
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> PC18(PC18)
<400> 18
Arg Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys
1 5 10 15
Val Tyr
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> PC19(PC19)
<400> 19
Glu Leu Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln
1 5 10 15
Ser Gln
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> PC20(PC20)
<400> 20
Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln Ile Asn Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> PC21(PC21)
<400> 21
Ser Val Ile Gln Ser Gln Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly
1 5 10 15
Ile Arg
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> PC22(PC22)
<400> 22
Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ile
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> PC23(PC23)
<400> 23
Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp Leu Val Asp
1 5 10 15
Pro Thr
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> PC24(PC24)
<400> 24
Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Ala Val
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> PC25(PC25)
<400> 25
Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp Pro Arg
1 5 10 15
Trp Lys
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> PC26(PC26)
<400> 26
Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu
1 5 10 15
Tyr Ala
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> PC27(PC27)
<400> 27
Gly Asp Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213> PC28(PC28)
<400> 28
Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp Thr Phe Ser Gly
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> PC29(PC29)
<400> 29
Leu Leu Ser Asn Leu Asp Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp
1 5 10 15
Phe Leu
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> PC30(PC30)
<400> 30
Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro
1 5 10 15
Lys Gln
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> PC31(PC31)
<400> 31
Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ser Gly Glu Leu
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> PC32(PC32)
<400> 32
Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu
1 5 10 15
Tyr Pro
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> PC33(PC33)
<400> 33
Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu Lys Asp
1 5 10 15
Asn Asn
<210> 34
<211> 18
<212> PRT
<213> PC34(PC34)
<400> 34
Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn
1 5 10 15
Phe Ala
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> PC35(PC35)
<400> 35
Phe Glu Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe Ala Thr Thr Val Ser
1 5 10 15
Asp Arg
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> PC36(PC36)
<400> 36
Pro Val Gly Asn Phe Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg Ser Arg Pro Leu
1 5 10 15
Asn Asp
<210> 37
<211> 18
<212> PRT
<213> PC37(PC37)
<400> 37
Thr Thr Val Ser Asp Arg Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn Glu
1 5 10 15
Lys Thr
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> PC38(PC38)
<400> 38
Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn
1 5 10 15
Asp Thr
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> PC39(PC39)
<400> 39
Lys Val Asn Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser Ser Arg Tyr
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> PC40(PC40)
<400> 40
Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala Val Glu Ala
1 5 10 15
Leu Asn
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> PC41(PC41)
<400> 41
Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala Val Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln
1 5 10 15
Lys Tyr
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> PC42(PC42)
<400> 42
Arg Phe Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val Leu Arg Asp Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P1(AMC P1)
<400> 43
Asp Arg Leu Lys Ala Leu Val Asp Ala Ala Val Gln Pro Val Met Lys
1 5 10 15
Ala Asn
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P2(AMC P2)
<400> 44
Asp Ala Ala Val Gln Pro Val Met Lys Ala Asn Asp Ile Pro Gly Leu
1 5 10 15
Ala Val
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P3(AMC P3)
<400> 45
Met Lys Ala Asn Asp Ile Pro Gly Leu Ala Val Ala Ile Ser Leu Lys
1 5 10 15
Gly Glu
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P4(AMC P4)
<400> 46
Gly Leu Ala Val Ala Ile Ser Leu Lys Gly Glu Pro His Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Tyr Gly
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P5(AMC P5)
<400> 47
Leu Lys Gly Glu Pro His Tyr Phe Ser Tyr Gly Leu Ala Ser Lys Glu
1 5 10 15
Asp Gly
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P6(AMC P6)
<400> 48
Phe Ser Tyr Gly Leu Ala Ser Lys Glu Asp Gly Arg Arg Val Thr Pro
1 5 10 15
Glu Thr
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P7(AMC P7)
<400> 49
Lys Glu Asp Gly Arg Arg Val Thr Pro Glu Thr Leu Phe Glu Ile Gly
1 5 10 15
Ser Val
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P8(AMC P8)
<400> 50
Thr Pro Glu Thr Leu Phe Glu Ile Gly Ser Val Ser Lys Thr Phe Thr
1 5 10 15
Ala Thr
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P9(AMC P9)
<400> 51
Ile Gly Ser Val Ser Lys Thr Phe Thr Ala Thr Leu Ala Gly Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Thr
<210> 52
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P10(AMC P10)
<400> 52
Phe Thr Ala Thr Leu Ala Gly Tyr Ala Leu Thr Gln Asp Lys Met Arg
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P11(AMC P11)
<400> 53
Tyr Ala Leu Thr Gln Asp Lys Met Arg Leu Asp Asp Arg Ala Ser Gln
1 5 10 15
His Trp
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P12(AMC P12)
<400> 54
Met Arg Leu Asp Asp Arg Ala Ser Gln His Trp Pro Ala Leu Gln Gly
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 55
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P13(AMC P13)
<400> 55
Ser Gln His Trp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Arg Phe Asp Gly Ile Ser
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P14(AMC P14)
<400> 56
Gln Gly Ser Arg Phe Asp Gly Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P15(AMC P15)
<400> 57
Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ala Thr Tyr Thr Ala Gly Gly Leu Pro Leu
1 5 10 15
Gln Phe
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P16(AMC P16)
<400> 58
Thr Tyr Thr Ala Gly Gly Leu Pro Leu Gln Phe Pro Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Lys Asp
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P17(AMC P17)
<400> 59
Pro Leu Gln Phe Pro Asp Ser Val Gln Lys Asp Gln Ala Gln Ile Arg
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P18(AMC P18)
<400> 60
Val Gln Lys Asp Gln Ala Gln Ile Arg Asp Tyr Tyr Arg Gln Trp Gln
1 5 10 15
Pro Thr
<210> 61
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P19(AMC P19)
<400> 61
Ile Arg Asp Tyr Tyr Arg Gln Trp Gln Pro Thr Tyr Ala Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gln Arg
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P20(AMC P20)
<400> 62
Trp Gln Pro Thr Tyr Ala Pro Gly Ser Gln Arg Leu Tyr Ser Asn Pro
1 5 10 15
Ser Ile
<210> 63
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P21(AMC P21)
<400> 63
Gly Ser Gln Arg Leu Tyr Ser Asn Pro Ser Ile Gly Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 64
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P22(AMC P22)
<400> 64
Asn Pro Ser Ile Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Arg Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P23(AMC P23)
<400> 65
Gly Tyr Leu Ala Ala Arg Ser Leu Gly Gln Pro Phe Glu Arg Leu Met
1 5 10 15
Glu Gln
<210> 66
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P24(AMC P24)
<400> 66
Leu Gly Gln Pro Phe Glu Arg Leu Met Glu Gln Gln Val Phe Pro Ala
1 5 10 15
Leu Gly
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P25(AMC P25)
<400> 67
Leu Met Glu Gln Gln Val Phe Pro Ala Leu Gly Leu Glu Gln Thr His
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P26(AMC P26)
<400> 68
Pro Ala Leu Gly Leu Glu Gln Thr His Leu Asp Val Pro Glu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P27(AMC P27)
<400> 69
Thr His Leu Asp Val Pro Glu Ala Ala Leu Ala Gln Tyr Ala Gln Gly
1 5 10 15
Tyr Gly
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P28(AMC P28)
<400> 70
Ala Ala Leu Ala Gln Tyr Ala Gln Gly Tyr Gly Lys Asp Asp Arg Pro
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P29(AMC P29)
<400> 71
Gln Gly Tyr Gly Lys Asp Asp Arg Pro Leu Arg Val Gly Pro Gly Pro
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P30(AMC P30)
<400> 72
Arg Pro Leu Arg Val Gly Pro Gly Pro Leu Asp Ala Glu Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Val Lys
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P31(AMC P31)
<400> 73
Gly Pro Leu Asp Ala Glu Gly Tyr Gly Val Lys Thr Ser Ala Ala Asp
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P32(AMC P32)
<400> 74
Tyr Gly Val Lys Thr Ser Ala Ala Asp Leu Leu Arg Phe Val Asp Ala
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P33(AMC P33)
<400> 75
Ala Asp Leu Leu Arg Phe Val Asp Ala Asn Leu His Pro Glu Arg Leu
1 5 10 15
Asp Arg
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P34(AMC P34)
<400> 76
Asp Ala Asn Leu His Pro Glu Arg Leu Asp Arg Pro Trp Ala Gln Ala
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 77
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P35(AMC P35)
<400> 77
Arg Leu Asp Arg Pro Trp Ala Gln Ala Leu Asp Ala Thr His Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Tyr
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P36(AMC P36)
<400> 78
Arg Leu Asp Arg Pro Trp Ala Gln Ala Leu Asp Ala Thr His Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Tyr
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P37(AMC P37)
<400> 79
Arg Gly Tyr Tyr Lys Val Gly Asp Met Thr Gln Gly Leu Gly Trp Glu
1 5 10 15
Ala Tyr
<210> 80
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P38(AMC P38)
<400> 80
Asp Met Thr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Ala Tyr Asp Trp Pro Ile Ser
1 5 10 15
Leu Lys
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P39(AMC P39)
<400> 81
Trp Glu Ala Tyr Asp Trp Pro Ile Ser Leu Lys Arg Leu Gln Ala Gly
1 5 10 15
Asn Ser
<210> 82
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P40(AMC P40)
<400> 82
Ile Ser Leu Lys Arg Leu Gln Ala Gly Asn Ser Thr Pro Met Ala Leu
1 5 10 15
Gln Pro
<210> 83
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P41(AMC P41)
<400> 83
Ala Gly Asn Ser Thr Pro Met Ala Leu Gln Pro His Arg Ile Ala Arg
1 5 10 15
Leu Pro
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P42(AMC P42)
<400> 84
Ala Leu Gln Pro His Arg Ile Ala Arg Leu Pro Ala Pro Gln Ala Leu
1 5 10 15
Glu Gly
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P43(AMC P43)
<400> 85
Ala Arg Leu Pro Ala Pro Gln Ala Leu Glu Gly Gln Arg Leu Leu Asn
1 5 10 15
Lys Thr
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P44(AMC P44)
<400> 86
Ala Leu Glu Gly Gln Arg Leu Leu Asn Lys Thr Gly Ser Thr Asn Gly
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P45(AMC P45)
<400> 87
Leu Asn Lys Thr Gly Ser Thr Asn Gly Phe Gly Ala Tyr Val Ala Phe
1 5 10 15
Val Pro
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P46(AMC P46)
<400> 88
Asn Gly Phe Gly Ala Tyr Val Ala Phe Val Pro Gly Arg Asp Leu Gly
1 5 10 15
Leu Val
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P47(AMC P47)
<400> 89
Ala Phe Val Pro Gly Arg Asp Leu Gly Leu Val Ile Leu Ala Asn Arg
1 5 10 15
Asn Tyr
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P48(AMC P48)
<400> 90
Leu Gly Leu Val Ile Leu Ala Asn Arg Asn Tyr Pro Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Val Lys
<210> 91
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P49(AMC P49)
<400> 91
Asn Arg Asn Tyr Pro Asn Ala Glu Arg Val Lys Ile Ala Tyr Ala Ile
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 92
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P50(AMC P50)
<400> 92
Glu Arg Val Lys Ile Ala Tyr Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Gln Gln
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 93
<211> 18
<212> PRT
<213> AMC P51(AMC P51)
<400> 93
Ala Tyr Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Gln Gln Gly Lys Val Pro Leu
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 94
<211> 99
<212> PRT
<213> PcrV(PcrV)
<400> 94
Glu Gln Glu Glu Leu Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile Val Leu
1 5 10 15
Ala His Ala Gly Gln Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Leu Lys Ala Leu
20 25 30
Ala Trp Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gln Gly Leu
35 40 45
Glu Val Leu Arg Glu Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln Pro Gly Ala Gln
50 55 60
Trp Asp Leu Arg Glu Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His Gly
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Asp Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp Val Leu Gln Thr
85 90 95
Gln Asp Gly
<210> 95
<211> 60
<212> PRT
<213> OprI 24Ser-83Lys(OprI 24Ser-83Lys)
<400> 95
Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala
20 25 30
Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu
35 40 45
Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys
50 55 60
<210> 96
<211> 397
<212> PRT
<213> AmpC(AmpC)
<400> 96
Met Arg Asp Thr Arg Phe Pro Cys Leu Cys Gly Ile Ala Ala Ser Thr
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Thr Thr Pro Ala Ile Ala Gly Glu Ala Pro Ala Asp
20 25 30
Arg Leu Lys Ala Leu Val Asp Ala Ala Val Gln Pro Val Met Lys Ala
35 40 45
Asn Asp Ile Pro Gly Leu Ala Val Ala Ile Ser Leu Lys Gly Glu Pro
50 55 60
His Tyr Phe Ser Tyr Gly Leu Ala Ser Lys Glu Asp Gly Arg Arg Val
65 70 75 80
Thr Pro Glu Thr Leu Phe Glu Ile Gly Ser Val Ser Lys Thr Phe Thr
85 90 95
Ala Thr Leu Ala Gly Tyr Ala Leu Thr Gln Asp Lys Met Arg Leu Asp
100 105 110
Asp Arg Ala Ser Gln His Trp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Arg Phe Asp
115 120 125
Gly Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ala Thr Tyr Thr Ala Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Leu Gln Phe Pro Asp Ser Val Gln Lys Asp Gln Ala Gln Ile Arg Asp
145 150 155 160
Tyr Tyr Arg Gln Trp Gln Pro Thr Tyr Ala Pro Gly Ser Gln Arg Leu
165 170 175
Tyr Ser Asn Pro Ser Ile Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Arg Ser
180 185 190
Leu Gly Gln Pro Phe Glu Arg Leu Met Glu Gln Gln Val Phe Pro Ala
195 200 205
Leu Gly Leu Glu Gln Thr His Leu Asp Val Pro Glu Ala Ala Leu Ala
210 215 220
Gln Tyr Ala Gln Gly Tyr Gly Lys Asp Asp Arg Pro Leu Arg Val Gly
225 230 235 240
Pro Gly Pro Leu Asp Ala Glu Gly Tyr Gly Val Lys Thr Ser Ala Ala
245 250 255
Asp Leu Leu Arg Phe Val Asp Ala Asn Leu His Pro Glu Arg Leu Asp
260 265 270
Arg Pro Trp Ala Gln Ala Leu Asp Ala Thr His Arg Gly Tyr Tyr Lys
275 280 285
Val Gly Asp Met Thr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Ala Tyr Asp Trp Pro
290 295 300
Ile Ser Leu Lys Arg Leu Gln Ala Gly Asn Ser Thr Pro Met Ala Leu
305 310 315 320
Gln Pro His Arg Ile Ala Arg Leu Pro Ala Pro Gln Ala Leu Glu Gly
325 330 335
Gln Arg Leu Leu Asn Lys Thr Gly Ser Thr Asn Gly Phe Gly Ala Tyr
340 345 350
Val Ala Phe Val Pro Gly Arg Asp Leu Gly Leu Val Ile Leu Ala Asn
355 360 365
Arg Asn Tyr Pro Asn Ala Glu Arg Val Lys Ile Ala Tyr Ala Ile Leu
370 375 380
Ser Gly Leu Glu Gln Gln Gly Lys Val Pro Leu Lys Arg
385 390 395
<210> 97
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 1(Pc 1)
<400> 97
Gly Ser Glu Gln Glu Glu Leu Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile
1 5 10 15
Val Leu
<210> 98
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 2(Pc 2)
<400> 98
Leu Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly
1 5 10 15
Gln Pro
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 3(Pc 3)
<400> 99
Ser Glu Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly Gln Pro Leu Ser Glu Ala
1 5 10 15
Gln Val
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 4(Pc 4)
<400> 100
Ala His Ala Gly Gln Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Leu Lys Ala Leu
1 5 10 15
Ala Trp
<210> 101
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 5(Pc 5)
<400> 101
Leu Ser Glu Ala Gln Val Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Asn Pro
<210> 102
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 6(Pc 6)
<400> 102
Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Gln
<210> 103
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 7(Pc 7)
<400> 103
Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Val
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> Pc 8(Pc 8)
<400> 104
Ser Ala Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Arg

Claims (10)

1.一种用于预防铜绿假单胞菌感染的融合蛋白，其特征在于，包含线性连接组合的第一肽段、第二肽段和第三肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:94，所述第二肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:95，所述第三肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO:96的第三肽段。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中一个或多个氨基酸残基经乙酰化、羧基化或糖基化修饰。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中还含有标签序列，所述标签序列选自Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ、c-myc或GST标签中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
5.一种编码如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的重组基因；优选地，所述重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
6.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求5所述的重组基因。
7.一种用于表达如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有如权利要求5所述的重组基因，或者如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白在制备用于预防铜绿假单胞菌感染的药物中的应用。
9.一种用于预防铜绿假单胞菌感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中活性成分含有如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为疫苗；优选地，所述疫苗中还含有药学上可接受的佐剂，优选地，所述佐剂为热凝胶多糖(Curdlan)。
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